UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

CENTRO DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA 7:

CURVA DE CRECIMIENTO

INTEGRANTE

TOBAR ANDRES

PARALELO 1

DOCENTE: Dr. Pablo Araujo PhD.

AYUDANTE DE CATEDRA: Karla Vallejo

QUITO-ECUADOR

2018 – 2019
 RESUMEN

Determinación de la curva de crecimiento microbiano de un microorganismo, así como

también determinar el tiempo generacional del mismo. Para ello se sembró el microorganismo
en un medio de cultivo y se inoculó 7 contenedores con la misma alícuota de muestra a una
temperatura determinada y posteriormente se los estandarizó a una concentración específica
de ufc/ml. Se llevó los contenedores a baño maría y se determinó la absorbancia. Se obtuvo
los datos de absorbancia en relación al tiempo con los que se realizó la curva de crecimiento
microbiano usando la curva de estándar McFarland y la Ley de Lambert-Beer. Se concluyó
que la concentración bacteriana en las muestras es proporcional a la absorbancia debido a que
aumenta la densidad celular en la muestra.

PALABRA_CLAVE:
CURVA_DE_CRECIMIENTO/TIEMPO_GENERACIONAL/TRANSMITANCIA/ES-
TANDAR_MCFARLAND/LEY_LAMBERT_BEER/DENSIDAD_CELULAR/
 PRÁCTICA 7

CURVA DE CRECIMIENTO

1. OBJETIVOS
 Determinar la curva de crecimiento microbiano con el uso del espectrofotómetro.
 Determinar el tiempo generacional
2. TEORÍA
2.1.Tiempo generacional
El tiempo generacional es el tiempo necesario para que una célula se divida y depende del
tipo de microorganismos y d elas condiciones físicas del medio, en donde al estar en
condiciones óptimas se puede determinar el tiempo de generación o de división de un
cultivo puro de bacterias y analizar su desarrollo mediante expresiones matemáticas.
(Bosco, 2018)
2.2.Curva de crecimiento microbiano
Al colocar una bacteria en un ambiente favorable para el crecimiento de la misma y se
trata de esquematizar un gráfico con coordenadas donde se encuentre el numero de
bacterias presentes con relación al tiempo se aprecia una curva que es específica para cada
bacteria y donde se distinguen varias fases. (Negroni, 2009)

2.3.Espectrofotómetro
Es un equipo el cual tiene sistemas de detección eléctricos el cual dependiendo del modelo
puede medir absorbancia, transmitancia, entre otras cosas. Además suelen poseer un
registro gráfico de una señal de salida que puede conectarse a un sistema digital o a un
medidor sencillo. (Olsen, 1990)

2.4.Curva de Mcfarland
La curva de Mcfarland consiste en una serie de tubos con turbidez creciente de escala 0,5
a 10 la cual resulta de gran utilidad para tener una estimación de la población bacteriana
en una muestra. (Camacho, 2013)

2.5.Ley de Lambert – Beer

La relación entre la absorción de luz por una solución diluida o por un gas y la
concentración de la fase absorbente viene dada por la ley de Beer. Mientras que la relación
entre la absorbancia de la luz y el camino recorrido por esta viene dada por la ley de
Lambert, en donde al relacionar ambas leyes se deduce una ecuación donde se postula que
cada cuanto de luz pentetra en una solución tiene igual oportunidad de ser absorbido y que
cada molécula de la sustancia que absorbe tiene igual oportunidad de absorber un cuanto
de luz. (Reyes, 2005)
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipos
 Espectofotómetro.
 Lámpara de alcohol
 Incubadora
 Tubos de ensayo
 Jeringuillas de insulina R=1 ml A±0.1 ml
3.2. Sustancias y reactivos
 Medios de Cultivo.
 Microorganismo activado.
 Agua peptonada
3.3. Procedimiento
3.3.1. Activar el microorganismo a utilizar (E. coli)
3.3.2. Sembrar en un medio de cultivo adecuado.
3.3.3. Preparar 7 tubos de ensayos con agua peptonada.
3.3.4. Inocular cada tubo con la misma cantidad de muestra.
3.3.5. Incubar todos los tubos a 37°C.
3.3.6. Estandarizar los tubos a una concentración de 1 x 10 5 ufc/ml
3.3.7. Dejar un tubo control del mismo medio, sin inocular y guárdelo en el refrigerador,
servirá para ajustar el espectrofotómetro a 100% de transmitancia y una longitud de
onda de 620nm
3.3.8. Dependiendo del tiempo generacional del microorganismo, (tiempo generacional:17
minutos) retire los tubos de la incubadora (baño maría a 37oC) y determine la
transmitancia en el espectrofotómetro.
3.3.9. Realizar la curva de crecimiento microbiano, utilizando la curva del estándar de
McFarland ya realizado.

4.1 Datos Experimentales.

Tabla 4.1-1
Datos iniciales
Variable Valor
Microorganismo Escherichia Coli
Concentración inicial 3*108
Volumen de agua peptonada 9mL
Volumen de inóculo 0,1 mL
Factor de dilución 1/10
Є 5.63E-10
Longitud de onda 625 nm

Tabla 4.1-2
Curva de crecimiento microbiano
Tiempo Absorbancia
0 0.2533
20 0.2148
40 0.2407
60 0.1911
80 0.2654
 Tabla 4.1-3
Datos Adicionales, Curva de calibración Mcfarland
Densidad de
Estandar Absorbancia Células
3 x 10 8
0 0,0040 0,00E+00
1 0,1880 3,00E+08
2 0,2570 6,00E+08
3 0,3160 9,00E+08
4 0,4380 1,20E+09
5 0,5010 1,50E+09
6 0,6170 1,80E+09
7 0,7450 2,10E+09
8 0,8620 2,40E+09
9 0,8875 2,70E+09
10 0,9875 3,00E+09

Fuente: Laboratorio de Análisis Químico e Instrulemtal, UCE

4.2. Cálculos.
4.2.1. Tiempo Generacional.
𝑻𝒅 = 𝒍𝒐𝒈𝟐/𝝁 Ec 4.2.1-1

𝑙𝑜𝑔2
𝑻𝒅 =
0.2148
20

𝑻𝒅 = 28,03 [𝑚𝑖𝑛]

 Deducir la ecuación 4.2.1-1

𝑋 = 𝑋𝑜 ∗ 𝑒 𝑢∗𝑡

2 𝑋𝑜 = 𝑋𝑜 ∗ 𝑒 𝑢∗𝑡𝑑

2 = 𝑒 𝑢∗𝑡𝑑

𝑙𝑜𝑔(2) = 𝑙𝑜𝑔(𝑒 𝑢∗𝑡𝑑 )

𝑙𝑜𝑔(2) = 𝑢 ∗ 𝑡𝑑

𝑙𝑜𝑔(2)
𝑡𝑑 =
𝑢

Fuente: Microbiología Industrial y Biotecnología Microbiana, Villanueva

td= Tiempo de duplicación (Generacional)

𝒖= Relacion entre transmitancia y el tiempo.
 𝟒. 𝟐. 𝟏. Cálculo de concentración
𝑨 = 𝑪 ∗∈∗ 𝑳 Ec 4.2.2-1

𝑨
∈= 𝑪∗𝑳 Ec 4.2.2-2

0.2533
∈=
3 ∗ 108 ∗ 1.5

𝑢𝑓𝑐
∈= 5.629 ∗ 10−10 [ ]
𝑚𝐿 ∗ 𝑐𝑚
𝑨
𝑪 = ∈∗𝑳 Ec 4.2.2-3

0.2148
𝑪=
𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
5.629 ∗ 10−10 [𝑚𝐿 ∗ 𝑐𝑚] ∗ 1.5[𝑐𝑚]

𝒖𝒇𝒄
𝑪 = 𝟐. 𝟓𝟒𝟒 ∗ 𝟏𝟎𝟖 [ ]
𝒎𝑳

A= Absorbancia
C= Concentracion
Є=Absortividad molar
L= Longuitud de onda.

5. RESULTADOS.

Tabla 5.1-1
Tiempo Generacional
Variable Valor (min)
Tiempo generacional 28,03

Tabla 5.1-2
Concentración de la muestra

Tiempo (min) Absorbancia Concentracion

0 0.2533 3.000E+11
20 0.2148 2.544E+11
40 0.2407 2.851E+11
60 0.1911 2.263E+11
80 0.2654 3.143E+11
6. DISCUSIÓN
El método cualitativo para la determinación de la curva de crecimiento microbiano y el
tiempo generacional de la bacteria Escherichia Coli fue válido debido a que mediante los
datos experimentales de las tablas 4.1-1 y 4.1-2 y las ecuaciones 4.2.1-1 hasta la ecuación
4.2.2-3 se determinó la concentración de microorganismos y mediante el espectrofotómetro
UV-VIS se determinó la absorbancia.
Existieron errores aleatorios en el momento de la medición de los tubos con la bacteria
debido a que al sacarlos del baño maría y tomar una muestra en la celda del
espectrofotómetro no se agitó el tubo de ensayo lo cual dio valores erróneos en la medición
de absorbancia ya que, al ser una suspensión, las bacterias generadas no se mezclaron
uniformemente en la muestra. Este error afectó directamente en la curva de crecimiento
bacteriano ya que los valores tienen dispersiones en sus datos y como se observa en el
Anexo 2 la curva no tiene crecimiento continuo. Así también los tubos de ensayo con las
muestras se colocaron en un baño maría que no calentó el agua, al contrario enfrió el agua
con lo cual las bacterias no se encontraron en un medio favorable para su crecimiento y
algunas bacterias probablemente murieron, al momento que se percató de esto se llevó los
tubos de ensayo a un baño maría en un agitador magnético con base térmica donde se
configuró la temperatura de 37°C pero la misma no fue constante en todo el proceso de
calentamiento debido a brisas que variaron la temperatura, así también la superficie de
contacto de la base del agitador con la base del contenedor donde se puso los tubos. Así
también la temperatura del agua no fue uniforme en todos sus puntos, errores por los cuales
la concentración de bacterias de Escherichia Coli y por ende la absorbancia de las muestras
es probablemente menor a la esperada si se hubiera realizado correctamente el
procedimiento.
Así también existieron errores sistemáticos en la celda del espectrofotómetro UV-VIS
debido a que la celda que se utilizó para las mediciones fue de plástico, la cual al ser de
plástico es de menor calidad el material y los valores de absorbancia verdaderos o más
cercanos a la realidad serán distintos, para ello se debió utilizar una celda de quarzo la cual
es un material altamente preciso para este tipo de mediciones.
Se recomienda tener el agua caliente de un baño térmico lista a 37°C configurado en el
equipo y comprobar con un termómetro en un tiempo antes de realizar la experimentación
por ejemplo cinco minutos, con lo que se comprobará que la temperatura para que las
bacterias se reproduzcan sea favorable. Así también se recomienda sumergir los tubos en
el equipo de ultrasonido, el cual mezclará uniformemente las bacterias contenidas en los
tubos de ensayo antes de someterlo al análisis del espectrofotómetro UV-VIS.

7. CONCLUSIONES.
De acuerdo a la Tabla 5.1-2 se determinó que la concentración de células es directamente
proporcional a la absorbancia, en donde también influye la longitud de onda como se
dedució en la ecuación 4.2.2-3, donde la mayor absorbancia de 0.2654 tiene mayor
concentración celular que la menor absorbancia de 0.1911.
De acuerdo al Anexo 2 y Anexo 3 se determinó que la concentración celular es creciente
en relación al tiempo generacional y a la absorbancia, aun que, debido a errores ocurridos,
en el Anexo 2 no se lo aprecia correctamente la curva de crecimiento constante de bacterias,
sin embargo, en el Anexo 3 se comprueba la tendencia de crecimiento celular similar a la
curva de calibración de McFarland con un R2 de 0.9911.
 Según la Tabla 4.1-3 y 5.1-2 se comprueba que la escala McFarland es viable para
determinar la concentración celular al utilizar la Ley de Lambert-Beer expresada en la
forma de la ecuación 4.2.2-3, donde se relaciona variables como la absortividad molar,
longitud de onda y absorbancia se determina la concentración de células de muestras que
se encuentren dentro del rango de valores de la Tabla 4.1-3 lo cual se comprobó también
en el Anexo 3 de las curvas en un mismo plano.
8. CUESTIONARIO.
a. Complete el cuadro de ventajas y desventajas
Método Ventajas Desventajas
Turbidez Se lo realiza con equipos donde La principal desventaja se da en
no se necesita de gran trabajo que, al ser un método de
para el laboratorista, además absorbancia de luz de una
tiene una precisión elevada determinada longitud de onda, la
debido a la capacidad de suspensión de partículas es un
modificar variables de longitud problema muy grande debido a
de onda, entre otras en el equipo que si la muestra no se encuentra
en el cual se trabaje, dando así homogeneizada correctamente
valores más exactos que otros antes de la medición, el valor será
métodos. inexacto debido a las
precipitaciones. Donde este
método además realiza el conteo
de microorganismos viables y no
viables.
Recuento en placa Es un método de conteo que no Éste método solamente considera
necesita equipos sofisticados bacterias viables que hayan
como un espectrofotómetro, en podido reproducirse en el medio
este método el valor de cantidad de cultivo, con lo que no permite
de células depende de la el conteo de bacterias no viables
apreciación del laboratorista, sin o muertas presentes en la
embargo existen equipos muestra.
especializados para realizar el
conteo en la placa con lo que se
reducirá el error de apreciación
humano.
Cámara de Neubauer Es un método de conteo no Las bacterias de tamaño muy
sofisticado en el cual se lo puede reducido no se pueden observar
realizar en un menor tiempo y por lo que no se las tomaría en
con mejores resultados que otros cuenta en el momento del cálculo
métodos, el cual consiste en el y presentará un error al momento
conteo por cuadrantes de una de la determinación de cantidad
placa con diámetro y longitudes de microorganismos en una
específicas, donde al realizar muestra.
correctamente el método permite
tener una idea clara de la
cantidad de bacterias presentes
 con simples modelos
matemáticos.
Fuente: (Camacho, 2013)
9. APLICACIONES
La determinación y conocimiento de la cantidad de bacterias, el crecimiento bacteriano y
el tiempo de generación es imprescindible en varios procesos, como ejemplo de estos
procesos son: aplicados a investigaciones, a producción comercial, a análisis de muestras,
medicina, etc.
En el ámbito microbiológico es importante para evaluar cepas bacterianas y controlar las
mismas o adaptar medios para utilizar dichas cepas con un beneficio como fuera
metabolismo o reducción de sustancias, además como tratamiento de especies químicas
como desechos ambientales o desechos químicos, esto debido a la realización de curvas de
crecimiento donde se puede determinar si las bacterias analizadas son capaces de
metabolizar ciertos elementos o sustancias, además las fuentes de energía potenciales al
mezclar los microorganismos analizados con residuos. (García, 2004)
10.Bibliografía

Bosco, U. N. (2018, 11 20). www.fcn.unp.edu.ar/. Retrieved from

https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=18&ved=2a
hUKEwjagbbzmOPeAhUN01kKHZkZD1kQFjARegQIBBAC&url=http%3A%2F%
2Fwww.fcn.unp.edu.ar%2Fsitio%2Fmicrogeneral%2Fwp-
content%2Fuploads%2F2017%2F02%2F04-CULTIVO-DE-
BACTERIAS.pdf&usg=AOvVaw01NeCh

Camacho, C. G. (2013). Microbiología basada en la experimentación. Barcelona:

ELSEVIER.

García, V. (2004). Introducción a la microbiología. Costa Rica: EUNED.

Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica: fundamentos y guía práctica 2°

Edicion. Buenos Aires: Médica Panamericana.

Olsen, E. (1990). Métodos Ópticos de análisis. Barcelona: REVERTÉ S.A.

Reyes, H. W. (2005). Análisis Químico e Instrumental moderno. Trujillo: REVERTÉ S.A.

11. ANEXOS
11.1Diagrama del equipo. (VER ANEXO 1)
11.2Curva crecimiento microbiano. (VER ANEXO 2)
11.3Curva de calibración y curva de concentración de las muestras. (VER ANEXO 3)
ANEXO 1
11.1. Diagrama del equipo
Figura 11.1-1 Diagrama del Equipo

3
5

2
1

Fuente: Laboratorio de Análisis Químico e Instrumental, UCE

Tabla 11.1-1. Equipos

Numero Equipo
1 Espectrofotómetro UV-VIS
2 Vaso de precipitación
3 Celdas para espectrofotómetro.
4 Muestra

Nombre: Fecha:
Universidad Central del Ecuador
Dibuja: Tobar Andrés 2018/11/15
Facultad de Ingeniería Química
Revisa: Karla Vallejo 2018/11/26 Escuela de Ingeniería Química

Escala: Diagrama del Equipo Lámina: 1

ANEXO 2
11.2 Construcción de la curva de crecimiento microbiano

Figura 11.2-1 Curva de crecimiento

Curva de Crecimiento Bacteriano

3.500E+08

3.000E+08

2.500E+08
Concentracion

2.000E+08
y = 2960.9x + 3E+08
1.500E+08

1.000E+08

5.000E+07

0.000E+00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (min)

Fuente: Laboratorio de Análisis Químico e Instrumental, UCE

Tabla 11.2-1. Datos Experimentales

Tiempo Concentracion
0 3.000E+08
20 2.544E+08
40 2.851E+08
60 2.263E+08
80 3.143E+08

Nombre: Fecha:
Universidad Central del Ecuador
Dibuja: Tobar Andrés 2018/11/15
Facultad de Ingeniería Química
Revisa: Karla Vallejo 2018/11/26 Escuela de Ingeniería Química
 Escala: Curva de crecimiento Lámina: 2

ANEXO 3
11.3 Curva de calibración y curva de concentración de las muestras.
Figura 11.3-1 Curva de calibración y curva de concentración de las muestras

Curva McFarland vs E. Coli

3.50E+09

3.00E+09
y = 3E+09x - 1E+08
2.50E+09
R² = 0.9911
Concentracion

2.00E+09 McFarland
1.50E+09 E. Coli

1.00E+09 Linear (McFarland)

Linear (E. Coli)
5.00E+08
y = 1E+09x
0.00E+00
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-5.00E+08
Absorbancia

Fuente: Laboratorio de Análisis Químico e Instrumental, UCE

Tabla 11.3-1. Datos Experimentales

Concentracion Celular
Estandar Absorbancia Muestra Absorbancia Concentracion
/mL
0 0.004 0.00E+00 0 0.2533 3.000E+08
1 0.188 3.00E+08 20 0.2148 2.544E+08
2 0.257 6.00E+08 40 0.2407 2.851E+08
3 0.316 9.00E+08 60 0.1911 2.263E+08
4 0.438 1.20E+09 80 0.2654 3.143E+08
5 0.501 1.50E+09
6 0.617 1.80E+09
7 0.745 2.10E+09
8 0.862 2.40E+09
9 0.8875 2.70E+09
10 0.9875 3.00E+09

Nombre: Fecha:
Universidad Central del Ecuador
Dibuja: Tobar Andrés 2018/11/15
Facultad de Ingeniería Química
Revisa: Karla Vallejo 2018/11/26 Escuela de Ingeniería Química
Escala: Curva de calibracion y de concentracion Lámina: 3