2.1.5.

Alcaloides del tarwi

El contenido de alcaloide del tarwi (Lupinus mutabilis), representa uno de los

problemas para la obtención y rendimiento de concentrados y aislados proteicos, por

ello es necesario realizar una buena elección del método de desamargado para

minimizar las pérdidas de proteínas y demás componentes.

El grano de tarwi crudo es amargo (alto contenido de lupinina, lupanidina,

esparteína y otros), por lo tanto es inconsumible, no es apetecido por aves, rumiantes

ni insectos; por ello para consumir los granos de tarwi, el primer paso es el

desamargado (Mujica y Sven, 2006).

Es natural la presencia de alcaloides en el tarwi, son tóxicos y dan un sabor

amargo a la semilla, es la razón por la que se ha priorizado el desarrollo de un proceso

de desamargado en muchas investigaciones. Un análisis bastante completo de

alcaloides de tarwi ha sido realizado por Hatzold (1981), Citado por Tapia et al.,

(2006), el cual muestra gran variedad de alcaloides presentes según la variedad

estudiado de lupino, destacándose la presencia de lipinina como el alcaloide más

común.

El contenido de alcaloides en el tarwi varía de 0,02 a 4,45% y en el follaje de

0,1 a 0,4%; los alcaloides reportados son los quinolizidinicos tales como: lupina,

esparteína, 13- hidroxilupanina, 4-hidroxilupanina, isolupanina entre otros. Entre

todos los indicados, los que se representan en mayor proporción son las lupininas (27-

74%), estos alcaloides quinolizidinicos amargos en la semilla del tarwi son sustancias

antinutritivas, que hasta el momento han sido mayor obstáculo para su utilización en
la alimentación humana y animal, se reporta que las variedades mejoradas

denominadas dulces tienen un contenido de alcaloides menor al 1,16% (Mori et al.,

2008).

Cuadro 07: Nombres de los principales alcaloides del lupino, formulación química y
fuente de origen.

Formula
Nombre Fuentes
química
Anagirina C15H20N2O Baptisia sp., Cytisus sp., Sophora sp.y Lupinus sp.
Citisina C15H14N2O Baptisia sp., Cytisus sp., Sophora sp., Lupinus sp.
Lupanina C15H24N2O Cytisus sp., Lupinus sp., Posalyria sp.
Lupinina C10H19NO Anabasis sp., Lupinus sp.
Esparteina C15H16NO Ammothamus sp., Baptisia sp., Cytisus sp.,
Lupinus sp., Retama sp.
Fuente: Fundación Chile, (1978) Citado por Acuña, (2001).

Mediante el mejoramiento genético se han obtenido lupinos denominados

dulces, que corresponden a aquellos en que el contenido de alcaloides es menor a

0,05%; los tipos amargos presentan de 1 a 4% de alcaloides. Los alcaloides como

grupo son tóxicos, pero individualmente se les ha encontrado aplicaciones en el

campo de la veterinaria y en la preparación de insecticidas para uso doméstico y

agrícola. Caracteriza fundamentalmente al grupo de los alcaloides del lupino el anillo

estructural denominado quinolizidina (Acuña, 2001).

Cuadro 08: Contenido de alcaloides en lupinos dulces y amargos (%).

Especie Tipo Mínimo Máximo Promedio
Lupinus Luteus Amargo 0,350 1,550 0,896
Dulce 0,000 0,090 0,045
Lupinus Albus Amargo 0,350 3,250 1,668
Dulce 0,001 0,061 0,030
Lupinus Angostifolius Amargo 0,250 2,050 1,150
Dulce 0,001 0,100 0,055
 Fuente: Laboratorio de Bioingeniería-Universidad de Concepción. Citado por
(Acuña, 2001).

Además de los alcaloides existen en muchas leguminosas otros componentes

tóxicos o llamados principios antinutritivos, como los inhibidores de proteasas y el

ácido prúsico (HCN). Sin embargo, no se han encontrado presentes en cantidades

significativas en el tarwi, o son eliminados en el proceso de desamargado. Se

considera que un contenido de 0,02% de alcaloides remanentes después del

desamargado es el límite que se puede aceptar como seguro para el consumo humano

sin ningún riesgo. Por otro lado el sentido del gusto humano puede identificar una

concentración de 0,1% de sabor amargo en la semilla, lo que evita el consumo y

protege de una posible intoxicación. Las cantidades que quedan después del

desamargado son eliminadas por heces y orina. En diferentes ensayos se ha probado

que aún después de un consumo prolongado por 4 semanas, no se observaron efectos

nocivos en animales de experimentación (Tapia et al., 2006).

Cuadro 09: Dosis mínima letal (DML) para los alcaloides de lupino multolupa sin
tratar, 0,07% de alcaloides.

DML (mg de Lupino

Grupo Peso corporal (kg)
alcaloides) diario (kg)

Adulto 60 18 750
Niño 24 7,2 300
Niña 12 3,6 150
Fuente: Hebbel, (1952). Citado por Acuña, (2001).

Las plantas sintetizan metabolitos secundarios que usan como defensa contra

el ataque de plagas y animales, los alcaloides cumplen esa función protectora, por otro

lado es posible su utilización con fines más específicos, tales como un agente
conservador o inhibidor. La acción antifúngica del extracto de lupinus mexicanus

(Variedad muy similar a lupinus mutabilis) está comprobado, puesto que es capaz de

inhibir significativamente el crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos

Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum (Zamora, 2007).

2.1.5.1. Métodos de deslupinización

Existen varios métodos de deslupinizado, cada una difiere en cuanto a sus

resultados en base el contenido de alcaloide residual, para el control del proceso de

desamargado, se presta sobre todo el método de determinación de los alcaloides

totales por titulación o por fotometría. Si se requiere la separación de los alcaloides, se

recomienda la cromatografía, en ocasiones se utiliza acido tricloroacético al 5 % para

el análisis (Zamora, 2007). Los principales métodos aplicados para el desamargado

del tarwi son:

A. Deslupinizado tradicional

Comprende una extracción con agua, haciéndolo hervir durante una hora

aproximadamente, colocándolo luego en bolsas de tela permeable y dejándolo en agua

corriente (río) por hasta 10 días. Con este método se pierde un 45% de la materia seca

de las semillas lo que incluye un alto porcentaje de proteína, hidratos de carbono y

aceite (Tapia et al., 2005). Por otro lado difiere significativamente con los métodos

propuestos por otros investigadores, quienes afirman llegar a un mejor deslupinizado

realizando una selección del grano por tamaño, remojar el grano durante un día en

agua, cocer el grano en agua durante una hora, colocar en un recipiente apropiado

(costalillo o canasta) y poner en agua corriente durante 45 días. Para estimar

manualmente el contenido de alcaloide se acostumbra probar el grano, si ya no es

percibido el sabor amargo, es posible suponer que ya está listo para ser consumido

(Mujica y Sven, 2006).

B. Extracción por medio de alcohol

Se utiliza metanol, etanol e isopropanol a escala de laboratorio para el

deslupinizado. Y a nivel de planta piloto se utiliza las mezclas etanol-agua (1:3). De

los métodos empleados para este fin, se puede concluir que el método tradicional de

desamargado con agua es el más eficiente en cuanto a eliminación de alcaloides y el

único que se acerca al límite de 0,02%. El problema de la contaminación del agua

puede ser solucionado en parte, desamargando en pozas y utilizando el concentrado

de alcaloides para baños sanitarios del ganado y elaboración de piojicidas.

Cuadro 10: Evaluación de los métodos para el desamargado del tarwi

Aspectos Agua Etanol-agua
Grado de dificultad tecnológica Bajo Mediano
Recuperación de sustancias solubles Muy complicado Algo complicado
Gastos de inversión Bajos Medianos
Contaminación Alta Baja
Aplicación Escala reducida Gran escala
Consumo humano Consumo humano
Contenido de alcaloides en producto
procesado 0,02% 0,27%
Fuente: (Bacigalupo y Tapia. 2005).

Para la deslupinización es requisito la hidratación, la cual se inicia de 3 a 4

horas después del remojo y se tiene la máxima absorción de agua a las 21 horas

incrementándose en 240% el peso inicial de la semilla, Posteriormente se procede a la

cocción en olla de presión (Bacigalupo y Tapia, 2005). Se ha probado el tiempo de

cocción, el uso de aditivos como sal, ceniza de horno y cal, para acelerar el proceso de

desamargado, se ha evaluado además la pérdida de nutrientes en cada uno de los

procesos. Experimentalmente se comprobó que con dos períodos de cocción de 40

minutos cada uno y con un cambio de agua se reduce notablemente el porcentaje de

alcaloides.

En el método llamado “Proceso Cusco”, la semilla remojada se somete a un

proceso de cocción en olla de presión con agua. La pérdida de nutrientes en este

proceso aún se puede disminuir, sin embargo, ya es 50% menor que en el proceso

tradicional; siendo la pérdida de proteínas 16,8%. La cocción puede efectuarse

también en hornos sencillos, usando los tallos y ramas de las plantas secas de tarwi

como combustible (Bacigalupo y Tapia. 2005).

Cuadro 11: Pérdidas de alcaloides y nutrientes en los diferentes procesos con uso de
coadyuvantes del “Proceso Cusco”, expresados en porcentajes en base seca.

Proceso Hidratación Cocción 1 Cocción 2 Lavado

Testigo(Solo agua)
Materia seca 3,56 10,97 18,17 22,97
Proteína 1,54 9,14 13,82 16,78
Aceite 1,01 1,84 4,96 11,83
Alcaloides 13,71 66,14 83,16 99,89
Con sal
Materia seca 3,56 12,71 18,75 23,24
Proteína 1,54 8,89 12,82 17,86
Aceite 1,01 2,5 4,57 9,78
Alcaloides 13,71 66,37 84,44 99,94
Con ceniza
Materia seca 3,56 12,14 19,38 24,25
Proteína 1,54 10,25 14,59 18,91
Aceite 1,01 3,17 3,9 11,31
 Alcaloides 13,71 60,85 80,96 99,81
Con cal
Materia seca 3,56 13,83 22,27 28,64
Proteína 1,54 13,91 20,12 24,73
Aceite 1,01 4,53 7,26 11,7
Alcaloides 13,71 72,63 80,36 99,75
Fuente: Bacigalupo y Tapia. (2005).

Evidentemente en el cuadro anterior se aprecia que el proceso de desamargado

en la que hay menor pérdida de proteína hasta la operación de lavado, es el proceso

sin uso de coadyuvantes como la sal, ceniza y cal. Además de ello se logra menor

contenido de alcaloide residual.

Por otro lado, Mori et al., (2008), desarrollaron otro método de desamargado

mediante la extracción sólido- líquido utilizando agua a diversos pH (4,5 y 7,5, siendo

adecuado un pH de 4,5) como solvente en proporciones mayores a 1:35 empleando

tiempos de remojo mayor de 24 horas. Así mismo, el tarwi desamargado obtenido

presenta un análisis proximal expresado en base seca de: humedad 12,02 %; cenizas

2,78 %; materia grasa 27,35 %; proteínas 58,48 %; fibra 5,13 %; carbohidratos 10,71

%, alcaloides 0,037%. Con este método se reduce significativamente las pérdidas de

proteína (44,38% inicialmente y 27,35 luego del deslupinizado), sin embargo, en

cuanto a costos del proceso es relativamente alto según a la cantidad de lupino a

procesar.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

La determinación de los componentes de la materia prima, se realizaron en

base a las normas AOAC 1998 16th edition 4th revisión (Asociación de análisis
químico), en algunos casos se han realizado algunas modificaciones según lo

requerido. En las cuales se mencionan los procedimientos a seguir según el

componente a ser determinado. Para más detalles véase el Apéndice I (métodos de

análisis).

A. Determinación de humedad

Método de la AOAC. 925.10, basada en la pérdida de peso que sufre la muestra por

calentamiento hasta obtener peso constante.

La fórmula para el cálculo es:

En la que:
M = Peso inicial en gramos de la muestra. m =
Peso en gramos del producto seco.

B. Determinación de Grasa

Método de la AOAC. 945.16, Extracción de la grasa con un solvente orgánico (Éter

de petróleo) en un equipo Soxhlet.

En la que:
P1 = Peso en gramos del matraz con el extracto etéreo.
P2 = Peso en gramos del matraz vacío.
P = Peso en gramos de la muestra empleada.

C. Determinación de proteínas

La metodología empleada fue el método indirecto, El cual consiste en la

destrucción orgánica por acción del acido sulfúrico, obteniéndose como resultado
sulfato de amonio, el cual después es destilado a amoniaco. Los cálculos se realizan

en base a un patrón (muestra en blanco) y se cuantifica la diferencia gastada de

titulante en la muestra (Referencia método AOAC. 960.52- Micro-

Kjeldahl). La fórmula utilizada fue:

. . , . .
Donde: Gb: Gasto

en la muestra en blanco G: Gasto en la

muestra analizada f: Factor de conversión

(6,25)

N: Normalidad del hidróxido de titulación

D. Determinación de ceniza

Método de la AOAC 923.03, incineración de la muestra a 600 ºC para quemar todo el

material orgánico, al material inorgánico no destruido se le llama ceniza.

En la que:

P = Peso en g de la cápsula con la muestra.

P1 = Peso en g de la cápsula con las cenizas.

P2 = Peso en g de la cápsula vacía.

E. Determinación de fibra

Se aplico el método de la AOAC. 962.09, consistente en la determinación del

remanente luego de la eliminación de los carbohidratos solubles por hidrólisis a

compuestos más simples (azucares) mediante la acción de los ácidos y álcalis débiles

en caliente.
Siendo:
P= Peso inicial de la muestra.

P1 = Peso del crisol conteniendo la muestra desecada.

P2 = Peso del crisol conteniendo la muestra calcinada.

F. Determinación de Carbohidratos

La determinación de carbohidratos (C) fue obtenida por diferencia entre los demás

componentes mediante la siguiente fórmula:

C=100-(Proteína + Grasa +Ceniza +Fibra +Agua), todos los componentes expresados

en %. Sin embargo cabe recomendar el uso de métodos analíticos para su

cuantificación.

3.5. DESLUPINIZACIÓN Y OBTENCIÓN DE HARINA

3.5.1. Deslupinización

Uno de los principales problemas que afronta el consumo del tarwi es la

presencia de alcaloides que le da ese sabor amargo. Los alcaloides pueden ser tóxicos

cuando es ingerido en exceso, por ello es de vital importancia realizar un

desamargado para eliminar éstos componentes (Tapia et al., 2006).

La eliminación de estas sustancias es de vital importancia, pues caso contrario

el producto que se pretende obtener tendría contenidos de alcaloide, el cual es

considerado toxico a niveles altos para consumo humano. El método empleado para
esta operación fue los procedimientos de deslupinizado propuestos por Mujica y

Sven, (2006). Consistente en la aplicación del método denominado “Cusco Mejorado”

con modificaciones mínimas, con este método se logra las menores perdidas de

proteína. El diagrama de flujo comprende las siguientes operaciones:

Materia Prima Remojo Cocción Lavado-Extracción

1 día 1 hora en ebullición 5 días en agua Figura 11:

Diagrama de flujo de deslupinizado del tarwi.

3.5.1.1. Descripción del proceso de deslupinizado

Remojo: El tarwi muestreado, se procedió a remojar en agua por un periodo de 1 día,

con la finalidad de ablandar la estructura del grano y facilitar la transferencia de calor

en la cocción.

Cocción: En esta parte los granos de tarwi fueron sometidos a ebullición, por un

periodo de tiempo de 1 hora (60 minutos), tal como se recomienda. Esta operación

permite la ruptura de las estructuras facilitando la difusión de los alcaloides por la

desnaturalización parcial de las proteínas (rotura de las estructuras complejas de la

proteína) a las que están unidas.

Lavado: Una vez ya coccionado los granos de tarwi se procedió a lavarlos en un

tanque con sustituciones sucesivas de agua, esto fue realizado por un periodo de 5

días, esto en función al amargor.

3.5.2. Secado
 Comprende la deshidratación del tarwi desamargado, para su posterior

transformación en harina, la cual es la materia prima para la extracción de las

proteínas en medio alcalino. La deshidratación se realizó en un secador de bandejas

hasta una humedad próximo al 10% que permita la obtención de harina.

3.5.3. Molienda

Posteriormente se procedió a la molienda, utilizando un molino de martillos,

cuya finalidad es facilitar el proceso de extracción proteica y separación de

componentes no proteicos, por tanto incrementar el contenido de proteínas. La harina

obtenida ingresó posteriormente a la etapa de desgrasado.

3.5.4. Desgrasado

Para la extracción alcalina es necesario que el producto a solubilizar tenga bajo

contenido de grasas, motivo por el cual esta etapa comprende el desgrasado. La

operación inició inmediatamente una vez desamargado, secado y realizado la

molienda, la harina se disolvió con una solución de etanol al 95% en una relación de

harina: solución de 1:3 con tres extracciones consecutivos durante 5 horas cada una,

finalmente la harina semi-desgrasada se volvió a moler según sea necesario. Aun que

es recomendable utilizar una prensa para extraer el aceite del tarwi inmediatamente

después del desamargado, con la finalidad de reducir costos y posibles alteraciones

químicas.

3.5.5. Análisis proximal de la harina de tarwi

 El análisis proximal, se ha realizado según los métodos de la AOAC, tal como

se ha realizado en el análisis proximal de la materia prima (Ver el punto de métodos

de análisis 3.4).

3.6. OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACIÓN ALCALINA

La optimización consta de tres etapas, los cuales comprende el Screening

(eliminación de las variables poco significativas), escalamiento (consistente en el

acercamiento hacia la región optima) y finalmente la optimización final (obtención de

la región óptima y los puntos óptimos), (Ayala y Pardo, 1995).

Una de las técnicas más eficientes para la optimización de procesos es la

Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), la cual tiene como objetivo principal

determinar las condiciones de operación óptima para un sistema, o determinar la

región del espacio de los factores en la que se satisfacen las condiciones de operación

(Dreyer, Coello y Montiel, 2000). Para este fin se siguió los procedimientos de

optimización.

3.6.1. SCREENING

El criterio de optimización usado fue maximizar el porcentaje de proteínas en

la etapa de extracción alcalina. En esta etapa se identificaron las variables que son

significativas en la solubilidad proteica y el tenor proteico del aislado proteico, para

luego seleccionar dos niveles por cada factor y someter a optimización mediante

superficie de respuestas (Diseño compuesto central).

Se ha priorizado el estudio de los efectos individuales de los factores

estudiados bajo el diseño completo al azar, se evaluó varios niveles por cada factor
con las que se busca comprender su comportamiento para posteriormente evaluar las

interacciones mediante un diseño factorial. El método aplicado fue tal como propone

Guerreo (1986), Citado por Ventura et al., (2005). Dichas operaciones se muestran en

el diagrama de flujo de la figura 12. La determinación la proteína solubilizada en base

a los parámetros evaluados, se ha realizado en base a la metodología de la AOAC.

960.52, Micro- Kjeldahl.

pH de extracción (PE): Debido a que la solubilización de proteínas es superior

a pH alcalino (Linden y Lorient, 1996), se ajustó el pH de la solución según lo

recomendado por Guerrero (1989) a valores de 3, 5, 7, 9 y 11 con HCl 0,1N y NaOH

0,1N según lo requerido. Se mantuvieron constantes la relación harina: solvente

(1:20); temperatura 50 °C (Cheftel et al., 1989), para ello se ha empleado un equipo

de baño maría y se agitó continuamente la solución durante 30 minutos, según lo

recomendado por Mustakas y Sohns (1976), quienes señalan que en este intervalo de

tiempo el nitrógeno extraído aumenta constantemente. Luego la solución se centrifugó

a 4000 rpm durante 20 min, el nitrógeno solubilizado fue determinado por el método

micro-Kjeldahl, tomando alícuotas de 2 mL del sobrenadante (por triplicado). Se

elaboró una curva con los datos obtenidos, relacionando la cantidad de nitrógeno

extraído, expresado como % de solubilidad en función del pH. El pH que permitió la

mayor solubilidad de proteínas se uso para el proceso de optimización, sin embargo el

uso de altos pHs pueden afectar las propiedades funcionales de las proteínas, incluso

la estructura misma imposibilitando la renaturalización proteica (Linden y Lorient,

1996).
 Relación harina y solvente (CH): Se trabajó con el pH definido en la sección

anterior (pH=9), temperatura de 50°C y un tiempo de extracción de 30 min. Las

relaciones harina: solvente analizadas fueron: 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 y 1:35 según lo

recomendado por Guerrero (1989); Ventura et al., (2005).

Temperatura de extracción (TE): Para determinar el efecto de la temperatura

sobre la cantidad de proteína extraída, se trabajó según lo recomendado por Guerrero

(1989); Ventura et al., (2005), con temperaturas de 20, 30, 40, 50 y 60 °C,

manteniéndose constante el pH de la solución del primer ensayo (pH=9), la relación

harina: solvente (determinada en el ensayo anterior, CH=1:30) y el tiempo de

extracción (30 minutos).

Todas las soluciones fueron centrifugadas a 4000 rpm por 20 min. El

nitrógeno solubilizado fue determinado por el método micro-Kjeldahl, tomándose

alícuotas de 2 mL del sobrenadante (por triplicado), expresándose como % de

solubilidad (Ventura et al., 2005). Los dos niveles de los factores que permitieron la

mayor solubilidad fueron seleccionadas para el diseño factorial (2k) de la primera

etapa de optimización.

3.6.2. ESCALAMIENTO

Mediante la determinación de la significancia de la curvatura en la etapa de

Screening se evaluó si se requiere realizar la etapa de escalamiento, que consiste en

escalar sucesivamente hacia la región óptima (mediante pendientes ascendentes),

hasta llegar a ubicar el rango de niveles que encierra dicha región (Ayala y Pardo,

1995).
3.6.3. OPTIMIZACIÓN FINAL

El arreglo del experimento bajo el diseño compuesto central rotable, fue

generado en STATISTICA V 8.0 tomando dos niveles (inferior y superior) por cada

factor seleccionado en la etapa de Screening. Este tipo de experimento para

optimización empieza con un diseño factorial estándar con dos niveles y se agrega dos

corridas adicionales para cada factor. Las corridas adicionales, llamadas puntos

estrella, son localizadas en distancias pequeñas iguales por debajo y encima del punto

central, esto permite la estimación de la curvatura con respecto a tal factor. Mientras

cada factor se empieza variándose, los otros factores son fijados en sus valores

centrales (Ayala y pardo, 1995). Dicho arreglo fue aleatorizado con la finalidad de

reducir el efecto de variables ocultas como tendencias sobre el tiempo entre otros y

garantizar la validez estadística de los resultados, considerando una probabilidad de

error tipo I de 0,05 (Muñoz, Camargo y Gallego, 2008). El diseño tiene las

características de ser rotable ya que la varianza de la respuesta predicha en cualquier

punto depende solo de la distancia del punto al centro del diseño y no de la dirección,

teniendo la misma precisión de estimación en todas las direcciones (Fernández y

Piñeiro, 2002).

El arreglo de experimentos generados por el programa, representa la secuencia

de experimentos a ejecutar bajo los valores mostrados. El número de corridas se ha

calculado con la siguiente fórmula:

N = 2 + 2k + n0
Donde: k es numero de factores, n0 número de puntos centrales y N es el número de

corridas.

k
Un diseño compuesto central consta de puntos factoriales 2 completo o

fraccional, en el que los niveles están en forma codificada (±1) o en forma natural

(tomando el nivel inferior y superior del factor); n0 ( ≥ 1) puntos centrales (que son

necesarios para hallar la variancia del error experimental) y los puntos axiales, dos

puntos axiales en los ejes correspondientes a cada uno de los factores,

k situados a una distancia α=±(2 )1/4 del centro del

diseño, el cual es importante para asegurar la rotabilidad de diseño y mostrar la
superficie de respuestas (Fernández y Piñeiro, 2002; Montgomery, 2005).

La optimización por el diseño compuesto central permite la obtención de un

modelo matemático empírico que explica el fenómeno, dicho modelo depende de los

valores estadísticos que demuestren la linealidad o la curvatura.

Un modelo de primer orden (Lineal) sin interacciones o productos cruzados:

=+ +

El modelo lineal de primer orden con interacciones:

=+ + +

Y el modelo cuadrático o de segundo orden:

=+ + + +
 Donde representa el ruido o error observado en la respuesta. Esta ecuación

explica en gran medida el fenómeno que ocurre, se incorpora un parámetro de

curvatura y interacciones entre las variables, por lo que la predicción es más cercana

al dato real (Muñoz, Camargo y Gallego, 2008).

En la mayoría de los casos la forma de la relación entre la respuesta y las

variables independientes se desconoce. Por ello, el primer paso en la MSR consiste en

determinar una aproximación apropiada a la relación funcional real entre la respuesta

y el conjunto de variables independientes, guiando al experimentador rápida y

eficientemente a la cercanía del punto óptimo; hasta finalmente localizarlo

(Montgomery, 2005).

La ventaja de este diseño es la evaluación de los efectos individuales y los

efectos combinados en la variable de respuesta, la réplica en los puntos centrales de

diseño permite evitar la linealidad, puesto que en los diseños factoriales no se cumple

tal linealidad perfecta y los modelos no se ajustan adecuadamente (Blanes et al., 2006;

Milde et al., 2009).

En todas las etapas de optimización, se ha utilizado el método Micro- Kjeldahl

para la determinación de la proteína solubilizada. Para expresarlo en relación al

contenido proteico total y la cantidad porcentual de proteína solubilizada se ha

utilizado la siguiente fórmula (Ferreyra et al., 2007).

3.7. OBTENCIÓN DEL AISLADO PROTEICO

 El aislado fue obtenido por el método estándar consistente en la solubilización

alcalina (bajo los parámetros óptimos de extracción alcalina) y precipitación

isoeléctrica mediante el ajuste de pH hasta el punto isoeléctrico (pH= 4,5 en el cual la

solubilidad proteica es mínima). En el punto isoeléctrico la carga eléctrica neta de las

proteínas es cero haciendo que la solubilidad proteica sea minimizada y genere la

precipitación (Linden y Lorient, 1996).

El procedimiento general para la obtención del aislado proteico se muestra

diagrama de flujo de la figura 12.

 Aislado proteico

Figura 12: Diagrama de flujo general para la obtención de aislado proteico

Adaptado de: Ventura et al., (2005).

Parámetros óptimos de extracción alcalina……tarwi. Tesis 2010.