El documento describe los métodos de Lowry y Bradford para determinar la cantidad de proteínas presentes en una muestra. Se muestran tablas con los datos de las curvas de calibración de cada método usando diferentes concentraciones de hemoglobina. Las figuras presentan las curvas de calibración obtenidas con sus ecuaciones y coeficientes de correlación. También se incluyen tablas con los análisis estadísticos realizados y una tabla sobre posibles interferencias en el método de Lowry.
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El documento describe los métodos de Lowry y Bradford para determinar la cantidad de proteínas presentes en una muestra. Se muestran tablas con los datos de las curvas de calibración de cada método usando diferentes concentraciones de hemoglobina. Las figuras presentan las curvas de calibración obtenidas con sus ecuaciones y coeficientes de correlación. También se incluyen tablas con los análisis estadísticos realizados y una tabla sobre posibles interferencias en el método de Lowry.
El documento describe los métodos de Lowry y Bradford para determinar la cantidad de proteínas presentes en una muestra. Se muestran tablas con los datos de las curvas de calibración de cada método usando diferentes concentraciones de hemoglobina. Las figuras presentan las curvas de calibración obtenidas con sus ecuaciones y coeficientes de correlación. También se incluyen tablas con los análisis estadísticos realizados y una tabla sobre posibles interferencias en el método de Lowry.
El documento describe los métodos de Lowry y Bradford para determinar la cantidad de proteínas presentes en una muestra. Se muestran tablas con los datos de las curvas de calibración de cada método usando diferentes concentraciones de hemoglobina. Las figuras presentan las curvas de calibración obtenidas con sus ecuaciones y coeficientes de correlación. También se incluyen tablas con los análisis estadísticos realizados y una tabla sobre posibles interferencias en el método de Lowry.
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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y BRADFORD
Datos experimentales
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry
Solución de Absorbancia 730 nm proteína Cantidad de proteína Tubo No. añadida (µg) Serie a Serie b (0.25 mg/mL) 1 0.1 25 0.079 0.077 2 0.2 50 0.139 0.136 3 0.3 75 0.181 0.18 4 0.4 100 0.249 0.233 5 0.5 125 0.272 0.283 Se muestra la cantidad de proteína que contenía cada tubo que fue sometido al espectrofotómetro a partir de una solución de proteína con una concentración de 0.25 mg/m, colocando cantidades diferentes de ésta a los tubos.
A continuación, se muestra un ejemplo de como se calculó la cantidad de proteína
presente en cada tubo. 0.3 y = 0.002x + 0.0321 R² = 0.9905
Figura 1. Curva de calibración por el método de Lowry a una absorbancia de 730
nm, donde puede observarse la obtención de la ecuación de la recta, así como su coeficiente de correlación.
Tabla 2. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Lowry
Solución de Absorbancia 730 nm proteína Cantidad de proteína Tubo No. añadida (µg) Serie a Serie b (0.25 mg/mL) 1 0.1 25 0.079 0.077 2 0.2 50 3 0.3 75 0.181 0.18 4 0.4 100 0.233 5 0.5 125 0.283 En la tabla se muestra las absorbancias que se tomaron para mejorar la ecuación de la recta, con la finalidad de obtener un coeficiente de correlación lo más cercano a uno y una ordenada al origen cercana a cero. 0.3 y = 0.0021x + 0.0266 R² = 0.9999 0.25 ABSORBANCIA 730 nm
Figura 2. Curva de calibración por el método de Lowry a una absorbancia de 730
nm, donde puede observarse la obtención de la ecuación de la recta con datos mejorados para obtener su coeficiente de correlación cercano a uno y la ordenada al origen cercano a cero.
Tabla 3. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford
Solución de Absorbancia 595 nm
Tubo No. proteína añadida Cantidad de proteína (µg) (0.25 mg/mL) Serie a Serie b 1 0.1 25 0.325 0.3 2 0.2 50 0.449 0.447 3 0.3 75 0.559 0.557 4 0.4 100 0.647 0.65 5 0.5 125 0.62 0.618 Se muestra la cantidad de proteína que contenía cada tubo que fue sometido al espectrofotómetro a partir de una solución de proteína con una concentración de 0.25 mg/m, colocando cantidades diferentes de ésta a los tubos. 0.8
Figura 3. Figura 1. Curva de calibración por el método de Bradford a una
absorbancia de 595 nm, donde puede observarse la obtención de la ecuación de la recta, así como su coeficiente de correlación.
Tabla 4. Curva de calibración de hemoglobina. Método de Bradford
Solución de Absorbancia 595 nm
Tubo No. proteína añadida Cantidad de proteína (µg) (0.25 mg/mL) Serie a Serie b 1 0.1 25 0.325 2 0.2 50 0.449 0.447 3 0.3 75 0.559 4 0.4 100 0.647 0.65 5 0.5 125 En la tabla se muestra las absorbancias que se tomaron para mejorar la ecuación de la recta, con la finalidad de obtener un coeficiente de correlación lo más cercano a uno y una ordenada al origen cercana a cero. 0.7 y = 0.0042x + 0.2304 R² = 0.9954 0.6
0.5 Absorbancia
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 20 40 60 80 100 120 Cantidad de proteína (µg)
Figura 4. Curva de calibración por el método de Bradford a una absorbancia de 595
nm, donde puede observarse la obtención de la ecuación de la recta con datos mejorados para obtener su coeficiente de correlación cercano a uno y la ordenada al origen cercano a cero.
Tabla 5 Réplicas para análisis estadístico. Método Lowry
Cantidad de Absorbancia Tubo No. proteína (µg) 730 nm formula nueva 1 0.196 80.7 2 0.182 74 3 0.181 73.5 4 0.165 65.9 5 0.197 81.1 6 0.166 66.4 7 0.183 74.5 8 0.168 67.3 9 0.171 68.8 10 0.176 71.1 Media S S2 %C.V. LCMS LCMI %Er 72.3 5.5 30.25 7.6 76.2 68.4 -3.6 Tabla 6. Replicas para análisis estadístico. Método Bradford
Ambas tablas muestran los resultados de los análisis estadísticos, a continuación
se ejemplifica como se obtuvieron dichas resultados, tomando como base los datos de Lowry, sin embargo, ambos métodos llevan la misma metodología. Tabla 7. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Lowry
Absorbancia Cantidad de Tipo de
Tubo No. Sustancia 730 nm proteína (µg) interferencia Sin 1 0.104 Tris 1M Ph= 7.0 36.8 interferencia Sin 2 0.171 Glicerol 1% 68.8 interferencia 3 Detergente comercial 0.2 82.6 Negativa Dodecil sulfato de sodio 4 0.198 (SDS) 81.6 Negativa Ácido tricloroacético (TCA) 5 0.195 5% 80.2 Positiva Se muestra la clase de interferencia que se tiene al probar la sustancias no proteícas por el método de Lowry
Tabla 8. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de
Bradford.
Cantidad Tubo Absorbancia de Tipo de Sustancia No. 595 nm proteína interferencia (µg) 1 Tris 1M Ph= 7.0 0.54 73.7 Positiva 2 Glicerol 1% 0.579 83 Positiva 3 Detergente comercial 0.191 -9.4 Negativa Dodecil sulfato de sodio 4 0.174 (SDS) -13.4 Negativa Ácido tricloroacético (TCA) 5 0.525 5% 70.1 Positiva Se muestra la clase de interferencia que se tiene al probar la sustancias no proteicas por el método de Bradford.
Tabla 9. Tabla de resultados del análisis de la prueba de t de student
Cantidad de proteína Cantidad de proteína
Di Di-D (Di-D)2 Bradford Lowry 71.6 81.1 -9.5 -0.47 10.89 70.1 80.6 -10.5 -4.3 18.49 69.4 74.5 -5.1 1.1 1.21 69 74 -5 1.2 1.44 66 73.5 -7.5 -1.3 1.69 65.9 71.1 -5.2 1 1 64.7 68.8 -4.1 2.1 4.41 62 67.3 -5.3 0.9 0.81 61.6 66.4 -4.8 1.4 1.96 60.6 65.9 -5.3 0.9 0.81 D media -6.2 Σ 42.71 SD 2.17 t calculada -9.03 t tablas 2.262 En la tabla se muestra los resultados de la prueba de t de students, la cual se encarga de determinar el grado de inexactitud en ambos métodos. Tabla 10. Tabla de resultados de la obtención de F.
Método S2 Resultado F F tablas calculada
Lowry 30.25 2.02 4.03 Bradford 14.98
La tabla indica el resultados de la F, la prueba se enfoca en conocer el grado de
imprecisión en ambos métodos.
Ahora, vamos a comparar la sensibilidad de los métodos, de la siguiente manera.
Empezare a hablar sobre el método de Lowry, el cual como sabemos se basa en la
cuantificación de proteínas usando el reactivo de Folin, el método es sensible y sencillo, por lo cual es fácil adaptar a ensayos con nuestras pequeñas (como en éste caso). De hecho, la coloración que se obtiene varía dependiendo de la proteína con la que se esté trabajando, sin mencionar que hay casos en los que la coloración que toda la reacción no es proporcional a la concentración de proteína que se tenga en cada muestra, sin embargo, la proteína con la que trabajamos (hemoglobina), da coloración azul, además de que los tubos que tenían una mayor concentración de proteína tenían una coloración mayor con respecto a los de menor concentración.
En el procedimiento, existen dos pasos que llevan a la producción de color, los
cuales se deben a la reacción que se lleva a cabo entre el cobre en solución alcalina y la segunda reacción a la reducción del reactivo de fosfomolibdico-fosfotungstico, en este punto se forma el complejo proteína-cobre. Por lo tanto, al momento de realiza la curva de calibración tomamos las lecturas a una absorbancia de 730 nm, debido a que en esté rango se toma la lectura de las reducciones del reactivo de Folin.
En cuanto a las interferencias en el método, se sabe que la prueba no es compatible
con detergentes, por dicha razón, el detergente comercial y el SDS usado en la práctica causan interferencias negativas con el método (tabla 7)
Referente a la figura 1, son los datos obtenidos experimentalmente, la figura 2, son
los mismos datos, exceptuando aquellos que hacen que la ordenada al origen se aleje de cero y que los coeficientes de correlación se alejen de 1. Por dicha razón todos los cálculos que se hicieron partieron de la ecuación de la recta que se obtuvo al modificar los datos.
En cuando al método de Bradford sabemos que se debe a la unión del colorante
Azul Brillante de Coomasie a las proteínas, lo cual hace que haya un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm, por dicha razón, la absorbancia a la que se realizan las mediciones es a 595 nm.
El complejo colorante proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo que hace al
ensayo 4 veces más sensible que el método de Lowry, esto podemos conocerlo con las relaciones de las pendientes, en donde se espera que la pendiente de Bradford sea 4 veces mayor que la de Lowry, sin embargo, el resultado de la sensibilidad es dos, lo que nos indica que está lejos de la sensibilidad.
En cuanto a las interferencias, podemos decir que por ejemplo, el Tris, glicerol y trazas de detergentes pueden ser eliminados fácilmente si se añaden los buffers adecuados, lo cual no ocurrío en estos casos, por esa razón, daba las interferencias.
De hecho, por tal razón, las grandes cantidades de detergentes, implican una interferencia muy grande.
En cuanto a la figura 3, muestra los datos completos obtenidos en la práctica y la
figura 4. Son los datos mejorados, en donde la finalidad es obtener una ordenada al origen más cercana a cero.
En cuanto al análisis estadístico de las réplicas, el %Ee se uso para conocer el
grado de inexactitud en cada método, es decir, en el método de Lowry, tiene como máximo un %Er en 10%, en donde en el resultado experimental es de 3.6, lo cual nos dice que el %Ee es aceptable, por estar en el intervalo, el %C.V. se basa en la imprecisión del método, en donde un valor máximo es %C.V. es de 10, en donde el valor experimental fue de %C.V.= 7.6, por lo que de igual manera, es un valor aceptado en la imprecisión. Haciendo el mismo análisis para Bradford, los valores de %Er y %C.V son máximo de 7.5, en donde los valores experimentales de %Er= -11.86 y %C.V.= 5.85, lo que nos indica que los valores son aceptados dentro del rango estipulado.
En cuanto a los cálculos de t de student y F, nos indica la imprecisión conociendo
la F y la inexactitud conociendo la t, en donde vemos que la t calculada>t tablas. Y con la F, podemos decir que la F calculada < F tablas, lo que nos indica que no hay diferencia significativa entre los métodos.
Bibliografía
Reisner, A. H.; Nemes, P. and Bucholtz, C., Anal. Biochem. 64, 509(1975) García A. H. 1998. Cuantificación de proteínas: una revisión. Instituto de Biotecnología UNAM. 3:77-88 Roca P., Oliver J., “Bioquímica: Técnicas y métodos”, Editorial Hélice, España, 2004, pp. 157-158
"Determinación Espectrofotométrica de Bismuto en Tabletas Utilizando Tiourea Mediante Curva de Calibración de Estándar Externo y Curva de Adición Patrón
"Determinación Espectrofotométrica de Bismuto en Tabletas Utilizando Tiourea Mediante Curva de Calibración de Estándar Externo y Curva de Adición Patrón
