PRACTICA 6 Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo

PRACTICA 6 Esterilizacin y Preparacin de Medios de Cultivo
PARTE I

Objetivos
Comprender los diferentes medios de cultivo e identificacin de los microorganismos
previo conocimiento de sus requerimientos nutricionales

Introduccin

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estriles. En Microbiologa la esterilizacin se define como
el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas
de resistencia) de un objeto, medio o superficie y su aplicacin garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
mtodos de esterilizacin, entre ellos: calor (seco o hmedo), filtracin (para sustancias
termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin de gas de oxido de etileno (para jeringas y
cajas de plstico).

Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias orgnicas e
inorgnicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el
desarrollo de los microorganismos. La composicin de los medios de cultivo vara en
funcin de: a) grupo microbiano que se pretende estudiar, b) complejidad qumica, c)
estado fsico, y d) aplicacin.

Material por grupo:
Balanzas granatarias
Potencimetro
Esptulas
Tiras de papel kraft (para envolver pipetas)
Agua destilada
Agar papa dextrosa
Tripticasa soya agar (medio de cultivo slido deshidratado)
Agar sal y manitol
Caldo malonato
Solucin de NaOH 1.0 N,
Solucin de HCl al 10%

Material por equipo:
Tripie
Charola metlica para tripi
1 Matraz Erlenmeyer de 50 mL
2 Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL
5 tubos de ensaye 16* 50
Probeta de 100 o 250 mL
Varilla de vidrio
Gradilla
Pipeta de 10 mL
Pipetas Pasteur (esterilizar para la siguiente clase)
Cajas Petri estriles
Asa bacteriolgica

Material que deben tener los alumnos:
Mecheros
Piseta
Papel kraft o de estraza
Maskin-tape
Plumones indelebles de punto grueso

PROCEDIMIENTO
Preparacin y esterilizacin de material de vidrio.
1. Lavar material con detergente lquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final
con agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, o secadora de cabello.
3. En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las pipetas.
7. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180C, esperar a que la
temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el tiempo de
esterilizacin (1 hora).

Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
Medio de cultivo lquido
1. Leer cuidadosamente el instructivo de preparacin.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar 100 mL de caldo del medio de cultivo y 40
ml para cada medio solido
3.-Pesar la cantidad de medio y evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del
contenido del frasco.
4. Disolver el medio en de agua destilada en un matraz de 250 mL, para el medio lquido y
de 50 mL para los del medio slido
5. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.2.
6. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 16x150 c/u
7.- Disolver el medio segn las instrucciones y autoclavear a una presin de 15 lb/in2 por
15 min. Antes de abrir la autoclave asegrese de que la presin de la olla ya este en cero
(siga las instrucciones de su profesor y tenga CUIDADO!)
8.-Una vez estril los medio slidos enfriar poco y depositar aproximadamente 20 mL del
medio slido en las cajas Petri segn corresponda el medio. Las cajas deben estar
previamente rotuladas
9.- Una vez slidos los medios se sellan con parafin, de acuerdo con las instrucciones de tu
profesor.

Investigacin previa
1.- Investigue cuales son el requerimiento nutricionales de las bacterias entricas
2.- Investigue las temperaturas y tiempo de incubacin de bacterias y hongos
3.- Investigue el uso del contador de colonias

PARTE II

Tcnicas de sembrado
1.- La presente tcnica es para el aislamiento y seleccin del microorganismo de bacterias,
a continuacin se presenta una tcnica de sembrado en cuatro cuadrantes

Tecnica de sembrado por agotamiento

2.- Los hongos se sembraran con la tcnica de agotamiento, o por picadura segn indique
el profesor.

3.- Realizar las incubaciones de las siembras a una temperatura segn corresponda el
microorganismo.

4.- Tomar lectura del crecimiento del microorganismo segn corresponda,
Tomar datos como
a.- Num. De colonias (utilizar el contador de colonias el cual se ver previamente su uso en
clase de laboratorio)
b.- Elevacin
c.- Textura aparente
d.- Aspecto (seco, hmedo) sellar la caja con parafin

5.- Refrigerar para que en la siguiente practica se realice la esterilizacin de los medios.

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