Practica 03

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I.

CUESTIONARIO

1. Realice un cuadro comparativo entre quiste y trofozoíto de las amebas E. histolytica,


E. coli, Iodamoeba butschlii y Endolimax nana.

Amebas Quiste Trofozoíto


 Redondeado u oval, mide de 20 a
E. histolytica  Redondeado y mide de 8 a 20 40 µm
µm  Un núcleo con cromatina
 posee una gruesa cubierta periférica.
quística (quitina)  Emite un pseudopodio
 4 núcleos (quiste maduro) unidireccional
 vacuola de glucógeno (reserva)  citoplasma granuloso (vacuolas
va desapareciendo a medida que digestivas y eritrocitos
se produce la maduración fagocitados)
 Núcleo mide de 4 a 7 µ

E. coli  Mide de 10 a 30 μm de diámetro  Numerosas vacuolas


 citoplasma carece de vacuolas  Cromatina periférica irregular
 Tiene un promedio de 8 núcleos  mide de 15 a 50 μm
 Algunas veces masa de  Citoplasma granuloso
glucógeno y barras cromatoides  Escasa diferenciación entre
en forma de astilla endoplasma y ectoplasma
 El único núcleo presenta un
cariosoma moderadamente
grande y excéntrico

Iodamoeba  La forma varía de esférica a  Miden de 4 a 20 μm


butschlii ovalada  El citoplasma puede contener
 Mide de 5 a 16 µm bacterias, pero no eritrocitos
 El quiste maduro tiene un solo  núcleo delimitado por una
núcleo membrana fina
 Vacuola de glucógeno (contorno  Un gran endosoma más o menos
regular y consistente) central y al extremo contrario la
vacuola.

Endolimax nana  Ovoide elipsoidal también los  Mide de 8 a 10 µm


hay esféricos  el citoplasma es finamente
 Mide entre 6 y 8µm granulado
 Citoplasma es finamente  vacuolas (bacterias y pequeñas
granular células vegetales)
 Quiste maduro tiene 4 núcleos  Se observa un estrecho anillo de
 Cariosoma que no es tan grande ectoplasma claro
como el del trofozoíto  Núcleo es pequeño
 No presenta cromatina periférica.  Endosoma grande (centro o
cercano a la periferia de la
membrana nuclear)
 vacuolas alimenticias
E. histolytica

E. coli

Trofozoíto de E. coli

Iodamoeba butschlii

Endolimax nana
2. Desarrolle el ciclo biológico de las amebas histolytica, coli, Iodamoeba butschlii y
Endolimax nana.

CICLO BIOLÓGICO: Entamoeba histolytica

Los trofozoítos (a), quistes (b), contaminan los alimentos (c). Al llegar al intestino, los quistes
tetranucleados se desenquistan formando cuatro amibas pequeñas que invaden la mucosa
intestinal o forman nuevos quistes que serán eliminados con las heces para reiniciar el ciclo (d, e).

Las localizaciones más frecuentes de Entamoeba histolytica en el hombre son la intestinal,


hepática, cerebral y cutánea.

- Los quistes atraviesan el estómago, en donde son capaces de tolerar los


jugos gástricos; las enzimas hidrolíticas destruyen la pared del quiste sin
afectar su citoplasma y llegan hasta el íleon.
- Ocurre el desenquistamiento, de cada quiste emergen ocho trofozoítos
uninucleados denominados metaquísticos.
- Se dividen por fisión binaria y se adhieren a la mucosa intestinal, donde
pueden vivir como comensales.
- Cuando las condiciones son desfavorables, los trofozoítos se desprenden de
la mucosa e inician el enquistamiento en la luz del intestino grueso.
- El quiste maduro tetranucleado se elimina con las heces y puede ser ingerido
por otro individuo, lo que completa el ciclo biológico y de transmisión de E.
histolytica.
CICLO BIOLÓGICO: Entamoeba coli

La E. coli es un comensal no patógeno, lleva un ciclo biológico parecido a la E.


histolytica, presenta las formas de:
- Trofozoíto
- Prequiste
- Quiste maduro
- Quiste inmaduro
- Metaquiste

CICLO BIOLÓGICO: Iodamoeba butschlii y Endolimax nana

Son comensales no patógeno del intestino grueso Presenta formas trofozoíticas y


quísticas y un ciclo evolutivo similar al de E. coli y E. histolytica.

- Después de que el quiste ha ingresado al huésped por vía oral, es


deglutido y transportado hacia el estómago, posteriormente llega al
intestino delgado y en todo este trayecto la acción del ácido gástrico y de
enzimas digestivas lleva a cabo la tarea de reblandecer y debilitar la pared
quística.
- Los trofozoítos, mismos que continuarán su viaje ayudados por el
peristaltismo y serán transportados a otros segmentos intestinales como la
luz del intestino grueso.
- El trofozoítos tienen que enfrentar condiciones que no les son favorables
para su sobrevivencia, para subsistir.
- Inicia un proceso de enquistamiento, en el citoplasma se va incorporando
material de reserva.
- En forma gradual el protozoario adquiere la fase de prequiste.
- Después la de quiste inmaduro y por mitosis la formación de un quiste
maduro.
- Esta forma será la que se expulse junto con la materia fecal.

Tanto los trofozoítos como los quistes pueden salir al exterior con las
heces; los primeros son formas lábiles y mueren con rapidez, no así los
quistes, que pueden resistir el medio ambiente exterior.
3. ¿Cuál es la forma infectiva del parásito y cuáles son sus mecanismos de transmisión
de las amebas?

En las amibas comensales la fase de quiste constituye la forma infectante y


resistente, salvo en el caso de E. gingivalis que sólo posee trofozoíto.

Su mecanismo de transmisión es generalmente por fecalismo, lo que implica la


contaminación de alimentos, bebidas o fomites con materia fecal procedente de
individuos que las alojan en su intestino y las eliminan con las heces; esta situación
se resume en el constante e imperceptible hábito de la coprofagia.

En el caso particular de E. gingivalis la ausencia de una fase quística hace notar que
el mecanismo de transmisión del trofozoíto puede ser directo de individuo a individuo
a través de algo tan simple como un beso o de forma indirecta como el uso
compartido de utensilios como una cuchara o tenedor e incluso por beber líquido
varias personas del mismo recipiente.
4. Mencione y esquematice los métodos de laboratorio para diferenciar a la E. Dispar.
De la E. histolityca.

Las dimensiones y características morfológicas que presenta E. dispar y la E.


histolytica son indistinguibles en la microscopia óptica por esa razón es que se
realiza diferentes métodos para diferenciarlas.

 PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa


Se aplicó un ensayo de PCR, utilizando oligonucleótidos específicos para
cada especie. Esta técnica demuestra una segura detección y diferenciación
de las dos especies que componen el complejo E. histolytica/E. dispar,
mediante la extracción del ADN directamente de las muestras

La extracción de ADN genómico a partir de muestras de heces, se llevó a


cabo a través de un procedimiento estandarizado en el laboratorio que
incorporó algunos pasos de protocolos de lisis enzimática, choque térmico y
mecánico.

La preparación de las mezclas de PCR se llevó a cabo en un área de trabajo


estéril y para las reacciones de amplificación se utilizó un termociclador MJ
Research PTC-100 (GMI Inc.). En todos los ensayos se incluyeron controles
negativos y positivos. Como control negativo, se utilizó la mezcla de reacción
sin el ADN blanco. Como controles positivos se utilizaron 2,5mL del ADN
extraído a partir del cultivo de E. histolytica y como control positivo de E.
dispar se utilizaron 2,5mL del ADN genómico.

Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa en cámaras


horizontales (BioRad Laboratoires). La concentración de agarosa utiliza-da
fue de 1%. Como buffer de corrida se utilizó TBE. La corrida se llevó a cabo a
40v/cm por 2-3 horas.
Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio, visualizados en
transiluminador ultravioleta y fotografiados. Se incluyó marcador de peso
molecular 100bp DNA Ladder de Promega.

Arriba: amplificación por PCR, utilizando


oligonucleótidos SRPEh 5/3, 553pb (específicos
de E. histolytica).

Abajo: productos de amplificación obtenidos


utilizando oligonucleótidos SRPEd 5/3, 567pb
(específicos de E. dispar)
PCR



 Pruebas inmunoenzimáticas
(ELISA)

Esta prueba con ELISA es muy superior al examen convencional por


microscopía porque es más sensible y porque detecta específicamente E.
histolytica. La microscopía generalmente no permite diferenciar E. histolytica
de E. dispar, una ameba morfológicamente similar pero no patógena.

La prueba de Elisa nos da una detección cualitativa de antígeno específico de


Entamoeba histolytica (Gal/GalNAc lectina) mediante enzimoinmunoensayo
de microplaca en fase sólida con anticuerpos monoclonales y policlonales en
muestra de heces.
La diferenciación a este nivel se basa fundamentalmente en aspectos
inmunológicos y en patrones isoenzimáticos.

E. histolytica E. dispar
Presenta mecanismos relacionados con su En E. dispar la presencia de
capacidad patógena como la presencia de ameboporos y proteasas de
lectina galactosa-galactosamina cisteína se encuentra en menor
(responsable de la adherencia), la presencia concentración y con menor
de polipéptidos solubles (amebaporos) que actividad biológica, lo que hace
se insertan a la membrana celular e inducen suponer tiene un impacto en la
lisis. carencia de patogenicidad de esta
especie.
También se han caracterizado proteasas de
cisteína capaces de degradar diversos
componentes de la matriz celular
involucradas también con la evasión de la
respuesta inmune (degradan IgA e IgG y
anafilotoxinas C3a y C5a).
 Tinción con hematoxilina-eosina

Con esta técnica es posible observar con mayor claridad la eritrofagocitosis


de la amiba, siendo ésta una característica propia de la Entamoeba
histolytica.

Esta consiste en: hacer un frotis de la evacuación en una laminilla fijándola en


alcohol al 80% durante 5 minutos; luego se sumerge en hematoxilina por 5
minutos y se lava la muestra en agua corriente para someterla a baño en
alcohol ácido (0.5 ml de concentrado de ácido clorhídrico por cada 100 ml de
alcohol), para luego lavar la laminilla y sumergirla en agua amoniacal (0.5 ml
de concentrado de amoníaco por cada 100 ml de agua destilada), se lava y
se sumerge en eosina por 5 minutos, se deshidrata y se aclara con xileno y
se observa al microscopio. Se consideró positiva cuando se observaron
trofozoítos con eritrofagocitosis, el núcleo de ellos en la periferia y con el
cariosoma central.

5. Según la OMS ¿cómo se debería informar los resultados de laboratorio en caso de


E. histolytica?

Comunicación de los resultados obtenidos en el laboratorio según la OMS, es


necesario que el informe del laboratorio contenga los datos siguientes:

1. Características de la muestra:
 Consistencia (Heces formadas, blandas sueltas o acuosas)
 Color
 Elementos anormales (sangre y moco)

2. Género y especie del parasito encontrado


 E. histolítica
3. Etapa del ciclo biológico de la amiba
 Trofozoíto
 Prequiste
 Quiste maduro
 Quiste inmaduro
 Metaquiste

4. Inclusiones citoplasmáticas distintas


 Hematíes en los trofozoítos
 Cuerpos cromatoides en forma de bastoncillo en los quistes
5. Características del exudado celular
 Piocitos
 Cuerpos picnóticos
 Núcleos anulares, otros.

6. Cálculo del número de huevos por gramo de materia fecal método Kato-Katz

Método Kato-Katz ANÁLISIS CUANTITATIVO = hpg)

Se basa en la técnica de Kato y que permite cuantificar la presencia de huevos de


helmintos. Se expresa en número de huevos por gramo de heces (hpg).

Materiales:

 Láminas portaobjetos 2,5 x 7,5 cm.


 Papel absorbente (toalla o periódico).
 Aplicador.
 Papel de celofán impregnado con
glicerina y verde de malaquita.
 Molde de plástico con perforación
central de 6 mm de diamétro.
 Malla metálica, nylon u organza de
color blanco de 0,09 mm.

Procedimiento.

- Con un aplicador (bajalengua) transferir la muestra fecal (0,5-1g) sobre el papel


absorbente.
- Colocar una malla o nylon de 2 x 3 cm. sobre la muestra.
- Con el aplicador del kit comprimir la malla para tamizar la muestra.
- Colocar el molde de plástico sobre la lámina portaobjeto y rellenar la perforación con la
muestra tamizada.
- Levantar el molde dejando el “cilindro” de la muestra en la lámina portaobjeto.
- Colocar la laminilla glicerinada con verde de malaquita sobre la muestra y con ayuda de
un tapón de jebe presionar sobre la laminilla, buscando extender la muestra.
- Dejar para la diafanización a temperatura ambiente de 30 a 45 minutos.

Observar los huevos de helmintos

Resultado.
El número de huevos encontrados en la lámina se multiplica por k (k= 24), el resultado es el
número de huevos por gramo de heces (hpg)
Deben contarse todos los huevos del preparado

7. Que es el microscopio optofluídico (ofm, del inglés optofluidic microscopy) y en qué


casos se utiliza.

El microscopio optofluídico (OFM) es un dispositivo sin chip, de bajo costo y altamente


compacto en chip que puede permitir imágenes de microscopía de alta resolución.

El OFM realiza imágenes mediante el flujo / escaneo de los objetos objetivo a través de
una matriz de agujeros inclinados. Al medir los cambios de transmisión de luz que varían
en el tiempo a través de los agujeros, podemos renderizar imágenes de los objetos a una
resolución comparable al tamaño de los agujeros. Consiste en una película metálica
opaca con una matriz grabada de aberturas submicrométricas y un chip microfluídico
PDMS que se une a la película metálica. 
Sen paralelo para aumentar el rendimiento de la imagen o se pueden vincular en serie
para realizar imágenes secuenciales de los mismos objetivos. La última configuración se
puede utilizar para realizar imágenes multiespectrales de los objetivos mediante la
fabricación de un filtro espectral diferente en cada unidad OFM.
Las principales ventajas de los dispositivos microfluídicos incluyen su compacidad y bajo
costo.
Esta técnica se usa cuando se quiere obtener de imagen de alta resolución, también se
puede usar para obtener imágenes de etapas de especies parasitarias
(trofozoítos,quistes).

8. ¿Qué es la Videomicroscopía?

Es un sistema de microscopía modular controlado por computadora que produce una


imagen tridimensional de video ampliada de una muestra de interés, presenta una
torreta de lente objetivo giratorio. La torreta de lente es un tambor cilíndrico giratorio
que tiene un extremo abierto y un extremo cerrado. Una pluralidad de lentes objetivo
transmisoras de luz están espaciadas uniformemente alrededor de la pared lateral
del tambor cilíndrico. 

Las lentes objetivas se dirigen cada una perpendicularmente al eje de rotación del
tambor cilíndrico. Se usa una computadora para seleccionar una lente objetivo
deseado y hacer señas a un motor para que gire el tambor cilíndrico alrededor de su
eje de rotación, a fin de mover la lente objetivo seleccionada hacia la trayectoria de
un haz de luz que se aproxima. Cuando el haz de luz ingresa al tambor a través de la
lente del objetivo, un prisma o espejo dentro del tambor cilíndrico dobla el haz de luz
en ángulo recto y lo dirige fuera del tambor a través de su extremo abierto. Una
imagen transportada por el haz de luz se enfoca en el plano de imagen de una
cámara de video. El microscopio también presenta una platina controlada por
computadora que mueve una muestra en cualquier dirección en el plano xy y un
sistema de iluminación que utiliza luz transmitida o luz incidente.

II. ANEXO

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