ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo:
Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de
esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común en Microbiología.
Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.

Introducción:
La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o
manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas
prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.

La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor
frecuencia en el Laboratorio de Microbiología.

El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos
directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180 °C durante 2 horas. Estos
métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material
de vidrio y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y

proteínas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables,
materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.

El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in 2);
con esta presión el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante
15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras
bacterianas más resistentes al calor.

Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios,

superficies y materiales de naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de
cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán de acuerdo
con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la Tabla 2.

1
Tabla 2. Métodos de esterilización.

húmedo vapor a presión (autoclave)

aire caliente (horno)
Calor seco Flameado
Incineración
Filtración discos de membranas o filtros absolutos
Métodos Físicos flujo laminar
rayos ultravioleta
no ionizantes rayos infrarrojos
Radiaciones rayos x
ionizantes rayos (cobalto-60)
radiación electrónica de alta energía
gases oxido de etileno
Métodos Químicos Formaldehido
líquidos β- propiolactona

Procedimientos

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua
corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el
material sobre una toalla o papel de envolver.
3. Preparar 200 mL de CN en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0
con un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCl
0.1M o solución de NaOH 0.1M en caso de que el pH sea más alcalino o ácido
respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapón de rosca que se
cerrarán sin llegar al tope.
4. Preparar agar nutritivo (AN) agregando 2.7 g a los 180 mL del CN restante (15 g/L).
5. Calentar el medio en una parrilla con agitación constante hasta ebullición (cuidar que
no se proyecte) y vaciar 5 mL de medio en cuatro tubos con tapón de rosca. Enjuagar de
inmediato la pipeta para evitar que se solidifique el agar.
6. Preparar 200 mL de medio de cultivo PDA en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar
el pH del medio a 5.6. Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición, cuidando
que no se proyecte o derrame. Vaciar 5 mL de medio en cuatro tubos sin rosca que se
taparán con tapón de algodón y gasa.

2
7. Preparar 200 mL de medio de cultivo EMB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
Colocar un agitador magnético y calentar hasta ebullición. NOTA: ¡Cuidar que no se
derrame!

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarán en un horno a 150ºC
durante 2 horas. Después de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en
área aséptica (cerca del mechero).
2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes
instrucciones:
a. Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca en el
tubo indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada.
b. Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso de
guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y
colocarla dentro.
c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a
que salga el vapor por el orificio de purga, después cerrarlo con la válvula.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in 2 de presión y
mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el manómetro y
regular el control de temperatura a valor medio o mínimo.
e. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la válvula y con
la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera
para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación.

1. Cerrar los tubos con tapón de rosca, los que contienen agar se colocarán en una
superficie inclinada para que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de
la boca del tubo.
2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-
50°C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
quemarse.
3. Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mecheros y colocarlos
a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres
cajas Petri en esta zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1
minuto en zonas no asépticas (patio, aulas, comedor) y etiquetarlas.
2. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1
minuto en zonas asépticas (cerca del mechero) y etiquetarlas.

3
3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30ºC durante 24-48
horas. Las cajas Petri se colocarán con la tapa hacia abajo.
4. Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos
con medio líquido, así como la formación de colonias microbianas en la superficie de los
medios sólidos.

Resultados
A. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco
crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
B. Describir la morfología de las colonias en el Cuadro 1.
C. Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los
materiales.

Cuadro 1. Descripción del crecimiento de colonias en cajas Petri y apariencia de tubos

con medios de cultivo.

Medio de cultivo En área no aséptica En área aséptica

Caja

Agar nutritivo Tubo

Caja

Agar papa dextrosa

Tubo

Agar EMB Caja

4
 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y LEVADURAS

Objetivo:
Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de
bacterias y levaduras en medios sólidos. Comprobar la utilidad que tienen los medios de
cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.

Introducción:
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de
técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o
mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios
morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros.

Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios

líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri;
por estría en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por
piquete o picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada
técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los
microorganismos de interés.

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones,

formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de
estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a
partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica
de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un
cultivo puro o axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de
microorganismo con la misma composición genética.

Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de interés a partir
de mezclas donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las
bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de
enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas
concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la
población del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento.

Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes,

indicadores, es posible distinguir entre especies bacterianas por la forma en que
metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la apariencia del pH del
medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran
utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas.

5
 Procedimientos
El profesor proporcionará cultivos puros (cepas) de bacterias Gram (+): Bacillus sp.,
Micrococcus sp., Gram (-): Escherichia coli y un cultivo de la levadura Saccharomyces
cerevisiae, así como una muestra problema (con al menos dos microorganismos
diferentes). Cada equipo de trabajo inoculará E. coli, una bacteria Gram +, la levadura y
un cultivo problema en una caja de cada medio.

Técnica de estría cruzada (Figura 1)

A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrás en cuatro cuadrantes. Esterilizar el
asa con calor en el mechero.
B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.
C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el
primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y hacer girar la
caja Petri un cuarto de vuelta.
D. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar la superficie de
las estrías recién hechas en un punto alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de
estrías como en el caso anterior. Realizar el mismo procedimiento en el tercer cuadrante y
en el último cuadrante, sin flamear el asa de siembra hará una estría más abierta (simple).
E. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35°C durante 24-48 horas.

Siembra en tubos y condiciones de incubación (Figura 2)

A. Después de la incubación de los cultivos, seleccionar, de las cajas Petri con AN, la colonia
más aislada de cada cepa.
B. Transferir con el asa, previamente esterilizada y fría, una pequeña muestra de la colonia a
un tubo de CN.
6
C. Transferir de la misma forma una muestra de la misma colonia inoculando por estría los
tubos inclinados con AN y PDA.
D. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 hrs. Observar la aparición de colonias y reportar la
forma de crecimiento de los microorganismos.

Resultados

A. Reportar en el Cuadro 2, sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de

cultivo.
B. Describir la morfología colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo
con los criterios indicados en los cuadros 3 a 6.
C. Verificar el tipo de microorganismos que corresponden a la muestra problema, en
comparación con los cultivos puros.

7
Cuadro 2. Resultados de crecimiento (C) y aislamiento (A) de cepas en medios de
cultivo. (-) no hay crecimiento o no se aisló; (+) hay crecimiento, sí se aisló.

Medio de E. coli Gram (+): S. cerevisiae Cultivo problema

cultivo
C A C A C A C A

AN

PDA

EMB

Cuadro 3. Morfología colonial de cultivos microbianos en AN.

E. coli Gram(+): S. cerevisiae Cultivo problema

Forma

Color

Tamaño (mm)

Borde

Elevación
Aspecto:
Opaco Brillante
Consistencia:
Dura Suave Elástica

8
Cuadro 4. Morfología colonial de cultivos microbianos en EMB agar.

E.coli Gram(+): S. cerevisiae Cultivo problema

Forma

Color

Tamaño (mm)

Borde

Elevación
Aspecto:
Opaco Brillante
Consistencia:
Dura Suave Elástica

Borde Forma Elevación

9
 Cuadro 5. Morfología colonial de cultivos microbianos en PDA.

E.coli Gram(+): S. cerevisiae Cultivo problema

Forma

Color

Tamaño (mm)

Borde

Elevación
Aspecto:
Opaco Brillante
Consistencia:
Dura Suave Elástica

Cuadro 6. Descripción de cultivos en tubos con CN, AN y PDA.

E.coli Gram (+): S. cerevisiae

Cultivo en tubos de CN
Forma de película: Si No

Opacidad: Ligera (L),Media (M),Nula (N)

Sedimento: Compacto (C), Grumoso(G),

Viscoso (V)

Cultivo en tubos inclinados

AN

Color de la colonia:

Color del medio:

PDA

Color de la colonia:

Color del medio:

10
 TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE, DIFERENCIAL Y SELECTIVA

Objetivo:
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más
utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos. Que obtenga la información
básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.

Introducción:
Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y
cianobacterias), por los que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico
de campo claro por la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo
que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.

Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los microorganismos

sobre una superficie transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o
disolventes orgánicos; lo que causará la inactivación o muerte celular y algunas
modificaciones de sus características.

Existen diferentes tipos de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el

número y tipo de colorantes utilizados y de los objetivos de estudio. La tinción que hace
uso de un solo colorante es la simple.

Las tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con características

superficiales distintas, por lo que requieren más de un colorante. La más utilizada en
bacteriología es la propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica
los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas que son útiles
para la clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas
permite identificar bacterias de tipo Bacillus y Clostridium.

Procedimientos

El profesor proporcionará cultivos líquidos y sólidos de cada una de las cepas de estudio y
un cultivo problema. El equipo de trabajo preparará frotis de los dos tipos de cultivos y
hará tinción simple de S. cerevisiae; tinción de Gram de Micrococcus sp., Escherichia
coli., Bacillus sp., así como la tinción selectiva de endosporas en cultivos de Bacillus sp.
También aplicarán estas técnicas en el cultivo problema.

11
 Preparación de frotis (Figura 3)

A. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.

B. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar
enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son
de cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
C. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e
introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos,
extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el
asa. Dejar secar el frotis al aire.
D. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se
realiza el mismo procedimiento antes descrito.

Fijación del frotis

E. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-3
veces por la flama del mechero.

F. Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que se
dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).

12
 Tinción simple

1. Cubrir el frotis de S. cerevisiae y de la muestra problema con 1 gota de azul de metileno

durante 60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.

Tinción de Gram

1. Cubrir el frotis de Micrococcus sp., E. coli, Bacillus sp. y de la muestra problema con 2
gotas de cristal violeta durante 60 segundos. Lavar cuidadosamente el frotis con agua
destilada para eliminar el exceso de colorante.
2. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar
con precaución el frotis con agua.
3. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más
colorante. Lavar de inmediato con agua.
4. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. Lavar de nuevo con agua, quitar el
exceso de agua y dejar secar al aire.

Tinción selectiva de endosporas

1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre un frotis de Bacillus sp.

2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la
preparación.
3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más, si es
necesario).
5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 segundos.
6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

Observación al microscopio.

1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación (iluminación Köhler),
siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X,
después pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar
previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

13
 Resultados

A. Reportar las observaciones microscópicas en los Cuadros 7- 9.

B. Comparar sus observaciones con la información reportada en la literatura.

Cuadro 7. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple.

Levadura Problema

Cultivo líquido

Aumento total:
Forma:(esféricas, ovales)

Agrupación(solos, par,cadenas,racimos)

Densidad

Cultivo sólido

Aumento total:
Forma: (esféricas, ovales)

Agrupación(solos,par,cadenas ,racimos)

Densidad

Cuadro 8. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram

Cepa 1 Cepa 2

Cultivo liquido

Aumento total:

Forma:(cocos,bacilos,espirilo )

Agrupación(solos,par cadena,racimos)

Cultivo solido

14
Aumento total:

Forma:(cocos,bacilos,espirilo )

Agrupación(solos,par cadena o racimos)

Cepa 3 Problema

Cultivo liquido

Aumento total:

Forma:(cocos,bacilos,espirilo )

Agrupación(solos,par cadena o racimos)

Cultivo solido

Aumento total:

Forma:(cocos,bacilos,espirilo )

Agrupación(solos,par cadena o racimos)

Cuadro 9. Descripción microscópica de endosporas

Bacillus sp. Problema

Descripción del cultivo: (líquido o

sólido, edad del cultivo)

Forma y localización de la endospora

(central o lateral)

15
 PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

Objetivo:

Que el alumno demuestre los tipos de metabolismo bacteriano utilizando las pruebas
bioquímicas. Observar la capacidad de utilización de diferentes sustratos y condiciones de
oxígeno por las bacterias, de importancia para su caracterización bioquímica.

Introducción

El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye
procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas
en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos.
Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes
esenciales (anabolismo).

Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son
intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son
liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.

Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su

inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como
fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes
esenciales necesarios para su crecimiento.

Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de

indicadores de pH para detectar la producción de ácido o álcali, con inhibidores
selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la
determinación de diferentes actividades metabólicas. Las actividades que se evalúan con
mayor frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa), para catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas
hidrolíticas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas,
etcétera.

Por la importancia que tienen estas pruebas bioquímicas para la identificación de

especies bacterianas en áreas de alimentos, clínica y ambiental, se han desarrollado
sistemas bioquímicos miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma
más rápida y segura pero que mantienen los criterios de evaluación de las pruebas
bioquímicas convencionales.

16
 Procedimientos

El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Pseudomonas fluorescens y Klebsiella sp. Cada equipo trabajará con un cultivo puro y un
cultivo problema, que inocularán en diferentes medios de cultivo para evaluar diferentes
actividades metabólicas. Compartirán sus cuadros de resultados con los otros equipos.

Nota: Los tubos con medio TSI y medio de citrato de Simmons se dejan solidificar en
forma inclinada; los tubos con agar gelatina nutritiva y medio SIM en forma recta. Uno de
los tubos de cada medio se etiqueta como control y no se inoculará pero se incubarán de
la misma forma que los tubos inoculados.

Fermentación de carbohidratos

1. Inocular cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa, lactosa,
sacarosa y manitol.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento,
cambios en el color del indicador y producción de gas en la campana de Durham (medios
de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol).

Criterios de evaluación:

Producción de ácido

Prueba positiva (+): color amarillo

Prueba negativa (-): color rojo

Producción de gas

Prueba positiva (+): Burbujas en campana de Durham

Prueba negativa (-): Sin burbujas

Utilización de urea, azúcares, proteínas y producción de sulfuros

1. Inocular cada cepa en tubos de caldo urea, leche tornasolada. Los tubos conTSI Agar se
inoculan primero por picadura en el fondo del tubo y terminar con estría simple en la
superficie.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación.

17
 Caldo urea

Prueba positiva (+): rojo cereza

Prueba negativa (-): rosa

TSI

-Para la producción de H2S

Prueba positiva (+): ennegrecimiento del medio

Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento

-Fermentación de azúcares:

Sin fermentación de azúcares: Medio alcalino, color rojo en pico de flauta sin cambio en
profundidad
Fermentación de los azúcares: Medio ácido, color amarillo en pico de flauta y
profundidad
Fermentación de glucosa: Alcalino/ácido, color rojo en pico de flauta y amarillo en
profundidad

-Producción de gas:

Prueba positiva (+): Separación ruptura del agar

Prueba negativa (-): Sin cambio

Leche tornasolada
-Cambio de color:

Fermentación de la lactosa: ácido color rosa

Formación de CO2 e H2: gas
Liberación de amoníaco: alcalino color azul púrpura
Reducción del tornasol: Incoloro (blanco)
Formación de coagulo
Peptonización (digestión): licuefacción

Producción de sulfuros, indol y movilidad

1. Inocular por picadura hasta el fondo del tubo cada uno de los tubos con agar SIM.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. Realizar observaciones a las 24 horas.
18
 Criterios de evaluación:

Producción de H2S

Prueba positiva (+): ennegrecimiento del medio

Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento

Movilidad
Prueba positiva: hay una turbidez difusa del medio,
Prueba negativa: sólo hay crecimiento a lo largo de la picadura.

Producción de indol
Prueba positiva: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Kovacs,
Prueba negativa: no hay aparición de color.

Asimilación de citrato como fuente de carbono

1. Inocular primero por picadura en el fondo del tubo y terminar con estría simple en la
superficie.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. Realizar observaciones a las 24 y 48 horas.

Criterios de evaluación:

Prueba positiva (+) viraje del medio a azul

Prueba negativa (-) sin cambio

Actividades hidrolíticas

1. Inocular cada cepa por picadura (con el asa recta) en los tubos con gelatina nutritiva y por
estría simple en la mitad de una caja de Petri con agar almidón.
2. Incubar los tubos y la caja a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. En los tubos de agar gelatina, observar si hubo licuefacción del medio y después agregar
cuidadosamente 1-2 gotas de solución de ácido tricloroacético al 5%, observar la
aparición de zonas claras o turbidez en el medio.
4. Observar la actividad de amilasas en la caja de agar almidón por el crecimiento de
colonias y aparición de zonas claras alrededor de la misma. Para mejor observación,
agregar unas gotas de lugol y localizar zonas claras cerca de las colonias y el color azul
en la parte no inoculada del medio como indicativo de prueba (+).

19
 Actividad de catalasa

1. Preparar en una gota de agua sobre un portaobjetos una suspensión de una colonia
obtenida en medio de agar almidón.
2. Agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas
que indican una prueba de catalasa (+).

Resultados

A. Reportar los resultados en el Cuadro 10 con la notación siguiente: Crecimiento: no hay

crecimiento (-), crece un poco (+), crecimiento medio (++), crecimiento abundante (+++).
Actividad metabólica: Positiva (+), Negativa (-).

B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los
obtenidos en la práctica.

C. Con base en sus resultados y la información bibliográfica, identifique la especie bacteriana

que corresponde a su cultivo problema.

Cuadro 10. Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica

Medio de cultivo Cepa Cultivo problema

Caldo rojo de fenol: Glu Lac Sac Man Glu Lac Sac Man
Crecimiento
Acido (amarillo)
Alcalino (rojo)
Gas
LECHE TORNASOLADA:
Acido (rojo o rosa)
Álcali (azul a purpura)
Sin cambio (azul)
Reducción (blanco)
Peptonizacion (licuefacción)

Coagulación (cuajada)
Gas (burbujas)

20
 CALDO UREA
Crecimiento
Sin cambio (rosa)
Hidrólisis de urea (rojo cereza)
MEDIO TSI
Crecimiento
Producción de H2S
Producción de gas
Fermentación de Glu
Sin fermentación de azúcar

MEDIO SIM:
Producción de H2S
Producción de índol
Movilidad
Crecimiento: superficial, en la parte media,
en el fondo
Crecimiento en la picadura
Gelatina nutritiva
Actividad proteolítica
Licuefacción del medio
Formación de turbidez al agregar TCA al 5%
Hidrólisis de gelatina
Crecimiento: superficial, en la parte media,
en el fondo
Crecimiento en la picadura
Movilidad
Agar almidón (actividad amilolitica)
Color del medio con el lugol
Descripción de colonias
Medio de Citrato de Simmons
Cambio de color
Utilización de citrato
Prueba de catalasa
Burbujeo

21
 CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS FILAMENTOSOS

Objetivo:
Que el alumno adquiera los conocimientos básicos para la manipulación de hongos
filamentosos y técnicas de cultivo. Que describa las características morfológicas
macroscópicas y microscópicas e identifique algunas especies de hongos.

Introducción
Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamaño y complejidad que las
bacterias. Se distinguen de otros eucariontes, como los animales, por ser inmóviles y, de
las algas y plantas, por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa;
es decir, dependen de nutrientes orgánicos disueltos por sistemas enzimáticos
específicos, que son absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.

En este grupo de organismos se encuentran formas unicelulares (levaduras) o

pluricelulares (filamentosos). Las levaduras son células de forma esférica u oval,
ampliamente distribuidas en la naturaleza; con frecuencia se encuentran formando una
cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen en forma
asexual por gemación, un proceso por el cual brota una protuberancia o yema de la célula
madre que, posteriormente se separa como célula individual.

Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica

denominada hifa. El conjunto de hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de
algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
hongos que pertenecen al grupo Zygomycota, las hifas no presentan estos septos y se
conocen como hifas cenocíticas.

El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual por fragmentación

de hifas vegetativas o por la producción de esporas en conidióforos y esporangióforos,
formados en hifas aéreas, llamadas reproductivas.

La presencia de estructuras de reproducción sexual, es el principal criterio de clasificación

que permite ubicar a los hongos en tres divisiones o phyla: Zygomycota, Ascomycota y
Basidiomycota. Otros criterios importantes para la clasificación de los hongos son las
características de las hifas y las estructuras de producción de esporas asexuales.

Procedimiento:

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos de: Aspergillus niger, Penicillium

chrysogenum, Rhizopus oligosporus, Fusarium sp. Cada equipo de trabajo, inoculará tres

22
 cepas en cajas de Petri con PDA y hará la descripción macroscópica y microscópica de
cada especie. Compartirán sus cuadros de resultados con los otros equipos.

Preparación de materiales e inoculación

1. Lavar y preparar todo el material para esterilizar.

2. Preparar medio PDA, esterilizar a 15 lb/pulg2 a 121°C durante 15 min, enfriar el medio
hasta aproximadamente 45°C y vaciarlo en las cajas Petri.

Siembra de hongos filamentosos

1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa una parte de micelio de los hongos
proporcionados por el profesor con asa de siembra, previamente esterilizada en la flama
del mechero.
2. Se coloca el micelio en el centro de una caja de Petri con medio por inoculación por
piquete.
3. Se incuban las cajas de Petri en forma invertida, envueltas en papel o en una bolsa de
plástico, a 28-30 ºC durante 3-5 días.

Descripción macroscópica

Observar las siguientes características de los hongos filamentosos:

a) Forma, tamaño y tipo de colonia
b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio
c) Color del micelio y color de las esporas
d) Cambios en el medio de cultivo

Descripción microscópica en montaje con cinta adhesiva

1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio.

2. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente; con pinzas de disección doblar
la cinta en “U” con el adhesivo hacia afuera.
3. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la
periferia de la colonia.
4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando
la formación de burbujas para no alterar las estructuras. La cinta funciona como
cubreobjetos, no es necesario colocar uno.
5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los
objetivos de 10X y 40X. Localizar y observar hifas, estructuras especializadas como
23
 esporangióforos, esporangios, conidióforos, conidias y rizoides; determinar si las hifas
presentan divisiones (septos).

Resultados

A. Reportar en el Cuadro 11 las observaciones macroscópicas y microscópicas de las cepas,

indicando el nombre de cada una.

B. Comparar las observaciones realizadas con la bibliografía.

C. Investigar en la literatura cómo se clasifican los hongos estudiados en la práctica.

Cuadro 11. Descripción morfológica de hongos en medio PDA

Cepa
Característica
1 2 3
Descripción macroscópica
(colonias)
Color
Tamaño
Aspecto
Textura

Descripción microscópica
Aumento total de:

Septos (si/no)

Estructura de
reproducción
Tipo de
esporas
Clasificación (phyla)

24
 CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Objetivo:
Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar
microorganismos viables y que compare sus resultados de la cuenta viable con los de
cuenta directa en el microscopio.

Introducción
El crecimiento microbiano se define como el aumento ordenado del número de
microorganismos o de biomasa en un periodo de tiempo determinado. Existen diferentes
métodos para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en microbiología es la de

recuento en placa con medios de cultivo específicos para la población de interés.
Consiste en inocular un volumen determinado de cultivo o muestra sobre un medio de
cultivo sólido adecuado para el crecimiento de colonias. Cada una de estas colonias
deriva de una célula aislada; es decir, una unidad formadora de colonia (UFC).

Hay dos variaciones en la forma de realizar esta técnica: la siembra en superficie o

vertido en placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de
diluciones sucesivas y cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles.

Es recomendable homogenizar las diluciones y hacer la adecuada inoculación de las

muestras para evitar resultados erróneos. Si no se separan bien las células, se
obtendrán valores bajos y los valores serán elevados si la toma de muestra se hace del
fondo del tubo donde se concentran los microorganismos por gravedad.

El recuento directo consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy

pequeños de suspensiones de bacterias. En portaobjetos especiales denominados
cámaras de Petroff-Hausser o de Neubauer.

Procedimientos

El profesor proporcionará un cultivo líquido de Saccharomyces cerevisiae; todos los

equipos de trabajo determinarán las UFC por diluciones decimales y siembra en placas
con medio de cultivo. Se compararán estos resultados con los de cuenta directa en
cámara. Al final, compartirán sus cuadros de resultados, calcularán la desviación estándar
de los resultados y compararan los resultados del grupo.

25
 Técnica de dilución y siembra en placa (Figura 4)

1. En condiciones asépticas, pipetear 1 mL del cultivo del microorganismo o de la muestra

problema y depositarla en el matraz Erlenmeyer con 99 mL de SSI. Esta corresponderá a
la dilución 10-2. Hacer diluciones decimales del cultivo hasta 10-7.

2. Para la inoculación por la técnica de superficie, se deposita 0.1 mL de cada una de las
diluciones 10-3-10-7. Distribuir cuidadosamente el inóculo en toda la superficie de la caja
con una varilla de vidrio doblada en “L” que previamente se sumergió en alcohol, se pasó
en la flama del mechero y se dejó enfriar.

3. Dejar absorber el líquido durante 5-10 minutos. En caso de utilizar la técnica de vertido se
deposita 1.0 mL de la dilución en la caja de Petri a la cual se le añaden ca. 20 mL de
medio fundido (48-50°C).

4. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 72 horas y realizar la cuenta de
colonias.

Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer (Figura 5)

1. Se coloca 1 mL de cultivo microbiano original en un tubo de ensaye y se agrega 1 gota de

azul de metileno. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.

26
2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el
portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el cubreobjetos sobre la zona central
limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada en
forma de cruz.

3. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar de inmediato una alícuota con pipeta Pasteur
de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la
cámara, evitando el exceso, dejando que la muestra se distribuya por capilaridad.

4. Reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con
el objetivo seco débil (10X) la zona de cuenta que se muestra en la Figura 5. El cuadro
central mide 1.0 mm por lado y al observar en objetivo seco fuerte (40X) se encuentra
dividido en 5X5 cuadros pequeños de 0.2 mm por lado.

5. Observar que las células que se tiñen de azul son las no viables y las que no se tiñen son
las viables. La cuantificación de células se hace generalmente en el cuadro central a 40X,
contando en diagonal las células de 9 cuadros (que a su vez están divididos en 16
cuadros más pequeños). Al dividir el número de células entre 9, se obtiene el #
células/cuadro de 0.2 mm de lado.

6. Se multiplica el # células/cuadro (de 0.2 mm) X 25 para obtener el # total de células/0.1

mm3 (1 mm x 1 mm de cada lado del cuadrante central x 0.1 mm de profundidad de la
cámara), que se multiplicará por 104 para obtener el # células/mL. Hacer esta cuenta por
duplicado.
7. En el caso de que el cultivo esté muy concentrado, se recomienda hacer diluciones (1:2,
1:5, 1:10 etc. según sea necesario) para facilitar el conteo.

27
 Resultados

A. Para calcular las UFC, células viables y no viables por mL de muestra original, se aplicará
lo siguiente:

En cajas de Petri:
- Número de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL,
El factor de dilución (FD) se calcula tomando en cuenta la dilución que se seleccionó
como válida para la cuenta (que tenga entre 30-300 colonias) y el volumen de muestra
inoculado en cada caja.
FD = 1
Dilución x Vol. inoculado
En la cámara de Neubauer:
- Número de células promedio/cuadro central X (Fd)= # células/ mL
El factor de dilución (FD) se aplicará solamente en casos de cultivos con alta densidad de
células, en las que se hicieron diluciones de la muestra original para hacer una cuenta
confiable.

B. Reportar los resultados de cuantificación en los cuadros 14 y 15.

C. Recopilar los resultados de los otros equipos y calcular la desviación estándar y

coeficiente de variación de todos los datos.

Cuadro 14. Cuenta viable de Saccharomyces cerevisiae en placa.

No. de colonias en caja No. de colonias promedio Fd UFC/ mL

±D.S.
Caja 1
Caja 2

Cuadro 15. Cuenta de Saccharomyces cerevisiae en cámara de Neubauer .

Tecnica No. de células No. de células Factor de No. células/mL

por cuadro de promedio ± D.S. dilución (Fd)
0.1 mm3
Cuenta viable

Cuenta no viable

28
 EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES EN LA CURVA DE CRECIMIENTO

Objetivo:
Que el estudiante identifique las fases de una curva de crecimiento bacteriano en cultivo
por lote. Que el alumno calcule y compare los parámetros cinéticos μ y td en curvas de
crecimiento obtenidas en diferentes condiciones ambientales.

Introducción:
Cuando se inoculan células bacterianas en un volumen finito de medio de cultivo
apropiado, después de cierto tiempo experimentarán un aumento del tamaño y posterior
división celular, por lo que se incrementará el número de células microbianas. El tiempo
que requiere una célula para que a partir de esta se formen dos se llama tiempo de
duplicación (td).

Así, las células cultivadas van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la
mayor eficiencia y rapidez, sintetizando sus componentes celulares y dividiéndose a una
tasa de crecimiento específico (μ) hasta alcanzar un incremento máximo de biomasa
celular denominado crecimiento total (Xt).

Si se gráfica el número de células o la cantidad de biomasa con respecto al tiempo, se

obtendrá una curva de crecimiento característica con cuatro fases.

El número de células y el tiempo de duración de cada fase dependerá de la especie de

microorganismo, la preparación y estado fisiológico del inóculo, la composición química
del medio de cultivo y las condiciones ambientales de incubación (T, pH, NaCl, O2).

Procedimientos
El profesor preparará un cultivo de Escherichia coli en un matraz Erlenmeyer con CN con
0.1 % de extracto de levadura y pH = 6.5; 12 horas antes de iniciar la práctica. Este cultivo
(matraz A) se utilizará como inóculo.

El crecimiento se cuantificará, midiendo la turbidez del cultivo durante 4 horas de

incubación. Cada equipo trabajará diferentes condiciones de pH y temperatura.

Preparación de material y medios de cultivo

a. Cada equipo preparará 120 mL de CN con 0.1% de extracto de levadura en un matraz de

250 mL. Ajustar al pH del medioa pH = 5.0 o pH = 7.0. según corresponde.
b. Colocar en 2 tubos de ensaye 10 mL del mismo medio que prepararon antes.

29
c. Esterilizar en autoclave (15 lb/in2 por 15 min) las pipetas, medios de cultivo y tubos de
ensaye vacíos.

Inoculación de matraces y tratamiento de muestras (Figura 6)

a. En condiciones asépticas, inocular 10 mL del cultivo de E. coli (del matraz A) en un

matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de caldo nutritivo (matraz B).
b. Homogeneizar el cultivo agitando suavemente y tomar de inmediato, con pipeta estéril, 3
mL que se pasan a un tubo de ensaye estéril. Esta muestra corresponde al tiempo cero
(t=0).
c. Colocar el matraz B en un agitador orbital a una velocidad de 100 rpm, incubando a la
temperatura correspondiente. De la misma forma, se tomarán muestras de 3 mL cada 30
min hasta completar 4 horas de incubación.
d. Leer la densidad óptica (D.O.) de cada muestra en un espectrofotómetro a 560 nm,
previamente calibrado con medio de cultivo estéril. Cuando las muestras reporten una
D.O. igual o mayor a 0.8, se prepararán diluciones con caldo de cultivo estéril. (Fd)

Resultados

A. Registrar los datos de D.O. del cultivo de E. coli para cada condición de pH y temperatura
con respecto al tiempo en el Cuadro 16.
B. Elaborar una gráfica de D.O. vs tiempo para cada condición de pH y temperatura e
identificar las fases de crecimiento y la duración (t) de cada una.
C. Elaborar una gráfica de ln D.O. vs tiempo para cada condición de pH y temperatura e
identificar la fase de crecimiento exponencial.
D. Determinar la tasa específica de crecimiento (μ) con los datos de la fase exponencial y
calcular el tiempo de duplicación de E. coli en cada condición de pH y temperatura.
E. Discutir cómo influyeron las condiciones estudiadas en la duración de las fases de
crecimiento, en el td y en la μ de crecimiento.
30
 Cuadro 16. Resultados de crecimiento de E. coli cultivada en diferentes condiciones
de pH y temperatura.

Equipo/Condición Tiempo D.O. Fd Parámetros Equipo/Condición DO Fd Parámetros

(h) Cinéticos cinéticos
0.5 μ1=
1.0 μ1=
1.5
1 2.0 2
pH5, 25 °C 2.5 pH5, 37°C
3.0 Td =
3.5 Td =
4.0
0.5
1.0 μ3 = μ3 =
1.5
3 2.0 4
pH7, 25 °C 2.5 pH7, 37° C
3.0 Td = Td =
3.5
4.0

31
 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE AGUA SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Objetivo:
Que el alumno observe y comprenda el efecto de la adición de altas concentraciones de
solutos en el crecimiento de bacterias y hongos. Que el alumno establezca la relación
entre la concentración de solutos, la actividad de agua y el crecimiento microbiano.

Introducción

Cualquier solución está formada por un soluto y por el solvente en el cual este se
disuelve. La concentración del soluto se relaciona con un fenómeno conocido como
presión osmótica; que es la fuerza con la que el solvente se mueve de una solución de
baja concentración de soluto a una mayor concentración a través de una membrana
semipermeable, por lo que también se define como la presión que se debe aplicar a una
solución para detener el flujo neto de solvente.

El aumento en la concentración de solutos en la fase acuosa de un alimento, por

ejemplo, mediante su deshidratación o por la adición de nuevos solutos, también provoca
una disminución en la actividad de agua (aw). Cuando se disuelve un soluto en agua
pura, la cantidad de agua disponible o agua libre se reduce, conduciendo a una
disminución en el valor de aw. La aw se define como la relación entre la presión de vapor
de una solución o un material (P) y la presión de vapor del agua pura (P0) a la misma
temperatura, a través de la siguiente ecuación:

Donde n1 y n2 son el número de moles de soluto y solvente respectivamente.

Como una alta concentración de solutos reduce la aw, al establecerse estas

condiciones se limitará el crecimiento de muchas bacterias por el efecto osmótico en
sus membranas.

Este efecto se utiliza de manera amplia para la conservación de alimentos, debido a

que la mayoría de los microorganismos no toleran estas condiciones adversas, sin
embargo, existen algunos que toleran o incluso requieren para su desarrollo bajos valores
de aw (xerófilos), con altas concentraciones de azúcares (osmófilos) o de sales (halófilos),
por tener mecanismos de adaptación específicos por cada tipo de microorganismo.

32
 Los microorganismos tolerantes a estas condiciones se encuentran principalmente en:
mermeladas, carnes y frutos secos; también habitarán en lagos salados, en desiertos y
condiciones salinas donde la mayoría de los microorganismos se deshidratarían
rápidamente.

Procedimientos
El profesor proporcionará cultivos de: Bacillus subtilis, Staphylococcus sp.
Saccharomyces rouxii y Aspergillus niger. Los equipos de trabajo inocularán las cuatro
cepas en diferentes medios y se observará la respuesta. Compartirán sus cuadros de
resultados de crecimiento con el grupo para calcular la desviación estándar y el
coeficiente de variación de los resultados.

Preparación y esterilización de medios de cultivo

1. Cada equipo preparará 200 mL de cada uno de los siguientes medios: AN con NaCl 0, 5 y
10% (p/v) o AN con sacarosa 0,10 y 20% (p/v).
2. Esterilizar los medios preparados en autoclave a 15 lb/in2 durante 15 min.
3. En condiciones asépticas, vaciar en cada caja de Petri entre 20 y 25 mL de cada medio.
Dejar que los medios enfríen y solidifiquen.
4. Etiquetar las cajas con la concentración de sal o azúcar correspondiente.
5. Dividir cada caja en cuatro cuadrantes con el uso de un plumón indeleble e indicar el
nombre de cada microorganismo a inocular.

Inoculación de microorganismos (Figura 7)

1. Con el asa estéril, inocular en línea el microorganismo correspondiente en cada cuadrante

de la caja. Cada equipo inoculará cada una de las cepas en cada caja con los diferentes
medios.
2. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 48 horas y observar el crecimiento.

33
 Observación y medición del crecimiento

1. Medir el ancho promedio de cada línea inoculada y registrarla. El ancho de las líneas
crecidas en las cajas con 0 % de sacarosa serán el control de crecimiento (+++).
2. Describir la morfología de un microorganismo de cada tipo (bacterias, levadura y hongo).

Resultados

A. Reportar el crecimiento microbiano en el Cuadro 17.

B. En el Cuadro 18 se reportarán las observaciones macroscópicas y microscópicas de cada

tipo de microorganismo.

C. Discutir los resultados con base en la capacidad de cada microorganismo para crecer en
diferentes concentraciones de NaCl o sacarosa. Comparar los resultados obtenidos con la
literatura.

Cuadro 17. Crecimiento de cepas microbianas en medios con NaCl y sacarosa.

Staphylococcus Bacillus Saccharomyces A. niger

Concentración
del soluto (%) Ancho Ancho Ancho Ancho Densidad*
Densidad* Densidad* Densidad*
(mm) (mm) (mm) (mm)
0
NaCl 5
10
0
10
Sacarosa
20

* Registre la densidad relativa, considerando como control (+++) el crecimiento observado

en la caja con 0 % del soluto.

34
Cuadro 18. Descripción macroscópica (Macro) y microscópica (Micro) de cepas en
medios con NaCl y sacarosa.

Concentración Staphylococcus Bacillus Saccharomyces A. niger

del soluto (%)
Macro Micro* Macro Micro* Macro Micro* Macro Micro**
NaCl 0
5
10
Sacarosa 0
10
20

*Observar en preparaciones con tinción de Gram.

**Observar en preparaciones con cinta adhesiva transparente y azul de lactofenol.

35
 EVALUACIÓN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

Objetivo:

Que el alumno conozca las técnicas microbiológicas comúnmente utilizadas en la

evaluación de agentes antimicrobianos sobre cepas bacterianas y observe la respuesta
frente a diferentes tipos de compuestos.

Introducción:
Los antimicrobianos son compuestos que se obtienen a partir de bacterias, hongos y
levaduras o de forma sintética. Los de origen microbiano por lo general son
metabolitos secundarios producidos durante la fase estacionaria de crecimiento.

Los agentes antimicrobianos presentan toxicidad selectiva, son muy efectivos contra
los microorganismos, por lo que se utilizan como agentes quimioterapéuticos para el
tratamiento de enfermedades infecciosas en seres humanos y animales.

Los antimicrobianos afectan el crecimiento microbiano en diferentes niveles y etapas

del crecimiento causando un efecto microbiostático. Un efecto microbiostático es
cuando se inhibe el crecimiento pero no se produce la muerte, solamente hay
inhibición de procesos, como la síntesis de proteínas por unirse a los ribosomas. Un
agente bacteriolítico induce la muerte mediante lisis celular y un bactericida elimina
completamente a la célula sin producir lisis o ruptura celular.

Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular y/o de la membrana

plasmática son de gran aplicación para la eliminación de especies bacterianas.

El efecto particular de los antibióticos sobre grupos de bacterias específicas se le

conoce como espectro de acción. En general, las bacterias Gram positivas son más
sensibles que las Gram negativas; sin embargo, existen antibióticos de amplio espectro
que actúan sobre ambos tipos de bacterias.

La eficiencia de un antibiótico se establece determinando la concentración mínima

inhibitoria (CMI) que nos indica “la concentración mínima en mg/mL de antibiótico
necesaria para inhibir el crecimiento microbiano”.

Otro parámetro de evaluación de antimicrobianos es la cantidad mínima bactericida

(CMB), que se refiere a la concentración de agente antibiótico necesaria para producir
una disminución del tamaño original del inóculo bacteriano en un porcentaje mayor o igual
al 99.9%. Muchas veces, el CMI es equivalente la CMB.

36
 Procedimientos

El profesor proporcionará cultivos en CN de: Staphylococcus sp, Escherichia coli y

Pseudomonas sp. Los cuadros de resultados se compartirán en el grupo para calcular la
desviación estándar y el coeficiente de variación.

Preparación de soluciones
Soluciones de: ampicilina, penicilina G y ketoconazol con 100, 1500 y 5000 μg/mL
Soluciones de desinfectante comercial de verduras o para limpieza: 1:10, 1:100 y 1:1000

Preparación de medios de cultivo

1. Preparar 350 mL de AN en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar en autoclave a

15 lb/in2 durante 15 min.
2. En condiciones asépticas, preparar 12 cajas de Petri con 20 -25 mL de AN

Inoculación de microorganismos (Figura 8)

1. Dividir la base de cada caja en cuatro cuadrantes con el uso de un plumón indeleble y
rotular en cada cuadrante las concentraciones a probar.
2. Introducir un hisopo estéril en la suspensión de la cepa correspondiente y sembrar las
placas con la cepa correspondiente arrastrando el hisopo sobre toda la superficie.
3. Con las pinzas de disección previamente flameadas y frías tomar un disco de papel filtro
que se sumerge en agua destilada estéril y se deja escurrir. Colocarlo cuidadosamente en
el centro del cuadrante “control”, asegurando el contacto del disco sobre el agar.
4. De la misma manera se sumergen discos de papel en las diferentes concentraciones de
los antibióticos.
5. Realizar el mismo procedimiento para cada una de las cepas y diluciones
correspondientes de cada agente. Incubar las placas a 37°C durante 24 hrs.

37
 Observación y medición del efecto

Retirar con la pinza de disección los discos y medir el diámetro (mm) de las zonas de
inhibición del crecimiento microbiano en relación al control.

Resultados

A. Reportar el diámetro de inhibición del crecimiento microbiano en el Cuadro 19.

B. Discutir los resultados con base en la capacidad de cada microorganismo para crecer en
diferentes concentraciones de agente antimicrobiano.

C. Comparar los resultados de CMI obtenidos con los reportes de la literatura.

38
Cuadro 19. Resultados de inhibición del crecimiento bacteriano frente a antimicrobianos

Concentración Diametro de inhibición (mm)

de Control Staphylococcus E.coli Pseudomonas CMI
Antibiótico sp sp
(μg/mL) (mg/mL)
Ampicilina
0
100
1500
5000
Penicilina G
0
100
1500
500
Ketokonazol
0
100
1500
5000
Desinfectante comercial
0
1:10
1:100
1:1000

39