PARTE CUATRO: Metabolismo microbiano

Actividad 11: Identificación de Enterobacterias

INTRODUCCIÓN

Entre los bacilos gramnegativos de interés en medicina, destaca la familia

Enterobacteriaceae y un amplio grupo de bacilos nutritivamente no exigentes. La
familia Enterobacteriaceae incluye los géneros: Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Salmonella, etc… (Prats, 2012)

Dentro de la importancia clínica cabe destacar que cuando se han aislado las
bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser identificadas hasta
llegar a género y especie, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioquímica o
metabólica. Del microorganismo asilado dependerá el tipo de tratamiento que
debe ser administrado al paciente. Las Enterobacterias son las responsables del
50% de todos los aislamientos clínicamente significativos. Son causa importante
de infección nosocomial. (Aranguren, 2014)

¿Para qué sirven las pruebas bioquímicas?

Las pruebas bioquímicas en microbiología sirven para diagnosticar enfermedades
causadas por los microbios y para monitorear tratamientos administrados para
combatirlos. Adicionalmente, se emplean para el cribado de enfermedades
infecciosas y para el pronóstico de las mismas.
La identificación bioquímica de microorganismos ofrece una idea de lo que estos
microorganismos son capaces de hacer, siendo posible la discriminación de
diferentes cepas de la misma especie por perfiles bioquímicos específicos.
Las diferencias en las actividades enzimáticas concretas informan sobre la
ecología, la fisiología o el hábitat natural del microorganismo, lo cual en algunos
casos puede considerarse información importante.
Las diferencias estructurales con respecto a la forma, el tamaño y la disposición
de las bacterias ayudan muy poco en el proceso de identificación, porque hay
muchas especies de bacterias que tienen forma, tamaño y disposición similares.
Por esta razón, en última instancia la identificación de las bacterias se basa
principalmente en las diferencias de sus actividades bioquímicas.
Cada especie de bacteria tiene un conjunto bien definido de actividades
metabólicas diferentes de todas las demás especies. Estas “huellas” bioquímicas
son propiedades controladas por las enzimas bacterianas. Así, las pruebas
bioquímicas son importantes porque ayudan al investigador a identificar

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correctamente los patógenos presentes en una muestra y, de esta manera, poder
recomendar el tratamiento adecuado al paciente.

Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia

de diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma
bacteriano. Estas enzimas (catalasas, coagulasas, descarboxilasas, deaminasas,
ureasas, peroxidasas, etc…) involucradas en el metabolismo bacteriano, pueden
ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los substratos
(DNA, hidratos de carbono, aminoácidos, etc.) sobre los cuales ellas actúan, junto
con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradación del
substrato o la presencia de un metabolito específico (ácido fórmico, ácido láctico,
ácido succínico, indol, etc.). (Aranguren, 2014)

Las pruebas bioquímicas también evalúan: la capacidad de reducir ciertos iones

(ferroso a férrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la
producción o no de hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores
especiales (proteínas séricas), la producción o no de algunas toxinas con
capacidad virulenta (toxina diftérica, toxina botulínica, etc.). (Aranguren, 2014)

Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de

las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas
rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía
entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su
lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h;
a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes
metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a
una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el
sustrato a metabolizar. (Cortés, 2014)

La forma usual de detectar una enzima se basa en el principio de que, si está

presente, utilizara un sustrato determinado que ha sido puesto adrede en el medio
de cultivo o en una prueba bioquímica determinada. Los productos terminales de
la acción enzimática son detectados a través de indicadores de PH o por el
aparecimiento de pigmentos que hacen virar el color del medio. (Cortés, 2014)

Las pruebas bioquímicas se pueden clasificar en 3 grupos:

Universales
Son las pruebas que se puede realizar a cualquier muestra y que orientan al
microbiólogo sobre los siguientes ensayos bioquímicos que deben realizarse para
obtener una identificación confiable. Ejemplo: La prueba de la catalasa y de la
oxidasa.

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Diferenciales
Son los ensayos que se realizan para identificar los microorganismos presentes en
la muestra hasta el nivel de especie.
La identificación se hace con base en los resultados de una combinación de
pruebas, ya que los resultados individuales no son lo suficientemente informativos
para hacer la identificación. Ejemplo: Las pruebas IMViC y las pruebas de
utilización de azúcar

Específicas
Son exámenes específicos para un conjunto particular de especies o para
subtipificar una especie. Estas pruebas generalmente se realizan para confirmar o
identificar a nivel de subespecie. Las pruebas individuales son informativas por sí
mismas. Ejemplo: La prueba de γ-Glutamil aminopeptidasa.

La mayoría de los microorganismos de esta familia crecen bien en los medios de

cultivo de laboratorio de rutina, como agar sangre de carnero al 5%, agar
chocolate y agar de MacConkey. Además, suelen usarse agares selectivos como
gar Hektoen entérico (HE), agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar
Salmonella-Shiegella (SS) para cultivar los patógenos entéricos a partir de
muestras gastrointestinales. Los caldos usados en los sistemas de hemocultivo,
asi como el caldo tioglicolato y el caldo infusión de cerebro y corazón, favorecen el
crecimiento de Enterobacteriaceae. (Forbes, 2007)

El agar cefsulodina-irgasán-novobiocina (CIN) es un medio selectivo usado de

manera específica para el aislamiento de Y. enterocolítica a partir de muestras
gastrointestinales. Klebsiella granulomatis no crece en los medios de cultivo
sólidos de rutina. En la práctica clínica el diagnostico de granuloma inguinal sólo
se establece sobre la base del examen directo. (Forbes, 2007)

Para la incubación, en circunstancias normales la mayoría de los miembros de la

familia Enterobacteriaceae producen crecimiento detectable en los medios de
cultivo líquidos y sólidos usados habitualmente dentro de las 24 horas de la
siembra. Para el aislamiento, el agar sangre de carnero al 5% y el agar chocolate
pueden incubarse a 35°C en dióxido de carbono o en aerobiosis. En cambio, el
MacConkey y otros agares selectivos solo deben incubarse en aerobiosis.
(Forbes, 2007)

Para su identificación existen más de 50 pruebas bioquímicas en tubos, aun se

utiliza en los laboratorios clínicos. Algunas pruebas fundamentales como la de
indol, la de rojo de metilo, la de Voges-Proskauer y la del citrato, conocidas con el
acrónimo IMViC se realizaban en forma sistemática para agrupar a los patógenos
aislados con mayor frecuencia. Actualmente para la identificación fiable de este

3
grupo de microorganismos puede utilizarse prácticamente cualquier sistema de
identificación comercial. (Forbes, 2007)

En la actualidad la identificación definitiva de las bacterias entéricas se basa en

métodos moleculares, en especial en la secuenciación del RNA ribosómico y la
hibridación DNA-DNA. Mediante el empleo de métodos moleculares se ha incluido
en la familia el género Plesiomonas, productores de oxidasa, se agrupa con el
género Proteus, pero esta no produce oxidasa como todas las demás. (Forbes,
2007)

El hallazgo de una agrupación de género que produce oxidasa, con uno que no la
produce es un concepto revolucionario en la taxonomía microbiana. (Forbes,
2007)

Para reducir gastos muchos laboratorios clínicos usan un esquema abreviado para
la identificación de los miembros de esta familia aislados con mayor frecuencia. E.
coli, el microorganismo entérico más común, puede identificarse mediante una
prueba de indol positiva en papel filtro. Para identificar de manera presuntiva un
microorganimo como E. coli se registra el aspecto característico de las colonias en
agar de MacConkey, así como la prueba de indol en papel filtro. (Forbes, 2007)

Esta última prueba también puede utilizarse para diferenciar de modo rápido a los
miembros de la familia Proteae que presentan crecimiento confluyente de tipo
enjambre como P. mirabilis y P. penneri, que son negativos, de la especie indol
positiva P. vulgaris. (Forbes, 2007)

En la mayoría de los laboratorios clínicos la serotipificación de los miembros de la

familia Enterobacteriaceae se limita a la agrupación preliminar de especies de
Salmonella, especies de Shigella y E. coli. La tipificación debe realizarse en un
medio que no contenga azúcares, como agar sangre de carnero al 5% o LIA. El
uso de medios de cultivo con azúcares, como agar de MacConkey o agar TSI,
pueden causar la autoaglutinación de los microorganismos. (Forbes, 2007)

Funciones de los componentes básicos de los medios de cultivos:

 Sustrato: Reacciona con la enzima específica y da origen a productos
terminales que pueden ser ácidos o alcalinos.
 Indicador de PH: Detecta productos terminales de la utilización del sustrato.
Son colorantes añadidos para indicar los cambios que hay en el medio durante
el crecimiento de los microorganismos. Estos indicadores son sensibles a los
cambios de PH, por lo tanto, los virajes de color de los mismos indican de
manera indirecta la presencia de productos terminales del empleo e sustrato.

4
 Nutrientes: La mayoría de las bacterias no crecerán solo con la presencia del
sustrato básico, por lo que se requiere agregar diversos nutrientes que varían,
dependiendo de los requerimientos de cada bacteria.
 Inhibidores: Son utilizados más en medios selectivos iníciales, pero hay que
tener en cuenta que no todos los microorganismos deseados serán inhibidos y
no todos los deseados crecerán. (Cortés, 2014)

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Caracterizar e identificar una cepa problema mediante el análisis de diversas vías

metabólicas expuestas en medios de cultivos diferenciales y selectivos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Medios de cultivo
Agar Citrato de Simmons
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Agar Fenilalanina (FAD)
Agar Hierro Triple Azúcar (TSI)
Agar Lisina Hierro (LIA)
Agar Mac Conkey
Agar Manitol Salado (MAS)
Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO)
Agar Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
Caldo Malonato
Caldo Rojo de metilo (RM)
Caldo Urea
Caldo Voges Proskauer (VP)

Reactivos
Alfa naftol
Cloruro Férrico
Hidróxido de Potasio al 40%
Reactivo de Kovacs
Rojo de metilo

Material
Asa de nicromo de halo y de picadura
Cajas de petri
Gradilla
Mechero Bunsen
Tubos de ensayo de 13x100 con tapón de baquelita

Equipos e Instrumentos

5
 Estufas ermoagitadores
Incubadora a 35 ± 2ºC
Potenciometro
Olla de esterilización
Refrigerador
Vortex

Cultivos
Cepa asignada

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ACTIVIDADES

Realice cinco preguntas con su respuesta relacionadas con el tema (preferentemente que
sea de aplicación).

7
 Procedimiento

1. Una vez preparados los medios de cultivos a utilizar, proceder a la

inoculación de estos según corresponda.

Cepa problema

Tinción al Gram

Oxidasa y Catalasa

Agar MacConkey Agar EMB Agar Salmonella-Shigella

Estría Estría y picadura Asada (caldos) Picadura

Citrato de LIA Urea SIM

Simmons

FAD
TSI Malonato MIO
A

RMVP

RMVP

8
 2. Incubar los medios a la temperatura óptima de desarrollo 35 ± 2ºC, de 24 a 48
horas según la prueba estudiada.
3. Realizar interpretaciones y lecturas de las pruebas bioquímicas.

RESULTADOS

Prueba bioquímica Fundamento, Reacción, Función e Interpretación

Citrato Fundamento:

Incluir fotos

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):
Medio no Resultado de
inoculado prueba
Resultado:

9
 TSI Fundamento:
A

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):
Medio no Resultado de
inoculado prueba
Resultado:

Fundamento:
LIA

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):

Resultado:
Medio no Resultado de
inoculado prueba

10
 Fundamento:
UREA

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Medio no
Negativo (-):
inoculado

Resultado:

Fundamento:
FAD

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):

Medio no Resultado de Resultado:

inoculado prueba

11
 Fundamento:
MALONATO

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):

Resultado:
Medio no Resultado de
inoculado prueba

MIO

Medio no Resultado de
inoculado prueba

12
 ROJO DE
METILO
Fundamento:

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):
Medio no Resultado de Resultado:
inoculado prueba

Fundamento:

MIO
VOGES
PROSKAUER

Reacción:

Función:

Interpretación:
Positivo (+):
Negativo (-):

Resultado:
Medio no Resultado de
inoculado pueba

13
Agar Salmonella-Shigella

Medio no
inoculado

CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO EN MAS

Tamaño:
Color de la colonia:
Color del medio:
Fundamento:

Resultado de
prueba

Agar eosina azul

de metileno

CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO EN EMB

Tamaño:
Color de la colonia:
Medio no Color del medio:
inoculado Fundamento:

Resultado de
prueba

14
Agar Mac Conkey

Medio no
inoculado
CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO EN AGAR MACCONKEY
Tamaño:
Color de la colonia:
Color del medio:
Fundamento:

Resultado de
prueba

RESUMEN DE IDENTIFICACIÓN

PRUEBA BIOQUÍMICA RESULTADO

Caracterización colonial:
Tamaño
Forma
Elevación
Borde
TINCIÓN AL GRAM
(morfología y agrupación)
MIO (Indol)
MIO (Movilidad)
MIO (Ornitina)
MIO (H2S)
Rojo de Metilo
Voges Proskauer
Citrato de simmons
(H2S) TSI
TSI (glucosa)
TSI (gas)
TSI (sacarosa y/o lactosa)
Urea
LIA

15
 FAD
SIM (Indol)
SIM (H2S)
SIM (Movilidad)
Malonato
Oxidasa
Catalasa

NOMBRE DEL GÉNERO IDENTIFICADO: ______________________

Realizar un informe técnico del microorganismo aislado que incluya:

a) Morfología colonial en los medios selectivos

b) Comportamiento tintorial, morfología y agrupación
c) Catalasa y oxidasa
d) Pérfil bioquímico
e) Descripción del género aislado, breve (no mayor a una cuartilla)

CONCLUSIÓN

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