UNIVERSIDAD TCNICA PARTICULAR DE LOJA

TITULACIN DE INGENIERO EN ALIMENTOS

MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA DE ALIMENTOS

GUA DE PRCTICAS DE LABORATORIO

Microbiologa de Alimentos
Mg.Sc. Diana Hualpa Salinas
 PRACTICA No. 3

I. INTRODUCCIN

1.1 Recuento de coliformes totales por agar rojo bilis violeta

Este mtodo utiliza la tcnica del recuento en placa por siembra en profundidad en agar
Cristal Violeta-rojo neutro Bilis (VRB) o similar y una temperatura de incubacin de 30 1C
para productos refrigerados y 35 1C para productos que se mantienen a temperatura
ambiente, por 24 2h.

Los coliformes son bacterias de forma bacilar, Gram negativas, aerobias y anaerobias
facultativas, mviles e inmviles, no esporuladas que forman colonias caractersticas en
agar Cristal Violeta Rojo neutro Bilis (V R B) o similar cuando se incuban a 30 1C los
productos refrigerados y a 35 1C los productos que se mantienen a temperatura
ambiente y se utiliza el medio y el mtodo descrito. Este grupo es utilizado como indicador
del grado de higiene.

El grupo coliforme est constituido por bacterias Gramnegativas capaces de fermentar la

lactosa con produccin de gas a las 48 horas de incubacin a 35 C. Este grupo est
conformado por cuatro gneros principalmente: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y
Klebsiella.

Este grupo comprende coliformes fecales y Esc. Coli. No se les considera por separado,
dado que los fecales (principalmente Esc. Coli pertenecen al grupo de los coliformes. Segn
la situacin, se examinan muestras de alimentos, agua y ambientales para la deteccin de
uno o ms de ellos (Bibek Arun, 2008).

Recuento de coliformes totales y E.coli por el mtodo rpido petrifilm

Se aplica a la enumeracin de Coliformes Totales y E.coli en alimentos. El mtodo es

apropiado para la determinacin de Coliformes Totales y E.coli en alimentos.

Petrifilm en placa para coliformes: las placas contienen violet red bile nutrientes, agente
gelatinizante soluble en agua fra, 2,3,5, triphenytetrazolium chloride indicador con la
adicin de 5-bromo 4 chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide, un indicador de actividad
glucoronidase. Esto permite leer coliformes y E. Coli en la misma placa. Coloreado para
mejorar la visualizacin del crecimiento y un agente gelatinizante soluble en agua fra. Las
muestras sin diluir o diluidas se aaden a las placas en un dimetro de 1 ml por placa. La

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 muestra se extiende en un rea de crecimiento de 30 cm2. El agente gelatinizante se deja
solidificar, las placas se incuban y se cuentan las colonias.

II. OBJETIVOS

Determinar el recuento de coliformes totales y E. coli en placas petrifilm y agar y

diferenciar las colonias en ambos mtodos.
Interpretar los resultados obtenidos con una norma nacional o internacional.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

3.1. MATERIALES

- 1 pipeta de 10 ml
- 3 pipetas de 1 ml
- 1 Incubadora
- 1 mechero bunsen
- 1 pera de succin
- 3 erlenmeyers de 250 ml
- 1 erlenmeyer de 500 ml
- 1 baln de 1000 ml
- Contador de colonias
- Termmetro NIST
- 1 varilla de agitacin
- Papel craf
- Algodn
- Papel aluminio
- Alcohol.
- 1 autoclave para esterilizacin

3.2 MEDIOS DE CULTIVO

Agar rojo bilis violeta

Placas coliformes totales y e.coli
Agua buferada

IV. METODOLOGA

4.1 SIEMBRA DE COLIFORMES TOTALES

AGAR

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 Limpiar la mesa de trabajo con alcohol y luego prender el mechero bunsen.
Limpiar el envase del producto con un algodn empapado en alcohol.
Abrir el envase y tomar aspticamente 10 ml de la muestra y poner en 90 ml de agua
buferada estril, agitar 30 veces esta ser la dilucin 10 -1 , tomar 1 ml de esta solucin
y poner en 9 ml de agua buferada estril esta ser la dilucin 10 -2, poner de esta
solucin 1 ml en 9 ml de agua buferada estril esta ser la dilucin 10-3 .
Poner estas soluciones en las cajas petri estriles
Colocar en la caja petri estril ,con una pipeta perpendicular colocar 1 ml de la muestra
en el centro de cada una de la diluciones (10-1,10-2,10-3)
Poner el agar rojo bilis violeta frio y templado a 45 C y realizar movimientos: 6 a la
izquierda, 6 a la derecha y 2 arriba y otro abajo.
Dejar solidificar el agar.
Agregar una capa de 4 ml de agar rojo bilis violeta fundido sobre el medio solidificado,
extendindolo para que cubra toda la superficie.
Dejar solidificar el agar.
Incubar las cajas invertidas a 35C durante 24 horas.
Pasado el tiempo de incubacin, seleccionar las placas que presenten 30 - 150 colonias
y examinar con luz transmitida. Contar todas las colonias de 1- 2 mm de dimetro
(mnimo de 0,5 mm) de color rojo amoratado rodeadas por un halo rojizo.

PLACAS PETRIFILM COLIFORMES TOTALES Y E.COLI

Colocar la placa petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.

Con una pipeta perpendicular a la placa petrifilm colocar 1 ml de la muestra en el
centro del film inferior de cada una de la diluciones (10-1,10-2,10-3)
Dejar caer el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire.
Con la cara lisa hacia arriba, colocar el aplicador en el film superior sobre el inculo.
Ejercer una presin sobre el aplicador para repartir el inculo sobre el rea circular. No
girar ni deslizar el aplicador.
Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel. RECUERDE inocular y
poner el aplicador antes de pasar a la siguiente placa.
Incubar las placas petrifilm cara arriba en pilas de hasta 20 placas a temperatura de 35
C por 48 +/- dos horas.

V. RESULTADOS OBTENIDOS

Calcular las UFC/g de alimentos para cada uno de los mtodos de ensayo, recuento de
coliformes totales y E.coli y evaluar los resultados frente a una norma tcnica de
referencia.

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 Recuento en placas petrifilm

- Coliformes: Aparecen como colonias rojas que tienen asociadas una o ms burbujas de
gas dentro del dimetro de la colonia.
- Escherichia coli: aparece como colonias azules asociadas con burbujas de gas. Para
obtener el nmero total de coliformes cuente las colonias rojas y azules asociadas con
burbujas de gas.
Las colonias no coliformes son de color rojo pero no estn asociadas con burbujas de
gas.

Para calcular el recuento de coliformes totales y E.coli, multiplicar el nmero total de

colonias por placa por el respectivo factor de dilucin.
Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas, calcule el
nmero promedio de colonias de cada dilucin antes de determinar el contaje total de
Coniformes y E coli. El rango para el conteo es de 15 150.

Se puede hacer contajes estimados en placas con ms de 150 colonias y puede ser
reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el contaje
promedio / 1 cm2 y multiplicar por 30 (rea de crecimiento circular de 30 cm2)

Ct: = Nmero de colonias por placa/(dilucin x volumen inoculado) (UFC)

E.Coli: = Nmero de colonias por placa/(dilucin x volumen inoculado) (UFC)

Para diferenciar las colonias de coliformes totales en las placas petrifilm, busque algunas
de las siguientes caractersticas tpicas del cultivo: puntos rojos asociados a burbujas de
gas. Los puntos rojos sin la presencia de gas no son considerados como coliformes.

Los resultados se expresan en ufc/g o ml de alimento y en forma exponencial.

Agar rojo bilis violeta

- Las UFC tpicas son de color rojo obscuro con halo de precipitacin rojo o rosa
alrededor y un dimetro de 0,5 mm o mayor.
- Confirmar las colonias con caldo lauryl sulfato triptosa.
- Informar UFC de organismos coliformes en agar rojo bilis violeta incubado 24 horas a
35C.

UFC = Nmero de colonias por placa/(dilucin x volumen inoculado) (UFC)

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ELIMINACIN DE RESIDUOS

Eliminar los residuos en autoclave a 121C por 15 minutos a 15 PSI, controlar con cinta de
esterilizacin para comprobar tiempo, temperatura y presin. Una vez destruidos poner en la
funda roja para desechar.

VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Decidir sobre la calidad higinica sanitaria de los alimentos analizados, realizar las
respectivas conclusiones y recomendaciones acerca de los resultados obtenidos

VII. BIBLIOGRAFA

Feng, P., Weagant, S., Grant, M., Burkhardt, W. 2012. Bacteriological Analytical Manual.
Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. Ch. 4.
AOAC (Official Methods of Analysis. Microbiological Methods). 2005. AOAC 991.14.
Mtodo rpidp PetrifilmTM para el recuento de E. coli y coliformes en alimentos. Ch. 17,
Ed. 18.
Gua de interpretacin. 3MTM PetrifilmTM
INEN (Instituto Ecuatoriano de Normalizacin, EC). 1990. Norma Tcnica Ecuatoriana
NTE INEN 1529-7. Control Microbiolgico de los Alimentos. Determinacin de
microorganismos coliformes por la tcnica de recuento de colonias. Quito-Ecuador. 9p.
Bibek, R; Arun, B. (2008). Fundamentos de microbiologa de los alimentos. Editorial
McGraw Hill.

VIII. ANEXOS

8. 1 Diagrama de siembra para recuento de coliformes totales y E.coli

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Mg.Sc. Diana Hualpa Salinas
Fuente: Andrade, Y. (2015). Calidad microbiolgica de lechuga lista para el consumo. Tesis de
grado. Universidad Tcnica particular de Loja.

8.2 Figura de siembra en placas petrifilm

8. 3 Figuras de colonias de coliformes y E. coli en mtodo rpido petrifilm

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 8.4 Figuras de recuento de coliformes en agar rojo bilis violeta

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