TIROSINASA II

RESULTADOS

t(min)/tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0 0,048 0,061 0,109 0,111 0,151 0,183
0,5 0,048 0,062 0,11 0,11 0,148 0,181
1 0,049 0,061 0,109 0,109 0,147 0,181
1,5 0,049 0,061 0,109 0,11 0,148 0,18
2 0,05 0,061 0,109 0,11 0,148 0,18
2,5 0,052 0,062 0,11 0,111 0,148 0,18
3 0,053 0,063 0,111 0,111 0,149 0,179
3,5 0,054 0,065 0,111 0,111 0,148 0,179
4 0,057 0,066 0,112 0,112 0,148 0,179
4,5 0,06 0,069 0,114 0,112 0,149 0,179
5 0,064 0,074 0,117 0,113 0,15 0,178
Tabla 1

Gráficas

Absorbancia vs tiempo (tubo 1)

0.07

0.06

0.05
y = 0.003x + 0.0456
R² = 0.8874
0.04

0.03

0.02

0.01

0
0 1 2 3 4 5 6
 Absorbancia vs tiempo (Tubo 2)
0.08

0.07

0.06
y = 0.0021x + 0.0587
0.05 R² = 0.7237

0.04

0.03

0.02

0.01

0
0 1 2 3 4 5 6

Absorbancia vs tiempo (Tubo 3)

0.118

0.116
y = 0.0013x + 0.1078
0.114 R² = 0.7161

0.112

0.11

0.108

0.106
0 1 2 3 4 5 6
 Absorbancia vs tiempo (Tubo 4)
0.1135
0.113
0.1125 y = 0.0005x + 0.1095
0.112 R² = 0.6338

0.1115
0.111
0.1105
0.11
0.1095
0.109
0.1085
0 1 2 3 4 5 6

Absorbancia vs tiempo (Tubo 5)

0.1515
0.151
0.1505
0.15
y = 5E-05x + 0.1484
0.1495 R² = 0.0064
0.149
0.1485
0.148
0.1475
0.147
0.1465
0 1 2 3 4 5 6
 Absorbancia vs tiempo (Tubo 6)
0.184

0.183

0.182

0.181
y = -0.0008x + 0.1818
0.18
R² = 0.8481
0.179

0.178

0.177
0 1 2 3 4 5 6

Tabla 2

Gráficas

V vs [S]
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
y = -0.2966x + 0.0036
0.001
R² = 0.9929
0.0005
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
-0.0005
-0.001
-0.0015
 1/[S] vs 1/V
25000

20000

15000

10000
y = -19.231x + 6798.4
R² = 0.0916
5000

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
-5000

CÁLCULOS

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Tanto en la tabla como en los gráficos de absorbancia vs tiempo correspondientes a cada tubo se
puede observar que la tendencia se ajusta a una linea recta por lo que los coeficientes de correlación
son muy cercanos a uno, a excepcion del tubo 5, en el cual se presenta un coefiente muy bajo. En
los tubos 1, 2, 3 y 4 se puede evidenciar por los resultados de la absorbancia tabulados que a medida
que pasa el tiempo la tendencia de la absorbancia es aumentar, sin embargo, al minuto, y esto
aplicó para todos los casos, disminuye y vuelve a incrementarse. Esto puede indicar que se esta
formando el dopacromo muy rapidamente por la accion de la enzima, pero como esta no actua de
la misma forma en todos los casos, pese a que se encuentra en todos los tubos la misma cantidad
de extracto enzimatico, lo que ocurre es que en ese tiempo puede estar ocurriendo la etapa lenta
del proceso, ademas lo que esta cambiando es la cantidad de sustrato, y por consiguiente su
concentracion, la actividad enzimatica no es la misma.

De acuerdo a lo planteado por Briggs y Haldane,tambien puede estar sucediendo que los periodos
de tiempo en que se mantienen constantes los mismos valores hasta incrementarsen de nuevo,
aunque sea un poco, se deba a que la reaccion se encuentra en un periodo del estado estable en el
que la reaccion degradar y producir esta ocurriendo a la misma velocidad.

Como cada tubo tiene una concentración diferente de sustrato que va en un aumento de 0,5 del
tubo 1 al tubo 6, los valores de las absorbancias tambien aumentan por lo que se esta formando
más dopacromo. En todas las graficas, la pendiente correspondiente a la velocidad inicial para cada
concentración de sustrato, que nos indica el incremento de los valores de absorbancia por cada
minuto a la longitud onda de 420 nm, fueron positivas, excepto en el tubo 6, en el cual los valores
de absorbancia decrecen en lugar de ascender, esto puede deberse a que este tubo contiene la
mayor concentracion de sustrato, por lo que la enzima se satura, y llega a un periodo de
estancamiento.

En cuanto a las gráficas obtenidas de los valores calculados en la segunda tabla respecto a los valores
de concentracion del sustrato final para cada tubo, los de velocidad inicial y los inversos de estos,
tenemos que no se dieron los resultados esperados respecto a los objetivos propuestos en la
práctica, ya que la gráfica de V vs [S] de acuerdo a lo planteado teoricamente y experimentalmente
por Michaelis y Menten debia ser hiperbolica, de modo que se visualizará una transición de la
cinética de primer orden a la de orden cero, es decir, un momento en que la velocidad de la reaccion
es proporcional a la concentracion del sustrato hasta pasar a un momento en que por la saturacion
de la enzima se llega a un estancamiento, o sea que la velocidad de reacción es independiente de la
concentración del sustrato. En lugar de esto, la grafica resultante de esta practica experimental de
acuerdo a los datos obtenidos es una linea recta con pendiente negativa, lo que indica esto es que
no hay una relacion proporcional entre la velocidad de reaccion y la concentracion de sustrato, ya
que mientras la concentracion de sustrato aumenta en cada tubo, la velocidad inicial
correspondiente a la pendiente de cada gráfica disminuye.

Estos resultados indican a modo de hipotesis que la enzima se esta saturando y hay sustrato en
exceso, por lo que la actividad enzimatica no es muy eficiente y no se esta aumentando la velocidad
de la reacción, en este sentido no se puede obtener un valor de velocidad maxima porque no hay
asíntota, ademas de esto, “Michaelis- menten plantearon que la velocidad guarda una relacion lineal
con la cantidad de enzima presente” (Bohinski, 1991, p.184), esto explica porque en los tubos 1 y 2
donde el volumen de extracto enzimatico es muy cercano al volumen del sustrato los valores de
concentracion de sustrato y velocidad inicial son proporcionales (esto puede verse en la tabla 2) y
en los tubos 5 y 6 estos distan mucho el uno del otro, a parte de que en este ultimo el valor de la
velocidad inicial es negativo, lo que quiere decir que la enzima practicamente estuvo inactiva porque
habia mucho sustrato. No obstante, vale señalar con base en lo obtenido y en lo planteado
anteriormente que si hubo una relacion lineal, tan solo que no fue ascendente, es decir no hubo un
incremento lineal, porque a medida que se aumentaba la concentracion de sustrato, no habia
suficiente enzima para actuar por lo que disminuia la velocidad de la reaccion en lugar de aumentar,
hay que tener en cuenta tambien que la velocidad inicial se mide en las primeras etapas de la
reaccion. Cabe destacar tambien que la grafica resultante se parece más a la de Eudie- Hofstee (V
vs V/[S]).

En cuanto a la grafica de los inversos de Lineweaver-Burk, tenemos que la tendencia fue una linea
recta lo cual es correcto para esta representacion, sin embargo, tambien la pendiente fue negativa,
lo cual es congruente con lo obtenido en la grafica anterior, ya que esta representacion se hizo con
lo calculado en los inversos de la concentracion de sustrato y la velocidad inicial, con esta grafica se
hallaron los valores de Km y Vmax, “los cuales son constantes cineticas que reflejan la accion de una
enzima, de modo que constituyen la base para comprender como funciona la enzima” (Bohinski,
1991, p. 189). El km en este sentido nos indica que la afinidad de la enzima por el sustrato y la
velocidad maxima se obtiene cuando toda la enzima se encuentra unida al sustrato.
De esta manera, el Km obtenido fue -0,00283 y la Vmáx fue de 0,000147, valores muy bajitos, hay
que tomar en cuenta, ademas que el km es negativo, esto nos esta indicando que no hubo mucha
eficiencia en la actividad enzimatica.

Aunque no se pudieron obtener los resultados esperados, si podemos decir basado en lo que esta
construido teoricamente que de los dos metodos, el de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk el mas
apropiado es este ultimo, ya que a traves del reordenamiento algebraico que este hace de la
ecuacion de Michaelis-Menten se puede obtener una grafica lineal, lo que permite tener mayor
confianzaal asignar valores a Km y Vmáx a partir de la pendiente y los puntos de interseccion, sin
embargo el mejor metodo es el de Eudie-Hofstee aunque aquí no se trabajó

Por último, tenemos que las posibles causas de error que contribuyeron a la consecucion de estos
resultados se debieron posiblemente al fotocolorimetro, ya que este estaba sin estrenar en el
momento de la medicion, puede ser que no haya estado bien calibrado, tambien puede deberse a
la concentracion inicial del sustrato, a la cantidad de extracto enzimatico utilizado, al tiempo, tal vez
hubiese sido necesario mas tiempo para las mediciones, otra posible causa pudo haber sido una
incorrecta medicion de las sustancias que contenian los tubos o talvez incluso a la naturaleza del
sustrato que no era muy afin con la enzima.

Tomando en cuenta que la absorbancia a traves del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la
reaccion en terminos de la cantidad de la L-metildopa que va reaccionando o de la cantidad de L-
metildopacromo que se va formando

idad presentada a bajas [S] incrementa mucho el error o hace imposible la

medida. En el caso de una enzima que posea una Km para el sustrato muy baja
con una alta actividad específica, va a ser muy difícil mantener las condiciones
iniciales al medir actividad, dado que cuando se mida actividad con [S]
menores a la Km, se partirá de una concentración baja que irá disminuyendo a
medida que pase el tiempo. Al no ser la actividad constante se pierden las
condiciones iniciales y el análisis según Michaelis y Menten no puede
realizarse.