Manual de Control de Calidad en El Area de Microbiologia

“2013.
Año del Bicentenario de los Sentimientos de la Nación”
PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN EL

AREA DE MICROBIOLOGIA
“MICROBIOLOGIA”
PLAN DE ESTUDIOS
2010: IAMB-2010-206
CLAVE DE LA ASIGNATURA
AEM-1050
Elaborado por: M. en I. García Araiza María del Carmen
Santos Cruz Juan Manuel
La Paz, estado de México a Enero 2013.
SECRETARÍA DE EDUCACIÓN
SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN MEDIA SUPERIOR Y SUPERIOR
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DEL ORIENTE DEL ESTADO DE MÉXICO
PARAJE SAN ISIDRO SIN NÚMERO, COLONIA BARRIO DE TECAMACHALCO, LA PAZ, ESTADO DE MÉXICO.
CÓDIGO POSTAL 56400. TELÉFONOS 59863497, 59863498
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“2013. Año del Bicentenario de los Sentimientos de la Nación”
INTRODUCCIÓN
El área de microbiología de un laboratorio, requiere para su correcto

funcionamiento un adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas
del proceso de análisis (recepción, manejo y reporte de muestras).
En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar

metodologías relativas a la calidad de material sometido a prueba. En este
contexto el control de calidad en Microbiología incluye en los monitoreo de los
medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para
asegurar una adecuada práctica en el desarrollo, aislamiento, identificación,
conteo y su caracterización cuando este sea llevado acabo.
Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de

Procedimientos que incluya la validación de metodología, equipos el desarrollo de
ciclos de educación continuada, elementos de bioseguridad y una supervisión
sobre los reportes generados .En éste sentido el Manual deberá hacer referencia a
la correcta valoración de las pruebas de laboratorio , loa agentes microbianos
aislados y cuantificados causales de enfermedades , el conocimiento de la flora
normal , una taxonomía bacteriana general y la interpretación correcta de los
resultados obtenidos.
El aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar

que el control de calidad, ya que su foco es el impacto de los resultados de las
pruebas de laboratorio en la calidad de producto analizado, Este control nos indica
que tan bueno es nuestro trabajo y establece mecanismos para asegurar la
generación de información de utilidad para el cliente rápida y segura. Este
concepto incluye entrenamiento y calificación del personal, evaluación de los
reportes, rapidez y seguridad diagnóstica, certificación de los laboratorios
controles externos, etc.
El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo, que el producto final del
trabajo tenga un grado aceptable de seguridad, de conformidad con los límites
establecidos.
Debido a que la mayoría de los resultados de microbiología son productos de

interpretaciones y en su momento evaluación de reacciones bioquímicas de los
seres vivos , donde la capacidad y experiencia del analista tiene un gran valor , los
cálculos de coeficientes de variación y desviaciones estándares que son parte de
funciones analíticas , tienen poca aplicación en el laboratorio de microbiología .
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Es por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad de

microbiología es más un arte que una ciencia.
Un programa de control de calidad debe contar con los siguientes elementos
mínimos:
 Las pruebas y los procedimientos.

 Verificación y validación del test.
 Manual de procedimientos.
 Mantenimiento de reportes y de registro.
 Evaluación del personal.
 Controles externos
El programa evalúa y documenta el desempeño de todos los aspectos de un

procedimiento. Esto incluye la calidad del espécimen, la eficiencia de los reactivos,
medios e instrumentos y verifica los resultados del test por errores.
El Manual de Procedimientos del laboratorio de microbiología, debe contener

todos los aspectos relevantes en la operación del laboratorio y la generación de
reportes que tiene que ver con la calidad de productos analizado.
El factor más importante en la generación de reportes microbiológicos de calidad

corresponde al personal .El personal del laboratorio de microbiología debe ser
escogido en base a sus cualidades académicas y personales. Debe poseer
habilidad para ejecutar pruebas complejas, la mayoría de las veces manuales,
interés de mantenerse al día en las ejecutorias y taxonomía bacteriana, excelente
concepto de protección de grupo y de bioseguridad en general.
El control de cálida en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que

ayuda en la confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad
de los materiales, reactivos y equipos empleados, mejora la auto confianza del
personal, detecta fallas que pueden reflejarse en el informe de resultados y en
general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del trabajo.
Conociendo los elementos básicos que debe poseer un programa de control de

calidad moderno, los albores de un nuevo milenio nos obligan a la confección de
un manual que pueda ser una guía para el personal dedicado a la microbiología
sanitaria.
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TOMA DE MUESTRA
Los procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestra para análisis

microbiológico, deben cumplir con lo establecido en las Norma Oficial Mexicana
NOM-230-SSA1-2002, Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para
uso y consumo humano en sistemas de abastecimiento de agua públicos y
privados y el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM.109-SSA1-1994, Bienes y
servicios. Procedimientos para la toma, anejo y transporte de muestras de
alimentos para su análisis microbiológico.
En el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la

toma correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de
primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto
implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad,
el tamaño o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote
o partida de donde provienen.
Por ello todo el personal que tiene que ver con estas responsabilidades, debe
comprender lo determinante que es el mantenimiento de la calidad de la muestra,
en la evaluación e informe de los resultados de la misma. Es responsabilidad del
laboratorio proveer ésta información en forma clara y que sea fácilmente
incorporada en la metodología de trabajo del área, el cual debe estar siempre
accesible al personal analista como una referencia.
Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestra requieren

metodología de colección muy especial, podemos enumerar algunos aspectos
generales que deben ser tomados en cuenta al colectar las muestras para análisis
microbiológico:
 La muestra debe ser representativa del producto o proceso que se va a

evaluar. Cuando se procede a tomar la muestra, es importante evitar la
contaminación con microrganismos ambientales externos del área así como de
la flora normal humana. Estos pueden interferir con la interpretación del cultivo
y enmascarar la presencia del verdadero agente que se busca.
 Seleccione el procedimiento más práctico y correcto por medio el cual se
obtendrá la muestra, esta selección dependerá directamente del tipo de
producto o espécimen, y de la finalidad del estudio.
 En el caso de investigar microrganismos anaerobios, la muestra nunca deberá
ser refrigerada en ninguna forma.
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 Colecta una apropiada cantidad o volumen de muestra. Insuficiente material

puede ser causada de resultados falsos – negativos.
Procedimiento para la Toma de Muestra.
El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y la

finalidad del examen.
Obtención
La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para

venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose
del mismo lote y en cantidad suficiente para su análisis, enviándose al laboratorio
tal como se presenta al consumidor.
Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos

y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación
microbiana.
Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren

precauciones estrictamente asépticas.
Cuando se requiere tomar muestra aséptica, éstas no deben tomarse en áreas

donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las
mismas.
Es necesario que el personal que lleve el muestreo se lave las manos antes de
desarrollar éste. Para muestreo aséptico debe utilizar: bata, cofia y cubre boca. De
ser necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán usarse
guantes estériles.
La toma de muestras deben hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los

recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de
introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar
que la tapa se contamine no dejándola libremente.
Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin
deberá diferente de la que se envía para su análisis para evitar cualquier
contaminación durante esta actividad.
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Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que

la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los
recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. Los
alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la
temperatura en que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a
una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en
condiciones de refrigeración.
En el caso de los alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar

hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en
diferentes niveles. En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto,
debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados, cucharas,
cuchillos, etc. En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del
contenedor para obtener una muestra representativa.
Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta

de una partida a granel, antes de obtener una muestra se deben dejar pasar las
primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
Las muestras de agua potable provenientes de cisternas, tomas o tinacos algunas

veces pueden contener cierta cantidad de cloro residual, es necesario tomar
muestras a las cuales se les inhiba el cloro para ello se loe agregara una solución
de sulfito de sodio, y para medir el cloro en campo se utilizan métodos fáciles tal
es el caso de la comparación por medio de ortotolidina, o de cloro libre DPD para
ello hacer lo siguiente:
Determinación de cloro residual libre:
1. Llene un tubo para colorimetría hasta la primera marca (5ml) con la muestra de
agua. Esto constituyen un blanco. Colocar este tubo en la obertura superior
izquierda del computador. Llena otro tubo para colorimetría hasta la primera
marca (5ml) con la muestra de agua.
2. Vierte el contenido de una de las capsulas de reactivo de cloro libre DPD en el
segundo tubo de los preparados anteriormente. Realice el análisis y lea el
resultado en el curso de un minuto tras la adición de polvo reactivo. Agite la
mezcla.
3. Coloque el segundo tubo en la abertura superior derecha del comparador.
4. Oriente el comparador hacia una fuente de luz, tal como el cielo, una ventana o
una lámpara. Mire a través de las aberturas frontales del comparador.
5. Haga girar el disco de color hasta que el color coincida en ambas aberturas.
Lea los mg/L de cloro libre en la ventanilla de la escala.
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Productos perecederos
Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a

granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados
en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel, se determinará la fecha de
caducidad, con base en productos de características similares.
Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran
para fines de la norma aplicable (Proyecto NOM-109-SSA1-1994), como no
perecederos.
Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria
será únicamente por duplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su
análisis y la segunda se quedará en poder el interesado para su análisis particular
si es necesario.
En caso se impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de
Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevará a
cabo personal autorizado tomando cinco muestras en forma aleatoria del lote
existente o la cantidad o número estipulado en la norma correspondiente del
producto, la cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar
terciarías y el resultado obtenido será el que definitivamente acredite que el
producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El
número de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de
cinco o lo que estipule la norma correspondiente.
Identificación de la muestra.
En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente,

inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra, mediante rótulo o
etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:
Fecha, lugar, hora del muestreo, número de lote y temperatura de la toma de
muestra si es que procede.
La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el
nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o
violada.
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Conservación y transporte
El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de la manera que se

impida su ruptura, alteración o contaminación evitando su exposición a la luz solar
directa.
Las muestras deben entregarse a los laboratorios lo más rápidamente posible. Los
alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a
8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las
pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su
colección.
En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C,

empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeración es recomendable el
empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas
de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de
los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.
En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan
ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u
origen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el
exterior de la temperatura.
En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o

contaminen con otras.
Los productos con representación comercial deben ser transportados en sus

envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de
45°C.
Para la conservación, durante el transporte de la muestra no está permitido el

empleo de sustancias químicas.
Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe
que además de contener la identificación de la muestra, incluya los siguientes
datos:
 Número de unidades y/o cantidad.

 Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante,
representante y/o distribuidor.
 Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca
comercial y cualquier otra información que se considere importante.
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Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se

encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato
que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean
necesarios.
La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales
que indiquen el cumplimiento de las especificaciones sanitarias y el particular no
decida llevar a cabo su impugnación.
TRANSPORTE DE LA MUESTRA.
La mayoría de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en su

procesamiento, cambios de temperatura, humedad, etc. Durante el transporte las
bacterias de rápido crecimiento, pueden crecer sobre los patógenos más
fastidiosos y de crecimiento lento o requerimientos especiales, por lo que es vital
en el éxito del cultivo que la muestra sea transportada y procesada con la
celeridad necesaria.
Todas las muestras deben ser enviadas de inmediatamente al laboratorio después
de colectadas. Se debe instruir al personal responsable del transporte de la
muestra y mensajeros en la importancia de un transporte expedito de las muestras
para análisis. En los casos en que el transporte o el procesamiento pudiera
demorar, se establece a continuación las condiciones de temperatura para
algunos tipos de muestras:
Mantenimiento a 4°C:
En general todas las muestras deberán ser preservadas a 4°C usando ya sea
hielo o geles refrigerantes, para retardar el metabolismo bacteriano.
En general no guarde ninguna muestra por más de 24h bajo ninguna condición.
Sin embargo, algunas especies pueden permanecer estables por 2 a 3 días en
medios de transportes apropiados, de acuerdo a lo que se establecido en el
método de análisis.
El transporte óptimo de la muestra depende en gran parte del volumen obtenido.

Mientras menor sea su volumen, con mayor rapidez debe transportarse.
Si se anticipa que habrá demora en el envío de la muestra o si el cultivo ha de ser

enviado a otro laboratorio, se recomienda utilizar medios de transporte adecuados
como Stuart, Amies o Cary-Blair. No enviar hisopos.
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Tenga en cuenta que los medios de transporte están formulados para mantener la
viabilidad de los microrganismos, sin embargo algunos podrían no sobrevivir en un
medio pobre de elementos nutricionales específicos. Siempre que sean posibles
las muestras deben ser enviadas directamente y en forma inmediata al laboratorio
de microbiología, sin utilizar las áreas de recibo central u otros departamentos del
laboratorio.
CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS.
El personal de laboratorio debe tener siempre presente que los especímenes que
son enviados para su evaluación, representan elementos de suma importancia en
la detección, evaluación y control de enfermedades potencialmente peligrosas que
pudieran presentes dentro del proceso o del área y que la rapidez y eficiencia con
que se logre obtener información de utilidad de las mismas, tendrá repercusiones
directas en la salud pública, el manejo racional y adecuado de los recursos del
laboratorio, la seguridad del resto del personal que allí labora, el control de los
desinfectantes y bactericidas, disminución de costo de operaciones y en general la
credibilidad del laboratorio. Por todo lo anterior las muestras que son recibidas por
el laboratorio, deben ser apropiadamente colectadas, transportadas y procesadas.
Estas muestras deben representar la causa probable de una contaminación seria,
de lo contrario el procesamiento y reporte de muestras no adecuadas pueden
proveer información equivocada, lo cual puede llevar a una serie de acciones en el
proceso y por consiguiente fallas en el mismo que pueden poner en riesgo este e
inclusive en peligro la vida de consumidores. Consecuentemente, el laboratorio
debe poner en ejecución una política estricta de aceptabilidad y rechazo de
muestras.
Causales de Rechazo de Muestras:
1. Muestras no rotuladas o sin identificación.

2. Discrepancia en la identificación.
3. Envase inapropiado o medio de transporte inadecuado.
4. Demora prolongada en enviar las muestras de laboratorio.
5. Duplicidad de muestras para análisis.
6. No indicar tipo de muestra o procedencia.
7. No indicar tipo de estudio que va practicarse a la muestra en la cadena de
custodia.
8. Muestra con preservativos.
9. Muestra derramada o rotura del envase.
10. Hisopos secos o en mal estado
11. Muestra para anaerobios en envases inapropiado.
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12. Líquido colectado en bolsas mal cerradas.

13. Volumen inadecuado.
14. Contaminación obvia de la muestra.
El rechazo de una muestra debe estar acompañado de

la Solicitud de una nueva muestra. Es conveniente notificarlo a la CC y está
directamente al cliente informando las causas.
PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS
Todas las muestras para análisis deben ser procesadas lo más rápidamente
posible al llegar al laboratorio dentro de un lapso no mayor a 6 horas, pero si esto
no es posible si se sabe que el transporte es crítico se dará un tiempo máximo de
36 horas tomando todas las previsiones correspondientes. Sin embargo, su
manejo puede ser clasificado de la siguiente manera, independientemente de su
orden.
Muestras urgentes. Todas aquellas muestras que estén a punto de rebasar su

tiempo máximo de validez. Muestras foráneas. Cuando estas muestras se
encuentran rotuladas con la advertencia “Urgente” los resultados deben ser
informados telefónicamente al cliente solicitante.
Muestras de Rutinas. Todas aquellas cuyos resultados pueden ser reportados en

el tiempo normal de entrega, con la respectiva elaboración de su informe.
CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del

exterior, así como la formación de agua dentro de los envases como consecuencia
de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorece el crecimiento
bacteriano esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y
cambios en el color del medio. Además la exposición a la luz puede llevar a
importantes alteraciones en los constituyentes del medio del cultivo.
Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura
ambiente y protegidos contra la humedad y la luz
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La mayoría de los suplementos se guardan en refrigeración. Utilizando

condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo
tienen una vida útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios
substanciales, tales como hidratación, endurecimiento y cambios de color, deben
descartarse.
Se deben mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado,

con el nombre del producto, numero, de control del frasco, fecha de recibo, fecha
de expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco, así como los
resultados de las pruebas iniciales de promoción de crecimiento las cuales se
realizan cada vez que ingrese un lote nuevo de medio de cultivo deshidratado y
que consiste en preparar un litro del medio de cultivo nuevo que ingrese a
laboratorio y realizar las siguientes pruebas:
pH
Con el potenciómetro previamente calibrado realizar la medición de pH antes y

después de la esterilización para verificar que se mantengan dentro de los límites
que abarca el fabricante, para medir el pH tomar una pequeña porción del medio o
caldo en un vaso de precipitado en condiciones de esterilidad, si es te no es
correcto procede a ajustarlo con soluciones de hidróxido de sodio 0.1 normal o si
fuese necesario con HCl 0.1 normal. El pH se debe medir con soluciones trazables
al CENAM y verificar con solución comercial.
PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO
Una vez trazada la esterilización en un par de tubos o placas según sea el caso,
es necesario inocular un microrganismo cuyo desarrollo en el medio recién
preparado sea ambulante, de tal forma que se verifiquen las cualidades del medio
para promover el crecimiento óptimo. Reportar de modo cualitativo como crece o
no crece, realizar esta actividad únicamente inoculado de una cepa de control de
trabajo diario en este caso Escherichia coli y Enterobacter aerogenes por medio
de una asada en cada uno de los tubos de prueba, en cuanto a medios solidos
verter en la caja el medio y dejar solidificar realizar una serie de estrías por cada
medio con los respectivos organismos de prueba. Hacer esto por lote de medios
preparados.
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Por otro lado es necesario realizar esta actividad reforzando como la validación de
medios de cultivo en este caso sólidos tal es el caso del Agar para métodos
estándar, Agar dextrosa y papa, agar rojo bilis verde brillante, y Agar soya y
tripticaseina, para ello se utiliza la técnica de validación de medios denominada
Vaciado en placa con la cual se obtendrá el Índice de recobro de cada medio y la
cual se propone realizar cada vez que es adquirido el medio de cultivo, realizarlo
mensualmente para comprobar que los medios de cultivo cuentan con las
características necesarias para aceptar una buena promoción de crecimiento.
PRUEBA DE FUNCIONALIDAD
En esta prueba se confirman las propiedades de un medio selectivo de inhibir el

crecimiento de diferentes microrganismos y favorecer el crecimiento de otro en
particular, por lo tanto dos tubos o placas del medio preparado es inoculado con
un microrganismo el cual debe ser inhibido para verificar esta propiedad. Se
realiza esta actividad en cada lote preparado de medio.
ESTERILIDAD
El último par de tubos incubado a la temperatura normal de incubación pero sin

ser inoculado con ningún microrganismo con lo cual se verificará la esterilidad del
medio dejándolo de 48 a 72 horas de incubación si al término de este tiempo no se
encuentra desarrollo en los tubos o placas el medio se aprueba. Realizar esta
actividad por cada lote de medio preparado.
VALIDACION DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Técnica Ecometríca de Mossel y Col., (1984)

Sembrar las capas seleccionadas en 10 ml de un caldo de enriquecimiento e
incubar de 18 a 24 h a 35°C ± 2°C. Se requieren 6 medios de cultivo de prueba,
por ejemplo Agar SS, 3 medios de cultivos sembrados con una cepa que debe
crecer: Salmonella typhim, Shigella fiexneri
Tres medios de cultivo sembrarlos con una cepa que se inhiba o tener un
desarrollo parcial: Enterococcus fecalis
Escherichia coli
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Dividir las cajas con el medio de cultivo en 4 cuadrantes. Cargar un microlitro

(0.001ml)con una asa calibrada estéril del cultivo de 24h, realizar 5 estrías en
forma diagonal en un cuadrante con el mismo inoculo sembrar cada uno de los
cuadrantes restantes. Finalizar con una estría oblicua en el centro.
 Seguir el mismo procedimiento para el medio de control.

 Incubar de 24 a 48 h a 35°C ± 2°C.
 Observar el crecimiento obtenido, el resultado se expresa con numero de 6
cifras, en donde las tres primeras representan la presencia del crecimiento en
las estrías de la cepa que debe desarrollar.
 Interpretación.
VALOR DE CADA ESTRIA POR CUADRANTE

1 0.2
2 0.4
3 0.6
4 0.8
5 1.0
El valor de cada cuadrante si desarrolla el microrganismo en las 5 estrías es 1. El

valor de la estría oblicua es 1. El valor total del medio de prueba y de control es de
5.
 Desarrollo en 1 estría=0
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Un medio de cultivo selectivo está representado por la cifra: 555 000. Son
aceptables para un medio de cultivo selectivo los siguientes resultados:
CIFRA VEREDICTO
555 000 MUY SELECTIVO ES IDEAL
554 001 APROBADO Y EL MEDIO ES SELECTIVO
544 110 APROBADO Y EL MEDIO ES SELECTIVO
533 221 MAS O MENOS SELECTIVO
441 332 RECHAZADO
320 332 RECHAZADO
REFERENCIA: Mossel D.A.A. Et al 1983, Qualyti Assurance of selective Culture

Media for Bacteria, Mounds and Yeasts: An Attempt at Standarization at the
International Level. J. Appl. Bacteriol. 54, 313-327.
METODOS DE VACIADO EN PLACA PARA VALIDACION DE MEDIOS

SOLIDOS
Este método es aplicable para los siguientes medios de cultivo en los cuales se
usan técnicas de vaciado en placas para determinación de microrganismos
coliformes totales, hongos y levaduras, cuenta total de mesofilos aerobios, para
medios de enriquecimiento como es el agar de soya y tripticaseina.
Para ello realizar el siguiente procedimiento:
 Sembrar las cepas seleccionadas en un caldo de enriquecimiento

 Incubar 18-24 h a 35 °C
 Igualar cada uno de los cultivos de prueba a la turbidez del tubo N° 1 del
Nefelómetro de Mac Farland
 Preparar de cada suspensión bacteriana estandarizada las siguientes
diluciones decimales:
DILUCION 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

SOLUCION
REGULADORA
9.9 9.9 9.9 9.9 9.9 9.9 9.0
DE FOSFATOS
pH 7.2
SUSPENSIÓN
BACTERIANA
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0
ESTANDARIZADA
3 X108 UFC/ml
UFC/ml 30000000 3000000 300000 30000 3000 300 30
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 Rehidratar el medio de cultivo de prueba y control con agua destilada

 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
 Enfriar a 45°C. mantener a baño María a esta temperatura
 Colocar 1ml de inóculo seleccionado para el medio de prueba en una caja de
Petri estéril
 Seguir el mismo procedimiento para el medio de control.
 En condiciones de esterilidad adicionar aproximadamente 18 ml del medio
conservado a 45 °C
 Dejar solidificar
 Incubar las muestras 24 – 48h a 35°+- 2°C
 Calcular el INDICE DE RECUPERACIÓN (IR), como sigue:
IR =No. De colonias en el medio de cultivo de prueba s factor de dilución x 100

No. De colonias en el medio de cultivo de control x factor de dilución
Ejemplo:
Medio de cultivo de prueba = 20 UFC/ml dilución 10-7

Medio de cultivo de control = 25 UFC/ml dilución 10-7
IR= 20x10-7 x 100
25x10-7
=20x100
25
=0.8x 100= 80%
 Se incluye que el cultivo de prueba tiene 80% de recuperación.
NOTA: Después de esterilizar los medios en autoclave, no mantenerlos más de 3

horas de 45°C. El medio solidificado estéril solamente puede licuarse una sola
vez.
REFERENCIA: Ellis Robert j., 1981. Quality Control Procedures for Microbiological
Laboratories. Dep. Of Health and Human Service, CDC, Atlanta, Ga.
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MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS
 Preparar los medios de cultivo deshidratados de prueba y control de acuerdo a

las instrucciones del fabricante.
 Seleccionar las cepas de ensayo.
 Sembrarlas en 5ml de un caldo de enriquecimiento.
 Incubar 18-24 a 35° +- 2°C.
 A partir de cada cultivo de 24 h preparar disoluciones decimales con el medio
de prueba 10-1 hasta 10-12
 Simultáneamente realizar las mismas disoluciones en un caldo de control o
testigo.
 Incubar 18 h a 35° +- 2°C
 Examinar si hubo desarrollo (turbidez).
 Para determinar el % de recuperación aplicar la siguiente fórmula:
% Recuperación= (No de tubos de prueba con crecimiento / No. De tubos control

con crecimiento) x 100
REFERENCIA. Mossel D.A.A. Et al 1983, quality Assumerance of selective

Culture Media for bacteria, Mounds and Yeasts: An Attempt at standardization at
the International Level. J. Appl. Bacteriol. 54, 313-327
Las pruebas anteriores se realizaran cada vez que ingrese un frasco de medio
Nuevo al laboratorio y en cada lote de preparación del medio se hace pruebas de
funcionalidad, de promoción de crecimiento cualitativo, y prueba de esterilidad.
El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo
ya preparado, dependen de gran medida del procedimiento empleado en la
rehidratación. Se recomienda utilizar agua recién destilada o completamente
desmineralizada y un Erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se
requiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, deben agitarse
constantemente para asegurar una adecuada homogenización al momento de
servirlos.
Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo,

presión y temperatura para la obtención de medios de cultivos óptimos. Una
temperatura de 121°C, presión de 15 libras y un tiempo de esterilización de 15
minutos, son suficientes para la mayoría de los medios.
Si no se disponen de autoclave, es posible esterilizar en una olla de presión de

vapor a las mismas condiciones.
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En ambos casos la esterilización debe ser controlada usando cinta testigo cada
vez e indicadores biológicos de esterilización cada 3 semanas para verificar la
efectividad de este proceso.
El medio esterilizado debe ser enfriado entre 45° y 60°C en un baño maría o dejar
enfriar a temperatura ambiente para evitar la formación de agua de condensación.
Al ser vertidos dentro las placas Petri, evitar la formación de burbujas y coágulos.
Durante el proceso de servida, debe tomarse una muestra del medio (una caja o
un tubo) para realizar el control de calidad para esterilidad y eficiencia.
El medio del cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de
inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su
utilidad durante un periodo de tiempo no mayor a 6 meses. El almacenamiento a
4°C es el mejor para la mayoría de los medios.
Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz

puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se aconseja
que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas, las cajas Petri bien
almacenadas así deben mantenerse con el fondo hacia arriba.
Cada lote de medio almacenada se etiquetara con los datos del lote recién
preparados estos son:
 Fecha de Preparación
 Determinación para el cual es utilizado
 Cantidad preparada
 Nombre y referencia de quien lo preparo
 Clave de lote asignada en su preparación
Pueden ser utilizadas las etiquetas que se usan para el resto de los reactivos
disponibles en el laboratorio. Dados que los medios almacenados en refrigeración,
cuando pasa a temperatura ambiente tiende a formar agua de condensación en la
superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35°C durante 2
horas, colocándolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca.
Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de
las colonias tanto el aislamiento como en los casos de pruebas especiales (de
sensibilidad a los antibióticos) en las que el exceso de agua puede afectar la
dilución de las colonias y por ende la lectura de la propiedad a ser medida (por
ejemplo de halo de inhibición).
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Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por
eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microrganismos cuyo
comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.
Pueden utilizarse para ello cepas bacterianas domesticas o cepas de control

comerciales (calidad o clasificadas como ATCC). Se deben mantener en bitácora
o libro de registro de los resultados obtenidos.
Evite el congelamiento de los medios preparados o en su caso de los suplementos

o sustancias a ser usadas (por ejemplo sangre de carnero u otros suplementos).
Al colocar en el refrigerador los medios preparados, deben colocar los de más
reciente preparación al fondo y los más viejos adelante.
DESECHO DE MEDIOS DE CULTIVO
Para los desechos de medios de cultivo tanto usados como aquellos que por
tiempo ya caducaron o se contaminaron, se deben esterilizar colocándolos en
bolsas de plástico (placas Petri) cerradas para evitar que se derrame el agar
licuado y dañen el autoclave. En el caso de los medios líquidos se esterilizar y
después pueden ser vertidos en la tarja al chorro del agua, lo anterior es en cajas
de medios de cultivos pequeñas ((menores de 5 Kg de desecho a la semana, de
tratarse de cantidades superiores será necesario contratar una compañía
especializada en dicha actividad.
Pruebas Básicas de Control para los Medios Recién Preparados:
pH. Mida el pH antes y después de la esterilización de modo que el valor obtenido

se mantenga dentro del intervalo reportado por el fabricante,
si esto no ocurre descartar el lote preparado y vuelva a preparar otro lote de
trabajo.
Esterilidad. Incube a las condiciones normales una caja o un tubo y registre el

resultado. El resultado para aceptar la prueba de esterilidad es que no se presente
ningún tipo de desarrollo.
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Promoción de Crecimientos y Reacción Selectiva:
Siempre en una caja Petri o en un tubo el microrganismo de control positivo

específico para evaluar el medio, así como el microrganismo de control negativo y
registre todos los datos obtenidos de forma que sean comparados contra los
reportados por los manuales o literatura técnica en cuestión esto se realiza
únicamente cada vez que se compre un medio de cultivo y que se haga la
apertura de este, de forma cuantitativa o a la llegada de alguno de estos, y de
forma cualitativa por cada lote de medio preparado.
Criterios de Calidad para los Medios de cultivo Preparados y Almacenados:
 Rajadura del plato o envase

 Rajadura en la superficie del medio
 Variaciones en el volumen del medio
 Hemólisis solo si se utiliza algún medio base con sangre de carnero.
 Cristales en el medio
 Presencia de burbujas
 Presencia de coágulos
 Cambio de color normal
 Contaminación evidente. Falla en la inhibición o crecimiento no característico
de microrganismos de control negativos.
Fallas y Causas en la Preparación de medios de Cultivo:
Valor de pH incorrecto
Medir el pH por encima de los 25°C. Sobrecalentamiento en la esterilización,

vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50°C. Solución incompleta del medio.
Mala cantidad del agua usada en la preparación. Recipiente mal lavado o con
residuos químicos. Mala conservación del medio deshidratado o vencido.
Turbidez o Precipitación
Manual calidad del agua. Sobrecalentamiento. Incorrecto pH. Solución incompleta.
Oscurecimiento
Sobrecalentamiento. Solución incompleta. Alteración del pH.
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Gel Reblandecido
Bajo porcentaje de agar en el medio si está preparado a partir de sus ingredientes.

Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
Sobrecalentamiento. Mala homogenización del medio. Exceso del agua.
Crecimiento Bacteriano Pobre
Exceso de calentamiento. Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.

Alteración en el pH. Evaluación en la eficiencia de algunos Medios de Cultivo
preparados de uso común en el laboratorio de microbiología. En el Formato LTA-
CC-PTO-51A-F1 se llevará acabo el registro de preparación de medios de cultivo
cada vez que se prepare un lote, donde se registrara, la fecha de preparación, el
pH, promoción de crecimiento, prueba de esterilidad con las iniciales del analista y
supervisor.
Control de los Suplementos:
Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo,

pudieran confrontar problemas de eficiencia o inhibición, ya que como todo
producto pudiera no haber sido almacenado y7o transportado adecuadamente.
Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con estos suplementos,
pudiera darnos la alarma de problemas en los mismos. Muchos suplementos son
lábiles al calor, por ello se añaden al medio después de la esterilización para evitar
su deterioro.
Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN, deben ser utilizados dentro
de los 8 días siguientes a su preparación ya que la eficacia de la mezcla decrece
muy rápidamente.
La misma advertencia es aplicable a los frascos de VCN rehidratados, por lo que

conviene guardarlos congelados si no se van a usar de inmediato. No sobrepasar
los 15 días.
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En el caso de la sangre de carnero para la preparación del Agar Base Sangre, es

importante cada vez que se reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar
por presencia de coágulos, hemólisis, número de lote, fecha de recibo y
expiración, hacerle una determinación de hemoglobina, la cual debe medir entre
los 13.0 y 15.0 g/dL, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla una
pequeña muestra del vial para sembrarla en Agar Sangre y Tioglicolato para
determinar su esterilidad. También se debe examinar el agar sangre preparado
con sangre de carnero, por adecuada formación de hemólisis, especialmente
utilizando Estreptococos hemolíticos.
Control de Reactivos:
Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituye los

reactivos, tanto comerciales como de preparación doméstica, que son utilizados
en la caracterización de microrganismos. Estos reactivos merecen una especial
atención, toda vez que fallas en su funcionamiento pueden generar
identificaciones equivocadas.
Por ello, se recomienda correr controles cada que sean usados con las cepas tipo
y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto almacenamiento de los
reactivos, metodología de la prueba y tiempo de lectura.
Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente

cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento.
Reactivo Microrganismo de Control Reacción Esperada

Coagulasa Staphylococcus aureus Coágulo Coagulasa Positiva
Staphylococcus epidermidis Inerte Coagulosa Negativo
Oxidasa Pseudomona aeruginosa Negro. Oxidasa Positivo
E. coli Inerte. Oxidasa Negativa
Catalasa Staphylococcus sp Burbujas. Catalasa Positiva
Streptococcus sp Inerte Catalasa Negativa
Ehrlich E. coli Anillo rojo. Indol Positivo
Klebsiella pneumoniae Incoloro Indol Negativo
Cloruro Férrico Proteus sp Verde Fenilalanina Negativo
E. coli Incoloro Fenilananina
Negativo
Sobres de Anaerobiosis Bacteroides sp Crecimiento en
Anaerobiosis
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CONTROL DE LOS TINTES
La clasificación correcta de las baterías de acuerdo de las reacciones bioquímicas

de la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentración de las
soluciones por efecto de la evaporación de los solventes o las variaciones
introducidas en los métodos recomendados, puede afectar los resultados de modo
adverso. Este es el caso de las tinciones para diferenciar bacterias por su reacción
al Gram y la morfología bacteriana, tintes para cápsulas, esporas, etc.
A) El control de calidad de estos tintes deben realizarse primero con cada lote
preparado; luego basta con un control cuando se utilice para mantener un
grado de seguridad apropiado en su uso.
B) En el caso de la tinción de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas
más importantes de microbiológico, se recomienda tener especial cuidado con
la mezcla de alcohol-acetona para decolorar la placa. Es posiblemente este
reactivo el que produce mayores problemas ya sea por decoloración excesiva
o por débil decoloración de los microrganismos. Es también la etapa de la
tinción de Gram en la que el tiempo de exposición es más determinante.
C) Para facilitar el control de los tintes, se recomiendan preparar placas con
microrganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas,
tomando en cuenta aquellos que pudieran set más útiles según la tinción a
evaluar.
Algunos ejemplos son:
Tinción Microrganismos Reacción esperada

Gram Estafilococo sp Morado. Gram –Positivo
E. coli Rosado. Gram-Negativo
Mezcla de ambos Mezcla de Ambos colores
Verde de Malaquita Clostridium sp Esperas de color verde
resto de la célula dorada
E. coli Célula completa rosada
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Causas de error durante la Tinción:
El Violeta Cristal tiende a precipitar, lo cual puede ser causa de conservación de

estructuras ficticias en el frotis. Si se observa precipitación, proceda a filtrar el
tinte.
La vaporización puede ser causada de mal funcionamiento de los tintes.
Las placas que no han sido previamente limpiadas o con restos de grasa, pueden
ser causa de mala fijación y tinción de la muestra.
Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca un
daño físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de
los colorantes.
Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción.
Proporción no adecuada de los componentes de la tinción.
Algunos tintes como Safranina y Fucsina básica puede contaminarse. Si se
sospecha esto, cultive 1 ml en Caldo Tioglicolato, o descarte el tinte.
Una Cepa Control positiva, debe ser teñida cada vez que un nuevo lote de tintes
para Zielh-Neelsen es preparado y cuando se reciba un nuevo pedido de tintes y
reactivos. Puede utilizar la cepa de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177
como control positivo en caso de ser necesario.
CONTROL DE EQUIPOS Y MATERIALES DE TRABAJO
Objetivo:
Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio, deben estar amparados por un

programa de verificación y de mantenimiento preventivo, vasados en las
instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos.
Programa de mantenimiento:
Un programa de mantenimiento preventivo es especial para asegurar la exactitud

y longevidad del instrumento. El chequeo periódico recomendado es importante
para minimizar el daño o la necesidad del servicio y separación. El coordinador del
Área de Microbiología, recayendo en el analista la responsabilidad primaria en su
área de trabajo apoyando al Coordinador.
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Expedientes de Equipos:
Estos registros deben ser organizados por grupo uno para equipos y otro para
instrumentos.
Ambos deben incluir un listado en el cual se incluirán: nombre, marca, modelo,
número de serie, fecha de recibo y número de inventario del laboratorio.
Los nuevos equipos requieren una inspección previa para garantizar su
funcionalidad y seguridad eléctrica.
La documentación debe estar accesible al personal en todo momento.
Instructivo de Operación de los Instrumentos:
Estos instructivos deben estar incluidos en los expedientes de cada instrumento,

redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive si es aplicable la
documentación del entrenamiento del personal.
Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de

limpieza y cuidado del instrumento. Estos instructivos deben incluir instrucciones
básicas para resolver problemas menores y un récord de incidencias, que incluye
el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la acción correctiva para
evitarlo en el futuro.
Calibración del instrumento:
Los equipos que requieren un exacto nivel para obtener un resultado seguro,
requieren de una calibración periódica. La fecha de la calibración, frecuencia y
resultado, deben ser mantenidos dentro del expediente y en la bitácora de control
de uso correspondiente dentro del laboratorio.
Control de calidad:
Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base
a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio.
Debe mantenerse un expediente récord de todo lo realizado al respecto, la fecha,
resultado y comentarios.
Referencias y Lecturas Suplementaria:
El laboratorio incluirá en un fólder toda literatura extra que acompañe o que se

obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, etc. Sobre su
funcionamiento y operación.
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Incubadoras:
Controle y registre diariamente la temperatura de las incubadoras, antes de sacar

el material en incubación anotando en la carta de control la lectura observada.
Observe el termo-regulador por cualquier alteración en su posición prestablecida.

Coloque las muestras, cajas de Petri y tubos, en una posición segura.
Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es
adecuado para mantener le humedad requerida.
Las incubadoras de CO2 requieren medir y registrar el nivel de gas diariamente si
es el caso.
El Coordinador del Área Analítica debe ser notificado cuando una incubadora falla
en mantener el rango de temperatura aceptable.
Observe visualmente si los medios de cultivo en caja Petri o en tubo presentan
desecación e informe de esto a sus superiores para tomar las acciones correctivas
correspondientes.
En incubadoras de CO2, si es el caso se recomienda colocar un cultivo de N.

gonorrhoeae , subcultivandola cada día, para observar su óptimo crecimiento, ya
que es un microrganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer.
A todas las incubadoras les deben ser practicadas una limpieza periódica
(bimestralmente es recomendable), llevando un récord de esta actividad de
mantenimiento preventivo.
Actividad Por corrida Diario Semanal Mensual

Cuide, mantenga
y registre la
Temperatura y X
presión de
esterilización
Utilice sinta
testigo para
X
control de la
esterilización
Utilice
indicadores
biológicos de X
Esterilización
para verificar la
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eficacia de la
esterilización
Registro de Uso X
Chequeo del
X
nivel del agua
Chequeo del
funcionamiento
X
de la válvula de
seguridad
Limpieza del
X
interior y Exterior
Verificación del
X
manómetro
Limpieza del
X
drenaje y sellos
Autoclaves
En el formato se registrará el uso de la autoclave cada ocasión que se utilice,

donde se establecerá el material o medios que fue sometido al proceso de
esterilización, así como las condiciones bajo las cuales se realizó.
Uso de Indicadores Biológicos
Con Sterikon plus bioindicador MERCK pueden controlarse autoclaves respecto a
la capacidad de su funcionamiento (15 minutos, 121 °C). Este consta de una
ampolleta, que contiene caldo nutritivo, azúcar, un indicador de pH, así como
esporas de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 (de esporulación
optimada) como organismo de ensayo a patógeno. La termoresistencia está
ajustada de tal manera que las esporas mediante calentamiento en vapor a
presión 121 ± 0.5(245 kPa) experimentan una destrucción total. A temperatura
más baja o tiempo de acción más breves las esporas sobreviven al menos
parcialmente.
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Las ampollas se agregan al material de carga. Después de haber tenido lugar el

autoclave se controla el éxito de la esterilización mediante incubación de ampollas:
si no existe crecimiento de Geobacillus stearothermophilus queda demostrada
una esterilización suficiente, mientras que la existencia de crecimiento indica una
esterilización insuficiente.
Aplicación.
Al realizar la esterilización en la autoclave se adjunta un correspondiente número
de ampollas a la carga de la autoclave. Se recomienda dotar a las autoclaves que
tengan un volumen de hasta 250 litros con 2 ampollas como mínimo, y a las que
tengan más de 250 litros de capacidad como mínimo 6 ampollas. Para evitar
contaminación en caso de rotura fortuita de la ampolla se recomienda situar está
en un vaso de precipitados.
Las ampollas deben colocarse en aquellos sitios donde de acuerdo con la
experiencia exista las condiciones de esterilización más desfavorables, es decir,
en el espacio inferior y medio de la autoclavaje de volúmenes individuales
grandes solamente es posible un ensayo con ayuda del bioindicador si se coloca
la ampolla en el centro correspondiente recipiente colgado en el interior de un
matraz o introducido en el contenido de las conservas. Otra posibilidad de empleo
de Sterikon bioindicador consiste en el control de autoclaves respecto a su
completa capacidad de funcionamiento, esto es, examinar si una autoclave
alcanza la temperatura prescrita de 121 ± 0.5 °C en todo el espacio interior y si la
conserva durante el tiempo prescrito de 15 minutos. La utilización de los
bioindicadores se hace dos veces por semana, ya que la demanda de
ampollas para la determinación del método es grande. Estos pueden ser
ingresados en cualquiera de las cargas del día, y solo se meten dos
ampollas a la carga seleccionada.
Después de la esterilización se toman las ampollas y se incuban a 60 ± °C durante
48 horas. Como control debe incubarse simultáneamente una ampolla no
esterilizada. No se recomienda el empleo a más de 125 °C de temperatura en el
esterilizador debido a un posible daño del bioindicador.
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Evaluación
En caso de esterilización suficiente de las esporas de Geobacillus
stearothermophilus quedan destruidas. El color del contenido de las ampollas
permanece violeta rojizo y transparente. En caso de esterilización insuficiente
sobreviven las esporas de Geobacillus stearothermophilus. El contenido de las
ampollas muestra generalmente ya dentro de 24 horas de incubación un viraje de
color hacia amarilla-naranja por formación de „acido como consecuencia de la
fermentación del azúcar así como una turbidez debida a crecimiento. En caso de
daño parcial de las esporas puede retrasarse la reacción. El contenido de la
ampolla de control vira igualmente hacia amarilla- naranja y se enturbia.
Estabilidad
En caso de almacenamiento en el refrigerador según las prescripciones de 2 hasta
8 °C es como mínimo estable hasta la fecha de caducidad impresa en el envase.
Conservación
El almacenamiento de las ampollas debería tener lugar en frigoríficos de 2 hasta 8
°C, en temperatura ambiente aproximadamente de 1 a 2 semanas. El
almacenamiento a temperaturas superiores a 30°C altera la estabilidad.
Valores característicos.
Los valores característicos de Sterikon plus bioindicador son:
N=5x105-1x107 por unidad
D121= 1,5 a 2,0 minutos
Análogamente a las declaraciones de la USP, la resistencia al calor y el numero
de esporas están ajustados entre si de tal manera de que después de un tiempo
de esterilización de 6 minutos y 121 °+- 0,5 °C todas las esporas están destruidas.
Para el periodo intermedio se encuentra tanto ampollas con esporas vivas como
ampollas con esporas muertas. Las esporas ya se encuentran en solución
nutritiva.
REFERENCIA : I.D. Costin, J. Griego : Bioindikatoren zur
Autoklavierungskontrolie, einigetheorestische aspekte u. praktische Erfahrungen
bei Entwicklung und Anwrndung,-Zbl. Bakt. Hyg., I. Orig. A, 227, 483-521 (1974)
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 United States Pharmacopoeia 23 (1995)

 European Pharmacopoeia, 3rd edition 1992
 Sterikon plus bioindicador (instrucciones de uso)
Áreas de siembra y de trabajo:
En general se mantendrá un elevado nivel de limpieza en las áreas de trabajo.

Controlado la calidad del aire (carga microbiana) mensualmente realizando un
monitoreo ambiental, para el cual se exponen placas con diferentes medios de
cultivo por un tiempo de 15 minutos, tiempo durante el cual en el trabajo del área
será el rutinario. Los puntos a evaluar se determinaran considerando los puntos
críticos (mayor contaminación por manejo de muestras, corrientes de aire y en el
área estéril) o más importantes en donde se trabaja por ejemplo en la preparación
de medios, el área de siembra, puerta de acceso etc.
Una vez incubadas las placas de exposición el resultado no debe superar los 15
UFC/placa/15 minutos. En cuyo caso se deberán ajustar las medidas de limpieza y
desinfección del área. También es importante para área de siembra establecer un
rol de desinfectantes de tal forma que no se permita la resistencia de los
microrganismos con los que usualmente se trabaja y se promueva la
contaminación del área. Para este rol de desinfectantes es necesario realizar la
prueba de germicidas o reto bacteriano que a continuación se describe.
PRUEBA DE RETO BACTERIANO O GERMICIDAS.

Se llevara acabo de acuerdo al PROGRAMA DE ROTACIÓN DE GERMICIDAS
ANUAL, en donde se indica que germicida es utilizado semanalmente pero la
prueba de esta se realiza bimestralmente, debido a la carga de trabajo.
Primero se debe conservar las cepas de los microrganismos de prueba
(Staphylococcus aureus y Echerichia coli) resembrándolas cada dos semanas en
tubos con medio de cultivo inclinado, este puede ser BHI o Soya Tripticaseína, los
cuales se incuban de 20 a 24 horas a una temperatura de 35 a 37°C, y
mantenerlos posteriormente en refrigeración.
Después se debe, realizar dos resiembras de cada uno de los microrganismos a
prueba e incubar de 20 a 24 horas a una temperatura de 35 a 37°C.
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A partir de estos cultivos, resembrar cada uno de los microrganismos de prueba

en tubos que contengan cada uno 12ml de agar nutritivo inclinado e incubar en
las condiciones señaladas . Remover el crecimiento de cada tubo, con 3 ml de
solución salina, transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo estéril y continuar
diluyendo con la misma solución hasta obtener una suspensión que leída a una
longitud de onda de 580nm, de una lectura entre 3% y 5% de transmitancia.
Determinar en la suspensión el número de UFC/ml y precisar el % de
transmitancia de una suspensión que contenga de 75 a 125x10 8 UFC/ml. Lo
anterior se verifica de acuerdo a lo indicado de la norma oficial mexicana NOM-
092-SSA1.
Colocar en cajas de Petri estériles, por duplicado 1 ml de cada dilución, agregar a
cada placa de 15 ml a 18 ml de agar para métodos estándar, homogenizar y dejar
solidificar invertir las cajas de Petri e incubar durante 48 h de 30° a 35 °C. Contar
las colonias obtenidas.
DETERMINACION DE CELULAS SOBREVIVIENTES.

Para cada uno de los microrganismos de prueba, medir exactamente y por
duplicado 99 ml del producto o su disolución transferir a matraces Erlenmeyer de
250 ml con tapón de roscas estériles.
Agitar los matraces, suspender la agitación, justamente antes de la inoculación
para que en el momento de la misma, aun exista movimiento residual del líquido y
asi facilitar la incorporación del inoculo. Inocular en forma individual cada matraz
con cada uno de los microrganismos de prueba en el centro de la superficie del
líquido, evitando tocar con la pipeta, el cuello o las paredes del matraz. Agitar el
matraz con la muestra inoculada y exactamente 30 s después de la inoculación,
transferir 1 ml de la misma, a un tubo de ensayo y conteniendo 9 ml de caldo
neutralizante, mezclar y transferir por duplicado alícuotas de 1 ml a cajas de Petri
estériles y continuar diluyendo hasta tener las disoluciones necesarias para
obtener placas que contengan colonias de 25 a 250 colonias, agregar a cada
placa de 15 a 18 ml del medio agar para métodos estándar con neutralizante,
homogenizar , permitir que solidifique, invertir las placas durante 48 h entre 35° a
37°. Después del periodo de incubación, contar el número de UFC en las placas.
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EXPRESION DE RESULTADOS.
Determinación de % de reducción.
Promediar los resultados de las placas de la cuenta viable inicial y de las células
sobrevivientes y calcular el % de reducción mediante la siguiente formula:
% de REDUCCIÓN= 100 – SX100
C.V.
Dónde :
S=son las células sobrevivientes UFC/ml
C.V.= es la cuenta viable inicial
Informar el porcentaje de reducción obtenido en la muestra del producto
INTEPRTACION DE RESULTADOS
Un producto etiquetado como germicida, debe tener un % de reducción de la
cuenta viable del 99.999% en 30 s de contacto a la concentración del uso
recomendada, cuando la cuenta viable inicial se encuentre entre 75 y 125 x10 8
UFC/ml.
REFERENCIA: NMX.-BB-040-SCFI-1999 Métodos generales de análisis –
Determinación de la actividad antimicrobiana en productos germicidas.
Puntos importantes antes de comenzar a trabajar:
Apegue la lámpara ultravioleta antes de comenzar a trabajar.
Limpie y desinfecte el área antes y después de trabajar.
Si hay derrame dentro del área, limpie con un desinfectante apropiado,
manteniendo prendidos los mecheros.
Realice evaluaciones ambientales del área de siembra de forma quincenal para
detectar contaminación.
No utilice el área para hacer mezclas de sustancias químicas u otras
determinaciones
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Cuando trabaje en el área, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de

las puertas del área.
La lámpara de luz ultravioleta se utilizara después de realizar la siembra.
Generadores de Ambiente (Sistema Gaspak).
Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado.

Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas
sellados.
Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeración (2-8 °C).
El tiempo de generación de la atmosfera dentro de la jarra es de 30 minutos.
El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4
a 5 horas.
Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color rojo a vino
del agar sangre.
Algunos microbiólogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novy B como
indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto.
Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocándolos en horno a
160 °C por 2 horas.
Control biológico de crecimiento.
Cepa ATTC Resultado
Clostridium perfringens 13124 Crece
Mocrococcus luteus 9431 No Crece
Campilobacter jejuni 33291 Crece
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Control diario de la temperatura.
Coloque los platos Petri en posición invertida con la tapa hacia abajo.
Mantenga una temperatura de operación entre 4 – 8 °C.
Utilice refrigeradores que no hacen escarcha.
No coloque medios de cultivo aun ligeramente calientes dentro del refrigerador.
Evite abrir con frecuencia la puerta del refrigerador
Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solución.
No guarde alimentos en refrigeradores para los especímenes en estudio.
Microscopios.
Centrifugas:
Problemas y Limitaciones.
Vibración.
Checar por balance apropiado.
Checar tamaño de los tubos.
Mirar si la centrifuga esta sobre una superficie plana.
Verificar el interior de los portatubos.
Para evitar el desprendimiento de tapas: Utilice tapas de rosca. Si es posible, use
Parafilm sobre los tapones de caucho.
Siempre que sea posible utilice tubos de plástico.
No centrifugue grandes volúmenes de líquidos inflamables, los cuales pueden
producir vapores que pueden incendiarse durante la operación del equipo.
La concentración de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el
área rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estén bien cerrados.
No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar.
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Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son
altamente corrosivas y dañan el portatubo.
Elemanteo / Accion Semestral

Por Corrida Diario Semanal Mensual
(cuidados y mantenimiento )
Verificar que los tubos no

X
tengan rajaduras.
Verificar que las camisa

portatubo no tengan restos
X
de vidrio o liquido en su
interior
Verificar la uniformidad del

balance de las camisas por
X
partes en cada lote de
análisis.
Verifique la temperatura de
operación cuando sea
X
aplicable en muestras
refrigeradas o congeladas
Limpie de cualquier derrame X
Limpie de la olla del rotor X
Limpieza extrema X
Desinfección de la olla del

X X
rotor
Verificación de brochas X
Cheque de circuitos
X
eléctricos
Verificación de la integridad X
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del Velocímetro
CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA
El agua destilada utilizada en la preparación de medios de cultivos y para

reconstruir reactivos, debe tener un control de calidad básico que incluye los
siguientes parámetros.
Control de Calidad Químico:
Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de
parámetros a evaluar tales como:
Conductividad, pH, Olor, Color aparente, Turbidez, Alcalinidad, Dióxido de

Carbono, Dureza, Iones, Cationes y Metales pesados. Para mediciones de
calibración de pH se usa material comercial, para llevar a cabo la calibración del
equipo Conductronic Pc 18 para la conductividad utilizar material trazable a
Cenam y verificar calibración con material comercial.
Calibración y medición de pH:
La medición de pH así como la calibración se realiza en base al manual de

operaciones del conductronic PC 18 que cuenta con medidor de pH, conductividad
y temperatura. La forma en la que se lleva a cabo la calibración del pH en base al
manual de operación es la siguiente:
 Calibración a un punto:
1. Conectar electrodo al instrumento.

2. Encender el instrumento con la tecla pH.
3. Introducir el electrodo y el sensor de temperatura en la solución patrón de pH
7.00 y permitir que la lectura se estabilice (aproximadamente 30 seg.)
4. Ajustar la perilla de calibración de pH calibrate, hasta que el medidor indique el
valor de pH 7.00 de la solución patrón.
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5. Retirar el electrodo y el sensor de temperatura de la solución patrón y enjuagar

con agua destilada, pero no sacar el electrodo.
6. Introducir el electrodo en la solución a medir y leer el valor de pH del medidor.
Si el valor de la solución no está entre ±3 unidades de pH de la solución patrón
(7.00 pH), se necesita hacer una calibración a dos puntos.
7. Retirar el electrodo y el sensor de temperatura y enjuagar con agua destilada.
 Calibración a dos puntos:
1. Siga los pasos de la calibración a un punto hasta el punto 4.

2. Retirar el electrodo y el sensor de temperatura, enjuagar con agua destilada.
Sumerja el electrodo en la segunda solución patrón de pH 4.01 o pH 10.00. La
temperatura de esta solución patrón debe ser idéntica a la de la primera.
3. Ajuste el control dependiente slope, hasta que el medidor indique el valor de
pH de la segunda solución patrón.
4. Retirar el electrodo, enjuagar con agua destilada y proceder a efectuar las
mediciones. No olvidar en juagar el electrodo con agua destilada después de
cada medición.
No olvidar calibrar siempre el equipo con soluciones trazables a Cenam y verificar

con soluciones de marca comercial, hacer las mediciones por triplicado y obtener
un promedio.
 Limpieza del electrodo:
Los electrodos deben ser humectados con una disolución de cloro de potasio, para
evitar que se seque el diafragma.
La membrana y el diafragma de los electrodos de pH pueden contaminarse
produciendo así errores en la medición.
La membrana de vidrio del electrodo, puede limpiarse con un papel húmedo. En
caso de contaminación con productos orgánicos, puede utilizar el disolvente
adecuado para limpiar la membrana, por ejemplo acetona. Un tratamiento de acido
clorhídrico 1:1, solución de pepsina para contaminación de proteínas o acido
sulfocrómico puede ser aplicado.
Cuando se mide el pH en muestras con grasas o aceites se pueden quitar lavando
el electrodo con detergente y agua abundante.
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Medición y calibración de conductividad.
 Calibración
Cuando se cambia la celda o cuando exista alguna causa para dudar de la

precisión de las lecturas, el instrumento deberá ser calibrado con una solución
estándar de cloruro de potasio KCL 0.01 Mol (1413 S/cm a 25 °C).
Seleccionar el rango de 1 a 1999 S mida la conductividad de la solución estándar.
Si la lectura no es igual a 1413 S, ajuste el instrumento con el control S calíbrate,
hasta obtener la lectura correcta.
 Medición
1. Si la celda ha estado almacenada durante mucho tiempo, sumérjala 30 minutos

en agua destilada.
2. Instale la celda de inmersión y el sensor de temperatura perfectamente limpios,
en Kids respectivos conectores.
3. Oprima la tecla S o mS según el rango que desee utilizar para la medición.
4. Sumerja la celda y el sensor de temperatura en la solución que va a analizar.
El nivel del líquido debe estar 2 cm arriba de los orificios de ventilación de la
celda.
5. Agite la celda de arriba hacia abajo para desalojar las burbujas de aire que
pudiesen haber quedado atrapadas dentro de la celda de inmersión.
6. Tome la lectura del medidor.
7. Después de cada inmersión, retire la celda y el sensor de temperatura de la
solución y enjuáguelos con agua destilada.
Limpieza de la celda de inmersión
La celda tu conductividad puede cubrirse con aceites o grasas, si se analizan

muestras con estos contaminantes. En dicho caso, la celda deberá ser limpieza
con una solución de detergente fuerte o ácido clorhídrico 1:1 y posteriormente
deberá ser enjuagada con agua destilada en abundancia. Para facilitar la limpieza
de la celda, se puede quitar la parte inferior de la misma.
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Los electrodos de la celda no deben ser lijados ni raspados ya que de ser así se
elimina el platinizado de estos.
Recordar siempre calibrar el equipo con solución trazable a CENAM, de Cloruro
de Potasio y verificar con solución de marca comercial de cloruro de sodio o
grado reactivo. Realizar las mediciones por triplicado.
Medición de temperatura.
1. Conectar el sensor de temperatura en el conector marcado con T.

2. oprimir la tecla marcada °C y tomar la lectura.
Referencia: Conductronic Medidor portátil de pH, conductividad, y Temperatura

modelo PC 18 “MANUAL DE OPERACIONES” hecho por Conductronic S.A. San
Judas Tadeo No. 4508 col. Santa Cruz Buenavista 72154 Puebla, Pue. México.
MATERIAL DE LABORATORIO
MATERIAL DE VIDRIO
Se sabe examinar antes de cada uso de material de vidrio y se rechazaran todos

los materiales que presenten bordes, mellados o con las superficies internas
deterioradas. Hay que comprobar con especial cuidado los frascos de disolución
con tapa de rosca y los matraces con borde sellados los cuales facilitan un
derramamiento y la contaminación del área de trabajo o dar lugar a la formación
de aerosoles.
Procedimiento para lavado de material
Primero es necesario esterilizar el material que este en contacto con

microrganismos o que se haya utilizado en análisis como los tubos que se usan en
la determinación de coliformes por número más probable o en su defecto
someterlos a un proceso de desinfección como la adición de una solución de
hipoclorito de sodio o si es necesario concentrado, el cual debe estar en contacto
un tiempo mínimo de 30 minutos. Es necesario el uso de un detergente específico
para el área de microbiología co0n actividad bactericida, una vez seleccionado, se
prepara una solución de detergente al 10% con agua destilada, donde se
sumerge el material por espacio de 60 a 90 minutos. Posteriormente se talla el
material con los escobillones correspondientes, se enjuaga con agua corriente de
dos a tres veces.
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Para finalizar se enjuaga nuevamente con agua destilada, de dos a tres veces, el
agua resultante del ultimo aclarado se recolecta para realizar la comprobación de
pH.
La inspección del material de vidrio se realiza después de lavarlo para comprobar

que no quede demasiadas gotas de agua y en su caso se volverá a lavar. Por
cada lote de material lavado se deberán realizar las siguientes pruebas de
comprobación de limpieza del material de vidrio.
Comprobación de pH
Dada la dificultad de eliminar por completo algunas soluciones limpiadoras, se

comprobara el pH de los lotes de material de vidrio limpios, sobre todo si se han
lavado con ácidos o álcalis. Para identificar residuos ácidos o alcalinos:
 Añadir unas gotas de azul de bromotinol (ABT)al 4%, este indicador es de color
gris azulado (dentro de límites normales) en caso de existir pH alcalino al
indicador vira a un tono azul , si los residuos presentes en la solución son de
pH ácido el vire será a un tono amarillo.
 La solución se prepara añadiéndose 16 ml de NaOH al 0.01n de ABT y que se
diluye hasta 250 ml con agua destilada.
 En caso de existir algún tipo de residuo, el lote del material se rechaza y es
necesario volver a iniciar todo el procedimiento lavado.
Comprobación del Cloro residual
Método de almidón y yoduro de potasio
 Solución de Almidón-Yoduro: disuelva 2g de almidón soluble en 100 ml de

agua destilada. Hierva la solución y déjala enfriar a temperatura ambiente.
Agregue 8g de yoduro de potasio y agite la mezcla hasta que esté
completamente disuelta. Guardar la solución en frasco marrón. Si se agregan
de 2 a 3 gotas de cloroformo o formaldehido, la solución permanece estable
durante 2 a 3 semanas.
 Agregue de 3-6 gotas de la solución de almidón y yoduro al agua recolectada

del material de vidrio y plástico una vez secos, mezcle bien y observe el
cambio del vire, en el agua en el contenido de cloro residual se calcula a partir
deñl color obtenido, de la siguiente manera:
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Color Color residual(mg/litro)

Incoloro 0.0
Celeste 0.1 a 0.3
Azul oscuro 0.3
Estas pruebas se realizan cada vez que se lave material.
REFERENCIA: Guías para la calidad del agua potable Vol. 3 Control de la calidad
del agua potable en sistemas abastecimiento para pequeñas comunidades.
Organización Panamericana de la Salud, 1988
Comprobación de residuos inhibidores en el material de vidrio o plástico
1. Algunos de los agentes humidificadores o detergentes que reutilizan para lavar

el material de vidrio contiene sustancias bacteriostáticas o inhibidoras, lo que
obliga a realizar de 6 a 12 aclarados para eliminarlas y asegurar que no existe
actividad bacteriostática residual. Esta comprobación se realizara una vez al
año y antes de utilizar un nuevo detergente.
2. Lavar y enjuagar 6 placas Petri con el método habitual utilizado por el
laboratorio, las cuales se marcaran como grupo A.
3. Lavar otras 6 placas de Petri enjuagándose 12 veces con porciones sucesivas
de agua para reactivos, márcalas como grupo B.
4. Enjuagar 6 placas Petri con agua con detergente en la concentración habitual
utilizada en el laboratorio, sacarlas sin enjuagarlas, márcalas como grupo C.
5. Al terminar la esterilización y colocar 1 ml del cultivo E. aerogenes que
contenga de 50 a 100 unidades formadoras de colonias, a todas las placas de
los tres grupos, realizar el método habitual para la cuenta total bacteriana
(vaciar en las placas agar cuenta estándar previamente esterilizado y
mantenido a 45°C aproximadamente, dejar solidificar las placas e incubarlas en
posición invertida 24 horas a 35°C). En ocasiones es necesario hacer una
prueba preliminar para obtener un recuento dentro de los límites especificados.
para asegurar este recuento, se inoculan 3 placas de cada grupo con 0,1 ml y
las otras 3 con 1ml.
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INTERPRETACION DE RESULTADOS. La diferencia entre los recuentos

promedio de las placas de los grupos A, B y C será inferior al 15% entre los
recuentos promedio de las placas A y B, y superiores al 15% en los grupos A y C,
indican que el detergente utilizado posee propiedades inhibidoras que
desaparecen durante el lavado convencional.
EL CEPARIO
Los sistemas de validación son los procesos que se requieren para asegurar que
los parámetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso
domesticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como métodos
de análisis en el laboratorio. La mayoría de los procedimientos en Microbiología,
dependen de los microrganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener
sus características morfológicas, fisiológicas y que sean típicas y reproducibles.
Para ayudar en este control, las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un
componente esencial de un proceso de validación.
Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad, algunos

ejemplos son:
ATCC: American Type Culture Collection –Rockville, USA.

NCIC: National collection of industrial Bacteria – Survey, Inglaterra.
JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism – Japon.
CCTM: Coleccion Nacional – Lille, Francia.
RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics – Moscu, Rusia.
NCIB: Coleccion Nacional Industrial – Aberdeen, Escocia.
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania.
Asi, la E. coli ATCC 25922 es igual al Adsm 1103 y a la NCIB 12210.
Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de

identificación, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos
por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATTC y si
son cepas domésticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye
nombre, área de aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a
los antibióticos, forma de almacenaje, fecha de ultimo trasplante, etc.
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Requisitos Específicos de las Cepas de Referencia.
En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos:
 Características típicas.
 Características estables.
 Reproducibilidad.
Métodos de Conservación de Cepas Bacterianas:
Los métodos de conservación de las cepas estándar de control de calidad, deben

asegurar que las mismas mantengan sus características típicas y que puedan ser
reproducidas después. El medio utilizado para su conservación debe mantener un
mínimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo un mínimo
crecimiento del microrganismo y aportando óptimas condiciones ambientales para
su sobrevivencia, con el menor número de subcultivos.
Para una mejor clasificación de los métodos de conservación de cepas, los

dividimos en tres categorías: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo
diario.
Cultivos Stock.
Estos representan el verdadero “Banco de Cultivos”. Estos son mantenidos en un

sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica,
para evitar su potencial mutación.
Los dos más importantes métodos para conservación en Stock, son la Liofilización
y el Ultra congelamiento.
Liofilización: se hace una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven en leche

estéril o similar o se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del
aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vacío,
hasta un sofisticado sistema. Durante un proceso evitar que el cultivo se derrame
dentro del aparato liofilizador y la formación de aerosoles. Este sistema tiene la
ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y
mayores facilidades para el transporte de las cepas.
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Ultra congelamiento: Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo

Brucella contenido 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en posiciones de 0.5 ml
en pequeños tubos con roscas y coloque en el profundo del congelador a -45 °C:
También se pueden utilizar la modificación de Ultra congelamiento de Nitrógeno
líquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato
específicamente designado para el mantenimiento de cepas en Nitrógeno líquido.
Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.
Cultivos Semistock: Este término se refiere al mantenimiento de cultivos por un

periodo intermedio entre el relativamente permanente el cultivo Stock y el cultivo
de cepas control para el trabajo diario, este se va a realiza mensualmente y se
realizara sembrar la cepa en Agar Infuso cerebro corazón (BHI), una vez que la
cepa crezca en el periodo y tiempo específico que es de 24 horas a 35 °C, se
produce a adicionar aceite mineral esterilizado a 121 °C y 15 lb de presión por 45
minutos. Luego serán etiquetadas con los datos necesarios correspondientes,
para luego proceder a realizar pruebas bioquímicas además de realizar una
resiembra en agar selectivo para establecer su morfología colonial.
Etiquetado de las cepas.
El etiquetado de cepas debe contener lo siguiente:
1. Nombre de la cepa con N° de identificación oficial

2. Nombre de la persona que resiembra
3. Fecha de siembra
4. Fecha de próxima resiembra
5. Nombre del medio de conservación, clave interna, N° de lote, caducidad,
marca
6. Medio selectivo
7. Temperatura y tiempo de incubación
8. Supervisión
De las 5 técnicas listadas a continuación, solo la de congelamiento es utilizable

para el mantenimiento de cepas anaerobias.
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Congelamiento en congelador convencional:
Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -

25 °C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el casco de la ultra
congelación y son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia
de bacterias y levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces
por amenos de 6 a 12cmeses.
Cultivo en CTA:
Se preparan tubos con roscas conteniendo Cisteina-Tripticasa y Soya agar.

Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener el
crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o
preferiblemente en refrigeración, si es posible en la oscuridad. Microrganismos
menos delicados sobreviven por un año y los fastidiosos por 6 meses.
Secado en Discos con Gelatina:
Este método es conocido también como método Stamp en honor a su creador.

Corte pequeños círculos de papel encerado y colóquelos en una caja Petri de
vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión.
Prepare una suspensión de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo (P/V) y
0.25% de Ácido Ascórbico (P/V) y dispense con tubos con rosca y esterilice en
autoclave.
Haga una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del
mismo con una pipeta estéril sobre uno de los discos de papel acerado estéril en
una caja Petri. Con una pinza estéril, transfiera el disco a un desecador de vacío
de contenido Pentaóxido de Fósforo.
Evacue el desecador con la bomba de vacío. Cuando el disco esta seco,

asépticamente introducir un tubo estéril con tapa de rosca y colocar en el
refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco, asépticamente retire un circulo de
papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e
incubar por 24 horas a 35°C. Luego hacer trasplante a agar sangre e incubar
nuevamente.
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Conservación en Medio de Cultivo Inclinado con Aceite Mineral:
Es un método especialmente utilizado para hongo. Pero es útil también para

algunas bacterias. Eb el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien
esporulado en un medio de cultivo inclinado, tal como Agar de Dextrosa-
Sabouraund. Cubrir completamente con aceite mineral estéril. El aceite debe estar
esterilizado a 15 libras de presión por 45 minutos, para asegurar su esterilidad
absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un
mechero o incinerador y mueva una porción visible de crecimiento con una asa
estéril larga o una aguja. Este método permite la sobrevivencia por muchos años.
Si el método se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-
Corazón o Agar Mueller- Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e
Isovitalex al 1%. Los medios se sirven con tubos con roscas. Se esterilizan y luego
se les hace coagular en forma inclinada.
Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35°C por 24 horas,

tomando en cuenta sus requerimientos de Oxigeno. Luego las cepas son cubiertas
con aceite mineral estéril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los
cultivos son viables por 2 años a temperatura ambiente.
Mantenimiento en Tierra Estéril:
Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas. Esterilice en auto

clave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presión por 1 hora. Hora haga
una suspensión fuerte del microrganismo joven y esporulado y colóquelo en el
tubo con tierra estéril. Deje secar y colóquelo en un refrigerador.
Cultivos de Trabajo Diario:
Los cultivos de control para el trabajo diario, son una forma conveniente para
realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una
lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de
coagulasa y oxidasa, entre otras. Para este propósito se utilizan cultivos de 24
horas y 48 horas que son trasplantados mensualmente, estos cultivos de trabajo
se resiembra dos veces a la semana o una dependiendo de la carga de trabajo y
de la viabilidad de los microrganismos de prueba que se utilizan como control
positivo y negativo, para pruebas de funcionalidad, promoción de crecimiento,
retos bacterianos y esterilidad o en general para realizar el control de calidad en
los lotes de análisis hechos en las muestras.
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Los cultivos de trabajo diario se cultivan en caja Petri en Agar Infusión Cerebro y
Corazón o en Agar Soya y Triptiacaseina. Esto se lleva a cabo tomando de las
cepas de trabajo diario anteriores para generar nuevas cepas de trabajo diario, el
procedimiento es verter medio previamente esterilizado y mantenido a 45°C en
baño María en cajas Petri de 15 a 20 ml del medio BHI y dejar solidificar, luego
realizar un estriado sobre la superficie del agar de los microrganismos control a
utilizar tal es el caso de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Candida
albicans, Pseudomona aureginosa, Staphylococcus aureus, posteriormente
incubar las cajas a 35°C por 24 horas, identificar y luego proceder a usar como
controles de trabajo diario.
Los cultivos de trabajo diario Pseudomona aureginosa, Staphylococcus

aureus, solo se realizan una vez al mes debido a que la carga de trabajo en
muestras para estos microrganismos no es siquiera mínima. A estos controles de
trabajo diario se le determina morfología colonia, microscópica, tipo de gram,
pruebas bioquímicas como a los cultivos semistock.
Bacterias Resistentes:
Tal es el caso de Estafilococos y enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia

joven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar
nutritivo inclinado e incubar por un mínimo de tiempo tal que haya crecimiento.
Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario son transferidos a otros
tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Después de este
tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo Stock.
Bacterias Delicadas:
Los cultivos de trabajo diario de microrganismos delicados como N. meningitidis,

N.gonorrhoeae, S. neumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes,
son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados
como Agar chocolate en ambiente de CO2, para luego ser colocados en
refrigeración. Después de una serie de 6 trasplantes consecutivos, se debe
preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en Stock.
Bacterias Anaerobias (cuando aplique):
Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden
ser mantenidos en Medio de Carne cocida o en Tioglicolato o con 0.5% de
Carbonato de Sodio adicionado después de esterilizar pro auto clave. Los cultivos
se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.
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Hongos:
Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con Agar
Sabouraud o su sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta
que haya crecimiento, y ocurra la esporulación, para luego ser colocados en
refrigeración. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos dos veces por
semana. Pasando este tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de
la cepa en stock.
Cultivos de Trabajo Comerciales:
Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC.
Estas son estables en refrigeración por un año. Tal es el caso de Bact- Check de
Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras. Para reactivar las cepas se
colocan en un clado nutritivo como el caldo de Trripticasa y Soya e incubados por
24 horas a 35°C. Luego se hace un trasplante a un medio de enriquecimiento o
Agar Sangre.
Mantenimiento del Cepario:
Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cerapio, ya que el mismo

constituye una ayuda importante en la validación de equipos, materiales, reactivos
y habilidad del personal. Debe existir un programa metódico de trasplantes de
cepas, archivo de una cada uno de los cultivos con sus características
bioquímicas, sensibilidad a los antibióticos, origen de la cepa, método de
identificación, fecha de siembra y próximo trasplante, etc.
Cepas ATTC:
En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas,

podemos tener acceso a las cepas control del American Type Culture Collection
(ATTC), la colección más grande e importante del mundo. Estas cepas
bacterianas pueden ser utilizadas como el control de una gran variedad de
utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos
comerciales o elaborados en el laboratorio.
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La siguiente tabla da a continuación algunas referencias de las cepas ATTC:
Microrganismo ATCC Medio Característica colonial.

E. coli 25922 McConkey Colonia rosada
S. tiphimurium 14020 McConkey Colonia incolora
P mirabilis 12453 McConkey Colonia incolora
E. faecalis 29212 McConkey No crece
St. Pyogenes 19615 Agar Sangre B – hemolisis
St pneumoniae 6305 Agar Sangre B-hemolisis
S. epidrmis 12228 Agar Sangre No Homolitico
Candida albicans 60193 Agar Sangre No Hemolitica
Candida albicans 60193 Tubos germinales Positivo
Candida tropicalis 66029 Tubos germinales Negativo
S. aureus 25922 Sal y Manitol Colonia amarilla
S. epirmidis 12228 Sal y Manitol Colonia incolora
P mirabilis 12 453 Sal y Manitol No crece
Transporte de Cepas Bacterianas:
La mayoría de las naciones han implementado regulaciones internacionales para

el empaque y transporte de materiales biológicos potencialmente nocivos para el
hombre o los animales. Estas reglas intentan proteger al público de accidentes al
tener contacto directo o indirecto con dichos productos. El personal que prepara
este envió debe ser apropiadamente entrenado en las formas de empaque y en
las regulaciones internacionales que lo rigen. Generalmente el transporte de
agentes etiológicos requiere de un doble o triple empaque, dependiendo de las
regulaciones del país de destino. Si la cepa está contenida en un tubo de vidrio, se
recomienda que se a pequeño y de vidrio grueso. Este a su vez debe estar
inmerso en un envase de metal con material aislante como el aserrín o foam
desmenuzado. A este envase se le puede acondicionar otro que contenga
igualmente aserrín o foam, dependiendo de las regulaciones y por último la caja
externa no porosa, con recubrimiento de cera en su interior y a prueba de
derrame. En esta caja irán las etiquetas de advertencia, números telefónicos para
contactar en caso de emergencia, tanto en el país de origen como en el destino.
Igualmente se etiquetara con un símbolo de material peligroso de color rojo.
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BIBLIOGRAFIA
1. Entidad Mexicana de Acreditación (EMA)
2. Comisión Federal Para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS)
3. Ley Federal de Metrología y Normalización
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Manual de Control de Calidad en El Area de Microbiologia

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“2013.

Año del Bicentenario de los Sentimientos de la Nación”

PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN EL

Elaborado por: M. en I. García Araiza María del Carmen

Santos Cruz Juan Manuel

La Paz, estado de México a Enero 2013.

El área de microbiología de un laboratorio, requiere para su correcto

En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar

Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de

El aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar

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Conociendo los elementos básicos que debe poseer un programa de control de

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 Colecta una apropiada cantidad o volumen de muestra. Insuficiente material

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Cuando se requiere tomar muestra aséptica, éstas no deben tomarse en áreas

La toma de muestras deben hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los

Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que

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Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta

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En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente,

El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de la manera que se

En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C,

En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o

Los productos con representación comercial deben ser transportados en sus

Para la conservación, durante el transporte de la muestra no está permitido el

 Número de unidades y/o cantidad.

Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se

La mayoría de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en su

El transporte óptimo de la muestra depende en gran parte del volumen obtenido.

Si se anticipa que habrá demora en el envío de la muestra o si el cultivo ha de ser

CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS.

Causales de Rechazo de Muestras:

1. Muestras no rotuladas o sin identificación.

12. Líquido colectado en bolsas mal cerradas.

El rechazo de una muestra debe estar acompañado de

PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS

Muestras urgentes. Todas aquellas muestras que estén a punto de rebasar su

Muestras de Rutinas. Todas aquellas cuyos resultados pueden ser reportados en

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del

Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

La mayoría de los suplementos se guardan en refrigeración. Utilizando