PRÁCTICA N° 1

ESTUDIO DE BACTERIOFAGOS
MÉTODO DE AISLAMIENTO DE VIRUS
BACTERIANO

OBJETIVOS:
En esta práctica aprenderemos acerca de la importancia del estudio de
bacteriófagos

Además de detectar bacteriófagos específicos de Escherichia coli en una

muestra de agua residual.

MARCO TEÓRICO:
Los virus, como la mayoría de los parásitos, son muy específicos en relación con
los hospedadores que parasitan. Algunos virus son específicos de bacterias y se
denominan virus bacterianos, bacteriófagos o fagos. La mayoría de las bacterias
son susceptibles a ataque por bacteriófagos.

Un fago está constituido por un “cromosoma” de ácido nucleico (DNA o RNA)

rodeado por una cubierta de moléculas de proteína. Una serie de fagos bien
estudiados son los que se conocen como T1, T2, etc., pertenecientes a la serie
denominada fagos T-par (T2, T4, etc.). Durante la infección el fago se adsorbe a
una bacteria e inyecta su material genético dentro del citoplasma. La información
genética del fago pasa entonces a controlar la maquinaria de la célula bacteriana
desconectando la síntesis de la bacteria hacia la fabricación de componentes del
fago.

Finalmente, se liberan muchas partículas nuevas de fagos cuando la pared de la

célula bacteriana se rompe. Este proceso de rotura se denomina lisis. Tras la lisis,
los fagos descendientes infectan a las células vecinas. Este fenómeno produce un
incremento exponencial en el número de células lisadas
Los bacteriófagos son los entes más abundantes de la biosfera, y se ha estimado
que existen 1010 fagos por cada litro de agua de mar, lo que representa un
excelente mecanismo de control de las bacterias marinas, ya que se produce un
equilibrio entre las bacterias que se multiplican y los fagos que destruyen una parte
de esa población bacteriana.

El organismo humano, está acostumbrado al contacto con los fagos ya que son
consumidos regularmente en los alimentos, son colonizadores habituales del
intestino humano y son muy abundantes en el medio ambiente (casi 108 millones
por cm3). De aquí que no resulte extraño que los fagos no produzcan graves efectos
inmunológicos sobre los animales. Desde el descubrimiento de los fagos por
D'Herelle y Twort (d’Herelle, 1917; Twort, 1915) hasta los años 40 del pasado siglo,
estos organismos se usaron, en muchas ocasiones con éxito, para combatir
diversas enfermedades infecciosas.

Filtrado de fago. Tomamos 5 ml de la muestra de aguas residuales y la

metemos en un tubo centrífugo a 3000×20 min. Transcurrido este tiempo
encontraremos en el sobrenadante las partículas víricas. A partir éste es de
donde tomamos la muestra para analizar.

EXPERIMENTO - RESULTADOS

Bacteriofago
Observación de lisis
generada por los
bacteriófagos obtenidos a
partir de aguas residuales
en medio de cultivo de E.
coli .
CONCLUSIONES
La utilización de cloruro de calcio (1.5%) permitió la permeabilidad de la E.
coli y así el bacteriófago pueda ingresar de manera más rápida y fácil a la
batería.

En esta presenta practica observamos que si bien es cierto se verifico la lisis

de la cepa utilizada, esta no fue del todo específica para la E. coli, esto se
puede deber a que el bacteriófago en estudio no era 100% específico para la
bacteria o también que pudo haber una probable contaminación de la
muestra.
 PRÁCTICA N° 2

LECTURA DE LAS PLACAS CON

BACTERIOFAGO. INOCULACIÓN DE
HUEVOS EMBIONADOS

OBJETIVOS:
En esta práctica se pretende conocer y aplicar correctamente los métodos
adecuados para realizar inoculaciones de virus en embriones aviares.

Aprender acerca de la importancia de la inoculación de virus pues nos

permitirá la realización de vacunas específicas para determinados virus.

MARCO TEÓRICO:
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente,
se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana
corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La
infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a
menudo, es característico del virus.

El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus
problema.

Entre los lugares de inoculación tenemos:

 Membrana Corioalantoidea:
Se emplean embriones de 10 – 12 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml.
Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de
laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan
focos o pústulas fácilmente visibles.

 Cavidad Alantoidea:
Se emplean embriones de 9 – 12 días y la cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml.
Entre los virus que desarrollan en el endodermo alantoideo tenemos: peste, New
 Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental
Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la inoculación y toma de muestra

 Cavidad Amniótica:
Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad
de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.

 Saco Vitelino:
Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2 – 1
ml. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades
venéreas, neumonía y rickettsias. El vitelo es empleado para la preparación de vacunas y
como antígeno para reacciones serológicas de los virus ya mencionados.

 Vía Intravenosa:
La membrana corialantoidea está irrigada por vasos sanguíneos, es susceptible de
inoculación para casos especiales, virus que ocasionan cambios hematológicos; por
ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad de
inóculo es de 0.02 -0.05 ml.

 Vía Intracerebral (embrión):

Se emplea embriones de 8 – 14 días, específicamente para virus que producen alteraciones
cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 – 0.02 ml

EXPERIMENTO

1. VIA ALANTOIDEA

PROCEDIMIENTO:
 Observar en el ovoscopio si el huevo es fértil o infértil.
 Encontrar el ojo del embrión. Marcar el embrión.
 Localizar la cámara de aire y marcarla. Colocar el huevo con posición vertical
y con unas pinzas hacer un orificio en posición directa del embrión.
 Limpiar la cáscara (con una torunda de alcohol yodado, todo, sobre todo, la
parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol).
 Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el
borde (en relación al eje longitudinal del huevo y alejado del embrión), en
zona libre de vascularización
 Inoculamos 0,1 ml de la muestra.

2. VIA AMNIOTICA

PRODECIMIENTO:

Observar en el ovoscopio si el huevo es fértil o infértil.

Encontrar el ojo del embrión. Marcar el embrión.
Localizar la cámara de aire y marcarla. Colocar el huevo con posición vertical
y con unas pinzas hacer un orificio en posición directa del embrión.
 Limpiar la cáscara (con una torunda de alcohol yodado, todo, sobre todo la
parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol).
Con aguja N° 22 perforar en el centro de la cámara de aire.
Inoculamos 0,1 ml de la muestra en la cámara amniótica.

Posterior a la inoculación del colorante, con unas pinzas se retira delicadamente

una parte de la cáscara y se vierte el contenido en una placa Petri.
RESULTADOSS

VIA ALANTOIDEA

Se observa como el
colorante invadió la cavidad
alantoidea
 VIA AMNIOTICA

Se observa como el
colorante invadió la cavidad
amniótica.

CONCLUSIONES
Esta práctica nos permitió aprender la manera más adecuada para la
inoculación de virus en diferentes cámaras en los huevos embrionados.

Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por
consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus
crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la
parotiditis prefiere la cavidad alantoidea.
 PRÁCTICA N° 3

OBSERVACIÓN DE LÁMINAS CON

EFECTO CITOPÁTICO

OBJETIVOS:
En esta práctica se aprenderá acerca del efecto citopatico (dañino) que tiene un
sobre las células de un determinado tejido.

MARCO TEÓRICO:
EFECTO CITOPATICO: Se conoce como efecto citopatico al aspecto macroscópico
e histológico del daño producido por un virus en un cultivo celular el cual es un
importante criterio de diagnóstico ya que muchos virus causan efectos citopaticos
característicos.

Entre los cambios citopaticos en la células se encuentran los siguientes:

DEGENERACION :Se refiere a todas las lesiones causadas por los virus en
el tejido afectado, este daño es causado por distintos factores como son la
síntesis de proteínas toxicas por parte del virus dentro de la célula o por la
acumulación de proteínas víricas que van a afectar la configuración original
de la célula; el virus al sintetizar sus proteínas impide que la célula sinteticé
sus proteínas estructurales lo que provoca la degeneración de esta hasta
llegar a la muerte.

CORPUSCULO : Un cambio característico de las células infectadas por virus

es la formación de cuerpos de inclusión identificables por microscopia óptica
con ayuda de tinciones . Dependiendo del virus estos cuerpos de inclusión
pueden ser simples o múltiples, grandes o pequeños, redondos o irregulares,
intranucleares o intracitoplasmáticos y acidofilos o basofilos; estos cuerpos
de inclusión son formados por acumulación de viriones o de componentes
virales como agregados cristalinos, es decir fábricas de virus donde los
componentes virales están siendo sintetizados; estos cuerpos de inclusión
 también pueden ser causados por agentes químicos y bacterias.
Ejemplo:(cuerpos de negri- virus de la rabia)

FUSION CELULAR : Es una característica de la infección de monocapas

celulares por paramixovirus, herpesvirus, coronavirus y poxvirus es la
formación de sincitios también llamados policariocitos o células gigantes,
esto se da por cambios en la membrana celular que determinan la fusión de
las células infectadas con las células vecinas no infectadas.

INCORPORACION DE ANTIGENOS A LA MEMBRANA PLASMÁTICA : En

muchas infecciones víricas se insertan proteínas codificadas por el virus en
la membrana plasmática de las células infectadas por virus RNA como por
ejemplo : influenza, paramixovirus y togavirus. Estas glicoproteinas víricas no
se insertan al azar en la membrana si no que indican el lugar en el que ha de
madurar el virus. Estos antigenos en la membrana constituyen la diana para
los mecanismos inmunitarios específicos del organismo los cuales pueden
destruir la célula antes de que se produzca un número significativo de nuevos
viriones.

MUERTE CELULAR : El evento terminal de muchas relaciones virus- célula

es la muerte celular causado por virus citocidas, la apariencia del daño
producido en los cultivos celulares es utilizado como criterio de diagnóstico;
la muerte celular puede ser causada por la suspensión de la síntesis del
ARN y de las proteínas del huésped lo que es incompatible con la vida de
este, otra causa puede ser el acumulo de proteínas virales toxicas para la
célula como las proteínas de la capside, las proteínas de viriones se
congregan en grandes cristales agregados o en inclusiones que distorsionan
a la célula, otra causa es que las células infectadas se hinchan bastante lo
que provoca cambios en la permeabilidad de la membrana, eventualmente
las enzimas de los lisosomas de la célula se derraman en el citoplasma
dando lugar a la digestión autolitica de la célula.

Los efectos citopáticos pueden ser utilizados para cuantificar partículas víricas
infecciosas mediante la ensayos de unidades formadoras de placas.

Las células se cultivan en una superficie plana hasta que forman una monocapa de
células cubriendo una botella o plato de plástico. Luego son infectadas con el virus.
El medio líquido de crecimiento es reemplazado por uno semi-sólido para que las
partículas víricas producto de la infección no puedan transportarse lejos de su sitio
de producción. Un placa se produce cuando una partícula vírica infecta una célula,
se replica y posteriormente provoca la muerte de dicha célula. Las células
adyancentes son infectadas por los virus recién producidos y también mueren. Este
proceso puede repetirse múltiples veces. Posteriormente las células son teñida con
una tinción que solo marca células vivas. Las células muertas en la placa no se tiñen
y aparecen áreas sin tinción en un fondo coloreado. Cada placa es resultad de la
infección de una célula por un virus seguido por la replicación y propagación de
dicho virus. Por otro lado, los virus que no provocan muerte celular no producen
placas.

EXPERIMENTO
Ensayo de placa. Diluciones seriadas de un virus que ha sido recubierto en cultivos
confluyentes de monocapas celulares. Las células se tiñen luego de un periodo de
tiempo en el que un único virus infecta una célula, produce nuevas partículas víricas
e infecta las células adyacentes. Las áreas blanquecinas muestran áreas del cultivo
en las que hay células muertas. Cada “placa” es resultado de la presencia de una
partícula vírica infecciosa original.

En la lámina se observa:

 Células cuya estructura está

bien definida.
 En la lámina podemos observar el
efecto citopático:

 Células redondeadas y
refringentes
 Han perdido su estructura
 Lisis celular

PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIÓN
COMO DIAGNOSTICO DE VIRUS
Estas pruebas se basan en la capacidad de algunos patógenos (p.ej. el virus de la
influenza) para causar la aglutinación de los eritrocitos. Pueden utilizarse para
detectar el patógeno (pruebas de hemaglutinación) o los anticuerpos dirigidos
contra las hemaglutininas del microorganismo (inhibición de la hemaglutinación).

Suelen ser pruebas específicas de serotipo o subtipo y bastante sensibles. Positivo

+. Inhibición de la o hemaglutinación. Las pruebas de hemaglutinación se utilizan
con patógenos que poseen esta capacidad, generalmente virus.

Hay virus que durante su multiplicación intracelular, expresan en la membrana de la

célula huésped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas,
glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de
glóbulos rojos de diferentes especies animales. De modo que si se agregan glóbulos
rojos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infección de esas
células a través de la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular.
El ejemplo más clásico es el diagnóstico de la influenza

CONCLUSIONES

Esta práctica nos permitió aprender acerca del efecto destructivo

producido por el efecto citopatico que tienen los virus.

Tambien nos permitió comprender acerca del método de aglutinación como

una prueba eficaz en el diagnóstico de algunos virus.
 PRÁCTICA N° 4

OBSERVACIÓN DE CORPÚSCULOS DE
NEGRI EN LÁMINAS COLOREADAS

OBJETIVOS:
Aprender acerca de los corpúsculos de Negri, que áreas de nuestro
organismo afectan y cómo implica eso en la salud humana.

Comprender de una mejor manera la prueba de ELISA, conocer el

fundamento y las fases en la realización de la técnica de ELISA, y cuáles son
las variantes de este método.

MARCO TEÓRICO:
Los corpúsculos o cuerpos de Negri constituyen incluciones especiales que se
encuentran en el citoplasma de las neuronas piramidales del sistema nervioso
central, especialmente en las asta de Ammon del hipocampo, y en el citoplasma de
las células de Purkinje del cerebelo de las personas infectadas por el virus de la
rabia.

Los corpúsculos de Negri son redondeados u ovales, poseen una membrana y

tienen una estructura apanalada, con vacuolas; son el producto de la acumulación
de proteínas ribonucleares producidas por el virus en las personas infectadas por
éste. Para demostrar su presencia basta el examen microscópico de una partícula
de cerebro macerada en ácido acético diluído, con el objetivo de inmersión. Se tiñen
bien con eosina y azul de metileno. Estos cuerpos anormales deben su nombre a
Adelchi Negri, científico italiano que los descubrió en 1903.

CORPUSCULOS DE NEGRI
 AGENTE CITOPATOGENICOS

Se deberá teñir con colorante citológico apropiado y examinar el área

total de la monocapa celular teñida, para evidenciar cuerpos de inclusión,
número total de células Gigantes u otra indicación de anormalidad celular,
atribuible a agentes extraños.

En láminas coloreadas de cultivos celulares infectados por virus

pueden ser visualizados los “corpúsculos de inclusión”, que en su
citoplasma o en su núcleo, coloreadas más intensamente en general
circundadas por un halo. Los corpúsculos de inclusión pueden ser acidó
filos(coloreados por eosina-rosa) o basófilos(coloreados por hematoxilina-
rojo o azul).

En general, si se localizan coloraciones de corpúsculos de inclusión

son característicos de determinados tipos de virus. Los corpúsculos de
inclusión que pueden ser visualizados en cortes histológicos de tejidos
infectados por virus provenientes de necropsias o biopsias.

A) Corpúsculo de inclusión de CitoMegalovirus.

B) Corpúsculo de inclusión de virus de la Rabia (Corpúsculos de
Negri): Descubiertos por Negri, Aldeschi (1876-1912) el cual fue un
médico italiano, que fue conocido por los corpúsculos que llevan su
nombre, los cuales son característicos en los animales que mueren
por la enfermedad de la Rabia, estos corpúsculos son inclusiones
en el protoplasma de células nerviosas de la corteza, cuerno de
Ammon y de los núcleos de los animales muertos de hidrofobia. Se
consideran característicos de esta enfermedad.
 MÉTODO DE ELISA COMO MÉTODO
PARA DIAGNOSTICO DE
ENFERMEDADES VIRALES

La técnica ELISA se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida
mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto,
por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene
muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su
realización, emplea reactivos económicos y mediante el uso de la fase sólida, consigue una
separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y
desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas
enzimáticas) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el
RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos
aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante
anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos,
etc.

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

 Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de
competición de antígeno.

 Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o

antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen
gran afinidad por proteínas.
  Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno
unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado
(ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario
anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la
amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada
anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una
mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de
antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de
competición del antígeno.

 Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos

las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el
sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica
(D.O.) mediante espectrofotometría.

TIPOS DE ENSAYO DE ELISA

han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución
(por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase
(idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el
antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la
solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo
tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia
del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se
encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular,
como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.
ELISA sándwich (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer
anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra
problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material
no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así
pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y
un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad
y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.