UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÌA
PRÁCTICA N°6

“Técnicas de Tinción

Grupo n°1

PARALELO 2

Integrantes:

 Santiago Achote
 Fátima Carvajal
 Gustavo Cubas
 Francisco González-Valerio
 Emerson Vizuete
Profesor: Ing. Pablo Araujo

Ayudante: Jessica Deleg

2018-2018
 RESUMEN

Determinación del tipo de microorganismo a través del uso de diferentes técnicas de tinción.
para lo cual se procedió a preparar las placas con los microorganismos tomados de cultivos
haciendo un frotis sobre la placa y se siguió un procedimiento específico para cada tipo de
tinción (negativa, diferencial y simple) usando los reactivos correspondientes en cada
proceso para posteriormente observarlos, obteniendo las placas con los microorganismos
tinturados según las clases de estos, con el fin de diferenciar lo tipos de microorganismos
presentes en los cultivos observados concluyendo que las técnicas de tinción permite
clasificar los organismos a través de la coloración final que poseen debido a la conformación
de su estructura celular.

PALABRAS CLAVE

TÉCNICAS_DE_TINCION / MICROORGANISMOS / ESTRUCTURA_CELULAR /

COLORACIÓN
1. OBJETIVOS
 Observar en el microscopio diferentes cultivos aplicando tinción.
 Aplicar diferentes técnicas de tinción.
 Determinar el tipo de microorganismos observados.
2. TEORÍA
2.1.Tinción.
La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una
superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. (Espinoza,
2014)

2.2.Frotis
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o
cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. (Reyes, 2015)

Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los
métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias
sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. (Reyes, 2015)
La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas
al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones
de células que pudiera haber. (Reyes, 2015)
2.3.Tipos de tinción.
2.3.1 Tinciones Simples
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del
mismo color. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para
que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser
observada. (Reyes, 2015)
2.3.2 Tinciones Diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial
consta de dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de
contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y, por tanto, revela) las células no teñidas por el
primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. (Reyes, 2015)
2.3.3. Tinciones Específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas. (Reyes, 2015)
2.4 Tinción Gram
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del
Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos,
bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM. (Danival,
2015)
Descrita en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el frotis fijado con calor
se tiñe 1 min con violeta cristal, se lava con agua, se cubre con solución yodada durante 1
min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y
cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. (Danival, 2015)
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. (Danival, 2015)
 Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)
 Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)
Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que las
gram – son muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.3. Material y Equipos
 Lámpara de alcohol
 Microscopio
 Porta y Cubre objetos.

3.4. Sustancias y reactivos

 Cultivos.
 Agua destilada H2O(ac)
 Tinta china
 Alcohol Cetona C3H6O(ac)
 Lugol I3-.(ac)
 Azul de metileno C16H18ClN3S(ac)
 Cristal violeta C24H28N3Cl(ac)
 Safranina C20H19N4+·Cl-(ac)
 Fucsina Fenica C20H20ClN(ac)
 Alcohol-Acido
 HCl

3.5. Procedimiento
3.5.3. Tinción negativa.
3.5.4. Se coloca en el portaobjetos una pequeña gota de tinta china, esta no debe sobrepasar
los 4 milímetros.
3.5.5. Se coloca el inóculo sobre la gota de tinta china.
3.5.6. Con otra placa de vidrio se realiza el frotis
3.5.7. Observar al microscopio.
3.5.8. Tinción simple.
3.5.9. Dependiendo del tipo de cultivo (sólido o líquido) se coloca los microorganismos en
la placa de observación.
3.5.10. Para medios líquidos
3.5.11. Se agita el tubo de muestra.
3.5.12. Se retira el tapon y se esteriliza con la lámpara de alcohol la boca del tubo al igual
que el asa de inoculación.
3.5.13. Se toma la muestra y se coloca en la placa delimitando un círculo en la mitad.
3.5.14. Para medios sólidos
3.5.15. Colocar una gota de agua en un extremo del portaobjetos
3.5.16. Con el asa bacteriológica estéril, tomar una pequeña cantidad de cultivo emulsionar
y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2, dejar secar al aire.
3.5.17. Una vez colocados los microorganismos se procede a colocar el tinte.
3.5.18. Se coloca el tinte (azul de metileno) por 1 minuto.
3.5.19. Se lava con agua el tinte, y el remanente en la placa se quita con cuidado con papel
absorbente.
3.5.20. Se observa al microscopio.
3.5.21. Tinción Gram
3.5.22. Se realiza el paso 3.3.10. dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.5.23. Se cubre la muestra con violeta de genciana o cristal violeta por 10 segundos.
3.5.24. Lavar por con agua destilada, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir para
eliminar el exceso de agua.
3.5.25. Se coloca la solución de yodo. (Gram´s Iodine). 10 segundos
3.5.26. Lavar por con agua destilada, remover el exceso de agua
3.5.27. Decolorar alcohol cetona 70% /30% por 5 segundos.
3.5.28. Lavar con agua
3.5.29. Cubrir con Safranina durante 10 segundos.
3.5.30. Lavar con agua remover el exceso de agua usando papel absorbente.
3.5.31. Dejar secar al aire
3.5.32. Observar al microscopio
3.5.33. Tinción Ácido resistente.
3.5.34. Se realiza el paso 3.3.10. dependiendo si el medio es sólido o líquido.
3.5.35. Colocar Fucsina fenica por 10 segundos, luego colocar al calor del mechero hasta que
se note la presencia de vapores blancos
3.5.36. Dejar reposar por 10 minutos.
3.5.37. Lavar con Alcohol ácido.
3.5.38. Colocar Azul de metileno.
3.5.39. Lavar con agua destilada.
3.5.40. Fijar y observar en 40x y 100x con aceite de inmersión.

4.1 Datos Experimentales.

Tabla 4.1-1
Observaciones de técnicas de Tinción

Técnica de Tinción Observación.

Tinción Negativa La muestra presentó una tinción de color negro debido
al colorante empleado (tinta china).

Tinción Simple La muestra de yogurt tuvo una coloración azul debido

a que utilizó azul de metileno como colorante.

Tinción Gram Los colorantes empleados fueron azul de metileno y

violeta de genciana, por lo tanto la muestra presento
una tinción violeta.
Tinción Ácido resistente Los colores que se presentaron en este tipo de muestra
fueron dos, un color azul debido al azul de metileno
mayoritariamente por toda la superficie y un color
fucsia dispersos en diferentes secciones pequeñas
debido a la fucsina fénica.

4. RESULTADOS.
Tabla 4.1-1
Observaciones en el microscopio

Técnica de Tinción Observación.

Tinción Negativa Presencia de cocos, mediante el contraste se observó la
capsula bacteriana, tiende a una forma redonda.
La coloración de la bacteria es blanca en un fondo
oscuro.
Tinción Simple Coloración azulada, presencia de bacteria saprófita,
coco, tiende a un forma redonda.

Tinción Gram Presencia de bacterias Gram negativas debido a su color

rojizo, Bacilos forma de bastón.

Tinción Acido alcohol Presencia de bacterias ácido resistentes positivas,

resistente presencia de endoesporas.
Por la forma redonda indica la presencia de bacterias
ácido resistentes positivas, presencia de cocos y esporas.
La coloración emitida fue fucsia.
5. DISCUSIÓN

El método cualitativo utilizado en la práctica para observar en el microscopio diferentes

cultivos aplicando diferentes técnicas de tinción y poder determinar el tipo de
microorganismos observados fue válido, ya que nos permitió observar la morfología de las
bacterias que se encuentran en el yogurt natural y en los medios de cultivo por causa de las
coloraciones de las bacterias como ejemplo se puede observar en la Tabla de resultados
habiendo en el yogurt las bacterias: lactobacilos y streptococos apreciados de mejor manera
por la técnica de tinción simple. En el desarrollo de la práctica se evidenciaron errores
aleatorios tales como fue el lavado que al hacerlo directamente pudo lavarse bacterias de la
muestra que no estaba totalmente fija a la placa y del mismo modo al secar la placa se toparon
con la muestra reduciéndola al ver en el microscopio, otro error que se evidenció fue que al
momento de realizar la técnica de ácido resistente ya que se colocó en la placa el aceite de
inmersión estando con poca humedad lo que daña la visión en el microscopio. Se recomienda
se recomienda precaución en la esterilización y fijado de las muestras en las placas, evitando
matar los microorganismos por el calor entregado, finalmente, se recomienda lavar con
cantidades moderadas de agua las muestras en cada ensayo para la tinción, debido a que la
corriente de agua puede llevarse partes de colonia en el lavado.

6. CONCLUSIONES
6.1 Al observar la Tabla 4.1-1 se puede concluir que las bacterias difieren mucho en los
cambios de color y morfología unas de otras, debido a estas diferencias es posible distinguir
las bacterias por tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con la célula bacteriana,
lo que proporciona un contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo
diferenciar varios tipos morfológicos. (Santiago Achote)

6.2 De acuerdo a las muestras analizadas se puede concluir que en su mayoría las muestras
presentaban con mayor incidencia cocos, además se puede concluir que de acuerdo a las
necesidades del analista se puede utilizar ya sea la tinción simple como la negativa o una
tinción diferencial como la gram, de esta forma se observaron presencia de cocos negativos,
ácidos resistentes, y capsulas bacterianas. (Emerson Vizuete).

6.3 Se determinó que la muestra empleada en la tinción simple poseía células de

características morfológicas descritas como fusiformes, esto es debido a su forma alargada
debido a que la tinta de azul de metileno resaltaba el relieve lineal de las principales colonias
y se determinó que la muestra empleada de cultivo tenía bacterias gram negativas, al
observarse en el microscopio una coloración rosada tenue que las caracterizaba. Se apreció
que una tinción muchas veces es requerida fundamentalmente para lograr observar a
organismos celulares, que de otra manera sin teñirlos sería muy difícil caracterizar su
morfología y tamaño. (Francisco González-Valerio)
6.4 Los microorganismos como las bacterias son sensibles o presentan afinidad a los
colorantes, lo que permite observar su morfología, presencia de cápsulas, capas delgadas o
gruesas, etc. En la práctica se logró identificar dicha morfología mediante la aplicación de
técnicas de tinción; para lograr una buena tinción de la muestra fue necesario colocar en
exceso el colorante, la fijación a la llama y el tiempo en que se dejó el teñido para que así la
muestra adquiera una mejor coloración. La tinción más sencilla de realizar fue la simple ya
que solo se utilizó un colorante y no fue necesario lavar la muestra, quedando teñida de color
azul y permitiéndonos la observación de la morfología de los microorganismos como son
cocos, bacilos de forma cilíndrica y espirilos de forma helicoidal. (Fátima Andrea Carvajal
Suárez)

6.5 En las observaciones realizadas podemos asegurar que en el medio de cultivo presentaban
bacterias ácidos resistentes, esto se debe a la presencia de ácidos grasos en la pared celular
que les confiere la capacidad de resistir la decoloración, ya que al usar este método de tinción
el resultado presento una coloración rojo-amarilla (ver anexo 2) que es la coloración que da
positiva a esta técnica de tinción (Gustavo Cubas)

7. CUESTIONARIO.
7.3. ¿Cuál es la aplicación de las preparaciones en fresco?
Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de estudio y
la presencia de otros elementos. Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a
examinar se sitúa entre un portaobjetos y cubreobjetos. De la siguientes formas.
a) Si la muestra es líquida, colocar una gota del material patológico en un portaobjetos´
b) Si la muestra es sólida, hacer una suspensión en suero fisiológico y colocar una gota sobre
un portaobjetos
c) Si se desea hacer una observación en fresco a partir de una colonia aislada, colocar una
gota de suero fisiológico en un portaobjetos y luego con el asa de cultivo tomar una porción
de la colonia y hacer una suspensión
d) En todos los casos, cubrir la preparación con un cubreobjetos
e) Cuando se sospecha que existen pocas bacterias en la muestra, se debe dejar sedimentar o
centrifugar
f) Cuando la muestra es muy espesa (pus, expectoración), suspender en suero fisiológico y
agitar
g) Una vez lista la preparación, observar en microscopio con el condensador abajo, utilizando
el objetivo seco de mayor aumento

7.4. ¿Qué grupos microbianos se observan con las preparaciones en fresco?

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo,
para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales o
Staphylococcus (cocos), Pseudomonas (bacilos), son leucocitos, células, eritrocitos,
cristales,etce. La preparación se observa al microscopio pudiendo determinar su morfología
(cocos o bacilos) al igual que la movilidad, aglutinación, yemación, entre otras

7.5. ¿Por qué se fija una muestra?. ¿Cuándo se lo hace con calor y cuando sin calor?
Tiene como objetivo no permitir que la muestra de estudio se pierda en el proceso de tinción.
La fijación por calor, pues el calor de la llama mata las células microbianas por
desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. La
fijación sin calor se realiza cuando se desea fijar especímenes delicados se utiliza la fijación
química, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, sobre
la muestra líquida con los microorganismos.

7.6. ¿Cómo están constituidos los colorantes?

Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados, Un colorante
es un compuesto orgánico que al aplicarlo a un sustrato, todos los colorantes funcionan bien
ya que tienen iones de color (Cromoforos) que están cargados positivamente.
Un cromóforo es la parte o conjunto de átomos de una molécula responsable de su color. La
mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a
formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

7.7. ¿Qué es una tinción diferencial?

Se utilizan para poner de manifiesto diferencias estructurales entre bacterias
Si se desean observar las características morfológicas de las bacterias, resulta sumamente útil
el utilizar las preparaciones fijas y teñidas, debido a que estas permiten que las células se
visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por su coloración,
este método en particular se llama tinción diferencial o selectiva.

7.8. ¿Cuál es la diferencia entre tinción Gram y tinción Ziehl Neelsen y cuál es su
importancia?
La tinción gram se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias gram
positivas y gram negativas (ácido muranico). Usualmente se utiliza para identificación de
infecciones bacterianas en el cuerpo.
Por otro lado la tinción de Ziehl Neelsen confiere la propiedad de resistir la decoloración con
alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Usualmente se utiliza para la
identificación de tuberculosis. (Ácido micólico)
(Michael, 2004)

7.9. De qué color se observan las bacterias ácido alcohol resistente, indique la causa.
Las bacterias que son acido alcohol resistentes presentan una coloración rojiza mientras que
las q no lo son presentaran una coloración azul. Esto se debe a que resisten la decoloración
con decolorantes enérgicos, como las soluciones de etanol en ácido clorhídrico, Esta
resistencia se debe a ácidos grasos específicos de la pared (ácidos micólicos). (www.ugr.es,
06)
7.10. Que tienen en común y en que se diferencian las paredes celulares de las Gram +
y Gram - ¿? Cite un ejemplo de cada uno de los grupos.
La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano,
además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie,
el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido
como mureína).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha
de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
8. Bibliografía
Acevedo, Severiche, & Bertel, C. (2013). Biología y Microbiología Ambiental . Madrid:
EUMED.NED.
Cartea, M. E., Francisco , M., Abillerla , R., & Velasco , P. (2008). Los glucosinolatos
como factor de calidad en las brásicas. Obtenido de
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Kremer, B. (1948). Manual de Microscopia. Cataluña: Omega S.A.
Sahagún, J. O. (1997). Métodos de microscopia electrónica de barrido en biología.
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Pascual M. Anderson, 1992.Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para
Alimentos y Bebidas. Editorial Díaz de Santos, S.A., MADRID, España.
ICMSF.2010 Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis microbiológico.
Volumen I - SEGUNDA EDICION. EDITORIAL ACRIBIA ZARAGOZA (España).
Romero R. Microbiología y parasitología humana: bases etiológicas de las
enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, México 2001 2º ed. Pag 257-429

9. ANEXOS
9.3.Diagrama del equipo.
9.4.Reporte fotográfico de las observaciones realizadas.
 Figura 8.1–1. Diagrama del Equipo

Microscopio

Colorantes

Medios de
cultivo
Lámpara
de Alcohol

Fuente: Universidad Central del Ecuador. Centro de Biología. 2018.

Nombre Fecha Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ingeniería Química
Dibuja. Grupo 1 2018/06/07 Carrera de Ingeniería Química
Revisa. Déleg Jessica 2018/06/14
Escala.
Lámina 1
Tema: Técnicas de Tinción
 Figura 8.2–1. Tinción Capsular

Figura 8.2–2. Tinción Gram

Fuente: Universidad Central del Ecuador. Centro de Biología. 2018.

Universidad Central
Universidad Central del
del Ecuador
Ecuador
Nombre Fecha
Achote Facultad de
Facultad de Ingeniería
Ingeniería Química
Química
Dibuja. Grupo 11
Grupo
Santiago 2018/06/07
2018/06/07 Carrera de
Carrera de Ingeniería
Ingeniería Química
Química
Revisa. Déleg Jessica
Déleg Jessica 2018/06/14
2018/06/14
Escala.
Escala.
Técnicas de
Tema: Técnicas de Tinción
Tinción
Lámina 12
Tema: Técnicas de Tinción
 Figura 8.2–3. Tinción Negativa

Figura 8.2–4. Tinción Ácido Resistente

Fuente: Universidad Central del Ecuador. Centro de Biología. 2018.

Nombre Fecha Universidad Central del Ecuador

Achote Facultad de Ingeniería Química
Dibuja. Santiago 2018/06/07 Carrera de Ingeniería Química
Revisa. Déleg Jessica 2018/06/14
Escala.
Lámina 3
Tema: Técnicas de Tinción