DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

ESTUDIO ANALÍTICO DE MATERIALES EMPLEADOS EN

BARNICES, AGLUTINANTES Y CONSOLIDANTES EN
OBRAS DE ARTE MEDIANTE MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS Y ESPECTROMÉTRICOS

JUAN PERIS VICENTE

UNIVERSITAT DE VALENCIA
Servei de Publicacions
2008
Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 28 de
Novembre de 2007 davant un tribunal format per:

- D. Francisco Bosch Reig

- Dª. Mª Teresa Galcerán Huguet
- D. Luis María Polo Díez
- D. Roberto Sebastiano
- Dª. Pilar Roig Picazo

Va ser dirigida per:

D. José Vicente Gimeno Adelantado
Dª. María Teresa Doménech Carbó

©Copyright: Servei de Publicacions

Juan Peris Vicente

Depòsit legal:
I.S.B.N.:978-84-370-7003-2
Edita: Universitat de València
Servei de Publicacions
C/ Artes Gráficas, 13 bajo
46010 València
Spain
Telèfon: 963864115
TESIS DOCTORAL / DOCTORAL THESIS

Estudio analítico de materiales empleados en

barnices, aglutinantes y consolidantes
en obras de arte mediante métodos
cromatográficos y espectrométricos
JUAN PERIS VICENTE

Tesis Doctoral presentada por:

Juan Peris Vicente
2007

Directores:
Dr. José Vicente Gimeno Adelantado
Dra. María Teresa Doménech Carbó
 FACULTAD DE QUÍMICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

Estudio analítico de materiales empleados

en barnices, aglutinantes y consolidantes
en obras de arte mediante métodos
cromatográficos y espectrométricos

Tesis Doctoral presentada por:

Juan Peris Vicente
para optar al grado de
Doctor en Ciencias Químicas
por la Universidad de Valencia

Directores:
Dr. José Vicente Gimeno Adelantado
Dra. María Teresa Doménech Carbó

Valencia, Septiembre 2007

i
 FACULTY OF CHEMISTRY

DEPARTMENT OF ANALYTICAL CHEMISTRY

Analytical study of materials used in

varnishes, binding media and consolidants
in artworks by chromatographic and
spectrometric methods

Doctoral Thesis presented by:

Juan Peris Vicente
to reach the Ph.D. degree in Chemistry
by the University of Valencia

Supervisors:
Dr. José Vicente Gimeno Adelantado
Dra. María Teresa Doménech Carbó

Valencia, September 2007

iii
 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

El Dr. José Vicente Gimeno Adelantado, Profesor Titular del

Departamento de Química Analítica de la Universidad de Valencia y la Dra.
María Teresa Doménech Carbó, Catedrática del Departamento de
Conservación y Restauración de Bienes Culturales y Directora del Instituto
de Restauración del Patrimonio de la Universidad Politécnica de Valencia,
como directores de la Tesis Doctoral “Estudio analítico de materiales
empleados en barnices, aglutinantes y consolidantes en obras de arte
mediante métodos cromatográficos y espectrométricos”, realizada por
Juan Peris Vicente, autorizan la lectura de la misma.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firman la presente en

Valencia, en septiembre de 2007

Fdo. Dr. José Vicente Gimeno Adelantado Fdo. Dra. María Teresa Doménech Carbó

v
 AGRADECIMIENTOS

La realización de esta Tesis Doctoral no habría sido posible sin la

ayuda y el apoyo de un gran número de personas:

En primer lugar, quisiera expresar mi más sincero y profundo

agradecimiento a mi director de Tesis, el Profesor Dr. José Vicente Gimeno
Adelantado, por haberme introducido y haberme hecho avanzar en el mundo
de la investigación, así como por toda su ayuda y consejos recibidos durante
el desarrollo de la Tesis. Sin su dedicación, paciencia y apoyo en los
momentos difíciles, tanto el trabajo realizado como la propia Tesis no
habrían sido posibles. De él he aprendido mucho, no sólo en el campo de la
investigación científica, sino en el ámbito de la vida cotidiana, debido a su
gran calidad humana.
Asimismo quisiera dar las gracias a mi co-directora de Tesis, la
Profesora Dra. María Teresa Doménech Carbó, por su confianza total hacia
mi trabajo , los consejos que me ha proporcionado, y los conocimientos sobre
los materiales presentes en muestras de origen artístico y su estudio
analítico.
Quiero extender mi agradecimiento al Profesor Dr. Ernesto Simó
Alfonso por compartir conmigo su saber en Cromatografía, Espectrometría
de Masas y especialmente en Quimiometría, así como por participar
activamente en parte del trabajo descrito en la presente Tesis e incrementar
su valor científico. Asimismo agradezco a la Profesora Dra. Adela Mauri
Aucejo por la atención especial que me ha prestado a nivel personal y en mi
evolución en la actividad investigadora.
Gracias a los Profesores Dr. Sinforiano Sánchez Ramos, Dr. Rufino
Mateo Castro, Dra. Misericordia Jiménez Escamilla y Dr. Antonio
Doménech Carbó por sus valiosos consejos , los cuales también me han
permitido aumentar mis conocimientos, así como su continuo interés en el
desarrollo de mi labor científica.
No puedo dejar de agradecer al Profesor Dr. Francisco Bosch Reig,
por su especial interés en mi formación científica. Asimismo agradezco a los
Profesores Dra. Rosa Villanueva Camañas, Dr. José Manuel Herrero
Martínez y Dra. Carmen Molins Legua, por su interés por mí y mi trabajo,
así como al Profesor Dr. Carlos Mongay Fernández por estar disponible
cuando ha sido necesario como Director del Departamento de Química
Analítica de la Universidad de Valencia.
Quisiera transmitir mi agradecimiento al personal de administración,
en especial a Javier García Vento y a Lourdes Menor Sánchez, por su ayuda
y disponibilidad a la hora de resolver problemas técnicos o burocráticos.
También querría agradecer a mis compañeros más cercanos:
_____________________________________________________________
vii
 AGRADECIMIENTOS

especialmente a Francisco Manuel Valle Algarra, por su compañía, consejos

y apoyo en los momentos difíciles, al Dr. Ángel Medina Vayá, de quien
adquirí mis nociones básicas de Microbiología y a Andreu Campos Candel,
por su compañía durante estos años. Juntos hemos pasado buenos momentos
durante todos estos años, sin olvidar los Congresos a los que hemos asistido
como grupo. Asimismo extiendo mi agradecimiento a Miguel Ángel Ferrer
Eres, por los trabajos que hemos compartido y por transmitirme sus
conocimientos sobre arqueología.
Quisiera dar las gracias a mis compañeras del grupo de estudio de
obras de arte, Dra. Dolores Yusá Marco, Dra. Laura Osete Cortina, Dra.
Mari Carmen Saurí Peris y Juana de la Cruz Cañizares, por sus consejos,
ideas y sugerencias, que me han ayudado a superar las dificultades que se
presentan en el laboratorio.
No quisiera olvidarme de mis compañeros del Departamento de
Química Analítica con los que, a pesar de no haber compartido trabajo, sí
que hemos pasado momentos inolvidables juntos , como Chistopher, Tania,
Anna, Cristina, Sandra, María Jesús, Victoria, José Ramón y Daniel.
Quisiera agradecer a los que me permitieron desarrollar mi proyecto
de investigación en el “Centre de Recherche et Restauration del Musées de
France, Palais du Louvre” y en el “Musée de la Musique”, especialmente a
sus respectivos Directores Jean Michel Menu y Stephane Vaiedelich.
También agradezco a Christine Benoît y Jean Philippe Echard, por haber
supervisado mi trabajo, por sus consejos, ayuda y por haberme transmitid o
sus enseñanzas acerca de los barnices de instrumentos musicales históricos,
su valor estético, la composición química y los métodos de análisis.
Igualmente agradezco a los demás miembros del laboratorio, especialmente
a Vincent Mazel por su cercanía y ayuda. Pour tous, mes très sincères
remerciments.
Asimismo, agradezco a los que hicieron posible mi estancia de
investigación en el Doerner Institut, Bayerische Staatsgemäldesammlungen,
Munich, Alemania : a su Director, el Dr. Andreas Burmester, quien me
introdujo en el Centro, a la directora del Departamento de Ciencias
Naturales, Dra. Heike Stege, quien dirigió el proyecto acerca del estudio
analítico de materiales sintéticos en obras pictóricas modernas en el que
colaboré, y me brindó toda la ayuda posible , a mis compañeras de
laboratorio Karin Lutzenberger y Ursula Baumer, que estuvieron a mi lado
en todo momento, y a los demás miembros del Doerner Institut como
Annette Ihle, Christian Nippert, Lars Raffelt, Cornelia Tilenschi y Gunther
Bisschof. A todos ellos les agradezco no sólo su compañía y transmisión de
su saber en las diferentes ramas del estudio de las obras de arte pictóricas,
sino también el impulso definitivo para aprender su hermoso idioma.
Herzliche Danken für allen.
Agradezco al Ministerio de Educación y Ciencia haberme concedido la
_____________________________________________________________
viii
 AGRADECIMIENTOS

beca de Formación del Profesorado Universitario, que me ha permitido

desarrollar mi Tesis Doctoral, así como la realización de dos estancias de
investigación en Centros Extranjeros de gran relevancia en el ámbito del
estudio científico de objetos pertenecientes al Patrimonio Cultural, las cuales
me permitieron alcanzar el requisito necesario para la obtención de l
Doctorado con la mención de “Doctor Europeus”.

Asimismo agradezco la financiación del Ministerio de Educación y

Cultura y la Unión Europea (a través del programa de I+D+i y los fondos
FEDER, respectivamente) para los proyectos de investigación en los que se
basa el trabajo desarrollado para la Tesis Doctoral: “Estudio analítico y
estado de envejecimiento de barnices, aglutinantes, y consolidantes
utilizados en obras de arte españolas (siglos XVI-XIX) mediante FTIR,
Microscopía IR, HPLC, Electroforesis, Electrocromatografía y
Voltamperometría” con referencia: BQU2001-2776-CO3-02, “Desarrollo de
métodos de análisis para caracterizar resinas sintéticas utilizadas como
materiales filmógenos en obras de arte españolas mediante técnicas
espectroscópicas, cromatográficas y electroanalíticas” con referencia:
CTQ2004-06754-CO3-02/BQU y “Estudio analítico de resinas sintéticas
utilizadas en arte contemporáneo mediante técnicas espectrométricas,
cromatográficas y electroquímicas” con referencia CTQ2005-09339-CO3-
02/BQU.

Fuera del laboratorio, también he de agradecer a numerosas personas

que han sido mi apoyo durante todos estos años:
A mis amigos, en especial a Pablo, Miguel Ángel, Alberto y Paco, con
los que he pasado buenos y malos momentos, espero que nuestra amistad
dure muchos años.
A mis familiares, en especial a mis abuelos, María Castellar Alcaina,
Daniel Vicente Debón, Dolores Martínez Crespo y Vicente Peris Chalmeta,
tanto los que se han ido como los que están cerca, ellos y su memoria me han
acompañado durante mis años de doctorado.
También agradezco profundamente a mi padre, Vicente Peris
Martínez, por su cariño y sus valiosos consejos, su recuerdo y ejemplo ha
sido indispensable para darme fuerzas todos estos años, y a mi madre María
Vicente Alcaina, sin cuyo sacrificio y apoyo esta Tesis Doctoral no habría
sido posible. Nunca podré devolverles lo que han hecho por mí.

_____________________________________________________________
ix
 Als meus pares,

xi
 ÍNDICE

xiii
 INDICE. PARTE A

PARTE A

ESTUDIO ANALÍTICO DE MATERIALES EMPLEADOS EN

BARNICES, AGLUTINANTES Y CONSOLIDANTES EN OBRAS
DE ARTE MEDIANTE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Y
ESPECTROMÉTRICOS

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................5

II. OBJETIVOS...................................................................................9

III. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL

1. Materiales orgánicos empleados como aglutinantes,

consolidantes y cubrientes en obras de arte pictóricas ........................13

1.1 Descripción general de los materiales empleados

en obras de arte ............................................................................13
1.1.1 Características generales.....................................................13
1.1.2 Factores causantes del deterioro ..........................................15

1.2 Proteínas.......................................................................................16
1.2.1 Generalidades....................................................................16
1.2.2 Aplicación de proteínas en obras pictóricas .........................18
1.2.3 Características químicas.....................................................19
1.2.4 Alteración química a lo largo del tiempo .............................20

1.3 Ceras naturales............................................................................24

1.3.1 Descripción......................................................................24
1.3.1.1 Descripción de las ceras de origen animal................24
1.3.1.2 Características de las ceras de origen vegetal............25
1.3.1.3 Mecanismos de biosíntesis de ceras naturales...........26
1.3.1.4 Descripción de las ceras de origen mineral...............27
1.3.1.5 Uso de ceras naturales a lo largo de la historia ..........28
1.3.2 Aplicación de ceras en obras pictóricas ..............................28
1.3.3 Características químicas....................................................30
1.3.4 Alteraciones producidas a lo largo del tiempo......................30

________________________________________________________
xv
 INDICE. ANTECEDENTES

1.4 Aceites secantes ...........................................................................31

1.4.1 Generalidades ...................................................................31
1.4.2 Aplicación en obras pictóricas............................................34
1.4.3 Características químicas ....................................................36
1.4.4 Mecanismos de envejecimiento ..........................................37

1.5 Barnices de instrumentos musicales.

Resinas terpénicas .......................................................................43
1.5.1 Descripción general de las piezas de los violines..................43
1.5.2 Evolución histórica y materiales usados
en la elaboración de violines ...............................................43
1.5.3 Generalidades acerca de la influencia
de los barnices en instrumentos musicales ...........................45
1.5.4 Características químicas de las resinas terpénicas..................48
1.5.5 Características químicas de otros materiales
empleados en barnices de violines......................................51
1.5.5.1 Disolventes .............................................................51
1.5.5.2 Aditivos ..................................................................52
1.5.5.3 Colorantes...............................................................55
1.5.6 Alteraciones experimentadas por resinas terpénicas...............57
1.5.6.1 Mecanismos de oxidación de abietanos y pimaranos ..57
1.5.6.2 Procesos de envejecimiento de los labdanos ..............60
1.5.6.3 Mecanismos de oxidación de triterpenoides ..............60

1.6 Resinas sintéticas ........................................................................62

1.6.1 Descripción y características químicas
de las principales resinas sintéticas ......................................63
1.6.1.1 Polivinilos.............................................................63
1.6.1.1.1 Poliolefinas................................................65
1.6.1.1.2 Resina de hidrocarburos saturada ................66
1.6.1.1.3 Resina de cumarona (indeno-benzofurano) ...66
1.6.1.1.4 Acetato de polivinilo ..................................66
1.6.1.1.5 Alcohol polivinílico....................................67
1.6.1.1.6 Poliacrílicos ...............................................67
1.6.1.2 Polímeros formados por condensación ....................68
1.6.1.2.1 Resinas alquídicas ......................................68
1.6.1.2.2 Poliésteres .................................................68
1.6.1.2.3 Resinas epoxídicas .....................................69
1.6.1.2.4 Resinas cetónicas .......................................69
1.6.1.2.5 Resinas de fenol-formaldehido ....................71
1.6.1.2.6 Poliacroleínas ............................................72
1.6.1.3 Resinas semiorgánicas..........................................73
1.6.1.3.1 Nitrato de celulosa .....................................73
________________________________________________________
xvi
 INDICE. ANTECEDENTES

1.6.1.3.2 Etilpolisiloxano ..........................................74

1.6.2 Aplicación en obras artísticas .............................................74
1.6.2.1 Polivinilos .............................................................75
1.6.2.1.1 Poliolefinas y resina de
hidrocarburos saturada ...............................75
1.6.2.1.2 Resina de cumarona (indeno-benzofurano) ..75
1.6.2.1.3 Acetato de polivinilo..................................76
1.6.2.1.4 Alcohol polivinílico....................................76
1.6.2.1.5 Poliacrílicos ...............................................76
1.6.2.2 Polímeros de condensación....................................76
1.6.2.2.1 Resinas alquídicas.....................................77
1.6.2.2.2 Resinas epoxídicas....................................77
1.6.2.2.3 Resinas cetónicas......................................77
1.6.2.2.4 Polímeros de fenol/formaldehido ................78
1.6.2.3 Polímeros semiorgánicos .......................................79
1.6.2.3.1 Nitrato de celulosa ....................................79
1.6.2.3.2 Polímeros de etilsiloxano...........................79
1.6.3 Mecanismos de envejecimiento de resinas sintéticas............80

2. Técnicas y metodologías analíticas de caracterización...................81

2.1 Espectroscopia de infrarrojo y Raman ........................................81

2.2 Cromatografía de gases ...............................................................82

2.2.1 Vaporización en inyector ...................................................83
2.2.2 Pirólisis previa ..................................................................83

2.3 Electroforesis capilar ...................................................................84

2.4 Cromatografía líquida de alta resolución.....................................85

2.4.1 Cromatografía líquida con detector de ultravioleta visible .....85
2.4.2 Cromatografía líquida con detector de fluorescencia ............86
2.4.3 Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas...88
2.4.4 Cromatografía líquida acoplada a otros detectores................89

2.5 Cromatografía por exclusión de tamaño......................................90

________________________________________________________
xvii
 INDICE. EXPERIMENTAL

IV. PARTE EXPERIMENTAL

1. Desarrollo de un método analítico para la caracterización

de proteínas empleadas como aglutinantes en obras de
arte pictóricas mediante cromatografía de líquidos con
detector de Fluorescencia ..............................................................93

1.1 Reactivos y disolventes.................................................................93

1.2 Patrones y sustancias de referencia..............................................93

1.3 Descripción de muestras procedentes de obras de arte ................93

1.4 Instrumentación...........................................................................95

1.5 Tratamiento previo de muestras y patrones.................................95

1.5.1 Hidrólisis de las proteínas..................................................96
1.5.2 Procedimiento de derivatización.........................................96

2. Desarrollo de una metodología analítica para la caracterización

de ceras naturales en obras pictóricas a partir de su contenido
en ácidos grasos e hidrocarburos mediante cromatografía
de gases ..........................................................................................97

2.1 Reactivos y disolventes.................................................................97

2.2 Patrones y sustancias de referencia..............................................97

2.3 Descripción de la muestra extraída de una obra de arte ..............98

2.4 Instrumentación...........................................................................98

2.5 Tratamiento previo de muestras y patrones.................................99

2.5.1 Tratamiento de las muestras de ceras naturales ....................99
2.5.2 Procedimiento de derivatización de los ácidos grasos ...........99
2.5.3 Análisis de hidrocarburos y ácidos grasos patrón................ 100

________________________________________________________
xviii
 INDICE. EXPERIMENTAL

3. Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización

de aceites secantes en obras de arte mediante cromatografía
de líquidos acoplada a un detector de absorción UV-Visible
y Fluorescencia............................................................................. 101

3.1 Reactivos y disolventes............................................................... 101

3.2 Patrones y sustancias de referencia............................................ 102

3.3 Descripción de muestras procedentes de obras de arte .............. 102

3.4 Instrumentación........................................................................ 103

3.5 Tratamiento previo de muestras y patrones............................... 103

3.5.1 Hidrólisis de los aceites secantes...................................... 104
3.5.2 Formación de los derivados absorbentes
de los ácidos grasos ......................................................... 104
3.5.3 Formación de los derivados fluorescentes
de los ácidos grasos .......................................................... 104

4. Desarrollo de una metodología de caracterización

de aglutinantes proteicos y lipídicos mediante
espectrometría de masas directa................................................... 105

4.1 Reactivos y Disolventes.............................................................. 105

4.2 Patrones y sustancias de referencia............................................ 105

4.3 Descripción de las muestras procedentes de obras de arte ......... 106

4.4 Instrumentación........................................................................ 106

4.5 Tratamiento estadístico de los datos experimentales.................. 107

4.6 Tratamiento previo de muestras y patrones............................... 109

4.6.1 Aglutinantes proteicos...................................................... 109
4.6.2 Aglutinantes oleosos ........................................................ 109

________________________________________________________
xix
 INDICE. EXPERIMENTAL

5. Caracterización de los constituyentes de barnices de

violines y laúdes italianos de la época renacentista
mediante cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas .............................................................. 111

5.1 Reactivos y disolventes............................................................... 111

5.2 Materiales de referencia ............................................................ 111

5.3 Descripción de los instrumentos de cuerda analizados............... 112

5.4 Instrumentación........................................................................ 114

5.5 Procedimiento experimental...................................................... 114

5.6 Interpretación de los espectros de masas ................................... 115

6. Caracterización de resinas sintéticas utilizadas en obras

de arte modernas mediante cromatografía de gases
acoplado a espectrometría de masas con pirólisis previa .............. 116

6.1 Patrones..................................................................................... 116

6.2 Descripción de las muestras procedentes de obras de arte .......... 116

6.3 Instrumentación........................................................................ 116

6.4 Procedimiento experimental...................................................... 118

________________________________________________________
xx
 INDICE. RESULTADOS

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Caracterización de proteínas empleadas como aglutinantes

en obras de arte pictóricas mediante cromatografía líquida
con detector de Fluorescencia....................................................... 121

1.1 Optimización del procedimiento experimental........................... 122

1.1.1 Obtención de los aminoácidos a partir de la muestra........... 122
1.1.2 Optimización de la etapa de derivatización........................ 123
1.1.3 Optimización de las condiciones cromatográficas .............. 124

1.2 Identificación de los aminoácidos y determinación de los

parámetros analíticos del método .............................................. 125
1.2.1 Identificación de los aminoácidos ..................................... 125
1.2.2 Determinación de los parámetros analíticos del método ...... 126

1.3 Estudio analítico de patrones de aglutinantes proteicos ............. 127

1.3.1 Análisis de las proteínas patrón......................................... 127
1.3.2 Caracterización de los aglutinantes proteicos ..................... 128

1.4 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte....... 130

1.4.1 Aplicación de la metodología a muestras reales................... 131
1.4.2 Caracterización de aglutinantes proteicos en muestras reales.132

2. Caracterización de ceras naturales en obras pictóricas a partir

de su contenido en ácidos grasos e hidrocarburos
mediante cromatografía gaseosa................................................... 135

2.1 Separación cromatográfica de hidrocarburos y ácidos grasos .... 136

2.1.1 Identificación de los alcanos lineales................................. 136
2.1.2 Identificación de los ácidos grasos .................................... 136

2.2 Estudio analítico de ceras naturales patrón............................... 137

2.2.1 Análisis de ceras naturales................................................ 137
2.2.2 Caracterización de ceras naturales..................................... 138
2.2.2.1 Ceras patrón no envejecidas ................................ 138
2.2.2.2 Ceras patrón envejecidas ..................................... 139
2.2.2.3 Tratamiento quimiométrico de los datos ............... 141
2.2.3 Diferenciación de las ceras naturales basada únicamente
en la cantidad de hidrocarburos ........................................ 142

________________________________________________________
xxi
 INDICE. RESULTADOS

2.3 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte....... 143

2.4.1 Aplicación de la metodología a muestras reales ................. 143
2.4.2 Identificación de la cera natural presente en la muestra real. 144

3. Caracterización de aceites secantes mediante cromatografía

líquida acoplada a un detector de absorción UV-Visible
y Fluorescencia............................................................................. 146

3.1 Optimización del procedimiento experimental........................... 147

3.1.1 Obtención de los ácidos grasos a partir de la muestra .......... 147
3.1.2 Optimización de la etapa de derivatización........................ 149
3.1.2.1 Reacción un agente cromógeno:
2-nitrofenilhidrazina............................................ 149
3.1.2.2 Reacción con un agente fluorógeno:
4-bromometil-7-metoxicumarina .......................... 153
3.1.3 Optimización de las condiciones cromatográficas .............. 153
3.1.3.1 Separación cromatográfica de las hidrazidas ......... 153
3.1.3.2 Resolución de los aductos cumarina-ácido graso... 155

3.2 Identificación de los ácidos grasos y determinación de los

parámetros analíticos del método .............................................. 156
3.2.1 Identificación de los ácidos grasos .................................... 157
3.2.2 Parámetros analíticos de las metodologías propuestas......... 158

3.3 Estudio analítico de los aceites secantes patrón.......................... 159

3.3.1 Aplicación de los métodos analíticos propuestos a
patrones de aceites secantes.............................................. 159
3.3.2 Caracterización de los aceites secantes.............................. 161

3.4 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte....... 164

3.4.1 Aplicación de los métodos propuestos a una muestra
de pintura al óleo............................................................. 164
3.4.2 Caracterización de aglutinantes lipídicos en muestras
procedentes de obras pictóricas al óleo.............................. 166

4. Desarrollo de una metodología de caracterización de

aglutinantes proteicos y oleosos mediante espectrometría de
masas por infusión directa............................................................ 168

4.1 Optimización del tratamiento de muestra................................... 169

4.1.1 Aglutinantes proteicos ..................................................... 169
4.1.2 Aglutinantes oleosos........................................................ 170
________________________________________________________
xxii
 INDICE. RESULTADOS

4.2 Identificación de los analitos ...................................................... 170

4.2.1 Aminoácidos ................................................................... 170
4.2.2 Ácidos grasos .................................................................. 171

4.3 Optimización de los parámetros instrumentales ........................ 172

4.3.1 Detección de los aminoácidos............................................ 172
4.3.2 Detección de los ácidos grasos .......................................... 175

4.4 Estudio analítico de las muestras patrón.................................... 176

4.4.1 Análisis de proteínas.......................................................... 176
4.4.2 Análisis de aceites secantes................................................ 177

4.5 Caracterización de patrones de aglutinantes.............................. 178

4.5.1 Diferenciación entre aglutinantes proteicos ........................ 178
4.5.2 Diferenciación entre aglutinantes oleosos ........................... 183

4.6 Aplicación de la metodología propuesta a muestras

procedentes de obras pictóricas ................................................. 188
4.6.1 Témperas y temples ......................................................... 188
4.6.2 Pinturas al óleo................................................................ 188

5. Caracterización de los constituyentes de barnices de violines

y laúdes italianos de la época renacentista mediante
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas ....... 189

5.1 Optimización del método de análisis de los materiales de

referencia.................................................................................. 190

5.2 Caracterización de los compuestos en esencias y

resinas naturales patrón............................................................ 192

5.3 Caracterización de los materiales en barnices de instrumentos

musicales de cuerda de la época renacentista............................. 194
5.3.1 Aceites secantes .............................................................. 195
5.3.2 Resinas terpénicas........................................................... 196
5.3.2.1 Muestra procedente del barniz de un laúd de Maler . 196
5.3.2.2 Muestra procedente del barniz de un violín de
Stradivarius ........................................................... 198
5.3.2.3 Muestra procedente de la capa filmógena de la
tiorba de Venere .................................................... 198
________________________________________________________
xxiii
 INDICE. RESULTADOS

6. Caracterización de resinas sintéticas utilizadas en obras de

arte modernas mediante cromatografía de gases acoplado
a espectrometría de masas con pirólisis previa ............................ 205

6.1 Estudio de resinas sintéticas patrón........................................... 205

6.1.1 Polímeros de vinilo ......................................................... 206
6.1.2 Polímeros de condensación.............................................. 208

6.2 Estudio de muestras procedentes de una obra pictórica

moderna ................................................................................... 209
6.2.1 Área pigmentada de azul.................................................. 211
6.2.1 Área pigmentada de negro ............................................... 211

VI. CONCLUSIONES..................................................................... 225

________________________________________________________
xxiv
 INDEX. PART B

PARTE/PART B

FOR DOCTOR EUROPEUS MENTION

ANALYTICAL STUDY OF MATERIALS USED IN

VARNISHES, BINDING AND CONSOLIDANTS IN
ARTWORKS BY CHROMATOGRAPHIC AND
SPECTROMETRIC METHODS

VII. SUMMARY

1. Introduction................................................................................. 235

2. Aims ............................................................................................. 237

3. Results and Discussion.................................................................. 239

3.1 Characterization of proteins in pictorial artworks through
their aminoacids relative amount by liquid
chromatography with fluorescence detection ......................... 239
3.2. Characterization of waxes by means of their relative
amount of linear alkanes and fatty acids in artworks
by gas chromatograph......................................................... 241
3.3 Characterization of drying oils by liquid
chromatography coupled to UV-Visible and
fluorescence detector .......................................................... 243
3.4 Characterization of protein and oil binding media by
direct infusion mass spectrometry........................................ 245
3.5 Characterization of the compounds in varnishes of
Italian string instruments by gas chromatography
coupled to mass spectrometry............................................. 247
3.6 Characterization of synthetic resins in modern artworks
by pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry........... 248

VIII. ANALYTICAL STUDY OF SYNTHETIC POLYMERS IN

ARTWORKS

1. Experimental................................................................................ 253
1.1 Standards............................................................................ 253
1.2 Description of the samples from artworks ............................. 253
1.3 Instrumentation ................................................................... 255
1.4 Experimental procedure....................................................... 255

________________________________________________________
xxv
 INDEX. PART B

2. Results and discussion.................................................................. 256

2.1 Study of standard synthetic resins ...................................... 256
2.1.1 Vinylpolymers ...................................................... 257
2.1.2 Condensation polymers........................................... 259
2.2 Studies of samples from a pictorial artwork........................ 260
2.2.1 Blue pigmented sample ........................................... 262
2.2.1 Black pigmented sample ......................................... 262

IX. CONCLUSIONS........................................................................ 265

X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES............................................... 273

________________________________________________________
xxvi
 PARTE A.
ESTUDIO ANALÍTICO DE MATERIALES
EMPLEADOS EN BARNICES, AGLUTINANTES Y
CONSOLIDANTES EN OBRAS DE ARTE
MEDIANTE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Y
ESPECTROMÉTICOS

1
I. INTRODUCCIÓN

3
 I. INTRODUCCIÓN

La creación de obras de arte ha sido el vehículo principal del hombre

para la expresión de sus sentimientos, emociones y estados de ánimo, tanto a
nivel individual como en el entorno de una sociedad e incluso de una
civilización. Así pues, el estudio del patrimonio artístico presenta un gran
interés cultural e histórico, ya que permite aumentar el conocimiento sobre la
evolución de las sociedades, a través del análisis de multitud de objetos. No
obstante, estos objetos sufren degradaciones a lo largo del tiempo a causa de
las agresiones de agentes externos y también a condiciones de conservación
inadecuadas. Debido a ello, resulta imprescindible su correcta restauración
para aumentar su duración, y permitir su estudio y exposición pública. La
propuesta de tratamientos de restauración exige disponer de una información
lo más completa posible acerca de los materiales que fueron utilizados en su
elaboración.
Uno de los campos de aplicación de la Química Analítica, cada vez
más extendido internacionalmente, es el estudio de obras de arte
pertenecientes al Patrimonio Artístico. Las ciencias analíticas se emplean
con el objetivo de caracterizar los materiales y las características físicas de
de las obras de arte con fines varios: determinar la técnica artística de
ejecución del autor , su autentificación, atribución, localización geográfica e
histórica, y datación, al poder hallar materiales de los que se conoce que son
característicos de ciertos artistas, escuelas, épocas o zonas geográficas. Al
mismo tiempo, se puede establecer la presencia de sustancias anacrónicas. El
análisis químico de la obra de arte permite, de igual manera, realizar el
estudio de las alteraciones y degradaciones, y la justificación de sus posibles
causas y establecer probables mecanismos, ya hayan sido producidos
mediante procesos naturales o por la propia acción humana. También resulta
apropiado el análisis químico para distinguir alteraciones de posibles
antiguas intervenciones destinadas, entre otros objetivos, a ocultar el
deterioro real de la obra de arte. Todo esto será de gran ayuda en el momento
de establecer las propuestas más idóneas para su posible intervención
conservativa y en su caso de restauración.
El análisis de obras de arte presenta ciertas particularidades debido,
principalmente, a la complejidad de los materiales involucrados, los cuales
resultan de la mezcla de los inicialmente utilizados por el artista junto a los
producidos por alteraciones de aqué llos. Todo este conjunto constituye la
matriz característica de las muestras analíticas. Una obra de arte es un objeto
propio de los fondos de los Bienes Culturales y suele formar parte de
colecciones expuestas en museos o lugares públicos, por lo que cualquier
modificación o degradación de los materiales pueden alterar sustancialmente
su valor artístico. Por ello, la toma de muestra debe ser muy cuidadosa,
________________________________________________________
5
 I. INTRODUCCIÓN

intentando tomar la mínima cantidad de muestra posible y de manera que no

afecte sustancialmente a la obra de arte. Otra particularidad radica en la
naturaleza de las muestras debido a su elevada heterogeneidad. En efecto, el
artista emplea de forma desigual los materiales y dado que las obras de arte
forman conjuntos sólidos no se produce ninguna homogeneización. Por otra
parte, las capas más exteriores están más expuestas al medio ambiente, por
lo que su evolución podrá ser diferente a la de las capas internas. Por ello, la
porción de muestra se debe de tomar de forma que represente lo más
fielmente posible al conjunto objeto de estudio, y el tratamiento de datos
debe tener en cuenta cómo se efectuó el muestreo. En consecuencia , dado
que las muestras son de mínimo tamaño y están constituidas generalmente
por una gran cantidad de compuestos, su análisis requiere el uso de técnicas
analíticas de gran sensibilidad y selectividad. Por ello, la técnica analítica
empleada dependerá de la naturaleza de la muestra y de la información que
se desea obtener.

________________________________________________________
6
 II. OBJETIVOS

7
 II. OBJETIVOS

Los objetivos generales propuestos para la presente Tesis Doctoral

están dirigidos hacia la puesta a punto de metodologías analíticas para la
caracterización de una amplia colección de diversos materiales utilizados en
obras de arte, concretamente proteínas, ceras naturales, aceites secantes,
resinas terpénicas y polímeros sintéticos. Con el propósito de evaluar la
validez de las metodologías propuestas, éstas se aplicaron al análisis de
muestras procedentes de obras de arte pertenecientes al Patrimonio Artístico.
Teniendo en cuenta las consideraciones indicadas anteriormente,
referentes a los objetivos generales de la presente Tesis, se establecen los
siguientes objetivos específicos:

-- Propuesta de caracterización de proteínas y aceites secantes utilizadas en

obras de arte por cromatografía líquida (HPLC).
- Optimización de la extracción y derivatización de los aminoácidos o ácidos
grasos para aumentar la sensibilidad.
- Establecimiento de las condiciones instrumentales adecuadas para la
separació n cromatográfica de los analitos.
- Identificación de los aminoácidos o ácidos grasos patrón y determinación
de los parámetros analíticos del método.
- Caracterización de las proteínas y aceites secantes a partir de la proporción
relativa de los analitos.
- Aplicación del método a muestras procedentes de obras pictóricas.

-- Estudio de las ceras naturales presentes en objetos de interés artístico y

arqueológico por cromatografía de gases (GC/FID), mediante análisis de los
alcanos lineales y etilderivados de los ácidos grasos.
- Identificación de los hidrocarburos y ácidos grasos presentes en la
composición de las ceras naturales.
- Caracterización de las ceras a partir de la composición relativa de ácidos
carboxílicos y de hidrocarburos.
- Aplicación del método propuesto a muestras artísticas.

-- Optimización de metodologías analíticas para la identificación de

aglutinantes proteicos y oleosos sin etapas previas de derivatización o
separación por espectrometría de masas directa.
- Proponer un tratamiento rápido de hidrólisis de las muestras y extracción
de los aminoácidos y ácidos grasos.
- Optimización de las condiciones instrumentales del espectrómetro de
masas para la identificación de los aminoácidos y ácidos grasos.
- Diferenciación de los aglutinantes proteicos y oleosos a partir de la
cantidad relativa de aminoácidos y ácidos grasos, respectivamente, a través
________________________________________________________
9
 II. OBJETIVOS

de un tratamiento quimiométrico de los datos obtenidos mediante Análisis

Discriminante Lineal.
- Aplicación de la metodología a muestras procedentes de obras de arte.

-- Estudio analítico de la fracción orgánica de barnices de instrumentos

musicales de cuerda por GC/MS.
- Optimización del método de derivatización y de las condiciones
instrumentales del GC/MS, para la identificación de las sustancias presentes
en los materiales patrón.
- Caracterización de las moléculas incluidas en los materiales patrón en las
muestras reales.
- Aplicación del método propuesto en barnices de instrumentos de cuerda
antiguos, incluyendo un ejemplar de Stradivarius.

-- Estudio analítico de resinas poliméricas presentes en obras pictóricas

modernas mediante pirólisis-GC/MS.
- Identificación de los fragmentos obtenidos a través del análisis de los
patrones de polímeros sintéticos.
- Identificación de los compuestos detectados en muestras procedentes de
una pintura moderna.
- Aplicación del método a muestras procedentes de obras pictóricas.

________________________________________________________
10
III. ANTECEDENTES Y ESTADO
ACTUAL

11
 III. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL

1. Materiales orgánicos empleados como aglutinantes, consolidantes,

cubrientes y barnices en obras de arte

Los materiales aglutinantes, consolidantes, cubrientes y barnices

ejercen una marcada influencia sobre la calidad artística de las obras de arte.
Los aglutinantes se utilizan en primer lugar como medio para disolver
los pigmentos, lo que permite su aplicación sobre la superficie objeto de
decoración. El propio aglutinante permite asimismo que la capa pictórica se
mantenga adherida a la superficie del soporte, y a la vez mantiene
cohesionadas las partículas del pigmento. Asimismo pueden modificar la
coloración del pigmento, mediante atenuación o intensificación. Estos
materiales también tienen propiedades consolidantes, ya que aumentan la
rigidez y la consistencia de la capa pictórica, así como cualidades cubrientes
debido a que forman una película protectora sobre los pigmentos [1-4].
Algunos instrumentos musicales están considerados como obras de
arte, como los violines y laúdes elaborados por los conocidos luthiers
(fabricante de instrumentos de cuerda) cremonenses como Antonio
Stradivarius. Estos objetos están fabricados de madera, mientras que su
superficie externa está recubierta por una película de barnices constituidos
por materiales filmógenos. Su función principal consiste en aislar el objeto
del exterior, para evitar que los agentes agresores del medioambiente causen
el deterioro de los materiales de la obra de arte. Asimismo se utilizan para
modificar la apariencia estética del instrumento musical, mediante
ensalzamiento del brillo y saturación de los colores. Algunos expertos
afirman incluso que la capa filmógena participa en las propiedades acústicas
de los violines [5].
Debido a lo referido con anterioridad, el conocimiento de las
características de los materiales y de las posibles causas de su deterioro es de
gran importancia para artistas y restauradores.

1.1 Descripción general de los materiales empleados en obras de arte

1.1.1 Características generales

Los aglutinantes eje rcen una influencia significativa sobre la

apariencia visual de la obra de arte hasta el punto que su elección por parte
del artista determina una u otra técnica pictórica, y más adelante se utilizará
por parte del restaurador/conservador como indicadores de las diferentes
épocas artísticas.
Hasta la edad moderna, los aglutinantes se obtuvieron a partir de
productos naturales, debido a su accesibilidad y abundancia. Las primeras
sustancias empleadas como aglutinantes fueron materiales de tipo
________________________________________________________
13
 III. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL

hidrofílico, extraídos a partir de proteínas de diverso origen. El uso de

aglutinantes proteicos da lugar a la s técnicas de témpera y temple, utilizadas
desde la Edad Antigua. Las proteínas exigen ser disueltas previamente en
agua, donde posteriormente se añadirán los pigmentos. Durante el secado, el
agua se retira, sin cambios químicos en el soporte [1].
Más adelante aparece otra técnica, denominada encáustica, que emplea
aglutinantes con propiedades hidrofóbic as como las ceras naturales. En este
caso el aglutinante se vuelve fluido mediante calentamiento o tratamiento
químico de la cera, tras lo cual se añadían los pigmentos [2].
A partir del siglo XVI se desarrolla la pintura al óleo, una nueva
técnica artística basada en el uso de aceites secantes de origen vegetal, cuyos
mayores exponentes fueron los hermanos Van Eyck. No obstante, el uso de
aceites secantes en obras pictóricas, generalmente combinadas con huevo
(temple mixto o graso), se conocía desde el siglo XII [3]. La principal
diferencia de la pintura al óleo respecto a la témpera, el temple y la
encáustica son las propiedades secantes de los materiales empleados. Los
aceites secantes son líquidos a temperatura ambiente, y pueden utilizarse
directamente para ser mezclados con los pigmentos. Una vez se aplican
sobre el soporte, empieza el proceso químico de secado, que hace que el
aceite forme una capa rígida. El aceite secante ejerce asimismo de medio
consolidante y cubriente, manteniendo la cohesión y formando una película
protectora sobre los pigmentos [4].
Los primeros materiales empleados para la elaboración de barnices
fueron resinas que se obtenían a partir de especies naturales, especialmente
de vegetales. Las resinas están compuestas principalmente por mono- y
sesquiterpenos (líquidos), así como di- y triterpenos (sólidos disueltos en los
anteriores), y, en escasa proporción, los correspondientes derivados
oxidados. Estas sustancias se disuelven en un líquido adecuado
(normalmente etanol, esencias o aceites secantes), y se aplican sobre la
superficie de la obra de arte. De ese modo, se forma una película que protege
las capas inferiores del deterioro, aunque ella misma puede ser atacada por
los agentes medioambientales, produciendo alteraciones en sus parámetros
físicos y químicos que modifican el valor estético de la obra de arte. Durante
el proceso de degradación se produce un aumento de la cantidad de
productos de oxidación. Al contrario que en las obras pictóricas, el barniz
depositado sobre la superficie de los violines forma parte del propio objeto y
no se suele retirar y sustituir en los procesos de intervención [5].
En la actualidad, el uso de las resinas sintéticas está muy extendido en
el campo del arte. Estos materiales poliméricos poseen gran versatilidad y
estabilidad química, por lo que se emplean como aglutinantes, consolidantes,
cubrientes y barnices. Las resinas poliméricas fueron sintetizadas por
primera vez durante la Revolución Industrial, siendo incorporadas a las obras
de arte, por lo que se encuentran únicamente en muestras procedentes de
________________________________________________________
14
 III. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL

obras pictóricas elaboradas o restauradas a partir del siglo XIX [6].

1.1.2 Factores causantes del deterioro

Los materiales que componen las obras de arte están sometidos a

alteraciones a lo largo del tiempo, lo que causa la variación de sus
características y propiedades. Estas alteraciones químicas provocan cambios
significativos en la composición, naturaleza, propiedades y estructura
general de las propias obras de arte, afectando a su valor artístico. Las causas
del deterioro tienen su origen tanto en la naturaleza de las sustancias que
forman parte de la obra artística, como en la influencia de agentes externos y
condiciones medioambientales [7].
Los componentes de los barnices, aglutinantes, pigmentos, así como
otros aditivos como plastificantes, blanqueadores, abrillantadores, agentes
secantes, etc, sufren procesos de deterioro y envejecimiento desde su
aplicación sobre la obra de arte. En ocasiones también pueden interaccionar
entre sí y acelerar la degradación de los materiales presentes [8].
Los procesos de degradación pueden ser provocados o catalizados por
agentes procedentes del exterior de la obra pictórica. La humedad ambiental
es una de las principales causas de deterioro de las obras de arte. La mayor
parte de los materiales empleados son de naturaleza higroscópica y se verán
modificados en función del grado agua presente en la atmósfera, además
incluyen en su estructura grupos reactivos susceptibles de experimentar
hidrólisis. Por otro lado, la propia estructura de la obra de arte tiene
tendencia a reequilibrar la cantidad de agua a su alrededor, expulsando el
agua que contiene cuando el grado de humedad es reducido, e introduciendo
agua al interior en el caso contrario. Estos procesos causan dilataciones y
contracciones de la estructura de la obra pictórica, afectando a largo plazo a
la cohesión y adhesividad de las capas pictóricas, aumentando la tensión
estructural y posibilitando la formación de deformaciones, grietas y
desprendimientos de la capa pictórica [8].
La temperatura también es un factor que puede afecta al
envejecimiento de los materiales, debido principalmente a que el calor
provoca un aumento de velocidad de las reacciones de degradación. Los
cambios bruscos de temperatura causan dilatación y contracción de los
materiales, pudiendo alterar la distribución de las capas pictóricas, de forma
análoga a la realizada por los cambios de humedad [8]. Los materiales
empleados en la elaboración de objetos artísticos pueden verse afectados por
la radiación, principalmente procedente de la luz solar. En estos casos, la
energía recibida permite alcanzar la energía de activación de numerosos
procesos químicos, lo que acelera las reacciones químicas y las rupturas de
enlaces. La radiación permite la formación de radicales, producidos a partir
de la ruptura homolítica de enlaces (principalmente carbono-hidrógeno y
________________________________________________________
15
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

carbono-oxígeno, conjugados a dobles enlaces). Estas entidades químicas

son enormemente reactivas, e inician rápidamente mecanismos de deterioro
de los materiales, provocando rupturas, reorganizaciones y la formación de
oligómeros y polímeros, que pueden hacer variar de forma drástica la s
propiedades de los materiales [9-11].
En la atmósfera existen gran cantidad de sustancias, principalmente
contaminantes ambientales, que pueden resultar dañinas para la obra de arte.
Los compuestos ácidos, junto a la humedad ambiental, favorecen la ruptura
de enlaces hidrolizables, como éster y peptídicos, aumentando la acidez de
los materiales [12].
Por otro lado, el oxígeno como birradical puede participar en la
iniciación y propagación de reacciones radicalarias, habitualmente mediante
el ataque a enlaces múltiples. Los agentes oxidantes presentes en la
atmósfera, principalmente el propio oxígeno y el ozono, interaccionan con
los materiales de las capas pictóricas, provocando su oxidación [7].
Numerosos agentes biológicos, como bacterias, hongos y algas, son
transportados por partículas en suspensión a través de la atmósfera y pueden
ser depositados sobre la obra de arte. Los microorganismos crean colonias
sobre su superficie, proceso influenciado en gran medida por las condiciones
medioambientales. En efecto, la presencia de luz favorece el desarrollo de
los agentes biológicos autótrofos que realizan la fotosíntesis, como las algas,
mientras que entorpece el crecimiento de los hongos. En general, una
humedad ambiental elevada favorecerá el desarrollo de la mayoría de
microorganismos. Las modificaciones de la composición química de la capa
externa se producen generalmente debido a que estos organismos pueden
utilizar los materiales sobre los que se asientan como fuente de alimentos
(especialmente si se trata de azúcares y proteínas), o bien para verter los
productos resultado de su metabolismo. Todo ello puede causar la
modificación del va lor estético de la obra de arte [11,13].
La capa superficial es la más expuesta a este tipo de procesos, debido a
que está directamente en contacto con el exterior. Sin embargo, en ocasiones
el agua en forma de humedad puede condensarse sobre la superficie de la
obra pictórica y filtrarse a través de su estructura por capilaridad. Así pues,
puede actuar como vehículo de transporte de contaminantes ambientales y
microorganismos, reproduciendo las condiciones de degradación en las
capas interiores [11].

1.2 Proteínas

1.2.1 Generalidades

Las proteínas son compuestos orgánicos ampliamente presentes en la

naturaleza. Tienen una gran importancia para los seres vivos, ya que
________________________________________________________
16
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

están involucradas en multitud de mecanismos bioquímicos que controlan

funciones indispensables en los organismos. Es de resaltar su influencia
tanto en procesos relacionados con su funcionamiento, como enzimas,
hemoglobina, anticuerpos, hormonas, etc., como en el mantenimiento de su
estructura anatómica, al estar presentes en el colágeno, los músculos,
tendones, piel, uñas, plumas, etc.
Las proteínas están formadas por macromoléculas cuyas unidades
básicas son los aminoácidos, los cuales se unen a través de enlaces
peptídicos. La estructura general de los aminoácidos consiste en un carbono
asimétrico, denominado carbono α, unido a un grupo carboxilo, una amina,
un hidrógeno y un grupo más o menos complejo R, que es característico de
cada uno de los aminoácidos. El enlace peptídico se considera un enlace
amida formado por la condensación entre el carboxilato de un aminoácido y
el grupo amina del siguiente. Este tipo de enlace es relativamente fuerte, por
lo que su ruptura exige condiciones ácidas o básicas extremas, o el uso de
enzimas específicos [14].

Se denominan polipéptidos a las moléculas compuestas por un número

limitado de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Una proteína se
define como un polipéptido de elevado peso molecular [14].
Por lo común, en la naturaleza sólo se encuentran veinte clases
diferentes de aminoácidos en las proteínas de plantas y animales, los cuales
presentan la misma configuración quiral, conociéndose únicamente L-
aminoácidos. Dado que los aminoácidos se diferencian únicamente por el
grupo característico R, su estructura se considera el parámetro que causa las
diferencias de propiedades fisico-químicas. Así pues, los aminoácidos se
subdividen en [15]:
- Hidrofóbicos, en los que el grupo R es una cadena hidrocarbonada, como
glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, metionina, prolina y
triptófano.
- Hidrofílicos ácidos: la cadena lateral contiene un grupo carboxilato, en esta
categoría están el ácido glutámico y el ácido aspártico.
- Hidrofílicos básicos: la cadena R tiene un grupo amino, como histidina,

________________________________________________________
17
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

lisina y arguinina.
- Hidrofílicos neutros: la cadena característica contiene un grupo polar, entre
los que se encuentran la serina, treonina, tirosina, cisteína, hidroxiprolina.
glutamina y asparaguina.
Además de estos veinte aminoácidos, en la naturaleza se han
identificado algunos otros formando parte de las proteínas. Se trata de
derivados de los aminoácidos principales, como la 4-hidroxiprolina, que
abunda en el colágeno, y la cistina, constituida por dos moléculas de cisteína
unidas por un enlace covalente azufre-azufre, que tiene gran importancia en
la estructura terciaria adoptada por las proteínas [16].
Los aminoácidos presentan un comportamiento anfótero, debido a que
incluyen en su estructura grupos con diferentes comportamientos frente a los
protones (carboxilato, amina, tiol, fenol, imidazol, etc). Así pues, el grado de
protonación de cada aminoácido dependerá de su naturaleza y del pH del
medio. En las disoluciones fuertemente ácidas, los aminoácidos se
encontrarán totalmente protonados, mientras que en medio básico
presentarán carga neta negativa. A cierto pH in termedio se encuentra el
punto isoeléctrico, donde la concentración de cationes y de aniones se iguala,
por lo que la carga neta es de cero. En este punto la solubilidad del
aminoácido es mínima. El punto isoeléctrico depende de la naturaleza de
cada aminoácido y se calcula de forma general como la media de los pK a de
los grupos incluidos en su estructura [15,16].
Los aminoácidos reúnen la reactividad de los grupos carboxilato
(esterificación, amidación, reducción, etc…) y las de los grupos amino
(amidación, alquilación, acilación, condensación con aldehidos y cetonas,
etc). Además, los aminoácidos con funcionalidades en la cadena lateral
presentan también las propiedades de sus grupos característicos: oxidación
del tiol y amina (cisteína y lisina), polimerización del fenol (tirosina),
reacciones propias de los alcoholes (serina y treonina), hidrólisis (glutamina
y asparagina), etc [15,16].
Es importante resaltar que las propiedades fisico-químicas, así como
la estructura terciaria de cada proteína, y por ende su funcionalidad en el
organismo, dependen tanto de la composición relativa de aminoácidos como
de su orden en la cadena peptídica [16].

1.2.2 Aplicación de proteínas en obras pictóricas

Las proteínas han sido ampliamente utilizadas desde la más remota

antigüedad en la decoración, especialmente como aglutinantes y
consolidantes en las obras de arte policromadas. Entre las razones más
importantes que explican su uso están su fácil disponibilidad debido a su
origen y aplicabilidad doméstica y por otra parte sus propiedades como
cubriente y consolidante.
________________________________________________________
18
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

La función de la proteína consiste básicamente en dar soporte y

cohesionar los pigmentos, por lo que influye directamente en las propiedades
artísticas de la obra pictórica. La selección del tipo de aglutinante proteico
empleado depende de factores diversos, tales como el tipo de pigmento
utilizado, la localización y la época de ejecución de la obra.
Como ya se ha anticipado, el uso de aglutinantes proteicos da lugar a
una técnica artística propia denominada témpera (cuando se utiliza proteína
de huevo) o temple (gelatinas animales), uno de los procedimientos más
antiguos que se conoce para la decoración de objetos artísticos. Se ha
atestiguado su uso en obras de arte policromadas procedentes del Antiguo
Egipto, Babilonia y Grecia. Durante el Medioevo se empleó en vidrios y
esculturas policromadas, así como en pinturas murales y para realización de
pinturas sobre tablas. La aplicación de aglutinantes proteicos fue
perfeccionada por los iconoclastas en el Imperio Bizantino (desde 400 a
1453), y posteriormente se extendió hasta Italia al inicio del Renacimiento.
Durante el siglo XVI el óleo hace su aparición, sustituyendo a la témpera
como técnica pictórica principal. Sin embargo, el uso de la témpera aumenta
a principios del siglo XX, debido a su aplicación por parte de ciertos pintores
modernos.
En las técnicas de témpera y temple, la pintura se prepara mezclando
en agua el pigmento finamente pulverizado y el aglutinante proteico. Esta
mezcla se deposita rápidamente, por medio de varias pinceladas, sobre la
superficie que se desee decorar. El secado se produce con rapidez,
formándose una capa transparente o semi-opaca, dura y quebradiza, que
permanece durante largo tiempo sin mostrar cambio de color. Los pigmentos
quedan encerrados en la capa pictórica así formada, viendo realzada su
coloración y aumentando su brillo, claridad y pureza.
La pintura mediante témpera y temple presenta diversas ventajas,
como la baja toxicidad de sus ingredientes y la posibilidad del empleo de un
amplio abanico de pigmentos posibles. Sin embargo, su proceso de secado es
rápido, por lo que es difícil corregir la obra pictóricas.

1.2.3 Características químicas

Los aglutinantes más habituales en las obras pictóricas realizadas

mediante la técnica de témpera están constituidos por material proteico
extraído a partir de leche y clara de huevo, mientras que para el temple
provienen de colas de colágenos procedentes de animales.
Las colas anima les o gelatinas son proteínas fibrilares o
escleroproteínas. Su componente principal es el colágeno, una
hidroxiproteína fibrosa insoluble en agua, que forma dispersiones coloidales
acuosas y se transforma en gelatina durante el proceso de fabricación de las
colas. Se extrae de la piel, los huesos, los tendones y los cartílagos de
________________________________________________________
19
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

diversos animales. Contiene elevadas proporciones de glicina, prolina e

hidroxiprolina. Su estructura forma tres cadenas enrolladas en forma
helicoidal, mantenidas por puentes de hidrógeno, que desaparecen al
transformarse en gelatina, compuesta únicamente por una cadena lineal.
También contienen otras proteínas y glicerina. Asimismo, su aspecto, su
composición química y sus propiedades físicas dependen del origen y del
tipo de tratamientos a los que han sido sometidas durante las fases de
preparación y purificación. Las menos puras suelen llamarse colas fuertes,
mientras que las más puras toman el nombre de gelatinas, y están
compuestas casi exclusivamente de colágeno. En el caso de la decoración de
obras pictóricas, las más habituales son las gelatinas procedentes de
colágeno porcino y bovino.
La albúmina es la principal proteína que se encuentra en la clara de
huevo formando una disolución acuosa coloidal. Pertenece a una clase de
proteínas que tienen la propiedad de coagularse con el calor. Se obtiene el
mismo efecto cuando está diluida y extendida en una capa fina, y exponerse
a la luz. La clara de huevo es el material proteico más extendido en la
técnica artística de témpera.
La caseína es una fosfoproteína contenida en la leche de los mamíferos
en forma de una sal cálcica en dispersión coloidal. Es posible extraerla
desnatando la leche, calentándola a 35 ºC y provocando la floculación de la
proteína en medio ácido a pH 4,8. Posteriormente, la sustancia obtenida se
lava con el mismo ácido y se deja secar. Actualmente, la floculación de la
leche desnatada se obtiene por medio de distintas sales, como el sulfato de
amonio y otros. La caseína que se elabora con este procedimiento no es
soluble en agua, y para que pueda ser empleada debe transformarse en otra
sustancia soluble llamada caseinato. La transformación se logra haciendo
reaccionar la caseína con álcalis, reacción que resulta posible porque los
ácidos carboxílicos libres de la caseína son preponderantes con respecto a los
grupos aminos básicos. Dos de las propiedades fundamentales de la caseína
son su rapidez de secado y la formación de una característica película mate.
Desde siglo XIX, se ha utilizado para la preparación de los lienzos y en las
intervenciones de reentelado de las pinturas

1.2.4 Alteración química a lo largo del tiempo

El proceso de secado en las capas pic tóricas formadas aglutinantes

proteicos se produce a través de la evaporación del disolvente. Al retirarse
las moléculas de agua, las cadenas proteicas se extienden intentando rellenar
los huecos producidos, causando el debilitamiento de las interacciones
establecidas entre los aminoácidos y alterando la estructura terciaria de las
proteínas. La reorganización posterior implica que los grupos orientados
hacia el interior de la estructura pasen al exterior, aumentando la reactividad
________________________________________________________
20
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

de la proteína [17].
Las proteínas son materiales relativamente estables frente al
envejecimiento y a la oxidación, por lo que en condiciones ambientales
normales su composición química experimenta pocos cambios. Sin embargo,
la humedad, unida a la presencia en la atmósfera de compuestos ácidos,
puede causar una hidrólisis lenta de los enlaces peptídicos, reduciendo la
masa molecular del biopolímero. Por otro lado, la propia humedad favorece
el crecimiento de microorganismos y bacterias. Estos agentes biológicos
segregan enzimas protolíticos que catalizan la descomposición de la
proteína, y digieren los aminoácidos liberados. Las proteínas también se
verán afectadas por elevadas temperaturas, provocando la modificación de
su estructura, e incluso su desnaturalización.
La luz solar afecta a los aglutinantes proteicos a través de procesos
catalizados por los pigmentos y colorantes, que cumplen la función de
fotoiniciadores. Estas sustancias inician la formación de radicales libres, a
través de la escisión de moléculas de agua, e hidroxiperóxidos al incidir
sobre ellos radiación con la energía adecuada, que a su vez provocan la
iniciación y propagación de reacciones radicalarias de oxidación [17]. Los
pigmentos y colorantes se encuentran dispersos por toda la capa pictórica,
por lo que se forman numerosos puntos de iniciación por la superficie de la
obra pictórica. Los aminoácidos más afectados por los procesos de
fotooxidación son los siguientes:
a) Triptófano: la cadena lateral del triptófano se oxida, mediante la
formació n de un grupo oxo, dando lugar a la kynurenina. Esta sustancia se
modifica por adición de un grupo formil sobre el nitrógeno del pirano,
produciendo N-formilkynurenina.

triptófano kynurenina N-formilkynurenina

b) Metionina: la modificación se produce sobre el sulfuro de la cadena

lateral, el cual pasa a sulfóxido y más tarde a sulfona.

________________________________________________________
21
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

c) Cisteína: la fotoxidación favorece la formación de puentes disulfuro

a través de la reacción entre los grupos tiol de la cadena lateral, dando lugar
al dímero cistina. El establecimiento de este entrecruzamiento ayuda a
mantener la estructura terciaria de la proteína [15].

d) Tirosina: en este caso durante el envejecimiento se producen

enlazamientos a través de reacciones de polimerización de los grupos fenol
de la cadena lateral.

e) Lisina: los grupos amino presentes en las cadenas laterales pueden

experimentar una serie de oxidaciones que conducen a la formación de un
grupo aldehido. En este caso dos residuos de lisina cercanos reaccionarán
entre ellos mediante una condensación aldólica dando lugar a un dímero. La
formación de este entrecruzamiento aporta rigidez a la proteína [15].

________________________________________________________
22
 III. ANTECEDENTES. PROTEINAS

Estos procesos de degradación están catalizados en presencia de

aceites secantes, incluso en ausencia de radiación incidente. Así pues, el
propio proceso de oxidación de los aceites secantes produce radicales alquilo
(R· ), alcóxido (RO· ) y peróxido (ROO· ), que iniciarán los mecanismos de
oxidación radicalarios de los aminoácidos. En especial, la condensación
entre los hidroperóxidos y carbonilos, con el grupo amino de la cadena
lateral de la lisina da lugar a la formación de iminas, que son responsables
del oscurecimiento paulatino de la superficie de algunas obras de arte que
contienen tanto material proteico como lipídico [18]. Por otro lado, se puede
producir la degradación de los compuestos de capa pictórica mediante la
condensación de los aminoácidos con grupos carbonilo de oligosacáridos,
que produce polímeros de color parduzco con grupos carboxílicos y
fenólicos libres [19].

Algunos tratamientos de limpieza pueden participar en el deterioro de

la obra de arte. En ocasiones se aplican sobre la superficie productos ácidos
o básicos, llevando el pH del medio a valores extremos, lo que puede
favorecer la ruptura de los enlaces peptídicos, así como la alteración de las
interacciones iónicas entre los diferentes aminoácidos, y causando la
modificación de la estructura terciaria. Asimismo es importante tener en
cuenta el disolvente empleado en el proceso de restauración. En el caso del
uso de alcoholes de bajo peso molecular, éstos pueden introducirse en los
resquicios intersticiales de la proteína, alterando las interacciones por
puentes de hidrógeno e iónicas entre las cadenas de aminoácidos, lo que
modifica su disposición espacial y debilita la estructura terciaria la proteína.
En algunos casos, son los propios reactivos utilizados en la restauración los
que resultan dañinos para la obra artística [17].
De forma general, el envejecimiento provoca en las proteínas cambios
en la proporción relativa de los aminoácidos, así como una modificación de
la estructura y una disminución de la solubilidad [17].
Por otro lado, algunos aminoácidos con menor estabilidad
termodinámica experimentan modificaciones del entorno del centro quiral y
________________________________________________________
23
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

descomposición a lo largo del tiempo. Los ejemplos más estudiados son la

modificación de la arguinina, que da lugar a ornitina y citrulina, la
descarboxilación del ácido aspártico forma â-alanina así como las
epimarizaciones de la isoleucina para dar lugar a aloisoleucina y del ácido L-
aspártico que produce D-aspártico [20].
Estos procesos permiten establecer una aproximación acerca de la
antigüedad de muestras que contengan proteínas fosilizadas, a partir de la
relación entre el aminoácido precursor y el producto. Así pues, la
epimarización del ácido L-aspártico se utiliza para datar muestras de mil a
cien mil años, mientras que la modificación de la leucina permite la datación
de muestras mucho más antiguas, hasta el periodo del Mioceno (26 millones
de años) [7].

1.3 Ceras naturales

1.3.1 Descripción

Las ceras son compuestos naturales obtenidos a partir de sustancias

excretadas a través de las capas superficiales de los organismos vivos. Estos
materiales están compuestos principalmente por mezclas de sustancias
orgánicas de elevado peso molecular. Contienen triésteres, diésteres y
monoésteres de ácidos grasos de cadena media y alcoholes de alto peso
molecular (mono-, di- o trialcoholes), hidrocarburos pesados, alcoholes
libres, ácidos grasos libres, aldehidos, cetonas, β-dicetonas, y en menor
medida flavonoides, esteroles, triterpenoles y ácidos terpénicos [7,21].
Existen numerosas clases de ceras, que se clasifican en función de su
procedencia, ya sea animal, vegetal o mineral [7,22]. De forma general, se
considera como “cera” a un material cuya composición química se asemeja a
la de la cera de abeja.

1.3.1.1 Descripción de las ceras de origen animal

En los animales la producción de ceras está asociada a las glándulas

sebáceas de la piel. Su función principal es impedir el movimiento del agua
por la cutícula y evitar la deshidratación. Su composición química depende
de la especie y de la edad del animal.
La cera de abeja es excretada a través del abdomen del insecto y se
obtiene como subproducto en la fabricación de miel. Contiene
principalmente ésteres, formados por alcoholes de elevado peso molecular y
ácidos grasos, e hidrocarburos [23]. Se trata de un producto comercial cuyo
uso se encuentra muy extendido hasta el día de hoy.
La cera de lana (lanolina) es un producto graso producido por las
________________________________________________________
24
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

ovejas, y se obtiene a partir del refino y limpieza de la lana. Esta cera está
compuesta principalmente de ésteres cerosos (principalmente de 1- y 2-
alcoholes) en un 50 % y de ésteres de esteroles en un 33%.
Numerosos animales marinos producen ceras, las cuales se acumulan
en diversos tejidos del organismo, como en el hígado y los músculos. Poseen
diversas funciones, como fuente de energía, aislamiento del medio exterior,
control del nivel de flotación y para la determinación de al posición por
sonar. Estas ceras están compuestas por hidrocarburos, principalmente
escualenos y otros hidrocarburos terpénicos, y ésteres formados por
monoalcoholes y ácidos grasos, de los cuales el mayoritario es el ácido
oleico.
Algunas especies de pájaros segregan material ceroso a través de las
glándulas uropigiales, cuya función principal consiste en recubrir las plumas
y evitar que se éstas se mojen con agua. Están compuestas por ésteres de
alcoholes de 16 a 18 átomos de carbono y ácidos grasos largos y
ramificados.
Diversos tipos de microorganismos como las micobacterias producen
ceras, a pesar de ser algo inusual en los procariotas. Estos productos
contienen principalmente ésteres micoserosatos, los cuales son agentes
patógenos con elevada toxicidad. Los ésteres contienen ftiocerol, un alcohol
polirramificado con 34 o 36 átomos de carbono y grupos hidroxi en las
posiciones 9 y 11 o 11 y 13, unidos a ácidos grasos de cuya cadena
carbonada contiene de 18 a 26 átomos, con sustituyentes metilo en las
posiciones 2; 4; 6 y 8 [24].

1.3.1.2 Características de las ceras de origen vegetal

Los vegetales producen ceras con el objetivo de recubrir sus hojas.

Esta protección está formada por micropartículas semicristalinas, que se
sitúan en la interfase entre la planta y la atmósfera. Esta capa protege a la
planta del medio ambiente y proporciona una adecuada defensa contra los
insectos. Asimismo, tiene por misión dificultar la evaporación del agua y de
sus solutos, con lo que se controla la pérdida de volátiles. La composición
química de las ceras presenta gran variabilidad y depende de la especie
vegetal y del lugar de deposición (flor, hoja, fruto). Los contenidos de ceras
procedentes de diversas especies vegetales se incluyen en la Tabla 1 [24].
La cera de carnauba se obtiene a partir de las hojas de la palmera
carnauba, Copernicia ceriferia , originaria de Brasil. Este material ceroso
recubre las hojas en forma de capa, formando una película brillante. Esta
cera está compuesta principalmente por ésteres de ácidos grasos, así como de
ácidos grasos libres, alcoholes, hidrocarburos y resinas.

________________________________________________________
25
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

Tabla 1. Proporción relativa de los constituyentes de las ceras producidas por ciertas plantas.
Clase de hoja de hoja de flor de hoja de caña de
manzana
sustancia uva rape rosa guisante azúcar
hidrocarburos 2 33 20 58 40-50 2-8
ésteres 6 16 18 11 5-10 6
alcoholes
60 12 6 4 20 5-25
primarios
alcoholes
- 8 20 9 7 -
secundarios
ácidos libres 8 8 20 5 6 3-8
aldehidos 6 3 2 - 5 50
cetonas - 20 3 - - -

Por su parte, la planta de jojoba (Simmondsia chinensis) que crece en

las regiones semiáridas de Estados Unidos y México, produce una cera
significativamente inerte frente a la oxidación que se almacena en la semilla.
Está constituida por ésteres de monoalcoholes de 22; 24 y 26 átomos de
carbono, con una proporción relativa de 22%; 21% y 4%, respectivamente,
acoplados principalmente a ácido oleico (6%), 11-eicosenoico (35%) y
erúcico (7%) [24].

1.3.1.3 Mecanismos de biosíntesis de ceras naturales

De forma general, la biosíntesis de los materiales constituyentes de las

ceras se produce en las células epiteliales e implica varias etapas en las
cuales participan numerosos enzimas e intermedios. En primer lugar, los
ácidos palmítico y esteárico son sintetizados por enzimas solubles que
forman el complejo ácido graso-sintasa. Posteriormente se produce el
alargamiento de la cadena carbonada de dos átomos de carbono, catalizado
por un complejo multienzimático anclado en las membranas, llamado ácido
graso-elongasa.
El sustrato se encuentra en forma de ácido graso esterificado con el
enzima acetilcolina (CoA), el cual se condensa con malonil-CoA, seguida de
una reducción â -cetónica. A continuación se produce una deshidratación y
una reducción enólica. Así pues, los constituyentes de las ceras se obtienen a
partir de los ésteres ácido graso-CoA por medio de dos rutas catalíticas.
En la primera vía, los sustratos se reducen con acetil CoA reductasa al
aldehido correspondiente, que a su vez se reduce a alcohol primario con el
mismo enzima. El producto formado reacciona vía acetil CoA alcohol
transacetilasa con un ácido graso para formar un éster (Figura 1).
La segunda ruta sintética consiste igualmente en la reducción del
sustrato ácido graso-CoA a aldehido, el cual se reduce a su vez a través de
una reacción catalizada por el enzima decarbonilasa, dando lugar a un
alcano. Éste se modifica posteriormente mediante la adición de un grupo
hidroxi en cualquiera de sus posiciones, a través de un proceso catalizado
________________________________________________________
26
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

por hidroxilasas. El alcohol obtenido puede esterificarse mediante el proceso

indicado en la primera vía sintética, o dar lugar a una cetona mediante una
etapa catalizada por un enzima oxidasa (Figura 1). Finalmente, otra serie de
reacciones análogas permiten obtener dicetonas y dialcoholes.
Así pues, estas rutas biosintéticas permiten asegurar la producción de
los constituyentes de las ceras por parte de los seres vivos, a partir de los
ácidos grasos contenidos en sus reservas de material lipídico [25].

Figura 1. Esquema de las principales rutas sintéticas que conducen a la formación de los
constituyentes de las ceras.

1.3.1.4 Descripción de las ceras de origen mineral

Las ceras de origen mineral se producen mediante procesos

geológicos, habitualmente en ausencia de oxígeno y luz.
La cera montan, una cera blanca que se emplea en pulidos y en
pinturas, se obtiene en los depósitos de carbón, turba y lignita a partir de la
descomposición de vegetales.
La ozocerita se forma partir del carbón animal y de la lignita, y se
extrae en yacimientos mineros. Está constituida por una mezcla de
hidrocarburos saturados y es soluble en la mayoría de los disolventes
orgánicos. A partir de ella se obtienen otras ceras como la vaselina, parafina
y okonita. Por su parte, la ceresina se obtiene a partir del tratamiento con
ácido sulfúrico de la ozocerita. Presenta propiedades de goma y es
________________________________________________________
27
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

relativamente inerte debido a su bajo contenido en ácido. Esta cera mineral

es blanca, inodora y amorfa, y se utiliza como adulterante de la cera de abeja
[7].

1.3.1.5 Uso de ceras naturales a lo largo de la historia

Debido a su accesibilidad y abundancia en la naturaleza, las ceras

naturales han tenido multitud de aplicaciones a lo largo de la historia. Se han
empleado como combustible y han sido el principal método de iluminación
en numerosas culturas.
La cera de abeja se utilizaba en el antiguo Egipto como cosmético y en
el proceso de momificación [23,26,27]. Asimismo se han hallado diversos
tipos de ceras en yacimientos de enterramientos neolíticos [23,28] y en
rituales religiosos [21].
Durante la antigüedad fue un material ampliamente utilizado en
escultura y joyería, siguiendo una técnica denominada método de la cera
perdida, utilizada principalmente para la manufactura de esculturas de
bronce [26,29]. Consiste en la elaboración de un modelo de cera de la
escultura, el cual se recubre con una capa de yeso, barro u otro material
refractario. Posteriormente se vierte en su interior el metal líquido, que va
fundiendo la cera y ocupando su lugar, la cual se evacua a través de orificios
practicados en la parte inferior. Por último, una vez se ha enfriado se rompe
el recubrimiento, descubriendo la escultura que conserva la forma de la
figura original construida en cera [29].
Las propiedades aislantes e hidrofóbicas de las ceras también han sido
aprovechadas en la edificación. En la época egipcia se empleaba para
proteger los ladrillos [7] y en la construcción de barcos [21], mientras que en
la época romana se empleó como aislante de agua, protector y vehículo de
los pigmentos para las superficies de piedras, especialmente las de mármol
[23,28]. Se han utilizado asimismo en alfarería como sellante [23,30,31].
Actualmente existen numerosos productos industriales para uso
comercial, que se clasifican como ceras. Se emplean principalmente en el
campo de la alimentación, en adhesivos, agentes sellantes, tintes,
cosméticos, productos farmacéuticos, lubricantes, pulimentos y protectores
contra la corrosión [26].

1.3.2 Aplicación de ceras en obras pictóricas

Desde la antigüedad, las ceras naturales se han aplicado en el campo

de la decoración, preservación y como aglutinante en obras de arte [26,32].
Su empleo en obras pictóricas da lugar a una técnica artística propia
denominada encáustica, donde la cera cumple la función de aglutinante
[23,33]. Esta técnica pictórica se conoce desde hace más de dos mil años, y
________________________________________________________
28
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

se ha establecido su uso en la elaboración de retratos en el Egipto romano

[2,29]. Aunque se abandonó su empleo a principios de la Edad Media,
algunos pintores modernos han empezado a utilizarla en arte contemporáneo.
La encáustica es una técnica pictórica que consiste en la aplicación de
cera fundida y mezclada con pigmentos sobre la superficie que se va a
decorar. Aunque se conocen diversas fórmulas y técnicas de aplicación de
las ceras, no se conocen la totalidad de los componentes que se utilizaban en
las pinturas antiguas. De forma general, la mezcla fundida se debe depositar
con rapidez sobre la superficie que se desea cubrir. Para ello se usan dos
procedimientos distintos de aplicación [2]:
a) Método de la cera caliente. Consiste en el uso del calor,
probablemente proporcionado por la combustión de carbón vegetal, para
provocar la licuefacción de la cera y permitir su mezcla con los pigmentos.
La cera se mezcla a elevada temperatura junto a los diferentes colorantes,
empleando un cuchillo llamado “cautarium”, y la mezcla se deposita sobre la
superficie artística con un pincel llamado “pencillium”. Así pues, se realiza
una primera distribución del color de la obra pictórica. Para dibujar sobre
cera enfriada se utiliza un “cestrum”, una aguja puntiaguda, que se emplea
también para afinar la mezcla, la textura y la anchura de la capa pictórica.
Este método se usa principalmente para decorar superficies de madera,
aunque también se ha aplicado sobre lie nzos. Para pequeñas superficies, se
prefiere introducir el pincel en la cera fundida y posteriormente se mezcla en
una paleta con el pigmento. Éste es el procedimiento más habitual de
encáustica. En ocasiones se utilizan varios tipos de ceras, o se añaden
aditivos como resina de dammar, aceite de linaza o material proteico, con el
objetivo de alterar las propiedades de la capa pictórica [4].
b) Método de la cera fría (método púnico). La existencia de esta
técnica pictórica ha llegado a partir de recetas descritas en la antigüedad por
Plinio y Disocórides, durante el siglo I. La cera se hierve con agua de mar,
después se filtra varias veces a través de un paño. Luego se deja expuesta
varios días al sol para un mejor blanqueado. Posteriormente se saponifica la
cera mediante la adición de bicarbonato sódico. Seguidamente se vuelve a
filtrar a través de un paño, se enjuaga con agua tibia y se seca al aire. Para
mejorar las propiedades de la cera se mezcla con aceite, para reducir su
viscosidad, y/o con yema de huevo para aumentar la adhesividad y la dureza
de la capa pictórica. Esta mezcla se combina con el pigmento en un medio
adecuado, y se aplica sobre el soporte de la obra artística. El uso de esta
técnica pictórica ha sido atestiguado en la elaboración de diversos retratos en
Egipto romano.
Las ceras se utilizan asimismo como aditivos en barnices. Su función
consiste principalmente en incrementar la maleabilidad, plasticidad y
adhesividad [7]. Asimismo se encuentra como aditivo en óleos, aumentando
la hidrofobicidad y la resistencia al calor.
________________________________________________________
29
 III. ANTECEDENTES. CERAS NATURALES

1.3.3 Características químicas

Los aglutinantes principalmente empleados en las obras pictóricas

decoradas mediante la técnica de encáustica están constituidos por ceras
naturales de diversas procedencias, como la cera de abeja (proveniente de
animales), cera de carnauba (origen vegetal) y ceresina (mineral).
La cera de abeja es la más utilizada en el campo de la decoración de
obras pictóricas por medio de la técnica encáustica. Está compuesta por una
mezcla de hidrocarburos (14%), monoésteres (35%), diésteres (14%),
triésteres (3%), hidroximonoésteres (4%), hidroxipoliésteres (8 %), ésteres
ácidos (1%), poliésteres ácidos (2%), ácidos grasos libres (12%), alcoholes
libres (1%) y otros compuestos (6%). Los ácidos grasos más importantes son
el ácido palmítico, palmitoleico, hidroxipalmítico y oleico, ya sea en forma
de éster o de ácidos libres. La cera de abeja tiene una densidad entre 0,958 y
0,970 g.mL -1 a 15ºC y un punto de fusión de 63ºC, por lo que su licuefacción
para la mezcla con los pigmentos se puede realizar sin necesidad de
calefacción muy fuerte, ya que además entra en combustión a 120ºC [34].
La cera de carnauba está compuesta principalmente por ésteres de
ácidos grasos (80-85%), alcoholes pesados (10-15%), ácidos libres (3-6%) e
hidrocarburos (1-3 %). Dentro de los ésteres se encuentran dioles de cadena
larga (20%), ácidos grasos hidroxilados (6%) y ácido cinámico (10%). Es
una de las ceras con mayor punto de fusión, alrededor de 78-85ºC, y es
asimismo una de las que tienen mayor dureza. Su densidad es de 0,97 g.mL -1
y es soluble en xileno e insoluble en etanol y agua [24].
Debido a las condiciones de su formación, la mayoría de las ceras
minerales contienen materiales relativamente poco oxidados. Así pues, la
ceresina está compuesta por una mezcla de hidrocarburos. Es insoluble en
agua y su punto de fusión variará entre 61 y 78ºC [24].
De forma general, las propiedades que las hacen aplicables en el
campo de la decoración de obras pictóricas son su maleabilidad,
hidrofobicidad e insolubilidad en agua, que la protegen de la humedad
ambiental, su plasticidad, y su bajo punto de ebullición, que permite su
licuefacción para la mezcla con los pigmentos en condiciones no muy
agresivas [26].

1.3.4 Alteraciones producidas a lo largo del tiempo

Las ceras están constituidas por sustancias que experimentan

modificaciones a lo largo del tiempo. Por ello, generalmente se aprecian
diferencias entre la composición química de una determinada cera
encontrada en un objeto arqueológico o de una obra pictórica, con su
correspondiente patrón actual, lo que dificulta su identificación [35].

________________________________________________________
30
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

Dada la diferencia de composición entre las diversas clases de cera y

la gran cantidad de diversos compuestos que contienen, la influencia del
envejecimiento será diferente para cada caso. De forma general, se produce
la oxidación progresiva de los compuestos menos estables, la evaporación de
los que posean mayor volatilidad y el consumo de materiales nutrientes por
parte de microorganismos (especialmente ácidos grasos).
Así pues, se observa una sensible disminución de la cantidad de ácidos
hidroxicarboxílicos, ácidos grasos insaturados y esteroles [21,22] y la
formación de compuestos fenólicos a partir de flavonoides [26]. Por otra
parte, se aprecia una pérdida de los n-alcanos por sublimación,
especialmente de los de menor número de átomos de carbono, debido a su
mayor volatilidad, así como de los ácidos grasos libres de cadena corta
[26,35]. Asimismo se produce una alteración de la distribución de ésteres,
debido a la hidrólisis causada por la humedad junto a agentes
medioambientales ácidos, aumentando a su vez la cantidad de ácidos libres y
alcoholes [26,35]. En el estudio de algunas muestras arqueológicas
procedentes de ceras encontradas en vasijas romanas, se ha evidenciado la
ausencia de ácido palmítico, debido probablemente a la acción de
microorganismos [35].

1.4 Aceites secantes

1.4.1 Generalidades

Los lípidos son biomoléculas orgánicas ampliamente presentes en la

naturaleza. Poseen una gran importancia para los seres vivos, ya que están
involucrados en diversos mecanismos bioquímicos que controlan funciones
indispensables en los organismos biológicos. Se utilizan principalmente
como acumuladores de alimento y son la principal reserva energética de los
seres vivos, ya que la energía liberada por unidad de masa, a través de las
reacciones metabólicas de oxidación, es superior a la suministrada por
proteínas y glúcidos. Asimismo participan en el mantenimiento de la
estructura de células, órganos y tejido cutáneo, en forma de membranas
lipídicas, las cuales forman una capa que les proporcionan consistencia y
protección frente al exterior. En ocasiones también actúan como
biocatalizadores, facilitando y favoreciendo reacciones químicas en los
organismos. Así pues, los lípidos se encuentran principalmente en las
semillas y en el recubrimiento externo de diversos vegetales, y en los
órganos, el tejido adiposo y el cutáneo de los animales. El material lipídico
se puede extraer de vegetales, tales como linaza, oliva, girasol, coco,
adormidera, nuez, linaza, cáñamo, perila, etc, y de animales como atún,
castor, cerdo, buey, cordero, leche de vaca, etc.
________________________________________________________
31
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

Los lípidos están compuestos principa lmente por una mezcla de

compuestos, mayoritariamente triglicéridos, formados a partir de una
molécula de glicerol esterificada por tres moléculas de ácidos grasos, además
de otros compuestos como diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos libres
y en menor proporción esteroles y vitaminas liposolubles (A, D, E y F) [14].
Se trata de compuestos fuertemente hidrofóbicos, debido a la ausencia
significativa de grupos polares libres en su estructura.
Los ácidos grasos son los componentes característicos de los lípidos.
Consisten en un grupo carboxílico unido a una cadena lineal hidrocarbonada.
Los ácidos carboxílicos naturales contienen un número par de átomos de
carbono, ya que su biosíntesis se basa en la adición sucesiva de monómeros
de acetilo. Difieren unos de otros en la longitud de la cadena y en la posición
y número de sus enlaces dobles; algunos ácidos grasos poseen también
ramificaciones constituidas por grupos metilo. El grado de insaturación y la
longitud de la cadena hidrocarbonada de l ácido graso influyen en su punto
de fusión, solubilidad en agua y reactividad.
Los ácidos grasos más importantes que constituyen los triglicéridos se
indican en la Tabla 2.

Tabla 2. Ácidos grasos naturales más comunes.

Pto. fusión
ácido graso nº C:insat. Estructura
(ºC)
saturados
laúrico 12:0 44.2 CH3(CH2)10COOH
mirístico 14:0 53.9 CH3(CH2)12COOH
palmítico 16:0 63.1 CH3(CH2)14COOH
esteárico 18:0 69.6 CH3(CH2)16COOH
araquídico 20:0 76.5 CH3(CH2)18COOH
insaturados
palmitoleico 16:1 -0.5 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH
oleico 18:1 13.4 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
linoleico 18:2 -5 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
linolénico 18:3 -11 CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
á-elaeostérico 18:3 49 ctt-CH3(CH 2)3CH=CHCH=CHCH=CH(CH 2)7COOH
araquidónico 20:4 -49.5 CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3CH=CH(CH2)3COOH
erucico 22:1 - CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH

En general, la presencia de dobles enlaces disminuye la temperatura de

fusión de un ácido graso, sin embargo, un aumento de la longitud de la
cadena hidrocarbonada produce un incremento del mismo, debido a un
aumento de la energía de interacción por fuerzas de Van der Waals [7].

________________________________________________________
32
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

Los ácidos grasos insaturados poseen isomería cis-trans. Los naturales

son, en general, isómeros cis, pero en los procesos industriales a
temperaturas elevadas se isomerizan parcialmente a la forma trans. La
presencia de enlaces dobles cis altera la estructura tridimensional de los
ácidos grasos y les da forma angular. Por esta razón, los ácidos grasos
saturados y los ácidos grasos insaturados con isomería trans presentan
empaquetamientos más compactos en los cristales y sus puntos de fusión son
más elevados. Los enlaces dobles cis de los ácidos grasos insaturados hacen
que sus cadenas carbonadas adquieran conformaciones que no se adaptan
con facilidad en una estructura cristalina ordenada de un sólido.
Los ácidos grasos son fuertemente apolares, por lo que son insolubles
en agua. Aun así, la solubilidad en disolventes polares aumenta al disminuir
la longitud de la cadena. Asimismo, son medianamente ácidos, pero debid o a
su insolubilidad en agua su acidez no se manifiesta. Los dobles enlaces
carbono-carbono son grupos fuertemente reactivos, por lo que la estabilidad
de los ácidos grasos disminuirá fuertemente al aumentar la insaturación.
Para formar el triglicérido, los ácidos grasos y los gliceroles se unen a
través de enlaces covalentes relativamente fuertes de tipo éster. Se trata de
una reacción de condensación entre el grupo carboxílico del ácido graso y
uno de los alcoholes del glicerol. En el siguiente esquema se muestra la
estructura de los triglicéridos:

CH3 (CH2)n C O CH2 (α)

O
CH3 (CH2 )n C O CH (β)

O
CH3 (CH2)n C O CH2 (α )

Los átomos de carbono extremos de la glicerina se designan con la

letra α y el central con la letra β. La mayoría de los triglicéridos naturales
son mixtos; es decir, dos o tres de sus ácidos grasos son diferentes. Los
ácidos grasos insaturados se encuentran generalmente en la posición β.
Cuando los dos constituyentes en α son diferentes pueden existir isómeros
ópticos. En la naturaleza sólo se encuentran L-glicéridos.
Tanto las reacciones de formación como de ruptura del enlace éster
están catalizadas por los protones, por lo que en medio ácido se llega a una
mezcla intermedia. Así pues, la esterificación está favorecida por la
eliminación progresiva del agua formada. En medio básico se produce la
saponificación irreversible del triglicérido, obteniéndose la sal del ácido
________________________________________________________
33
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

graso y el glicerol libre. Las sales sódicas y potásicas de los ácidos grasos así
obtenidas son los jabones.
En los organismos vivos, los triglicéridos se sintetizan y se destruyen
mediante reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas específicas
(lipasas). La hidrólisis parcial de triglicéridos da lugar a compuestos más
hidrofílicos, como los diglicéridos y monoglicéridos. Estos compuestos son
tensioactivos no iónicos, con su parte polar en los OH libres y se usan como
emulgentes en las industrias alimentarias.

Los lípidos se denominan grasas cuando son sólidas a temperatura

ambiente, y aceites cuando son líquidos. Así pues, en una grasa la
proporción de ácidos saturados será superior a los aceites.
Dependiendo del tipo de ácido graso mayoritario, las grasas y aceites
se clasifican en:
- monoinsaturadas: contienen principalmente ácidos grasos con una
insaturación, como en el aceite de oliva y de frutos secos.
- poliinsaturadas: presencia mayoritaria de ácidos grasos con varios dobles
enlaces, como el aceite de semillas vegetal y grasas de pescado.
- saturadas: contienen mayoritariamente ácidos grasos sin insaturaciones,
como en el aceite de palma y en grasas animales

1.4.2 Aplicación en obras pictóricas

La categoría de lípidos más empleada en obras de arte son los aceites

secantes, los cuales contienen una elevada proporción de ácidos insaturados
de 18 átomos de carbono. Los ácidos grasos que se encuentran
principalmente en los triglicéridos de este tipo de aceites son: linolénico,
linoleico, oleico, esteárico, palmítico y mirístico.
Los aceites secantes han sido tradicionalmente empleados en obras de
arte pictóricas como cubrientes, consolidantes y aglutinantes. La función del
aceite secante consiste básicamente en dar soporte y cohesionar los
pigmentos, por lo que influye directamente en las propiedades artísticas de la
obra pictórica. Estas sustancias deben sus características a la presencia de
ácidos grasos de elevada insaturación. En efecto, debido a la capacidad
reactiva de los dobles enlaces, los aceites secantes son susceptibles de sufrir
reacciones de oxidación por polimerización (proceso de secado), que los
________________________________________________________
34
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

transforman en polímeros de consistencia sólida. Esta transformación es

importante en el ámbito de los materiales pictóricos ya que tras este proceso
se convierten en películas transparentes que presentan óptimas propiedades
mecánicas y ópticas, que los hacen muy adecuados como medio o vehículo
para los pigmentos.
El uso de aceites secantes en obras pictóricas da lugar a una técnica
artística propia denominada pintura al óleo. A pesar de que la mayor parte de
las citas históricas emplazan la técnica al óleo durante la primera mitad del
siglo XV, siendo sus mayores exponentes los hermanos Van Eyck, cabe
resaltar que existen evidencias de que ya era empleada en el siglo XII en el
sur de Europa [3]. De hecho, los maestros flamencos se limitaron a
emplearla sistemáticamente, contribuyendo así a su difusión y consolidación,
proceso que se realiza durante los siglos XVI y XVII. Gozó de gran
aceptación en Europa a partir de finales de la Edad Media, debido a su
mayor simplicidad de manejo, y por las posibilidades más amplias que
ofrecía. Ha sido la más importante técnica pictórica desde el siglo XV hasta
nuestros días.
La pintura al óleo se define como el arte de aplicar pigmentos
disueltos en aceites secantes sobre la superficie de un soporte adecuado para
crear una obra artística. La preparación se realiza mezclando pig mentos
pulverizados, que deben ser insolubles, resistentes a la decoloración y poco
reactivos, con algún aceite secante. Además se añaden tanto resinas
terpénicas, para facilitar el secado de los aceites evitando contracciones de la
película sólida formada y dar claridad a los colores, como esencias, que
ayudan en su solubilización y permiten retardar el envejecimiento.
La preparación de pinturas al óleo sobre tela más extendida en el siglo
XX, consiste en el uso de un soporte para la superficie pictórica, que puede
ser una tabla o panel compuesto, o también, más frecuentemente, una tela de
lino, algodón o yute tensada en un bastidor o encolada a una tabla. A
continuación se debe preparar este soporte para ser recubierto por la pintura,
llamado imprimación. Del éxito de esta fase depende no sólo la luminosidad
final de la obra, sino también su duración. Posteriormente se extiende una
primera capa de cola, a la que se añade amoníaco y glicerina. Después se
aplica sobre la capa anterior una mezcla de cola, óxido de zinc y carbonato
de calcio, en forma de una capa muy fina. Dicha preparación disminuye la
capacidad de absorción del soporte, y proporciona una superficie pictórica
que no es muy áspera ni muy suave. Aunque dicha superficie presenta color
blanco, en ocasiones se aplica una capa de color gris, castaño o rojizo. No
obstante a lo largo de la historia y en la actualidad se han utilizado también
otros pigmentos y aglutinantes diversos.
La aplicación de la pintura al óleo sobre la superficie se lleva a cabo
por etapas. En primer lugar, se bosqueja el dibujo sobre la preparación a
lápiz o a carboncillo. Después se rellenan las zonas que van a ser coloreadas
________________________________________________________
35
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

con una pintura fluida, y a continuación se van refinando y corrigiendo

sucesivamente con la pintura al óleo, más espesa. Este proceso puede durar
desde pocos días hasta varios meses. La pintura al óleo se seca relativamente
despacio con poca alteración de color, lo que permite igualar, mezclar, o
degradar los tonos y hacer correcciones con facilidad. Por último, una vez
seca la pintura, se recubre de una capa de barniz, para evitar su deterioro.
La técnica de pintura al óleo permite al autor de la obra pictórica no
estar limitado a pinceladas lineales, sino que puede aplicar veladuras,
aguadas, manchas, vaporizaciones o empastes (pigmentos muy espesos). El
óleo permite la obtención de efectos de gran riqueza con el color, tales como
los contrastes tonales y el claroscuro

1.4.3 Características químicas

Los aglutinantes lipídicos más habituales en las obras pictóricas

decoradas mediante la técnica de pintura al óleo están constituidos por
aceites secantes extraídos de las semillas de diversas especies vegetales,
como la linaza, nuez, adormidera y girasol.
El aceite de linaza es el aglutinante lipídico más utilizado en obras de
arte pictóricas y se extrae por prensado de las semillas de la planta del lino
(Linum usitissimum). Otros aceites secantes son el de adormidera (amapola),
obtenido por prensado de la s semillas de adormidera blanca; el aceite de
nuez, que se consigue por el prensado de nueces maduras; y el aceite de
girasol, elaborado a través del prensado de semillas de girasol.
Resulta muy difícil conocer todos los glicéridos que forman parte de
un aceite y sus proporciones debido a que la separación de una mezcla tan
compleja de sustancias muy semejantes es una operación analítica larga y
complicada. Por eso, su composición se suele expresar dando las
proporciones de los ácidos grasos globalmente, sin distinguir en qué
glicéridos están distribuidos. En la Tabla 3 se muestra la composición en
ácidos grasos de los aceites secantes. Todos los aceites contienen asimismo
alrededor de 1% de sustancias no saponificables, como glicerol, triterpenos,
metilesteroles, esteroles, β-sitosterol y colesterol.
Tabla 3. Proporción de ácidos grasos y características de los aceites secante más
habitualmente utilizados como aglutinantes lipídicos [7].
Aceite d
C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 T eb(ºC)
secante (g/mL)
linaza trazas 6-7 3-6 14-24 14-19 40-60 0,93 387
nuez ------- 3-7 0,5-3 9-30 57-76 2-16 0,93 386
adormidera ------- 10 2 11 72 5 0,92
girasol trazas 5-6 4-6 17-51 38-74 trazas 0,91

________________________________________________________
36
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

Dado que son los ácidos grasos insaturados los que confieren al aceite
sus propiedades secantes, éstas dependerán de la proporción en el aceite
secante de ácidos grasos con dobles enlaces y de su grado de insaturación.
El aceite de linaza es el que presenta mayores propiedades secantes, ya
que contiene gran proporción de ácidos insaturados, especialmente de ácido
linolénico. El aceite de nuez también muestra propiedades secantes, debido a
que contiene mayoritariamente ácido linoleico, así como cantidades menores
de ácidos linoleico y oleico. Los aceites de girasol y adormidera se
denominan aceites semisecantes por su menor contenido en ácidos grasos de
gran insaturación, por lo que experimentan con mayor lentitud el proceso de
secado.

1.4.4 Mecanismos de envejecimiento

El envejecimento de los aceites secantes se inicia durante la etapa de

secado de la capa pictórica. Se producen una serie de reacciones de
oxidación que afectan principalmente a los ácidos grasos del aceite secante a
través de los dobles enlaces, y conducen como efecto global la formación de
enlaces entrecruzados entre las moléculas de ácidos grasos para dar lugar a
un material de elevado peso molecular [7,14]. En efecto, debido su
reactividad, las sustancias con dobles enlaces tienen tendencia a oxidarse
mediante reacciones radicalarias con las moléculas de oxígeno atmosférico.
Este proceso tiene lugar en contacto con el aire y es catalizada por la luz UV,
la exposición a elevadas temperaturas, la humedad, la presencia de enzimas
como lipoxigenasas y peroxidasas que se encuentran en los extractos
vegetales, los microorganismos, y algunos iones metálicos (Fe 2+, Co2+ , Cu2+ ,
etc) [7]. Una característica importante de este proceso es su acción
autocatalítica por lo que una vez iniciado, la veloc idad de reacción aumenta
progresivamente.
Dado que el proceso de oxidación incluye numerosas reacciones
radicalarias, y está influido por multitud de factores, los mecanismos de
oxidación son en su mayor parte desconocidos. Por ello, sólo es posible
establecer hipótesis acerca de las reacciones químicas que se suceden y de
los procesos que tienen lugar durante el envejecimiento de los aceites.
El proceso de reacciones radicalarias se puede clasificar en tres etapas:
iniciación, propagación y terminación, como se muestra en el siguiente
esquema:

Iniciación: In* + RH à R*+InH (1)

Propagación: R∗ + : O2 à RO2 ∗ (2)
RO2 ∗ + RH à ROOH + R∗ (3)
Terminación: RO2 ∗ + RO2 ∗ à ROOOOR (4)
RO2 ∗ + R∗ à ROOR (5)
R∗ + R∗ à RR (6)
________________________________________________________
37
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

La eta pa de iniciación es decisiva en el proceso, ya que la ruptura de

un enlace C-H presenta una elevada energía de activación, aun en el caso en
el que esté conjugado a una insaturación. La formación de radicales puede
tener lugar mediante ruptura homolítica fotoquímica o térmica del enlace
RH, mediante abstracción de un H por un radical libre iniciador (In), que
suele ser una molécula cuya transformación en radical requiere baja energía,
así como por reacción redox con un catión metálico reducible.

Esta etapa está más favorecida en los ácidos grasos poliinsaturados, ya

que el radical formado está estabilizado por la conjugación de los dobles
enlaces. La etapa de propagación siguiente implica la adición de un
birradical de oxígeno sobre el radic al formado en la anterior etapa para dar
como producto primario un radical peróxido (7). Este producto formado
sustrae dos hidrógenos a dos moléculas de ácidos grasos nuevas, formando
el hidroperóxido (8) y dos nuevos radicales (2R’), que pasarán a actuar
entonces como propagadores de la reacción en cadena [36,37]. Debido a que
casi todos los triglicéridos presentes en los aceites secantes contienen más de
un ácido graso insaturado, el oxígeno puede incorporarse en más de una
posición.

(7)

(8)

Por otro lado, el hidroperóxido (8) se descompone debido a su

inestabilidad, produciendo aldehidos (a,b) y cetonas (c). En el siguiente
esquema se muestran las tres posibles vías de fragmentación de los
hidroperóxidos:

________________________________________________________
38
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

*O
OOH

R´ + OH* (9)
R´ R H
R H

La estructura de los aldehidos producidos depende de la localización

del grupo hidroperóxido, que normalmente se forma en el doble enlace o en
posiciones α a él. Estos aldehidos posteriormente se oxidan para dar lugar a
ácidos carboxílicos. La descomposición de los radicales hidroperóxidos se
puede producir también por vía homolítica, o mediante reacciones redox con
los cationes metálicos, generando radicales peróxidos, alquilos y alcóxidos
[38].
M n+ + ROOH à M (n+1)+ + RO· + OH-

M (n+1)+ + ROOH à M n+ + ROO· + H+

Los procesos de mayor importancia para la formación de la capa

filmógena consisten en el ataque de un radical con cadena carbonada sobre
el doble enlace de un ácido graso cercano. La reacción radicalaria fuerza la
apertura de la insaturación y genera un nuevo radical, que propagará la
reacción sobre los dobles enlaces de otros ácidos grasos, extendiendo la red
polimérica. Independientemente de la naturaleza del atacante, el producto
será un radical alquilo. Cuando la reacción está producida por peróxidos se
obtiene un dímero unido por dos átomos de oxígeno.

________________________________________________________
39
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

Los alcóxidos también atacarán las insaturaciones de ácidos grasos

cercanos, formando un dímero enlazado por un enlace éter,

Los radicales alquilo generados reaccionan según el mismo

mecanismo, produciendo dímeros más estables unidos por enlaces carbono-
carbono. Esta reacción es mayoritaria, debido a la importante cantidad de
radicales alquilo generados, y la que más participa en la estabilidad de la red
polimérica.

La fase de terminación conlleva la recombinación de dos radicales. La

reacción más frecuente en condiciones normales es la de dos radicales
peróxido ROO∗ para dar un intermediario tetróxido, ROOOOR que debido a
su inestabilidad se descompone en una cetona, un alcohol secundario y
oxígeno molecular. Por otro lado, también pueden reaccionar dos radicales
alquilos, lo que da lugar a la formación de un dímero estable.

Junto a los procesos de oxidación de los aceites secantes, se produce la

hidrólisis de los enlaces éster de los triglicéridos, lo que aumenta la acidez
de la capa pictórica [39]. En algunos casos, los grupos carboxílicos pueden
complejar los cationes metálicos, formando las correspondientes sales [40].
Otra serie de reacciones conducen a la formación de ácidos
carboxílicos de bajo peso molecular, resultado de la degradación de ácidos
grasos de cadena larga. La ruptura se produce en las insaturaciones, debido a
________________________________________________________
40
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

que son los puntos más reactivos de la cadena carbonada. Los productos
formados son generalmente di- y mono- ácidos de 8, 9 o 10 átomos de
carbono. El producto de degradación más habitual es el ácido azelaico
(diácido de 9 átomos de carbono), ya que se encuentran gran cantidad de
ácidos grasos insaturados con dobles enlaces en la posición 9 [41].
Uno de los procesos de degradación que conduce a la formación de
este tipo de compuestos es la escisión de los alcóxidos en â. Se produce la
ruptura homolítica del enlace carbono-carbono que se encuentra junto al
oxígeno, lo que conlleva a la formación de un radical alquídico y un
aldehido. Éste último se oxidará y se convertirá en ácido carboxílico,
mientras que el radical puede incorporarse a la serie de reacciones que
causan el crecimiento de la red polimérica, o puede interaccionar a su vez
con oxígeno, dando lugar a un aldehido, que se oxidará en ácido carboxílico
[12].

Las características del proceso de secado están influenciadas por los

parámetros medioambientales. La presencia de una cantidad moderada de
agua puede frenar las reacciones de degradación de los aceites secantes a
través de la interacción con los hidroperóxidos, interfiriendo en su
descomposición. Asimismo el agua puede complejar los cationes metálicos
de los pigmentos, lo que ralentiza la formación de radicales libres, y actuar
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41
 III. ANTECEDENTES. ACEITES SECANTES

como disolvente y difusor de sustancias antioxidantes hacia las capas que

contienen lípidos. La influencia de la temperatura y de la radiación consiste
en el aporte de la energía suficiente para alcanzar los estados de transición de
las reacciones de oxidación, por lo que acelerarán el proceso de secado
[42,43].
Los microorganismos depositados sobre la superficie de la capa
pictórica pueden causar su deterioro, especialmente por su capacidad de
utilizar los ácidos grasos como aporte de energía, reduciendo la masa
molecular de los polímeros. Además, se produce el vertido de desechos del
metabolismo, que pueden interaccionar con los compuestos de la capa
filmógena. La humedad y la temperatura favorecen en gran medida el
desarrollo de bacterias y hongos, mientras que la luz ayuda al crecimiento de
microorganismos vegetales fotosintéticos [44].
Debido a los cambios químicos que experimenta el aglutinante
lipídico, se producen variaciones en sus características químicas y físicas. El
aceite secante es inicialmente un líquido, y a medida que avanza el secado
aumenta progresivamente la viscosidad al crecer la masa molecular de los
oligómeros, hasta obtener un material sólido y de gran consistencia. Por otra
parte, la capa filmógena formada está constituida por materiales insolubles
en agua y posee elevada hidrofobicidad, por lo que una vez formada
constituirá una eficaz protección contra los efectos de la humedad en los
pigmentos y capas inferiores [7].
La tendencia al amarillamiento, observada en los aceites secantes, se
produce esencialmente en la oscuridad, y se invierte al ser expuesto a la luz
[45]. Este proceso también ocurre después del envejecimiento acelerado por
irradiación UV, seguida de tratamiento a elevada temperatura, tras los cuales
se produce un amarillamiento que revierte tras la exposición de la muestras
a la luz visible [46]. Los cromóforos causantes del amarillamiento no están
aún identificados, aunque algunos autores proponen que los responsables son
sustancias polares que presentan una fuerte absortividad hacia los 400-430
nm [47], y poseen dobles enlaces aislados [48]. Otras investigaciones
apuntan a la intervención de compuestos, producto de la descomposición de
los hidroperóxidos, como dicetónicos, sales metálicas de sus formas enólicas
[49], moléculas de tipo quinona formadas por condensación de dicetonas
[50], sustancias con dobles enlaces conjugados [51], o bien obtenidos a partir
de reacciones cooxidativas con agentes contaminantes [52]. La luz visible
interaccionaría con estos compuestos, lo que causaría su descomposición
[43,53,54]. Dada su mayor cantidad de ácidos grasos insaturados, el aceite
de linaza tenderá a envejecer y a amarillear más rápidamente que los aceites
de nuez, adormidera y girasol.

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42
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

1.5 Barnices de instrumentos musicales. Resinas terpénicas

Las resinas terpénicas han sido ampliamente utilizadas como

ingredientes principales en la elaboración de barnices aplicados en forma de
capa filmógena sobre multitud de objetos. Su función consiste en aislar el
objeto del exterior y evitar la degradación de las capas interiores a partir del
ataque de agentes medioambientales, por lo que resulta esencial en piezas
constituidas por materiales químicamente más reactivos. Asimismo se
utilizan para modificar las propiedades estéticas mediante la adición de
sustancias colorantes. En el campo del arte se utilizan principalmente en
obras pictóricas como protector y ensalzador del brillo. Dado el amplio uso
de las resinas terpénicas, en esta sección el trabajo se centrará en el estudio
de los barnices utilizados en instrumentos musicales de cuerda.
Los instrumentos musicales han sido utilizados por el hombre desde el
principio de la historia. Se trata de herramientas que permiten a los músicos
expresar sus sentimientos, anhelos y estados de ánimo, transformándolos en
ondas sonoras que estimulan el sentido del oído del receptor. Algunas de las
creaciones musicales se consideran incluso como obras de arte y han
perdurado a lo largo de los siglos.
Existen multitud de familias de instrumentos musicales, entre las
cuales es de destacar la ele va importancia y el amplio uso de los
instrumentos de cuerda. Dentro de esta denominación se encuentran los
laúdes y violines, los cuales no sólo se utilizan para la creación de obras de
arte, sino que ellos mismos también se pueden considerar como tales. Esta
apreciación es especialmente acertada al referirse a los violines elaborados
por los luthiers cremoneses del Renacimiento (siglos XVI-XVII), entre los
que destaca el maestro Antonio Stradivarius, cuyas creaciones nunca han
sido superadas en términos de calidad sonora. Así pues, el estudio de los
diseños de su elaboración y de los materiales que los componen resulta
importante para comprender su funcionamiento y su evolución histórica, así
como para proponer tratamientos de restauración que permitan su exposición
y/o su empleo como instrumento musical.

1.5.1 Descripción general de las piezas de los violines

Los violines están compuestos por cuatro piezas fundamentales, las

cuerdas, la caja de resonancia, el mango o mástil y el arco (Figura 2). Su
longitud es variable y depende de la altura del artista. Un violín de talla
máxima se denomina “entero” y mide alrededor de 60 cm.
Las cuerdas son el elemento que produce el sonido a partir de su
vibración. En un principio se fabricaban a partir del intestino grueso de
oveja, y en algunos casos se recubrían con plata o cobre. Debido a su relativa
fragilidad, en la actualidad se elaboran de acero o de un material sintético
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43
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

rodeado con aluminio. En cualquier caso, la característica principal de las

cuerdas de violín son su elasticidad, su flexibilidad y su color transparente.
La caja de resonancia tiene como función principal la amplificación de
los sonidos producidos por la vibración de las cuerdas. Presenta
generalmente un perfil de forma ovalada, con dos estrechuras cerca del
centro. La cara superior se denomina tabla superior o tapa (tradicionalmente
fabricada de madera de Picea abies), es de perfil abombado y tiene dos
orificios aproximadamente en la zona central, llamados oídos o “eses”, por
donde se libera el sonido. Entre los oídos se encuentra el puente o ponticello
(usualmente de madera de arce), el cual sostiene las cuerdas por encima de la
tabla superior, manteniéndolas en planos diferentes, y permite la transmisión
de las vibraciones hacia la caja de resonancia. En la parte inferior de la tapa
se sitúa el cordal, una pieza triangular de madera de ébano, cuyo papel es de
mantener fijas las cuerdas. La cara posterior se denomina tabla de fondo o
armónica (tradicionalmente de madera de arce o de Picea abies), cuya forma
es ligeramente menos abombada que la tapa. Estos dos elementos están
unidos por las cubiertas laterales o aros. En el interior de la caja de
resonancia se encuentran el alma y la barra armónica, dos cilindros de
madera cuya función es la transmisión de los sonidos y soportar las tensiones
estructurales provocadas por la vibración de las cuerdas.
Otra parte fundamental del violín es el mango, una pieza de madera de
arce, cuya función principal consiste en sostener las cuerda s. En su extremo
se encuentra la voluta (tradicionalmente de madera de arce), a cuyos lados
está el clavijero, donde se controla la tensión de las cuerdas a través del giro
de las clavijas, (habitualmente de madera de palisandro) a las que están
atadas. Una pieza de madera de ébano, denominada diapasón o tastiera,
cubre la parte superior del mástil y sirve de guía para las cuerdas.
Por último, el arco no forma parte del violín, pero resulta
imprescindible para su uso como instrumento musical, ya que se utiliza para
provocar la vibración de las cuerdas por frotación. El arco está constituido
por una vara de madera estrecha, de curva suave, normalmente de madera de
Pernambuco. Incorpora tradicionalmente una cinta de hecha con crines de
caballo, aunque en la actualidad también se utilizan de fibra vinílica, sujeta a
los extremos superior e inferior (talón) de la vara. Este último tiene un
sistema de tornillo que, al hacer desplazarse la pieza que va unida a un
extremo de las crines, las tiende o las distiende, lo que permite fijar la tensión
de la cinta. El control de la frotación entre este elemento y las cuerdas,
permite al artista controlar su vibración, y por ende, dirigir el sonido
finalmente producido por el violín. Para que las cuerdas vibren
adecuadamente, la cinta debe estar impregnada de forma periódica con resina
de colofonia.

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44
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

Figura 2. Partes fundamentales de un violín (a) y de un arco (b).

La mayor parte de la superficie externa del violín está recubierta por

una capa filmógena de barniz, el cual cumple importantes funciones. Así
pues, se utiliza para aglutinar y dar soporte a los pigmentos, de lo que
dependerá la apariencia estética del violín, así como para protegerlo de
agresiones por parte de agentes externos. Al contrario de lo que sucede en
obras pictóricas, en los instrumentos de cuerda la capa externa forma parte de
la propia obra de arte y no se suele retirar ni sustituir para no modificar su
valor artístico. Los barnices se preparan de forma general mezclando
materiales filmógenos (como resinas naturales, gomas y lacas), con los
colorantes en un disolvente adecuado (tradicionalmente etanol, esencias o
aceite secantes) [5].

1.5.2 Evolución histórica y materiales usados en la elaboración de

violines

Los violines actuales son el resultado de la evolución de otros

instrumentos musicales más antiguos. El ancestro más antiguo de los
instrumentos de cuerda es el “ravanastron”, un instrumento de cuerdas muy
simple originario de Ceilán, que fue inventado hacia el tercer mileno a.C.
________________________________________________________
45
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

Los instrumentos actuales descienden del rebab, desarrollado en Asia central

(actual Afganistán) hacia el siglo VIII e introducido en Europa durante el
siglo XIII a través de España por los árabes.
Los primeros violines renacentistas aparecen a lo largo del siglo XVI
en Baviera y en el norte de Italia, aunque fueron los maestros de Cremona
los que lograron fabricar instrumentos de mejor calidad. Se acepta que el
creador del violín en su forma actual fue Andrea Amati (1520-1578),
continuando su obra su nieto Nicolo Amati (1596-1684). En él se inspiró
posteriormente el luthier Antonio Stradivarius (1644-1737), considerado el
fabricante de violines más hábil que haya existido. Sus instrumentos
producían sonidos limpios, bien balanceados, firmes y dinámicos y poseían
elevada rapidez de respuesta, pureza y colorido tonal, así como poder de
penetración [55].
La calidad de los instrumentos fabricados en aquella época no ha
podido ser reproducida en la actualidad, a pesar de la tecnología de la que se
dispone. De hecho, los luthiers modernos intentan fabricar sus violines
imitando los instrumentos de los maestros renacentistas. Este trabajo está
dificultado por la falta de información acerca de las técnicas de fabricación,
debido a que no se escribieron recetas acerca de la manufactura de violines,
y por la tradicional forma de transmisión del conocimiento, que se establecía
únicamente de maestro a aprendiz. Una de las teorías que explica la
extraordinaria calidad sonora de los violines renacentistas sugiere que son
debidas a la madera y al barniz usados en su fabricación. No obstante, su
estudio está dificultado por la cantidad de productos presentes y sus posibles
modificaciones posteriores. También influye el carácter artístico del violín,
que provoca gran renuencia en el propietario a su cesión para efectuar los
análisis, y en todo caso, a la pequeña cantidad de muestra disponible sin
reducir su valor artístico [55].
Algunos expertos plantean diversas hipótesis, según las cuales la
madera elegida para la fabricación del violín provendría de especies
vegetales ya extinguidas, o de árboles cuyas condiciones ambientales de
crecimiento eran radicalmente diferentes a las actuales [55]. Asimismo se
han encontrado evidencias, mediante análisis por FTIR y RMN, de
tratamiento alcalino de las maderas de los violines, mediante ahumado o en
contacto con agua a pH básico hirviendo, lo que destruye parte de la
hemicelulosa y la lignina de la madera, aumentando su blandura [56]. Otra
alteración probable es la producida por hongos y bacterias, en este caso
provenientes de los ríos y lagunas por los que circulaba la madera antes de
llegar al taller del luthier. Los microorganismos presentes degradaban
ligeramente la madera, aumentando su ductilidad y maleabilidad. Así pues,
la aparición de poros permite la circulación del aire, reduciendo la presión
interna, disminuyendo la sensibilidad a los cambios climáticos y facilitando
la absorción del barniz. Estudios anteriores de las maderas utilizadas en
________________________________________________________
46
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

talleres de Cremona mediante Microscopía Electrónica revelaron la

presencia de filamentos de hongos y restos de bacterias [57].
Los instrumentos pueden estar total o parcialmente barnizados, en
algunos casos con varias capas [5], cuya influencia en la sonoridad aún no ha
sido establecida. No obstante, se piensa que las propiedades vibratorias de la
capa filmógena formada pueden influir en la calidad sonora del instrumento.
Por ejemplo, un barniz demasiado plástico atemperaría el sonido, mientras
que uno muy elástico podría incrementar las vibraciones de baja frecuencia.
Aunque no se tiene información acerca de la composición de los barnices de
violines, se sugiere que eran similares a los empleados en el mobiliario de la
época, de los que se dispone de muestras y también de recetas para su
elaboración.
En algunos casos se han descrito barnices de violines que contienen
copal, sándalo, alcanfor, ámbar, colorantes como sangre de dragón y áloe
pardo, así como los aditivos minerales procedentes del polvo de vidrio,
sulfato cálcico, carbonato cálcico cristalino, porcelana pulverizada y cenizas
volcánicas [58]. Estas partículas intervendrán en la coloración final del
barniz, y, al agregarse, influirán en la dureza de la madera y por tanto de las
propiedades vibratorias, protegiéndola también del ataque de los insectos.
Diversos estudios realizados sobre violines elaborados por Stradivarius
indican la presencia de barnices al óleo, con ámbar y abundante cantidad de
materia mineral. El análisis por Espectroscopia de Rayos X mediante
dispersión de energía ha revelado la presencia de cuarzo, calcita, feldespato
potásico, yeso y rubí, siendo significativo el bajo tamaño de partícula
(inferior a 0,2 ìm) [58]. Otros estudios realizados utilizando SEM/EDX, así
como por Fluorescencia de Rayos X por reflexión total (TXRF) y dispersión
de energías, han demostrado la existencia de minerales de sulfato de plomo,
sulfato de mercurio y minerales de hierro y arsénico en violines renacentistas
[59,60,61,62]. Por otro lado, el barniz de violines contiene probablemente
una mezcla de resinas y aceite de sándalo, aunque se dispone de poca
información al respecto, ya que la fracción orgánica de los barnices de
violines ha sido relativamente poco estudiada [55].
En conclusión, los barnices elaborados con el objetivo de recubrir
violines de la época renacentista están compuestos por una mezcla de
sustancias de origen natural. Aunque no se conocen recetas de fabricación
de barnices de violines, sí han llegado a nuestra época manuscritos acerca de
la elaboración de barnices para otros objetos de madera [64,65]. Según estos
datos bibliográficos, la fracción inorgánica consta de partículas de minerales
mientras que la fracción orgánica está compuesta principalmente por resinas
terpénicas, ceras, aceites secantes, gomas, oleogomorresinas, plastificantes y
colorantes.

________________________________________________________
47
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

1.5.3 Generalidades acerca de la influencia de los barnices en

instrumentos musicales

Se considera que los barnices influyen en tres aspectos del instrumento

musical: su protección, su aspecto estético y la sonoridad [5].
La naturaleza del instrumento musical de un violín implica,
contrariamente a las obras de arte pictóricas, ser continuamente manipulado,
al ser frecuentemente desplazado, utilizado, sostenido y tocado por un
músico. Asimismo se expone a la luz y al polvo, así como a variaciones
microclimáticas constantes. En particular, los instrumentos de madera son
muy sensibles al contacto con la piel, al sudor y al aliento del propio músico.
La capa protectora debe presentar una barrera contra los choques mecánicos,
para evitar la aparición de raspaduras y abolladuras. Así pues, el barniz debe
poseer cierto grado de flexibilidad y no ser quebradizo.
Por otra parte, el barniz permite realzar la textura de la madera, su
estructura y sus motivos decorativos. La capa filmógena puede también tener
una pigmentación propia que influya en su apariencia. La gran variedad de
pigmentos a disposición del luthier permiten obtener numerosos matices de
coloración. También es posible la aplicación de diversas capas de barnices
con diferentes coloraciones, cuya superposición permite obtener efectos
ópticos como el dicroísmo, presente en gran cantidad de violines [5].
La influencia del barniz en la sonoridad del instrumento no ha sido
establecida. No obstante, algunos luthiers afirman que el barnizado modifica
el timbre del violín y que las propiedades sonoras del instrumento
evolucionan durante varios años después de su fabricación, coincidiendo con
el proceso de secado del propio barniz. La influencia de una capa cubriente
sobre las propiedades mecánicas de una placa de madera será diferente si se
deposita de forma longitudinal o radial, debido a que se trata de un medio
anisótropo. También influyen los tratamientos de la superficie de la madera
y el estado de los poros, de lo que derivará el grado de penetración del
barniz. Por otro lado, algunos estudios han demostrado que la madera
modifica sus propiedades mecánicas (densidad, masa, flexibilidad, rigidez y
amortiguación) al ser recubierta de barniz, alterando su vibración, y
probablemente afectando a la calidad de los sonidos emitidos [63]. Por
último, la propia protección que aporta el barniz al instrumento permite la
preservación del sonido al dificultar la evolución de los materiales del
instrumento.

1.5.4 Características de las resinas terpénicas

Las resinas están constituidas por mezclas de hidrocarburos terpénicos

y sus derivados oxidados (terpenoides). Se trata de sustancias naturales
formadas por la unión de moléculas de isopreno (C5 ). Se denominan
________________________________________________________
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 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

monoterpenos a los dímeros (C10 ), sesquiterpenos a los trímeros (C15 ),

diterpenos a los tetrámeros (C20 ) y triterpenos a los hexámeros (C30 ).
Habitualmente, los diterpenoides y triterpenoides son materiales sólidos y no
aparecen en las mismas resinas, aunque sí pueden ir acompañados de
monoterpenos o sesquiterpenos. Una resina di- o triterpénica con gran
cantidad de mono- y sesquiterpenoides puede estar en estado líquido, y se
denomina oleorresina [7].

- Resinas diterpénicas

a) Colofonia. Es un residuo no-volátil de la destilación de la resina de

diversas especies de pino (Pinus) [7]. Su composición química depende del
género de especia pinácea, pero se trata generalmente de una mezcla de
ácidos diterpénicos, sobre todo abietanos y pimaranos (abiético,
levopimárico, neoabiético, pimárico, palú strico y deshidroabiético (DHA))
[7,73-78]. Es soluble en hidrocarburos y alcohol, y funde hacia 130ºC. Al
envejecer sus compuestos tenderán a dar derivados oxigenados (alcoholes y
cetonas) del ácido deshidroabiético, como el ácido 7-oxo-deshidroabiético
(7-oxo-DHA) y el 15-hidroxi-7-oxo-deshidroabiético (15-OH-7-oxo-DHA)
[7,75,79]. Es un material ampliamente utilizado en la elaboración de
barnices de violines modernos.
b) Trementina de Venecia. Es un líquido viscoso extraído de l árbol
Larix Gmelinii. Desde el punto de vista químico es una mezcla de
labdanoides neutros y de ácidos diterpénicos y no posee moléculas
polimerizables. Su caracterización se basa en la detección de larixol y el
acetato de larixilo, ya que únicamente se encuentran en esta resina. Se usa
muy frecuentemente en la elaboración de barnices. generalmente con ceras,
aditivo empleado aumentar su plasticidad y adhesividad. Debido la elevada
proporción de sustancias neutras que contiene, su acidez resulta muy baja
[7,73,74,76,78].
c) Bálsamo de Canadá. Resina obtenida a partir del árbol Abies
baslamea, originario de América del Norte. Este material contiene
principalmente ácidos diterpénicos de tipo abietano y pimarano (abiético,
DHA, isopimárico, palústrico, pimárico, sandaracopimárico, neoabiético,
abietatetraenoico y los oxidados 7-oxo-DHA y 15-OH-7-oxo-DHA) y una
elevada proporción de cis-abienol. Este labdanoide experimenta una rápida
reacción de polimerización, siendo este proceso responsable de las
propiedades como agente fijante de la resina [7, 74,76,80].
d) Trementina de Estrasburgo. La composición química y las
características de esta resina son muy similares a las del Bálsamo de Canadá,
aunque en este caso se extrae de la especie europea Abies alba [7,74].
e) Sandaraca. Se trata de una resina diterpénica obtenida a partir de l
árbol Tetraclinis articulata [7]. Está constituida principalmente por ácido
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49
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

comúnico, el cual polimeriza rápidamente a ácido policomúnico

[7,73,81-83]. También contiene ácido sandaracopimárico, 12-
acetoxisandaracopimárico, fenoles (totarol) y labdanoides. Es soluble en
alcohol, éter y acetato de amilo, y moderadamente soluble en cloroformo,
esencia de trementina y benceno, y pasa a estado líquido a 145ºC. En los
barnices se encuentra habitualmente mezclado con aceite [7].
f) Copal (“melengk, loba, pontianak, boea”). Resina diterpénica
obtenida a partir del Agathis, de la cual se conocen numerosas clases. El
Copal más importante es el Kauri, que se obtiene a partir del Agathis
Australis, una variedad originaria de Nueva Zelanda. Se ha usado como
ingrediente para la fabricación de barnices de alta calidad. Químicamente se
trata de un polímero constituido principalmente por comunol y ácido
comúnico. La resina de Copal de Manila se extrae del árbol Agathis
dammara [7]. Esta resina es rica en ácido comúnico y en ácido agático, y
contiene cantidades menores de ácido sandaracopimárico, ácido agatólico y
ácido torulísico [7,73,82]. El barniz obtenido con estas resinas se caracteriza
por su dureza, que indica el grado de polimerización del ácido comúnico
[7,84]. Estas resinas se utilizan normalmente mezcladas con aceites.
g) Copaiba. Resina líquida obtenida a partir de árboles de la familia
Leguminosae, originaria de América del Sur. Desde el punto de vista
químico, está compuesta por diterpenos labdanoides y abietanos disueltos en
sesquiterpenos. Su color depende de la proporción relativa de estas
sustancias, desde amarillo claro hasta marrón oscuro. Se utiliza en barnices
para retrasar es secado de la capa pictórica y en tratamientos de limpieza y
restauración [7,80].

- Resinas triterpénicas

h) Elemi. Con este nombre se denominan varias resinas triterpénicas

obtenidas a partir de diversas familias de árboles pertenecientes a la especie
Burseraceae. El elemi de Manila se obtiene a partir de Canarium lurzonicum
o Canarium commune originaria de Filipinas, mientras que la variedad
conocida como “copal mejicano” se extrae de la resina de Amyris elemifera,
Bursera cuneata, Elaphirium jacquinianum (Bursera tomentosa) y
Elaphirium elemifer, procedentes de Méjico y California. La variedad de las
Indias Occidentales se obtiene del Dacryodes hexandra. Por otro lado, el
elemi brasileño se obtiene a apartir del Icica icicariba y el elemi oriental se
extrae de Boswellia Frereana, originario de África [85]. En todos los casos
se trata de una mezcla de triterpenoides neutros, principalmente los alcoholes
pentacíclicos á- y â-amirina, y de diversos sesquiterpenoides [7,73,85]. Los
compuestos triterpenoides cristalizan dando a la resina una apariencia blanca
o amarillo pálido opaca. Es blanda y maleable, por lo que se utiliza en
barnices desde el siglo XIX como material plastificante. Sin embargo, al
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50
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

envejecer va adquiriendo dureza, debido a la evaporación de la fracción

sesquiterpénica [7].

i) Mastic. Resina obtenida a partir del árbol Anarcardiaceae Pistacia .

Está compuesta por triterpenos tetracíclicos y pentacíclicos parcialmente
oxidados. Las moléculas presentes en mayor cantidad son: ácido
masticadienoico, ácido isomasticadienoico, oleanano, ácido oleanónico y
ácido morónico. Este último sólo se encuentra en el mastic, por lo que su
identificación en un barniz se considera como indicio de que se ha utilizado
esta resina en una muestra. Es soluble en esencia de trementina, en tolueno y
en xileno, e insoluble en alcohol. Es conocido como ingrediente de los
barnices desde la antigüedad, sobre todo en la cuenca mediterránea
[7,18,53,73,86].
j) Dammar. Se trata de una resina triterpénica obtenida a partir del
exhudado de árboles de la familia del Dipterocarpacae. Está compuesta
principalmente de triterpenoides y de sesquiterpenos. Las moléculas
presentes en mayor cantidad son: hidroxidammarenona, ácido ole anónico,
aldehido ursónico, dammaradienol, hidroxihopanona, ácido dammarólico y
ácido dammarenólico. Al envejecer, el esqueleto del dammarano se oxida y
se puede formar ocotillona. El dammar ha sido utilizado como barniz a partir
del siglo XIX, por lo que aparece únicamente en objetos barnizados o
rebarnizados a partir de dicha época [7,18,73].

1.5.5 Características químicas de otros materiales empleados en

barnices de violines

En los barnices de violines se encuentran una amplia variedad de

compuestos orgánic os, además de las resinas terpénicas, como trazas del
disolvente, aditivos para modificar las propiedades de la películas formada
(plasticidad, dureza, densidad, etc) y pigmentos que aportan la coloración
adecuada.

1.5.5.1 Disolventes

Los barnices se clasifican en función del disolvente utilizado en su

elaboración. Existen tres grandes familias de barnices, que difieren en la
naturaleza del disolvente, su comportamiento durante el secado y su papel en
las propiedades finales de la capa filmógena [5]. Los líquidos
tradicionalmente usados en la preparación de barnices de violines
renacentistas son etanol, aceites secantes y esencias:
a) Etanol. Este disolvente se evapora rápidamente, sin dejar indicios
de su uso. Así pues, se obtiene una capa muy fina, en cuyas propiedades
influyen únicamente la resinas terpénicas utilizadas.
b) Aceites secantes. Se trata de líquidos compuestos por mezclas de
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51
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

triglicéridos, con una elevada proporción de ácidos grasos insaturados. Estos

materiales se obtienen a partir del prensado de semillas de especies
vegetales, cuyas características químicas ya han sido previamente discutidas
en los apartados 1.4.1 y 1.4.3. El secado corresponde a una modificación
química por polimerización del disolvente, con resultados análogos a los
expuestos en el apartado 1.4.4, por lo que intervendrá en las propiedades del
barniz. En este caso se obtiene una capa más gruesa.
c) Aceites esenciales. Existe una amplia variedad de líquidos
compuestos principalmente por mezcla s de monoterpenoides y
sesquiterpenoides, que se pueden clasificar dentro de esta categoría.
La esencia de trementina (aceite de trementina, aceite de pino), se
obtiene a partir de la destilación de diversas resinas de Pinus, principalmente
de Larix decidua [7]. Está compuesta por hidrocarburos monoterpénicos
volátiles (C10 H16 ) y sesquiterpenos [66]. Las moléculas mayoritarias son α-
pineno (60-70%) y β-pineno (20-25%) [7,66-68], y también se encuentran
moléculas de limoneno, ∆3 -careno, β-helandreno, α-mirceno, β-mirceno,
alcanfor, borneol, isoborneol, fenchona, fenchol, mentol, timol, linalool y 1-
8 cinelol [7]. Ya en el secado y sobre todo al envejecer, las moléculas más
volátiles (la mayoría), se pueden evaporar. Aquellas que posean dobles
enlaces pueden formar un polímero difícilmente volatilizable.
Otro disolvente utilizado es la esencia de lavanda (aceite de lavanda,
“spike lavender, spike oil”), un líquido extraído del Lavandula spica [7].
Está compuesta de monoterpenos oxigenados y de sesquiterpenos, y sus
moléculas principales son linalool, acetato de linalilo, alcanfor y éteres
[7,69]. Al estar compuesta principalmente por moléculas volátiles, durante el
secado y el envejecimiento del barniz tenderán a volatilizarse.
Por su parte, la esencia de romero se obtiene por extracción a partir de
las hojas del Rosmarinus officinalis y contiene principalmente 1,8-cineol
(15-55%), a lcanfor (10-25%), pineno (15-25%), borneol (2%),
sesquiterpenos, fenoles, canfeno, y cimbreol [7, 70]. De forma general, los
barnices disueltos en esencias tendrán un comportamiento intermedio a los
dos anteriores.

1.5.5.2 Aditivos

Los aditivos más habit uales en los barnices son sustancias obtenidas
principalmente de especies vegetales y se subdividen en bálsamos, ceras,
oleogomorresinas, y resinas fosilizadas. Aunque de forma menos habitual,
también se encuentran en ocasiones barnices compuestos por productos
extraídos a partir de secreciones animales. Los materiales presentes en
objetos de madera de la época renacentista son: bálsamos, ceras,
oleogomorresinas, aceites esenciales, ámbar y secreciones animales:

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52
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

- Bálsamos

a) Benjuí. Se trata de una resina sólida obtenida a partir de la savia del

árbol Styrax benzoin. Está compuesta de una mezcla de alcoholes y de ácidos
aromáticos y se emplea tradicionalmente en barnices disueltos en alcohol.
Los benjuíes de Sumatra y de Siam se obtienen a partir de diversas especies
del Styrax, y presentan una gran cantidad de benzoato de coniferilo. El
benjuí de América del Sur se obtiene a partir del Myroxylon balsamum y
contiene benzoato de coniferilo y benzoato de bencilo [7].

- Ceras

b) Propiolis. Esta sustancia cerosa y resinosa es extraída por las abejas

a partir de las flores y la corteza de diversas especies de árboles,
particularmente de coníferas, álamos y castaños. Su coloración depende del
origen y la época de la cosecha por lo que se puede encontrar de diferentes
coloraciones, como negro, marrón oscuro, rojo, verde y blanco. Está
compuesta principalmente por productos resinosos (50%), ceras (30%),
aceites esenciales (10%) y polen (5%). Este material es pegajoso a partir de
temperatura ambiente, y por debajo de temperatura ambiente se vuelve más
duro y quebradizo. Su aplicación en los barnices se debe a sus propiedades
como consolidante, bactericida y fungicida.
c) Cera de abeja. Las propiedades de este material se discuten
previamente en el apartado 1.3.2.

- Oleogomorresinas

Las oleogomorresinas contienen una fracción apolar constituida por un

aceite esencial y por una resina, y otra fracción soluble en medios polares
compuesta por oligosacáridos.
d) Resina de enebro. Se obtiene a partir de la planta leñosa Juniperus
communis, originaria de amplias regiones del norte de Europa, América y
Asia. Está compuesta por una mezcla de diterpenoides, principalmente de
ácido policomúnico, y en ocasiones se ha confundido con la resina
sandaraca, debido a su similar composición química [7].
e) Olíbano (franquincienso). Oleogomorresina aromática obtenida del
árbol Boswellia thurifera o Boswellia sacra, de la familia Burseraceae, que
crece en la península arábiga y en África occidental. Está compuesta
principalmente por una mezcla compleja de terpenoides y oligosacáridos
[7,71]. Este material ha sido utilizado desde la antigüedad en cosméticos y
en medicinas, así como, en menor medida, en la elaboración de barnices [7].
f) Mirra. Se trata de una oleogomorresina extraída del árbol
Commiphora Abyssinica, perteneciente a la familia de las Burseraceae, que
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53
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

crece en Arabia y Somalia. Contiene principalmente triterpenoides,

furanosesquiterpenos y oligosacáridos. Este material es conocido desde la
antigüedad para la fabricación de perfumes e inciensos, pero es menos
habitual en barnices de obras de arte [7,72,73].

- Aceite esencial

g) Alcanfor. Esta sustancia se obtiene a partir de la madera del árbol

Cinnamomum camphorae. Está constituido esencialmente por alcoholes
monoterpénicos, principalmente alcanfor y borneol [7].

- Resina fosilizada

h) Ámbar amarillo (ámbar báltico, succino). Este material es el

resultado de un proceso de fosilización de la resina excretada por especies
vegetales pertenecientes a la familia Coniferae. Se encuentra en estratos
geológicos en la costa del mar Báltico, especialmente en Polonia y Lituania.
Está compuesto principalmente por ácido succínico, el co-polímero de
comunol y ácido comúnico, monoterpenoides como el borneol, a lcanfor,
fenchol, fenchona, y diterpenoides procedentes de la resina original, que
representan alrededor del 0,4 % de la composición del ámbar. Esta resina
fosilizada ha sido utilizada desde la antigüedad en joyería y en artículos de
lujo. Asimismo se ha encontrado en barnices de pequeños objetos
manufacturados en zonas cercanas a las costas del mar Báltico [7].

- Secreción animal

i) Goma laca (shellac). Resina de origen animal, obtenida a partir de

un insecto, el Kerria lacca [7]. El materia l excretado se somete a un proceso
de purificación hasta la obtención de la goma laca. Su composición química
depende del entorno natural del insecto, generalmente contiene compuestos
cerosos, ácidos grasos y sesquiterpenos hidroxilados, principalmente ácidos
aleurítico, butolítico, 6-hidroximirístico, jalárico y laccijalárico. Las resinas
de goma laca envejecidas presentan también moléculas con grupos aldehidos
y grupos cetonas. Los ácidos contenidos en la resina de goma laca se
convierten en ácido epishelólico, epilakshólico, shelólico y lakshólico,
epilaccishelólico, epilaccishólico y laccishelólico. La resina de goma laca
funde hacia 115ºC y es soluble en alcohol y en acetato de amilo,
moderadamente soluble en éter, cloroformo y benceno, aunque poco soluble
en esencia de trementina. Ha sido ampliamente empleada como barniz para
todo tipo de objetos [7,73].

________________________________________________________
54
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

1.5.5.3 Colorantes

Los pigmentos se incluyen en los barnices con el objetivo de dar color

al instrumento musical y manipular su apariencia estética. Consisten en
sustancias que interaccionan fuertemente con la radiación, produciendo una
coloración intrínseca muy intensa. Los pigmentos inorgánicos
principalmente utilizados en barnices son el cinabrio (HgS, de coloración
rojiza) y el oropimente (As2 S3 , amarillento). Estos materiales se conocen
desde la antigüedad como pigmentos en pinturas murales [87], aunque han
ido cayendo en desuso, debido a su ennegrecimiento a lo largo del tiempo y
a su elevada toxicidad. Los pigmentos orgánicos son mezclas de
macromoléculas que contienen grupos cromóforos, como fenil y dobles
enlaces conjugados. Los colorantes más habituales en barnices de objetos de
madera de la época renacentista son los siguientes: sangre de dragón, goma
guta, extracto de cachú, laca de granza, extracto de achiote, curcuma, áloe,
azafrán y palo de campeche.

- Secreciones vegetales

a) Sangre de dragón. Sustancia resinosa de color rojizo obtenida a

partir de árboles pertenecientes a los géneros Dracaena, originario del norte
de África y de la s costas del mar Rojo, Daemonorops, procedente de Borneo
y Sumatra, Croton y Pterocarpus. Las sustancias colorantes son la
dracurubina y la drachorodina. La sangre de dragón se conoce desde la
antigüedad y fue ampliamente utilizada por los romanos , griegos y árabes, en
barnices, medicinas, incienso y tintes. Durante el siglo XVIII fue empleada
por los luthiers como colorantes en barnices de violines [7, 88].
b) Goma guta (gutagamba): es una oleorresina secretada del árbol
Garnicia hanburyi, originaria del sudeste asiático. Se obtiene efectuando
cortes en espiral sobre la corteza del árbol, y acumulando la resina extraída
en el interior de un cilindro de bambú hueco. El látex recogido se lleva a
congelación, y tras quebrar la barra de madera, se obtiene el colorante. Este
material presenta una coloración amarillenta y fue introducido en Europa a
través de Inglaterra a principios del siglo XVII. La sustancia responsable del
color es el ácido gambógico. Además está compuesta por un 73% de
polisacáridos pola res solubles en acetona, por lo que puede utilizarse
directamente en aglutinantes disueltos en agua [7].

- Extractos vegetales

c) Extracto de cachú. Este material se obtiene a partir de la madera del

árbol Acacia catechu, perteneciente a la familia de las Babaceas, originarias
de Asia. El extracto es rico en flavonoides y taninos y el tinte presenta un
________________________________________________________
55
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

color marrón rojizo. Asimismo presenta propiedades hidrófobas y

antibacterianas, por lo que protege la capa filmógena del medio ambiente
[89].
d) Laca de granza (rubia de tintes). Este extracto vegetal se obtiene a
partir de las raíces de la flor Rubia tinctorum. El colorante está constituido
por una mezcla de derivados de la antraquinona, principalmente purpurina,
pseudopurpurina y alizarina, y aporta una coloración rojiza. Se trata del
pigmento natural más importante y ha sido ampliamente utilizando en tintes
de tejidos, madera y seda [90].
e) Extracto de achiote (Achiotl, Urucú, Bija, Bijol, Roncon, Onoto).
Se obtiene a partir de la cera que rodea las semillas de la planta arborescente
Bixa orellana, originaria de las regiones intertropicales de América. El
colorante es un carotenoide de color rojizo-amarillo con elevada
fotosensibilidad, pero inerte frente a agentes químicos. Se utiliza
principalmente como aditivo en alimentos y como tinte corporal [91].
f) Curcuma. Extracto procedente de la plante herbácea Curcuma
longa, perteneciente a la familia de las zingiberáceas, originaria del sudeste
asiático. El tinte presenta una coloración amarilla -anaranjada y se ha
utilizado como colorante natural en tejidos [7].
g) Jugo de áloe. Este material se obtiene a partir de las hojas de ciertas
especies del género Aloe, en especial del Aloe vera, originario de las islas del
Caribe, Aloe ferox y Aloe perryi, procedentes del este y sur de África. El
tinte presenta una coloración amarilla, y se ha utilizado en pinturas y
decoración como pigmento. La sustancia responsable de la coloración es una
antraquinona, la barbaloina, cuya concentración en el colorante es de 25 %
[7].
h) Azafrán. Se trata de un extracto obtenido del estigma de la flor de
Crocus sativus, que se utiliza para aportar una coloración amarillenta. Las
moléculas causantes de la coloración son el glucósido pricocrocetin, safranal
y el carotenoide crocin. Además contiene una considerable cantidad de
flavonoides. El azafrán ha sido un material muy apreciado como tinte desde
la antigüedad en el área mediterránea, así como por sus propiedades como
perfume y condimento alimenticio , aunque poco usado debido a su elevado
coste [7].
i) Palo de Campeche. Este colorante se obtiene a partir de la especie
arbórea Haematoxylum campechianum, que crece en América central y en la
península de Yucatán, en México. La sustancia colorante es la hematoxilina,
que proporciona un intenso color rojo en su forma reducida, y pasa al azul al
oxidarse. Debido a la diferencia de coloración según los diversos estados de
oxidación, se ha utilizado para tintes con coloraciones del azul al rojo,
pasando por diversos matices violeta y malva, así como grises y negros
intensos. Este colorante empezó a usarse masivamente en Europa a partir del
siglo XV [92].

________________________________________________________
56
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

1.5.6 Alteraciones experimentadas por resinas terpénicas

La alteración de los materiales que forman el barniz depositado sobre

los violines consiste fundamentalmente en la evaporación de las sustancias
más volátiles (etanol y monoterpenos), así como la oxidación,
polimerización y degradación de la fracción más pesada (glicéridos, di- y
triterpenoides) [5].
Los procesos de oxidación de las moléculas presentes en el barniz se
producen a través de reacciones radicalarias. Inicialmente se originan por el
ataque del oxígeno ambiental a los dobles enlaces, proceso catalizado por la
humedad, la radiación y los cationes metálicos presentes en los barnices
[7,53,83,84,93].
Estos procesos de envejecimiento que transcurren durante el secado
del barniz pueden conducir a una variación de sus propiedades. Así pues, se
produce la aparición de un número elevado de insaturaciones, las cuales
pueden actuar como cromóforos, aportando al barniz una coloración
amarillento-parduzca y aumentando la sensibilidad a la radiación y a los
cambios de humedad. Estos procesos conducen generalmente a un
debilitamiento de la estructura de la capa filmógena, produciendo
cuarteamientos, grietas e incluso desprendimientos, que disminuyen su
capacidad protectora y deterioran su apariencia visual [18,53,69,83,93]. Por
otro lado, se aprecia en los barnices la tendencia a amarillear, como en el
caso de los aceites secantes expuesta en el apartado 1.4.4.
Los procesos oxidativos de mayor importancia son las modificaciones
experimentadas por los compuestos de las resinas terpénicas y los aceites
secantes. El comportamiento de estos últimos ya ha sido discutido
previamente. Por otra parte, la evolución de los diterpenoides depende de su
naturaleza como abietanos, pimaranos o ladbanos, mientras que en los
triterpenoides depende principalmente de su estructura.

1.5.6.1 Mecanismos de oxidación de abietanos y pimaranos

Los mecanismos de oxidación de los abietanos, diterpenoides

tricíclicos principalmente presentes en resina de Pinus, han sido
ampliamente estudiados.
Los cuatro abietanos principales (ácido levopimárico, levopimárico,
abiético, y neoabiético) presentan una elevada reactividad debido a la
presencia de dobles enlaces en su estructura. Estos compuestos experimentan
isomerizaciones e interconversiones, llegando en el equilibrio a una mezcla
en la que el levopimárico tiende a desaparecer y el abiético es el
constituyente principal [7]. La etapa siguiente consiste en la oxidación de
este último para formar ácido deshidroabiético. Los mecanismos de
oxidación no están claros, pero algunos autores proponen que transcurren
________________________________________________________
57
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

por vía radicalaria [75,83,84]. Mediante la incorporación de oxígeno al doble

enlace se genera un peróxido, que se descompone formando un alcohol o
cetona conjudados a una insaturación. Estos productos experimentan una
deshidratación que da lugar al ácido deshidroabiético. Esta etapa del
mecanismo está fuertemente favorecida, debido a la fomación de un anillo
aromático estable [75].
En las siguientes fases la oxidación continúa mediante un mecanismo
radicalario. Los puntos más reactivos son los carbonos adyacentes al anillo
bencénico, ya que el radical formado está estabilizado por deslocalización.
Los compuestos más importantes producidos por la progresiva oxidación del
ácido deshidroabiético son los ácidos 3-hidroxideshidroabiético (3-OH-
DHA), 7-hidroxideshidroabiético (7-OH-DHA) y 15-hidroxideshidroabiético
(15-OH-DHA). Posteriormente se forman 3,15-dihidroxideshidroabiético
(3,15-diOH-DHA), 7-oxo-DHA y 15-OH-7-oxo-DHA [7,75,83,84,94]. Al
avanzar la degradación de la capa filmógena se generan derivados aún más
oxidados a través de mecanismos desconocidos, tal y como se describe en la
Figura 3.
La presencia de abietanos en los estados más avanzados de oxidación
es un indicativo de que la muestra es más antigua, y/o que ha sido expuesta a
condiciones ambientales más agresivas [83,95].
Por su parte, los pimaranos son más estables frente a la oxidación,
debido a la ausencia de dobles enlaces conjugados en su estructura. Sin
embargo, se observa efectivamente la disminución de su cantidad a lo largo
del proceso de envejecimiento, por lo que algunos autores constatan su
participación en procesos de polimerización [7,84].
Otra serie de reacciones involucran a tanto a los abietanos como los
pimaranos, los cuales experimentan aromatizaciones, desfuncionalizaciones
y desmetilaciones, que conducen a la formación de productos tales como los
norabietatrienos y tetrahidrorretenos, de los cuales el reteno es más estable
[9].

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 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

1.5.6.2 Procesos de envejecimiento de los labdanos

Los labdanos son diterpenoides (ácidos y alcoholes) bicíclicos,

presentes en gran cantidad en las resinas procedentes de especies vegetales
de las familias Cupressaceae, Araucariaceae y Leguminosae [7].
Estas sustancias experimentan principalmente procesos de
polimerización, que ocurren cuando entran en contacto con la luz y el aire.
Problablemente la oxidación transcurre mediante un mecanismo radicalario,
cuya iniciación tiene lugar en los dobles enlaces conjugados presentes al
final de su cadena de labdanoides como el ácido comúnico, comunal y cis-
abienol. El crecimiento del polímero prosigue a través de reacciones de
isomerización, entrecruzamientos y ciclaciones intra- e intermoleculares, que
dan como resultado una red polimérica basada en estructuras policíclicas.
Los mecanismos de entrecruzamiento continúan a lo largo del tiempo,
aunque están contrarrestados por reacciones de escisión en â y rupturas
oxidativas de los dobles enlaces. Finalmente se obtiene una red polimérica
basada en unidades de moléculas bicíclicas de menor peso molecular, unidos
por largas cadenas alquídicas [84,95].
Por otra parte, los labdanoides que no poseen dobles enlaces
conjugados resultan afectados en menor medida por el proceso de oxidación.
Aun así pueden experimentar reacciones a través de las insaturaciones
mediante entrecruzamientos que dan lugar a una estructura oligomérica. En
otros casos se produce una pérdida de los grupos reactivos, como los ácidos
agatálico y agatólico, que dan lugar al ácido 19-norlabda-8(20),13-dien-15-
oico, debido a la pérdida de los grupos aldehido y carboxílico,
respectivamente. Este producto sufre una reacción oxidativa de
deshidrogenación, originando ácido 19-norlabda-4,8(20),13-trien-15-oico.
Asimismo se producen hidrólisis que afectan a los ésteres presentes, como el
ácido acetoxiagatólico, que se descompone en ácido agatólico y ácido
acético [84].

1.5.6.3 Mecanismos de oxidación de triterpenoides

Las resinas triterpénicas están constituidas por una mezcla compleja de

sustancias, que se complica aún más tras el proceso de envejecimiento.
Además, la diversidad de puntos reactivos en los esqueletos de los
triterpenoides permite la formación de multitud de productos de oxidación.
Las posiciones más reactivas son los carbonos terciarios y conjugados a
dobles enlaces, que estabilizan los radicales generados. De forma general, se
obtendrán derivados oxigenados de las sustancias originales, añadiendo
grupos alcohol, carbonilo y carboxílico, así como la construcción de una red
polimérica [53,81,96].
La iniciación de los procesos de fotooxidación se produce
________________________________________________________
60
 III. ANTECEDENTES. RESINAS TERPÉNICAS

probablemente mediante la excitación de los grupos carbonilo situados en

una ciclohexanona, seguido de una escisión en á y de la ruptura del anillo. El
radical obtenido propaga la reacción, atacando moléculas cercanas y
produciendo entrecruzamientos que extienden la red polimérica [53,54,97]
de forma análoga a lo expuesto en el apartado 1.4.4. El alargamiento del
polímero se realiza asimismo mediante reacciones de condensación [54]. A
medida que se produce el envejecimiento, el polímero aumentará su masa
molecular [81].
Los triterpenoides con esqueleto de tipo damarano contienen
insaturaciones, carbonilos y grupos alcohol, por lo que presentan una
elevada reactividad. El proceso de envejecimiento de esta clase de sustancias
se inicia mediante la oxidación de la cadena lateral, dando lugar a derivados
más pesados de tipo ocotillona (anillo tetrahidrofurano) y â -lactona
mediante mecanismos de reacción desconocidos [53,81,96].

Junto a la oxidación se produce una serie de reacciones de ruptura,

cuyos intermedios son desconocidos, que conducen finalmente a la
formación de moléculas de menor peso molecular, como el 3-â-
acetoxihexakisnordammaran-20-ona, y compuestos volátiles que no se
quedan retenidos sobre el barniz [53,81]. Estas reacciones competirán con
los entrecruzamientos y la adición de átomos de oxígeno, limitando el
crecimiento del polímero y aumentando su fragilidad [53].

________________________________________________________
61
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

La primera etapa en la oxidación de las moléculas con estructuras de

tipo olenano y ursano (1) consiste principalmente en la adición de un grupo
hidroxilo en la pos ición 28. El alcohol generado (2) se oxida a su vez en
aldehido (3) y en ácido carboxílico (4). Tras la posterior descarboxilación
(5), se produce una hidroxilación en la posición C17 (6). Otra serie de
reacciones pueden conducir a la adición de un grupo carbonilo en posición
11, conjugado a un doble enlace [53,81,98].

A causa de la adición de oxígeno en el esqueleto de los triterpenoides

durante el proceso de envejecimiento, el barniz aumenta progresivamente su
polaridad, por lo que puede ser necesario el uso de un disolvente más
hidrofílico para retirarlo. Las propiedades mecánicas del barniz se ven
alteradas por el incremento de polaridad, ya que las interacciones entre las
diferentes sustancias serán más fuertes, debido a la formación de enlaces por
puentes de hidrógeno. No obstante, la fortaleza de estas atracciones
intermoleculares se puede ver atenuada por la entrada de humedad
ambiental, llegando a resquebrajar el barniz [46]. Asimismo, al reducir la
hidrofobicidad se favorece el paso de sustancias polares a través del barniz
hacia las capas inferiores, exponiéndoles a la acción del agua [53].

1.6 Resinas sintéticas

Una de las innovaciones más importantes aportadas por la Revolución

Industrial fueron los materiales poliméricos. Su uso se fue extendiendo con
rapidez tras su descubrimiento en el siglo XIX, ya que resultaron muy útiles
en multitud de aplicaciones, debido a la diversidad de polímeros disponibles,
su versatilidad y la variedad de sus propiedades. En la actualidad se
encuentran en muchos objetos de uso corriente, como tejidos, pinturas, en
________________________________________________________
62
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

barnices de muebles, obras de arte y superficies metalizadas, aislantes de la

humedad, adhesivos, recipientes, embalajes, moldes, etc.
Existen tres grandes grupos de resinas sintéticas. Uno de ellos se
caracteriza por que la formación de la cadena polimérica se basa en la unión
de los monómeros a través de los dobles enlaces mediante reacciones
radicalarias (polivinilos). En el segundo grupo, la resina polimérica se
construye a través de la condensación entre grupos reactivos, en este caso se
produce la pérdida de sustancias de bajo peso molecular, principalmente
agua. En la tercera categoría, el polímero se extiende asimismo a través de
reacciones de condensación, pero en este caso incluye grupos inorgánicos en
su estructura.
En todos los casos, la reacción puede partir de una única clase de
monómero, dando lugar a homopolímeros, o de una mezcla, obteniéndose
copolímeros [7].
Los monómeros deben ser como mínimo bifuncionales para servir de
reactivo en la síntesis de material polimérico, en cuyo caso se obtiene una
cadena lineal. Por otra parte, la polimerización en cuya mezcla de partida se
encuentre algún monómero polifuncional dará como producto un material
con una estructura ramificada, cuyo grado de entrecruzamiento estará
determinado por la proporción de monómero polifuncional inicialmente
presente [7].
Las estructuras de las resinas poliméricas son relativamente poco
conocidas, debido a su complejidad. Además, al haber sido desarrolladas en
su mayoría por industrias, sus rutas sintéticas y modos de preparación
forman parte de patentes y no se encuentran generalmente en publicaciones
de libre acceso.

1.6.1 Descripción y características químicas de las principales resinas

sintéticas

1.6.1.1 Polivinilos

El descubrimiento de los polivinilos data de 1835, con la síntesis del

cloruro de polivinilo. No obstante, la fabricación de estos materiales se
estancó durante largo tiempo y no fue hasta 1917 cuando comenzó la
producción masiva de este tipo de compuestos.
Los polímeros vinílicos están formados principalmente por unidades
de hidrocarburos de cadena corta que contienen una o varias insaturaciones.
La reacción de polimerización transcurre por vía radicalaria, a través de la
formación de enlaces simples carbono-carbono entre los monómeros.
Aunque se supone que las reacciones involucradas son semejantes a las
experimentadas por los ácidos grasos poliinsaturados (apartado 1.4.4), se
deduce que en este caso no existe la intervención del oxígeno, ya que no se
________________________________________________________
63
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

observa su incorporación en la estructura del polímero [7].

La activación de las insaturaciones se produce por la intervención de
un iniciador I (principalmente persulfato de potasio), que se fija sobre el
doble enlace, provocando su apertura y la formación de un nuevo radical [7].

En la mezcla de radicales originada, el derivado, cuyo electrón libre

está sobre el carbono más sustituido, será mayoritario. Durante la etapa de
propagación se produce el ataque del nuevo radical sobre otro monómero
insaturado.

De nuevo, la adición se realizará de forma que el nuevo radical que se

genere esté en la posición más sustituida. Este proceso se repetirá
continuamente, causando el alargamiento progresivo de la cadena
polimérica. Por último, durante la etapa de terminación, el radical polimérico
atacará esta vez a otro radical (T· ) para obtener una molécula no reactiva,
interrumpiendo el crecimiento de la resina sintética [7].

________________________________________________________
64
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

El terminador T puede ser otro radical polimérico, algún aditivo y en

algunos casos oxígeno. Las condiciones de reacción (temperatura y presión),
así como las cantidades de iniciador y terminador, ejercerán una notable
influencia en la longitud de la cadena polimérica.
Los procesos de polimerización se llevan a cabo en medio líquido,
para lo cual se prepara una emulsión de los monómeros y aditivos en una
disolución acuosa. Este sistema es fluido, por lo que el aumento de
viscosidad, producido por el alargamiento de la cadena, no es muy elevado,
y la temperatura se mantiene bajo control. Todo ello permite alcanzar
materiales con elevados grados de polimerización [7].
La naturaleza del grupo R puede resultar muy diversa, por lo que
existen numerosos grupos de polivinilos.

1.6.1.1.1 Poliolefinas

Las poliolefinas están constituidas por homo- y copolímeros de

alquenos de bajo peso molecular, principalmente eteno, propeno, butadieno
y estireno [7].
El polietileno es el polivinilo más simple, está constituido a partir de
monómeros de eteno y se sintetizó por primera vez hacia 1940. Las diversas
variedades comerciales del polietileno difieren en su grado de
polimerización (desde 70 hasta 200.000) e incorporan éster ftálico como
plastificante. El propio polímero es un hidrocarburo saturado sin centros
reactivos, por lo que presenta gran inercia química y elevada hidrofobicidad.
Debido a tales propiedades resulta ideal para la fabricación de recipientes
aislantes de agua [7].
El polipropileno es una resina sintética obtenida a partir de
monómeros de propeno y presenta características semejantes a las del
polietileno. Por su parte, el poliestireno fue sintetizado por primera vez
durante la primera mitad del siglo XIX, aunque su comercializació n data de
1930, y su producción masiva empezó después de la segunda guerra
mundial. Sus propiedades son parecidas a las de los anteriores polivinilos,
aunque su hidrof obicidad es mayor, debido a la presencia del anillo
bencénico. Habitualmente se encuentra en copolímeros junto a otras
unidades vinílicas [7].
El copolímero de estireno-etileno/butadieno-estireno (SEBS),
denominado comercialmente Kraton G [99], fue producido por primera vez
en la década de los 1960. Presenta elevada estabilidad frente a la oxidación,
elevadas temperaturas, radiación UV y agentes contaminantes, y es
compatible con aceites minerales y otras poliolefinas. Esta resina sintética se
utiliza principalmente como adhesivo y material elástico. El producto
comercial Kraton G1650 está constituido por un 30% de estireno, mientras
que el Kraton G1657 contiene un 13% [100].

________________________________________________________
65
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.1.1.2 Resina de hidrocarburos saturada

La primera resina hidrogenada de hidrocarburos fue desarrollada por

Arakawa Chemicals (Osaka, Japón), con la denominación de Arkon P90.
Este material incluye en su estructura hidrocarburos alicíclicos y pentaciclos
saturados [101]. Es soluble en líquidos hidrofóbicos e insoluble en alcoholes
y cetonas, y presenta elevada resistencia ante las agresiones térmicas y
medioambie ntales [102].

1.6.1.1.3 Resina de cumarona (indeno-benzofurano)

La resina de cumarona es un copolímero del benzofurano (cumarona)

y del indeno, de bajo peso molecular medio (alrededor de 1.000 Da), muy
utilizado en la industria del asfalto, del caucho y de los aislantes [103,104].
Este material es relativamente transparente, aunque tiene tendencia a
amarillear, y químicamente es resistente al agua, a los ácidos, a las bases y a
las sales. Asimismo presenta elevada dureza, aunque a 100ºC se reblandece
de forma considerable [104]. Este polímero es soluble en alcoholes, éter,
esencias naturales e hidrocarburos clorados, y compatible con un amplio
grupo de plastificantes [104].

1.6.1.1.4 Acetato de polivinilo

El monómero del acetato de polivinilo es etanoato del enol del

acetaldehído. La reacción de polimerización se produce rápidamente en
presencia de iniciadores o bajo la influencia de la radiación UV. Su
producción se inició hacia 1930, y en la actualidad se comercializa en forma
sólida bajo las denominaciones de Mowilith, Acetato de Polivinilo (PVAc) y
Palmer Cement. Estos materiales son brillantes y transparentes, y presentan
elevada resistencia a la luz, al calor, al agua y a los ácidos. Asimismo de
caracterizan por su capacidad adherente y por su dureza, aunque son
termoplásticos y se vuelven blandos al elevar la temperatura. Debido a la
presencia del grupo acetato en su estructura, posee elevada solubilidad en
alcoholes, cetonas, ésteres, hidrocarburos aromáticos y cloroformo. Sin
embargo es insoluble en agua, éteres y alcanos, y ligeramente hidrolizable
mediante ataque básico [7,99,103,104,105].
Las propiedades de las resinas de acetato de polivinilo dependen de la
longitud de la cadena. Así pues, tanto la viscosidad como la temperatura de
transició n vítrea y el punto de reblandecimiento aumentarán a mayores
grados de polimerización [7,99,103].

________________________________________________________
66
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.1.1.5 Alcohol polivinílico

El alcohol polivinílico se produce mediante la hidrólisis del acetato de

polivinilo. Debido a la presencia de los grupos alcohol, esta clase de
polímeros son polares, miscibles con agua y forman películas permeables al
oxígeno. Asimismo experimentan reacciones de entrecruzamiento, a través
de la formación de enlaces éter por reacción entre los alcoholes libres. En
este caso la capa puede regenerarse mediante lavado con agua [7].
La resina de Mowital es un butiral de polivin ilo, un derivado del
alcohol polivinílico que se sintetiza por medio de la hidrólisis ácida del
acetato de polivinilo en presencia de butanal [103]. El material resultante
posee elevada estabilidad química, resistencia a la radiación, y una vez
aplicado sobre una superficie proporciona una película consistente y
termoplástica, cuya temperatura de reblandecimiento se sitúa en torno a los
250-230ºC [99]. Por otro lado, pesenta una adecuada adherencia sobre
vidrio, madera y metales [106]. La solubilidad del Mowital es satisfactoria
en alcoholes y éteres, mientras que es baja en agua, ésteres e hidrocarburos
[104,106].

1.6.1.1.6 Poliacrílicos

La denominació n de polímeros acrílicos se aplica a un amplio grupo

de resinas sintéticas compuestas por homopolímeros y copolímeros de
ésteres de ácidos acrílico y metacrílico, principalmente metil, etil y
butilderivados.
Estos materiales proporcionan plásticos y barnices transparentes de
gran estabilidad química y solubles en disolventes orgánicos [45]. Los
polímeros basados en ésteres con alcoholes ligeros proporcionarán
materiales de una dureza y rigidez mayor y, a medida que aumente la
longitud de la cadena carbonada, la resina sintética se volverá más blanda y
cerosa. En general, se utilizan en la fabricación de objetos como sustituto del
vidrio, debido a sus similares propiedades [7].
El poliacrílico de mayor importancia es el Paraloid, una categoría de
acrílicos muy amplia, de la cual los más importantes son B44,
B48N (metilmetacrilato) , B66 (polibutilmetilmetacrilato), B67
(isobutilmetacrilato), B72 (etilmetacrilato-metilacrilato), B82 (etilacrilato-
metilmetacrilato) y B99 (polimetilmetacrilato). Estos materiales presentan
una excepcional estabilidad, la ausencia de entrecruzamientos, nula
tendencia al amarilleamiento y forman una película estable [99,107]. Otros
productos acrílicos ampliamente utilizados en restauración son las
emulsiones de Primal AC35 y E330 (etilmetacrilatos), Plextol B500, D458,
D498 (etilacrilato-etilmetacrilato), así como Elvacite 2044 y 2046 (n-
butilmetilmetacrilato) [7,45].
________________________________________________________
67
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.1.2 Polímeros formados por condensación

Los polímeros de condensación engloban a una extensa categoría de

materiales, producidos mediante el ataque nucelofílico o electrofílico entre
los monómeros, generando un intermedio de reacción que se deshidrata para
obtener el producto final. Las reacciones de condensación más habituales
son los de esterificación, amidación, eterificación, aldólica, etc. Todas ellas
están catalizadas en medio básico o ácido.
Las sustancias que experimentan este tipo de reacciones incluyen
grupos reactivos polares en su estructura, como ácidos carboxílicos,
alcoholes, aminas, cicloéteres, cetonas, aldehidos, fenoles, etc [15]. En este
caso, la polimerización sólo es posible si los monómeros incluyen dos o más
grupos reactivos en su estructura [7]. Las características de esta clase de
materiales varían en función de los monómeros y de las reacciones de
polimerización.

1.6.1.2.1 Resinas alquídicas

Las resinas alquídicas se desarrollaron alrededor de 1930, a partir de la

esterificación entre ácidos policarboxílicos y alcoholes polifuncionales. Los
ácidos más utilizados para la síntesis de los productos comerciales son el
ácido ftálico, isoftálico, tereftálico, así como los ácidos succínico,
hidroxisuccínico, málico, tartárico, adípico, sebácico y cítrico, mientras que
los polialcoholes más habituales son el etilenglicol, glicerol, pentaeritrol,
hexantriol, trimetilpropanol y 1,6-hexandiol [103]. El polímero formado se
modifica posteriormente mediante la adición de aceites secantes, seguido de
calefacción para favorecer la transesterificación.
El producto finalmente obtenido contiene proporciones variables de
aceite secante (35-70%), e incorpora asimismo algunas de sus características,
en especial sus propiedades hidrofóbicas [7]. La resina sintética fresca es
soluble en hidrocarburos y alcoholes, propiedad que pierde gradualmente
durante el envejecimiento [106]. Las resinas alquídicas son compatibles con
las resinas de la colofonia, polivinilos de estireno/butadieno, cloruro de
polivinilo, acrílicos, resinas cetónicas y nitrato de celulosa [106], mientras
que son incompatibles con pigmentos básicos [7].

1.6.1.2.2 Poliésteres

Los poliésteres constituyen una serie de polímeros comerciales

sintetizados a partir de ácido tereftálico y etilenglicol. Se caracterizan por su
gran rigidez y en la actualidad se utilizan principa lmente para la fabricación
de cintas magnéticas [7]. En arte contemporáneo se usan combinados con
fibra de vidrio para la fabricación de esculturas y moldes.

________________________________________________________
68
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.1.2.3 Resinas epoxídicas

Las resinas epoxídicas se constituyen a partir de unidades

monoméricas de éteres cíclicos, como la epicloridrina (1-cloro-2,3-
epoxipropano) y el bisfenildifenilolpropano. La polimerización está
condicionada por la iniciación, por lo que la selección del activador es clave
en proceso de síntesis. Por su parte, la etapa de propagación se realiza con
rapidez, debido a la inestabilidad de los éteres cíclicos. La resina obtenida
forma una red polimérica entrecruzada muy estable y, debido a la presencia
de los enlaces éter, ligeramente hidrofílica. Estos materiales experimentan
una fuerte tendencia a amarillear, mediante procesos catalizados térmica y
fotoquímicamente.

1.6.1.2.4 Resinas cetónicas

Los polímeros cetónicos están formados a partir de reacciones de

condensación que involucran a grupos carbonilo. [7].
El principal grupo de resinas cetónicas está formado por polímeros
basados en unidades de la ciclohexanona y sus derivados metilsustituidos.
La resina cetónica AW2, sintetizada por primera vez hacia 1930, es el
producto de la condensación aldólica entre ciclohexanona y
metilciclohexanona, en relación (1/3), catalizada en medio básico en
ausencia de agua (Figura 4) [108].
La resina se forma por una serie de reacciones de condensación
aldólica, seguida de deshidratación, que conducen a la formación de un
producto final ramificado. El material resultante presenta ausencia de
coloración y un fuerte brillo, así como elevada adherencia, capacidad de
relleno y reversibilidad. Asimismo, posee una fuerte estabilidad ante la luz,
el calor y los agentes químicos, por lo que tiene una baja tendencia a
amarillear. Por otra parte, no resulta muy útil para aplicar en forma de capa
filmógena, debido a su fragilidad. La resina AW2 es soluble en cetonas
cíclicas, ésteres, esencias, alcanos e hidrocarburos clorados. [103,104,109].
El polímero MS2, fabricado a partir de la década de los 1950, es un
material sintético producido por condensación de la metilciclohexanona con
hasta un máximo de 20% de ciclohexanona, o en ocasiones únicamente un
homopolímero de metilciclohexanona [109].
________________________________________________________
69
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

Figura 4. Esquema de de polimerización entre la ciclohexanona y la metilciclohexanona para

dar lugar a la resina AW2.

Hacia 1960 se desarrollaron dos nuevos polímeros, fruto de la

reducción e hidrogenación total del MS2 y AW2, denominados MS2-A y
MS2-B, respectivamente, los cuales presentaban mejores características
como barniz [109].
Por su parte, el Keton N (Laropal K80) es un homopolímero de
ciclohexanona, y se produce desde 1960. El mecanismo de la síntesis de esta
resina se inicia por la autocondensación aldólica del monómero, en medio
KOCH3 /CH3 OH en ausencia de agua [99,103,109].

Posteriormente se produce de nuevo una condensación aldólica, entre

una ciclohexanona y el oligómero anteriormente formado, seguida de una
eliminación de Hoffman.

________________________________________________________
70
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

La reacción continúa de igual manera, dando lugar a oligómeros hasta

grado de polimerización 12. Este material forma películas de elevada
consistencia, es inerte ante álcalis, y soluble en la mayoría de medios
empleados en lacas, en esencias, alcoholes, acetato de etilo e insoluble en
agua. [103,109].
La resina de Laropal A81 es el producto de la condensación de la urea
con aldehidos alifáticos [99]. El grado de polimerización es relativamente
bajo, con unidades de masa molecular media de 600 Da [106]. Las
características físicas más notables del producto obtenido son su resistencia a
la dilatación térmica, fluidez, transparencia y su ausencia de coloración.
Químicamente resulta inerte frente al calor y la luz, y no tiene tendencia al
amarillamiento [99,103,110]. Por otra parte, la solubilidad del polímero en
hidrocarburos alifáticos y alcoholes es limitada, y nula en agua [99,110]

1.6.1.2.5 Resinas de fenol-formaldehido

Las resinas de fenol-formaldehido son materiales desarrollados a

principios del siglo XX a partir de la condensación de formaldehído y fenol.
El primer paso de la ruta sintética consiste en la adición del
formaldehído sobre el fenol (principalmente en las posición orto y para),
seguido de una deshidratación. El oligómero formado puede reaccionar de
igual manera con otra molécula de formaldehído, o con fenol, aumentando el
grado de polimerización [7,103,104,111].

Cuando la reacción se produce en medio ácido, las unidades en el

polímero resultante están enlazadas por grupos metileno. Sin embargo, en
medio alcalino se establecen puentes metilol, etileno, y metileno [103]. En
ambos casos, se efectúa un tratamiento por calentamiento para aumentar el
grado de entrecruzamiento y la dureza [7]. El producto final es una resina
sintética cuyas propiedades físicas y químicas se ven relativamente poco
afectadas por el aumento de la temperatura, y soluble en aceites secantes, así
como en esencia de petróleo. En este sentido se aprecian diferencias en
________________________________________________________
71
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

función de las condiciones de preparación, ya que los polímeros obtenidos

por catálisis ácida resultan más sensibles al aumento de la temperatura, más
blandos y solubles [104].
Al aplicarse sobre una superficie forma una capa aislante, consistente,
dura, poco resquebrajable y resistente a agresiones químicas causadas por el
agua, ácidos, álcalis y disolventes orgánicos [111].

1.6.1.2.6 Poliacroleínas

La estructura de esta resina sintética está basada en el acrilaldehido

(propenal), cuya polimerización se produce mediante adición conjugada de
los monómeros [104].
La iniciación se produce mediante ataque nuleofílico contra un doble
enlace, que provoca su apertura y la formación de un nuevo anión:

En la fase siguiente de propagación se produce el ataque al monómero,

lo que causa el alargamiento de la cadena polimérica:

Sin embargo, en ocasiones la cadena experimenta procesos de

ciclación catalizados por electrones:

Por otro lado, las extremidades pueden experimentan procesos de

oxidación que conducen a la formación de ácidos carboxílicos, los cuales
pueden establecer enlaces por puentes de hidrógeno y aumentar la rigidez de
la cadena.

________________________________________________________
72
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

Las resinas de acroleína son poco solubles debido al gran número de

entrecruzamientos que tiene su estructura [104,110].

1.6.1.3 Resinas semiorgánicas

Las resinas semiorgánicas son polímeros de condensación cuyos

monómeros consisten en compuestos organometálicos o son, posteriormente,
modificados con sales inorgánicas.

1.6.1.3.1 Nitrato de celulosa

El nitrato de celulosa en un poliéster inorgánico obtenido a partir de la

condensación entre el ácido nítrico y los grupos de alcohol de las unidades
cíclicas del polisacárido. La producción de la resina se inicia sobre el
polímero natural, el cual experimenta una serie de reacciones de nitración
con una mezcla de ácido sulfúrico, ácido nítrico y agua, purificación,
digestión y deshidratación que conducen a la formación del producto final
[112].
El polímero comercial contiene de media aproximadamente 2,3
unidades de nitrato por unidad de glucosa, lo que significa que el 50% del
polímero contiene unidades de glucosa trisustituidas, 34% disustituidas y
16% monosustituidas, con un peso molecular de 20.000 y 250.000 Da [113].
Sin embargo, estos valores pueden oscilar fuertemente en función del
fabricante.

________________________________________________________
73
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

Esta sustancia presenta elevada inercia química frente al agua y otros

disolventes pola res como cetonas y ésteres. Es soluble en disolventes
medianamente polares como ésteres, alcoholes y éteres, e insoluble en
esencias de petróleo e hidrocarburos aromáticos. Por otra parte resulta
fácilmente atacable por ácidos y álcalis [112].
Debido a sus propiedades y a su bajo costo, se ha utilizado en multitud
de aplicaciones. En un principio se limitó su uso a fines militares, debido a
sus propiedades como explosivo. Por otra parte, su elevada inestabilidad la
volvía inutilizable en otras aplicaciones. Más adelante se descubrió que esta
propiedad era debida a la formación de ésteres con el ácido sulfúrico
utilizado en la síntesis [114]. La estabilización del producto mediante la
adición de alcanfor 4/1 (mezcla denominada celuloide) o a través de la
purificación y eliminación de los sulfonatos [115], permitió ampliar su
empleo a usos civiles. Los productos resultantes se incorporaron a la
industria de la fabricación de plásticos, y desde entonces se utiliza en lacas,
capas protectoras, explosivos, propulsores, tintas para impresora, así como
en barnices y adhesivos [112].

1.6.1.3.2 Etilpolisiloxano

La resina de etilpolisiloxano es un polímero de silicona de fórmula

general [(CH3 CH2 )2 SiO]n . Su síntesis parte de la reacción entre el silicio
metálico y el cloruro de etilo, para obtener el intermedio (CH3 CH2 )2Cl2 Si, el
cual se hidroliza a (CH3 CH2 )2 (OH)2 Si. Este último experimenta una
autocondensación con pérdida de agua, que conduce a la formación de la
cadena silicio-oxígeno que da soporte a la estructura del polímero. El
producto resultante es un líquido muy viscoso, en forma de gel, aceite o
elastómero reticulado. Debido a la estabilidad química de este enlace, el
polímero es relativamente inerte frente a agentes químicos, la radiación UV
y el calor. La flexibilidad de la cadena, debida a la facilidad de rotación del
enlace silicio-oxígeno, otorga a la resina una baja viscosidad e
independencia de las propiedades mecánicas respecto de la temperatura.
Asimismo presenta una solubilidad elevada en disolventes orgánicos.
Esta clase de polímeros se utilizan ampliamente a nivel industrial
debido principalmente a sus propiedades como agente sellante,
antiespumante, lubricante, desmoldeador y antiadhesivo [116].

1.6.2 Aplicación en obras artísticas

La historia de la aplicación de las resinas poliméricas con finalidades

decorativas arranca en 1846, a partir de la síntesis del nitrato de celulosa por
parte de Schönbein. Algunos años más tarde, Alexander Parkes mostró una
serie de objetos manufacturados con este polímero en la Exposición
________________________________________________________
74
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

Universal de Londres. Desde entonces una amplia variedad de resinas

poliméricas han sido utilizadas en el campo artístico, como materia prima en
la elaboración de las obras de arte, adhesivos, aglutinantes, consolidantes,
cubrientes, cohesionantes, barnices y para rellenar huecos producidos por el
deterioro en objetos artísticos antiguos [6]. La amplia gama de posibilidades
de uso de estos materiales se explica por su versatilidad y la gran cantidad de
clases de polímeros. Sin embargo, debido a que fueron descubiertos durante
la revolución industrial, sólo se encuentran en objetos artísticos elaborados o
restaurados con posterioridad al siglo XIX.
Las resinas poliméricas deben reunir una serie de condiciones para su
empleo en el campo de la conservación/restauración de obras de arte. En
principio deben de ser fácilmente solubles en una serie de líquidos o
mezclas, para favorecer su aplicación como capa filmógena sobre una
superficie. Una vez en forma de barniz, deben de ser lo más estables posible
contra la radiación, la temperatura y los agentes medioambientales. En
principio se considera como una sustancia adecuada la que posee una
duración mínima de 400 años [112]. Otros factores importantes son su
elevada dureza, inercia química, propiedades físicas estables, propiedades
ópticas adecuadas, así como resistencia al amarillamiento y en general al
cambio de coloración, al resquebrajamiento y al deterioro de sus propiedades
artísticas (como barniz, aglutinante, consolidante, adhesivo, etc) [117]. Un
determinado material se selecciona, para la elaboración o restauración una
obra de arte, tras comprobar sus características y teniendo en cuenta sus
posibles inconvenientes.

1.6.2.1 Polivinilos

1.6.2.1.1 Poliolefinas y resina de hidrocarburos saturada

Las poliolefinas más simples (polietileno y polipropileno), presentan

escasa aplicación en el campo artístico, ya que resultan únicamente útiles en
el relleno de objetos inacabados, mediante extrusión, moldeado e inyección
[7].
El Kraton G se utiliza principalmente como plastificante en resinas de
Regalrez, y como aditivo para polímeros sintéticos con el objetivo de
aumentar su flexibilidad, por ejemplo para permitir el ajuste elástico de una
capa de barniz [99]. Por su parte, el Arkon P90 se utiliza como barniz en
pinturas al óleo modernas [102].

1.6.2.1.2 Resina de cumarona (indeno-benzofurano)

La resina de cumarona se utiliza para la preparación de barnices y

pigmentos, y mezclado con cloruro de polivinilo o nitrato de celulosa, para
________________________________________________________
75
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

la elaboración de capas protectoras frente al agua y los agentes químicos

[104].

1.6.2.1.3 Acetato de polivinilo

Los acetatos de polivinilo fueron los primeros polímeros sintéticos

utilizados en objetos artísticos, por ejemplo en forma de cubriente para
pinturas murales orientales como tratamiento previo a su desplazamiento
[118], debido a la dureza y durabilidad de la película protectora que
proporciona. Asimismo se utilizan como aglutinantes, adhesivos en
materiales porosos, sobre todo en madera, y como aditivos en lacas, para
aumentar el brillo, la adherencia y su resistencia a la luz [7,103,105]. En
ocasiones también se utilizan junto a otras resinas como poliacrílicos, resinas
de fenol-formaldehido, así como con plastificantes y pigmentos, mientras
que son incompatibles con los aceites vegetales [104,105].

1.6.2.1.4 Alcohol polivinílico

El alcohol de polivinilo se utiliza como adhesivo cuando se precisa de

un material soluble en agua. En los barnices forma una película muy poco
permeable al oxígeno, la cual experimenta rápidamente reacciones de
deterioro. Su principal ventaja consiste en que puede ser retirado mediante
limpieza con agua junto a posibles impurezas depositadas, y renovada
periódicamente con facilidad [119]. Por su parte, la resina de Mowital se
emplea como aglutinante, adhesivo y plastificante, así como en la
producción de lacas [99,106]. En la elaboración de vidrieras se utiliza para
depositar una película entre dos capas de vidrio [104].

1.6.2.1.5 Poliacrílicos

Los polímeros acrílicos se utilizan en el campo artístico como barnices

y como materiales de retoque, debido a su excepcional estabilidad, la
ausencia de entrecruzamientos y su nula tendencia al amarillamiento. El
homopolímero de metilmetacrilato presenta considerable inercia química,
pero no es útil en obras de arte debido a su rigidez y su elevada temperatura
de transición vítrea [120]. Por su parte, el Paraloid B72 es el más apreciado
en campo de la conservación/restauración, debido a sus propiedades
filmógenas como barniz, aglutinante, consolidante y adhesivo [121].
Algunos autores consideran que las propiedades ópticas de las
películas de poliacrílicos no son satisfactorias, debido a su bajo índice de
refracción. Esta dificultad se ha resuelto en parte con la introducción de un
polímero de fenil acrilato y metilmetacrilato [122]. Otra desventaja que
presentan es su insolubilidad en mezclas apolares como esencia de petróleo,
________________________________________________________
76
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

por lo que deben ser disueltos en líquidos con una cantidad elevada de
hidrocarburos aromáticos. Sin embargo, el poliacrílico Paraloid B67 es
soluble en disolventes polares, pero tiene una ligera tendencia a formar
entrecruzamientos y a amarillear [7].

1.6.2.2 Polímeros de condensación

1.6.2.2.1 Resinas alquídicas

Las resinas alquídicas se utilizan como barnices sobre superficies de

madera y en pinturas, principalmente como sustitutos de la mezcla
copal/aceite de linaza, debido a que sus propiedades son semejantes a las de
los aceites secantes. También se emplea en lacas, como adhesivo y aditivo,
así como en bases para esmaltes. Sin embargo, las resinas alquídicas
presentan una insolubilidad mucho mayor que los aceites secantes, por lo
que ejercen una protección más eficaz sobre la capa pictórica. Por otro lado,
esta característica hace que sea difícil retirar la capa filmógena sin dañar la
obra pictórica, por lo que no es conveniente emplearla en conservación
preventiva [7].
Los polímeros alquídic os son altamente reactivos una vez aplicados
sobre la superficie de la obra de arte, debido a la presencia de insaturaciones
en su estructura. El material experimenta una serie de procesos de oxidación
a través de sus dobles enlaces, catalizados por la luz, la temperatura y los
cationes metálicos, que conducen a la formación de entrecruzamientos, de
manera análoga al envejecimiento de los aceites secantes (apartado 1.4.4
anterior). Debido a ello se obtiene una red polimérica muy hidrofóbica,
resistente, elástica e insoluble [106].

1.6.2.2.2 Resinas epoxídicas

Las resinas epoxi constituyen una serie de materiales muy apreciados

por sus propiedades como adhesivo. En el campo de la restauración se utiliza
principalmente para la reparación de vidrio, debido su polaridad y su índice
de refracción. [7].

1.6.2.2.3 Resinas cetónicas

Los polímeros de ciclohexanona se utilizan ampliamente en barnices y

material de retoque en obras pictóricas, donde son apreciadas debido que
presentan propiedades cercanas a las de las resinas de colofonia, mastic y
dammar [7,103,104,109].
Los productos sintéticos AW2 y MS2 se emplearon principalmente
como aditivo en lacas y en aglutinantes oleosos , ya que una vez mezclados
________________________________________________________
77
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

con aceite de linaza o de tung (madera china), se obtiene un material

filmógeno con adecuada adherencia y resistencia a los agentes
medioambientales. Asimismo se utilizan mezclados con otras resinas como
cloruro de polivinilo, alquídicos y nitrato de celulosa [7,103,104,109]. En un
principio se incluyeron en recetas para la elaboración de barnices, pero
actualmente se prefieren los derivados reducidos MS2-A y MS2-B,
respectivamente, por su mayor capacidad filmógena y estabilidad frente a la
fotooxidación y al amarillamiento, debido a la ausencia de insaturaciones en
su estructura [7,109].
El Keton N se utiliza principalmente como aditivo en lacas y en la
preparación de pigmentos [99], y en ocasiones se encuentra asimismo
mezclado con aceites secantes, nitrato de celulosa y caucho sintético [104].
No obstante, no resulta adecuado para barnices de obras pictóricas [109].
La resina de Laropal A81 se utiliza en la elaboración de barnices en
obras pictóricas, así como en lacas y esmaltes para aumentar la capacidad de
relleno, la adherencia, dureza, brillo y resistencia al amarillamiento.
También se emplea como aglutinante en la preparación de pigmentos. En
ocasiones se mezcla con otro tipo de resinas para modificar sus propiedades,
principalmente para aumentar su brillo. Combinada con nitrato de celulosa,
se obtiene un material adecuado para la preparación de capas filmógenas,
que se secan rápidamente en contacto con el aire. Asimismo se utiliza como
aditivo del Tinuvin 292, para aumentar su adherencia. El Laropal A81 es
compatible con polímeros alquídicos, resinas epoxídicas y plastificantes [99,
103,110].

1.6.2.2.4 Polímeros de fenol/formaldehido

Las resinas de fenol-formaldehido se utilizan para la elaboración de

barnices en obras pictóricas debido a su resistencia a los disolventes [123], y
como adhesivo [103]. Asimismo se utilizan para la fabricación de moldes y
esmalte para horno utilizados para la elaboración de objetos. La resina
Bakelite (obtenida por condensación catalizada por álcalis) se utiliza para
imitar materiale s naturales como el ámbar, debido a su color amarillo-
negruzco. Asimismo resulta adecuada para la aplicación de capas aislantes y
como pigmento [7,103,111]. El producto resultante de la reacción catalizada
por ácidos se utiliza como sustituto del copal de Manila y de la goma laca,
así como aditivo en plastificantes y en capas filmógenas de aceites secantes
[103].

________________________________________________________
78
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.2.3 Polímeros semiorgánicos

1.6.2.3.1 Nitrato de celulosa

El polímero semiorgánico nitrato de celulosa es apreciado en el ámbito

de la conservación/restauración como capa protectora y adhesivo. Sus
propiedades adherentes se deben a la fortaleza de las interacciones
intermoleculares de los grupos polares que la componen. Asimismo presenta
la viscosidad, maleabilidad, plasticidad y reversibilidad adecuadas. Por otra
parte, el nitrato de celulosa proporciona capas filmógenas de rápido secado,
duras y quebradizas, con un elevado índice de refracción. No obstante
presenta la desventaja de ser un material poco estable, aunque tiene poca
tendencia al entrecruzamiento, por lo que al aplicarlo a un objeto se debe
tener en cuenta su necesaria sustitución en poco tiempo [112]. Algunos
expertos rechazan su uso debido a su baja resistencia ante el calor, la
radiación y las impurezas ácidas [124,125], por lo que se proponen una serie
de tratamientos sobre el producto original, como la desnitración y la
eliminación de las impurezas ácidas, así como la adición de un plastificante
adecuado [112].
El nitrato de celulosa ha sido ampliamente utilizado en arqueología,
como consolidante y adhesivo en la reparación de cerámica [126], azulejos
[127], esmaltes agrietados [127,128], marfil [128], vasijas, y materiales
porosos [127,129], y en menor medida para la reparación de vidrios [130].
De forma general la estabilidad del nitrato de celulosa, como adhesivo, es de
alrededor de 200 años, por lo que en términos de estabilidad no resulta un
material adecuado. También se utiliza en capas filmógenas de objetos
metálicos, como lacas sobre plata, hierro y barnices [125] así como para
realizar copias de la superficie de la obra de arte [112]. Al estar expuesto al
exterior, se considera que tiene una vida media de alrededor de 150 años
[112]. Por ello algunos autores desaconsejan su uso como capa protectora,
prefiriendo los polímeros de tipo acrílico para recubrir plata [131] y vidrio
[125], debido a su resistencia a la abrasión, protección contra el deslustre y
aplicabilidad.

1.6.2.3.2 Polímeros de etilsiloxano

Las resinas de polietilsiloxano se utilizan principalmente para la

preparación de esmaltes, combinadas con poliésteres, poliacrílicos y
alquídicos. Asimismo se depositan sobre la superficie de vidriados y
cerámica, para formar una capa aislante del agua.

________________________________________________________
79
 III. ANTECEDENTES. RESINAS SINTÉTICAS

1.6.3 Mecanismos de envejecimiento de resinas sintéticas

Las resinas sintéticas son materiales susceptibles de experimentar

reacciones de degradación, causadas principalmente por la luz, el calor, el
oxígeno, el agua, contaminantes medioambientales y agentes
microbiológicos. Las consecuencias de su actividad consisten principalmente
en polimerizaciones y entrecruzamientos, así como rupturas de enlaces y la
aparición de cromóforos que modifican la coloración del material polimérico
[120]. En general, los cambios químicos producidos causan la alteración de
la estructura y propiedades del polímero, como el color, brillo, solubilidad,
adhesividad, fragilidad, etc, lo que afectará al valor artístico del objeto [45].
Las reacciones de entrecruzamiento provocan un aumento de la masa
molecular media de los polímeros, disminuyendo su solubilidad, mientras
que las fragmentaciones provocarán el efecto contrario. En general, los
polímeros, cuya estructura está mantenida por enlaces carbono-carbono,
serán más estables que los polímeros de condensación. Estos últimos serán
más sensibles a los procesos de hidrólisis, que pueden afectar a los enlaces
entre monómeros y reducir el grado de polimerización de la resina sintética.
La tendencia al amarillamiento se debe a la formación de dobles
enlaces conjugados y carbonilos sobre las cadenas laterales, mediante una
serie de mecanismos catalizados por la radiación UV, o por el calentamiento
en la oscuridad [132]. Este proceso se revierte por exposición a luz, que
probablemente provoca la destrucción de los grupos cromóforos [133].
Por otra parte, las resinas sintéticas también pueden verse afectadas
por la degradación provocada por microorganismos, ya que la capacidad de
hongos y bacterias para utilizar estos materiales como fuente de carbono y
de energía, producen en general aperturas de la cadena y la descomposición
del polímero. La acción de los microorganismos está favorecida por la
humedad ambiental y el calor [45].

________________________________________________________
80
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

2. Técnicas y metodologías analíticas de caracterización

La caracterización de materiales presentes en obras de arte presenta

una gran dificultad, principalmente debido a la diversidad de materias primas
usadas en su elaboración y a los procesos de degradación, que pueden dar
lugar a un extenso número de sustancias. Asimismo, el valor histórico
habitualmente asociado a las muestras de origen artístico impone severas
restricciones respecto a la cantidad de muestra disponible para su estudio.
Sin embargo, a pesar de dichas dificultades, se ha desarrollado un extenso
número de metodologías dirigidas a la caracterización de este tipo de
materiales basadas en diversas técnicas analíticas.
La espectroscopia molecular se utiliza para el análisis de una muestra
en su conjunto, lo que permite tener una idea general acerca del tipo de
material presente en la obra de arte. Las dos principales técnicas
espectroscópicas, infrarrojos por Transformada de Fourier (FTIR) y Raman,
se basan en los movimientos vibracionales de los enlaces intermoleculares.
Su principal ventaja consiste en que se pueden estudiar y diferenciar
simultáneamente los materiales que se emplean en el campo artístico.
Las técnicas separativas permiten la resolución de una mezcla de
sustancias, por lo que se obtiene una mayor información acerca de la
composición química de la muestras. Estas técnic as están basadas en la
diferencia de diversas propiedades entre los analitos , tales como: la afinidad
entre las fases para cromatografía líquida de alta resolución, el volumen
hidrodinámico en cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), la
movilidad en un campo eléctrico en electroforesis, y la volatilidad en
cromatografía gaseosa. En este último caso se distingue entre la volatilidad
intrínseca de la sustancia y la de algún derivado, que se vaporizan tras su
introducción en el inyector o de sus fragmentos obtenidos por ruptura
térmica mediante pirólisis.
Los aceites secantes y las proteínas son analizables por las tres
técnicas separativas, mientras que para las ceras y resinas naturales se
prefiere la cromatografía gaseosa. En el caso de las resinas sintéticas se suele
emplear la pirólisis acoplada a la cromatografía gaseosa, debido la
estabilidad de las macromoléculas que las componen, así como la
cromatografía por exclusión de tamaño. Por su parte, FTIR y Raman se
pueden utilizar para la detección de la mayor parte de materiales en obras de
arte.

2.1 Espectroscopia de infrarrojo y Raman

Estas técnicas analíticas se aplican al análisis de muestras procedentes

de obras de arte debido a su versatilidad, la posibilidad de caracterizar
simultáneamente materiales de origen diverso y la posibilidad de realizar las
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81
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

medidas directamente sobre muestra sólida sin procedimientos

experimentales complejos. Se basan en la detección de grupos funcionales en
el esqueleto mole cular de las sustancias estudiadas, a partir del cual se
deduce su origen. Además se trata de herramientas útiles para el estudio de
los efectos del envejecimiento en los materiales, ya que este proceso suele
modificar la presencia de los grupos característicos de las distintas
sustancias. Estas dos técnicas se basan en parámetros físico-químicos
complementarios, por lo que su empleo combinado proporciona información
completa acerca de su estructura [134].
La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier ha sido
empleada con éxito en estudios sobre el efecto de la humedad en pigmentos
y aglutinantes [135], la degradación de aceites secantes por oxidación
térmica [51,136], y el deterioro de resinas sintéticas por ataque
microbiológico [137], así como para la caracterización de barnices,
aglutinantes y pigmentos en obras pictóricas [138], de residuos resinosos en
ánforas romanas [31], y también de ceras naturales [26,139] y resinas
fosilizadas [140] en objetos arqueológicos. Asimismo resulta una técnica útil
para la identificación de resinas sintéticas [6,141-147]. Por su parte, la
espectroscopia Raman ha sido utilizada en la detección de aceites secantes,
proteínas y resinas naturales presentes en aglutinantes y barnices [148-150],
así como en la caracterización de pigmentos [148-153] y de ceras naturales
[154], etc. Cabe resaltar su empleo como técnica analítica en la
autentificación de marfil [155] y en la determinación de la fracción orgánica
de barnices de violines [156]. Ambas técnicas pueden ser acopladas a un
microscopio con el objeto de comprobar la homogeneidad de las muestras
[148,150,153,155,157-159].

2.2 Cromatografía gaseosa

La cromatografía gaseosa (GC) es la técnica analítica más extendida

en el estudio de barnices, aglutinantes y consolidantes en general, debido a
su versatilidad, su elevada sensibilidad y a su considerable poder de
resolución, que se basa en la diferencia de volatilidad de los analitos. La
instrumentación utilizada para la cuantificación son el detector de ionizació n
de llama (FID), y el Espectrómetro de masas (MS). Este último es el más
empleado en la actualidad, debido a que tiene la capacidad añadida de
proporcionar el espectro de masas, que permite la identificación de los
analitos sin tener que recurrir necesariamente a patrones. La muestra se
puede introducir disuelta en un disolvente adecuado, en cuyo caso los
analitos se volatilizan en el inyector, o en forma sólida, mediante la
introducción de la muestra en un pirolizador, donde los fragmentos
obtenidos por la ruptura térmica entran en el sistema cromatográfico en fase
gaseosa.

________________________________________________________
82
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

2.2.1 Vaporización en inyector

La aplicación de la cromatografía gaseosa precisa habitualmente de

una etapa previa para obtener derivados volátiles y térmicamente estables de
los compuestos presentes en la muestra. Los procedimientos de
derivatización más habituales están basados en el empleo de esterificantes
como el cloroformiato de etilo [74,160-166] o de metilo [9,85],
diazometano [53,93], trifluoruro de boro [167-169], metanólisis ácida [170],
hidróxido de trimetilamonio (TMAH) [77,171], anhídrido trifluoroacético
[152,165], trimetilsulfonio [172] y agentes sililantes como
bistrimetilsililacetamida (BSA) [169], la N-t-butilmetil-silil N-metil
trifluoroacetamida (MTBSTFA) [18,138,173], bis-trimetil-silil-
trifluoroacetamida(BSTFA) [18,21,23,26,31,32,35,39,75,173,174], el
hexametildisilazano (HMDS) [152,174] y trimetilsililimidazol [175].
Así la GC ha sido aplicada con éxito en la caracterización de
numerosos componentes de capas pictóricas y barnices de las obras de arte,
como los aglutinantes lipídicos [18,32,138,154,163,164,176], proteínas
[138,154,161-163,176], ceras [21,23,171], ácidos biliares [166],
polisacáridos [154], ámbar [177], oleogomorresinas [178,179], resinas
diterpénicas [74] y triterpenoides [53,77,86,93]. Es de resaltar su aplicación
al estudio del proceso de envejecimiento de materiales tales como cera de
abeja [26], aceites [39,165,168,169,173,180], diterpenoides [75,175], resinas
triterpénicas [85] presentes en barnices, así como en el desarrollo de un
método para la supresión de la interferencia de los pigmentos en la
determinación de aminoácidos [160]. Como consecuencia de este amplio
estudio se ha podido establecer la caracterización de muestras procedentes
de objetos arqueológicos: aceites secantes, cera de abeja, resinas diterpénicas
y taninos en momias egipcias embalsamadas de la época ptolemaica [174],
restos de resinas en ánforas romanas [9,31], cera de abeja en recipientes de
cerámica griega [35], así como resinas y colorantes procedentes de barnices
de violines renacentistas [65].

2.2.2 Pirólisis previa

La pirólisis-GC es una modificación de la cromatografía gaseosa, que

consiste en la inclusión previa de una etapa en línea (on-line) que origina la
ruptura térmica de la muestra, tras la cual los productos pirolíticos formados
se introducen en el sistema cromatográfico, por lo que resulta especialmente
útil cuando la muestra se compone de macromoléculas de elevado peso
molecular [181]. Una de las ventajas que presenta es la ausencia de
tratamientos previos largos y laboriosos, dado que la fragmentación se puede
efectuar directamente sobre la muestra sólida. Sin embargo, es aconsejable
bloquear los grupos polares liberados tras la fragmentación mediante una
reacción de derivatización. Así pues, la mayoría de los métodos aplicados
________________________________________________________
83
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

están basados en el empleo de hidróxido de trimetilamonio (TMAH)

[41,77,80,82-84,94,143,182,183], aunque diversas dificultades como
reacciones secundarias que pueden dar lugar a polialquilaciones,
degradaciones, isomerizaciones y compuestos nitrogenados, así como la nula
reactividad con grupos hidroxilo [184], han favorecido el uso de otros
modificadores como el hexametildisilazano (HDMS) [23,85,185-187],
hidróxido de trimetilsulfonio [188,189] y el hidróxido de
trifluorometilfeniltrifenilamonio (TMTFTH) [77,190]. No obstante, también
se han desarrollado métodos analíticos en los que se propone no realizar
ninguna modificación química de los fragmentos [22].
La pirólis is-GC/MS ha resultado una herramienta analítica útil para el
desarrollo de metodologías dirigidas a la caracterización de aglutinantes
oleosos [143,182,188-190], ceras [22,23], resinas diterpénicas [80,185,186],
triterpenoides [77,85], ámbar báltico [191] y polímeros acrílicos [187]
procedentes de obras artísticas, así como para realizar estudios acerca de la
degradación de los aceites secantes [41,183] y compuestos diterpenoides
[82-84, 94].
Esta técnica analítica resulta adecuada para la caracterización de
resinas sintéticas, ya que los polímeros no pueden ser analizados
directamente por cromatografía gaseosa, debido a su baja volatilidad, y la
ruptura por ataque químico presenta menor reproducibilidad que la
fragmentación térmica. En ese sentido es de destacar los estudios realizados
por T. Learner et al. acerca de la identificación de polímeros empleados en
obras de arte, como acetato de polivinilo, poliacrílicos, alquídicos y nitrato
de celulosa [108,141]. Asimismo, la pirólisis-GC se ha empleado para la
caracterización de resinas cetónicas [193] y de urea/formaldehido [193],
polímeros fenol/formaldehido y epoxídicos [194], así como resinas
organosilícicas [195]. Por otra parte, ha permitido la identificación de
polímeros sintéticos empleados en la restauración de murales pintados por
Giotto, en la Iglesia de Scrovengi (Padua, Italia), donde se detectó
poliestireno, resina acrílica, acetato de polivinilo, y polifluoropolímero. La
presencia de este último no había sido detectada anteriormente en
restauración, mientras que no se encontraron indicios de
poliisobutilmetacrilato [196].

2.3 Electroforesis capilar

La electroforesis capilar basa su poder resolutivo en la diferencia de

movilidad de los analitos bajo la influencia de un campo eléctrico, en un
medio tamponado. Su principal ventaja consiste en la posibilidad de trabajar
con reducida cantidad de muestra.
Esta técnica se ha aplicado con éxito para la caracterización de aceites
secantes [197] y proteínas [198,199] empleados en obras de arte, mediante
detección conductimétrica sin derivatización previa. Por otro lado, también
________________________________________________________
84
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

ha resultado útil para la identificación de ácidos diterpenoides con detector

de fluorescencia, mediante una derivatización previa con 4-bromo-7-
metilcumarina [200].

2.4 Cromatografía líquida de alta resolución

La cromatografía líquida de alta resolución es una eficaz técnica

separativa, basada en la diferencia de afinidad de los analitos en la columna
y la fase estacionaria, a partir de la cual se han desarrollado numerosas
metodologías dirigidas al estudio analítico de muestras de origen diverso. Su
principal ventaja consiste en la elevada cantidad de variables que influyen en
su poder separativo (clase de columna, disolventes en la fase móvil, uso de
gradientes, temperatura, etc) y que pueden ser optimizadas hasta alcanzar
una resolución adecuada entre los analitos de la mezcla. Asimismo, para la
cuantificación existe la posibilidad de emplear un amplio abanico de
detectores basados en la medida de propiedades muy diversas, obtenidas
mediante espectroscopia molecular (UV-Visible, fluorescencia, resonancia
magnética nuclear (RMN), etc), espectrometría de masas (MS),
electroquímica (conductimetría, voltamperometría), quimioluminiscencia y
la desviación del camino óptico (detector evaporativo de luz dispersiva
(ELSD), índice de refracción (RI)).
La cromatografía líquida es la técnica analítica más extendida en la
identificación de aminoácidos. Debido a su importancia y amplia presencia
en la naturaleza, se han desarrollado numerosas metodologías dirigidas a su
diferenciación y cuantificación. A causa de la interacción de los analitos con
los protones, habitualmente se propone el empleo de un tampón en la fase
móvil. Esta técnica analiza se utiliza asimismo para la separación de ácidos
grasos, basándose en la diferencia de hidrofobicidad debido a las diferencia
de longitud de cadena y de insaturaciones.

2.4.1 Cromatografía líquida con detector de ultravioleta visible

En el campo del estudio de obras de arte la cromatografía líquida se

emplea principalmente en la identificación de pigmentos orgánicos, ya que
debido a sus propiedades colorantes, éstos son directamente cuantificables
por UV-Visible con elevada sensibilidad [138,201-203].
La detección de aminoácidos mediante la absorción UV-Visible ha
sido desarrollada en diversas metodologías [253,254,255], pero
generalmente se prefiere utilizar la fluorescencia, dada la mayor sensibilidad
que proporciona.
Algunos métodos analíticos proponen la determinación de ácidos
grasos mediante la HPLC-UV-Visible. En este caso, se precisa una reacción
de derivatización de los analitos con agentes cromóforos, para aumentar la
sensibilidad y permitir su detección. Las metodologías más extendidas están
________________________________________________________
85
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

basadas en reactivos como el p-nitrobencilsulfonato, 3,5-dinitrofenil

sulfonato, 2-(ftalimino)etil p-toluensulfonato [213], todos éstos precisan
tiempos de derivatización superiores a los sesenta minutos; á-
bromoacetofenona [214-217], á,p-dibromoacetofenona [215,216], bromuro
de p-nitrobencilo [215] y p-metoxianilina [218] , éste último que requiere la
previa formación del cloruro del ácido carboxílico. Asimismo se emplean
otros derivatizantes, como el bromuro de p-fenilazofenazilo [219] y la
nitrofenilhidazina [220-223], un agente cromóforo muy utilizado en el
estudio de ácidos carboxílicos porque proporciona un rendimiento elevado
de la reacción y límites de detección del inferior al nanomolar [220].

2.4.2 Cromatografía líquida con detector de fluorescencia

Numerosos métodos de análisis de ácidos grasos sugieren el empleo de

HPLC-Fluorescencia como técnica de identificación y cuantificación. En
este caso, los analitos deben ser previamente modificados con compuestos
fluorógenos, que pueden acoplarse por reacción con los grupos carboxilo ,
debido a la baja sensibilidad intrínseca que proporcionan aquellos. En ese
sentido, es de señalar el completo estudio realizado por Toyo’oka et al.
acerca del empleo y las propiedades de una amplia colección de
derivatizantes fluorescentes aplicados en el análisis de ácidos grasos por
HPLC-fluorescencia. [224]. Los más utilizados se subdividen en compuestos
de diazometano, hidrazinas, aminas, alcoholes, sulfonatos y alquilderivados:
a) Diazometano. El 9-(diazometil)antraceno (ADAM) [225] es un
reactivo ampliamente utilizado como derivatizante fluorescente, debido a la
elevada sensibilidad que proporciona (del orden de picomolar). No obstante,
tiende a formar productos secundarios y se descompone con facilidad, por lo
que se prefiere el 1-pirenildiazometano (PDAM) que posee más estabilidad
aunque sus derivados son menos fluorescentes [224].
b) Hidrazinas. El uso de reactivos como el 7-(dietilamino)
cumarin-3-carbohidrazina (DCCH), 5,6-dimetoxi-2-(4’hidrazinocarbonil
fenil)benzotiazol (BHBT-Hz) [226], 2-(5-hidrazinocarbonil-2-furil)-5,6-
metilendioxibenzofurano (FM-Hz) [227] y 2-(5-carbonil-2-oxazolil-5,6-
metilendioxibenzofurano (OM-Hz) [228], proporciona sensibilidades del
orden de picomolar, aunque se emplean habitualmente para el análisis de
ácidos grasos de cadena corta.
c) Aminas y alcoholes. Los reactivos más utilizados como agentes
fluorescentes son las aminas 9-aminofenantreno (9-AP) [229] y dansil
cadaverina (DNS-CD) [230], así como los alcoholes 9-(2-
hidroxietil)carbazol [231], 9-(hidroximetil)antraceno (HMA) [224] y (4-
piridil)-2-tiofenmetanol (PTM) [228]. Sin embargo, dada la baja reactividad
intrínseca de estos agentes, se debe incluir una etapa de activación del grupo
carboxilato, consistente en la obtención del haloderivado del ácido graso
[224].
________________________________________________________
86
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

d) Sulfonatos. La reacción de derivatización está basada en el

desplazamiento del grupo sulfonato por parte de los analitos. Los más
habituales en el análisis de ácidos grasos por HPLC-Fluorescencia son el 2-
(2,3-naftalimino)etil trifluorometansulfonato (NE-OTf) [232] y el 2-(2,3-
antracendicarboxidiimida)etil trifluorometansulfonato (AE-Tof) [233].
e) Haloalquilados. Los derivatizantes más habituales son los reactivos
bromoalquilados, de los cuales existe una amplia gama y se utilizan para el
estudio de una gran variedad de compuestos con grupos carboxilo (ácidos
grasos alifáticos y aromáticos, herbicidas, barbituratos, drogas y
prostaglandinas). Los reactivos principales son las quinoxalinonas, como 3-
bromometil-6,7-dimetoxi-1-metil-2(1H)-quinoxanilona (Br-DMEQ) [234] y
3-bromometil-6,7-dimetoxi-1-metil-2(1H)-quinoxalinona (Br-MMEQ)
[235], así como las cumarinas 4-bromometil-7-acetoxicumarina (Br-MAC)
[234], 3-bromoacetil-7-metoxicumarina (Br-AMC) [236], 3-bromoacetil-6,7-
dimetoxicumarina (Br-AMDC) [237], y 4-bromometil-7-metoxicumarina
(Br-Mmc) [238,239,240,241,242,243]. Para todos ellos, la etapa clave de la
reacción es el desplazamiento del bromuro por el carboxilato en medio
básico. El uso de Br-Mmc está descrito en numerosos estudios relativos a los
ácidos carboxílicos, a causa de la cuantitatividad de la reacción, el bajo
límite de detección (del orden de picomolar), la elevada sensibilidad y el
amplio intervalo dinámico lineal [222,242].
La detección de fluorescencia es la más utilizada para la cuantificación
de los amonoácidos. No obstante, dichos analitos no presentan propiedades
fluorescentes, por lo que se modifican para formar un aducto cuantificable.
Se han desarrollado numerosos métodos de derivarización, que utilizan
como agentes fluorescentes una gran variedad de reactivos:
a) Cloruro de carbazol-N-(2-metilacetilo) (CMA-Cl). Este reactivo
reacciona con rapidez con los aminoácidos para formar derivados muy
estables [256].
b) 4-Fenantrolina (fanquinona). Este agente fluorescente proporciona
un amplio intervalo de linealidad, pero tiene un tiempo de derivatización
muy largo, del orden de 60 minutos [257].
c) Isocianato de 7-[(N,N-dimetilamino)sulfonil]-2,1,3-benzoxadiaxol-
4-ilo (DBD-NCS). Los derivados formados presentan elevada sensibilidad,
pero la reacción incluye un proceso de oxidación, lo que incrementa la
incertidumbre del método [258].
d) 6-Amino-quinolil-N-hidroxisuccininidilcarbamato (AQC).
Proporciona límites de detección del orden de nanomolar [259].
e) Naftalen-2,3-dicarboxaldehido (NDA). Este derivatizante
proporciona derivados estables con un límite de detección deel orden de
picomolar, aunque experimentan rápidos procesos de degradaciónlinealidad
de dos órdenes de magnitud [260,261].
f) Cloroformiato de 2-(9-carbazol)etilo (CEOC). Reacciona
rápidamente y proporciona elevada sensibilidad, aunque en la resolución
________________________________________________________
87
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

cromatográfica se observan interferencias entre los derivados de ácido

aspártico e histidina, por un lado, y lisina y tirosina por otro [262].
g) Cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (FMOC-Cl). Reacciona
rápidamente en medio básico con aminas primarias y secundarias dando
lugar a derivados estables, proporciona límites de detección del orden de
nanomolar e intervalo dinámico lineal con tres órdenes de magnitud, aunque
forman derivados poco estables con cisteína, histidina y tirosina
[212,263,264]
h) O-ftalaldehido (OPA). Se trata del reactivo cuyo uso se encuentra
más extendido para el análisis de aminoácidos. El OPA forma derivados en
medio básico con aminas primarias a temperatura ambiente, con rapidez y
cuantitatividad. Asimismo proporciona límite de detección del orden de
nanomolar, intervalo lineal de tres órdenes de magnitud y resolución de la
totalidad de los derivados sin interferencias en condiciones no agresivas para
las columnas. Por otro lado, no forma derivados estables con la cisteína ni
con aminoácidos secundarios [265,266-271]. Sin embargo, se han
desarrollado diversos métodos analíticos adecuados para la determinación de
aminoácidos con grupos tiol [272, 273], mientras que algunos autores
proponen el empleo combinado de OPA/FMOC para la determinación
conjunta de aminoácidos primarios y secundarios [263].

2.4.3 Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

El espectrómetro de masas como detector en HPLC proporciona

información sobre los analitos tanto cuantitativa, a través de la abundancia
de los iones obtenidos, como cualitativa, ya que el espectro de masas facilita
la identificación de los compuestos. Esto representa una gran ventaja
respecto a los detectores de UV-Visible y fluorescente, que únicamente
proporcionan datos cuantitativos.
El análisis de compuestos diterpénicos mediante HPLC presenta una
gran dificultad, debido a la similar hidrofobicidad de los diferentes isómeros
de los diterpenoides. Sin embargo, se emplea habitualmente para la
determinación de la cantidad total de ácidos resínicos en análisis
medioambiental, utilizando un detector de espectrometría de masas
[204,205].
La cromatografía líquida ha sido de utilidad para la separación de
compuestos termolábiles, no analizables por cromatografía gaseosa, como es
el caso de intermediarios generados durante el envejecimiento de aceites
secantes y terpenoides [53,81,95]. Por otra parte, también se ha utilizado la
HPLC con detector UV-Visible y acoplado a un espectrómetro de masas
para la identificación de triterpenoides en muestras frescas y envejecidas
[53,81].
El espectrómetro de masas como detector es de gran utilidad debido a
su versatilidad, ya que permite la cuantificación directa de ácidos
________________________________________________________
88
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

carboxílicos sin necesidad de derivatización previa [205,223,244-248], y se

utiliza con fines cualitativos para la determinación estructural de los aductos
formados ácido graso-derivatizante [214] y como elemento confirmativo,
complementario a otro detector no destructivo [217,243].
Por otra parte, diversas metodologías proponen el uso de la
espectrometría de masas para la identificación de los aminoácidos. Al ser
directamente detectables con suficiente sensibilidad, no se precisa de una
etapa previa de derivatización. En estos casos se suelen utilizar, para la
separación, fases móviles con disolventes orgánicos (contaminantes) que se
volatilizan en el nebulizador enviándose directamente a la atmósfera.
Además, en la detección se identifican los aductos entre los aminoácidos y
los protones, y en ocasiones con moléculas de la fase móvil (amino, agua,
acetonitrilo, etc), así como iones resultantes de la fragmentación de los
aminoácidos. Así pues, estos procesos complican los espectros de masas
obtenidos y provocan un aumento del límite de detección. Los modos de
ionización más habituales son por ionspray (I.S.P.) [274-277] y por
electronebulización (electrospray, E.S.I.) [255,275,276,278,279]. No
obstante, en ocasiones se recurre a una etapa de modificación previa de los
aminoácidos, con el objetivo de aumentar la sensibilidad [280]. Igualmente
esta técnica de detección se emplea para evaluar las características de los
aductos aminoácido-modificador [261,262],

2.4.4 Cromatografía líquida acoplada a otros detectores

El detector electroquímico se considera otra alternativa válida para la

cuantificación de ácidos grasos. Algunas metodologías de análisis proponen
una medida indirecta de la señal, mediante la introducción de algún
catalizador electroquímico en la fase móvil, lo que evita la necesidad de una
derivatización previa [249,250]. En ocasiones se propone tratamiento previo
de los analitos con algún reactivo electroactivo para aumentar la
sensibilidad, empleándose para ello derivatizantes como p-aminofenol [251]
y 3-bromoacetil-1,1’-dimetilferroceno [252].
La detección de aminoácidos a través de las propiedades
electroquímicas ha sido sugerida en numerosas metodologías. Para aumentar
la sensibilidad se propone una reacción previa de derivatización con
reactivos electroactivos, como el o-ftalaldehido [281,282,283,284], 6-
aminoquinolilurea [285], aunque desaconsejado por que precisa el empleo de
benceno en la etapa de derivatización, fenilisocianato [254] y p-N,N-
dimetilaminofenilisotiocianato [286]. Por otro lado, para evitar la etapa de
derivatización y aumentar la robustez y reproducibilidad del método, se
utilizan electrodos modificados con cobre [287] o con un aminoácido-
oxidasa [288]. Esta última presenta además mayor selectividad, debido a la
especificidad de los enzimas.
Asimismo se proponen diversas metodologías de análisis de
________________________________________________________
89
 III. ANTECEDENTES. TÉCNICAS ANALÍTICAS

aminoácidos que no precisan de modificación previa, empleando detectores

de quimioluminiscencia, dispersión de luz por evaporación, resonancia
magnética nuclear (RMN), conductividad e índice de refracción (RI) [255].

2.5 Cromatografía por exclusión de tamaño

La cromatografía por excusión de tamaño es una técnica separativa

cuya capacidad de resolución se basa en la diferencia de tamaño de las
moléculas de los analitos (volumen hidrodinámico). Su uso se encuentra
extendido en el ámbito del estudio de materiales poliméricos para establecer
la distribución de masas moleculares. En resinas sintéticas se ha empleado
para el análisis de acetato de polivinilo [206] , alcohol polivinílico [207],
polímeros acrílicos [208], alquídicos [209], nitrato de celulosa [210], así
como de una mezcla de policiclohexanonas y de resinas urea-formaldehido
presentes en barnices aplicados en procesos de restauración [211].
En el campo del estudio de obras de arte resulta muy útil para evaluar
los mecanismos de crecimiento de la red polimérica durante el
envejecimiento de aceites secantes [51], resinas diterpénicas [41,84],
triterpenos [53, 54, 93], así como en poliacrilatos [107].

________________________________________________________
90
IV. PARTE EXPERIMENTAL

91
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS

En este Capítulo se expone una descripción general de los materiales

(patrones, muestras procedentes de obras artísticas e instrumentación), y los
procedimientos experimentales aplicados para el estudio analítico de los
compuestos descritos en el Capítulo anterior y alcanzar los objetivos
propuestos para la presente Tesis. El trabajo realizado se distribuye de la
siguiente forma: caracterización de proteínas por HPLC-Fluorescencia,
diferenciación de ceras naturales mediante GC, identificación de aceites
secantes por HPLC-UV-Visible y Fluorescencia, caracterización de
aglutinantes proteicos y oleosos por espectrometría de masas directa, estudio
de compuestos orgánicos en barnices de violines mediante GC/MS y
caracterización de resinas sintéticas mediante FTIR y Py-GC/MS.

1. Desarrollo de un método analítico para la caracterización de

proteínas empleadas como aglutinantes en obras de arte pictóricas
mediante cromatografía de líquidos con detector de Fluorescencia

La metodología experimental descrita a continuación se propone para

la diferenciación entre diversas proteínas ampliamente utilizadas en el
campo artístico (gelatinas bovina y porcina, huevo, albúmina y caseína), a
partir de la cantidad relativa de aminoácidos, y su caracterización en
muestras procedentes de obras de arte. En primer lugar se sugirió una
reacción de derivatización de los analitos para aumentar la sensibilidad, y se
optimizaron las condiciones de HPLC para la separación de los derivados
obtenidos. Posteriormente, se establecieron las condiciones de
descomposición de la proteína y extracción de los aminoácidos, los cuales
fueron derivatizados y cuantificados por HPLC-Fluorescencia. Los datos
obtenidos de proporción relativa de cada aminoácido se tratan mediante
estudio quimiométric o para la caracterización de las proteínas.

1.1 Reactivos y disolventes

Los siguientes reactivos y disolventes se emplearon en el tratamiento

previo de la muestra: o-ftalaldehido (OPA) (para análisis, Carlo Erba, Val de
Reuil, France), 2-mercaptoetanol (2-ME) (para análisis, Carlo Erba) (estos
reactivos se almacenaron a -20ºC), etilendiamintetraacetato disódico
(Na2 EDTA) disuelto en tampón de amoníaco y cloruro de amonio a pH=9
(Probus, Barcelona, España), ácido bórico (para análisis, Panreac, Barcelona,
España), ácido clorhídrico (HCl) 37% para análisis (Scharlau, Barcelona,
España), hidróxido de potasio (KOH) (para análisis, Merck, Darmstadt,
Alemania) y metanol (para análisis, Fischer Chemical, Loughborough, UK).
El agua empleada (grado nanopure II) se generó en el laboratorio con un
equipo de producción de agua nanopure (Sybron-Barnstead, Dubuque, IA,
________________________________________________________
93
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS

USA).
Las disoluciones se preparan de la forma siguiente: 100 mg de OPA y
1,25 mL de 2-ME en 25 mL de metanol (OPA/2-ME) (esta disolución se
almacena a – 20ºC en oscuridad, bajo estas condiciones es estable durante
una semana). Por su parte, el tampón que forma el medio de reacción se
preparó disolviendo 6,194 g de ácido bórico y 6,524 g de hidróxido de
potasio en 200 mL de agua nanopure, y ajustando el pH a 10,4 mediante la
adición de ácido clorhídrico concentrado.
Las fases móviles empleadas para la separación cromatográfica se
prepararon de forma siguiente:
- Eluyente A: se disuelven 6,084 g de acetato de sodio (para análisis,
Panreac) en un litro de agua nanopure, ajustando el pH a 5,8 mediante la
adición de ácido acético glacial (pureza 99,99%, Aldrich, Steindhem,
Alemania). Posteriormente se añadieron 50 mL de tetrahidrofurano (THF)
(grado HPLC, Carlo Erba)
- Eluyente B: metanol (grado HPLC, Carlo Erba).

1.2 Patrones y sustancias de referencia

Los siguientes aminoácidos (AA) patrón se utilizaron para el estudio

analítico: alanina (ala), arguinina (arg), asparagina (asn), ácido aspártico
(asp), glutamina (gln), ácido glutámico (glu), cisteína (cys), glicina (gly),
histidina (his), isoleucina (ile), leucina (leu), lisina (lys), metionina (met),
fenilalanina (phe), prolina (pro), 4-hidroxi-prolina (4-OH-pro), serina (ser),
treonina (thr), triptófano (trp), tirosina (tyr) y valina (val). Todos ellos fueron
grado GC y adquiridos de Sigma (Saint Louis, Missouri, USA). Las
disoluciones de aminoácidos se prepararon disolviendo la cantidad adecuada
de patrón en HCl 0,1 mol.L-1 .
Para el estudio analítico se seleccionaron las siguientes proteínas
patrón: caseína, albúmina, gelatina de vaca y de cerdo, (Sigma) y proteína de
huevo, que se corresponden con los aglutinantes proteicos más habituales en
témpera y temple. La proteína de huevo se preparó en el laboratorio
mezclando la clara y la yema, y la mixtura obtenida sobre un portaobjetos, el
cual se irradia con una lámpara fluorescente OSRAM L36/37 a 350-400 nm
y 36 W durante cuatro horas a 12 cm. Por otra parte, se prepararon de la
misma forma dos portaobjetos con clara y yema de huevo por separado.

1.3 Descripción de muestras procedentes de obras de arte

Las muestras reales se obtuvieron, con un escalpelo, a partir de la

superficie de las siguientes obras pictóricas:

Muestra 1. Retablo de San Miguel, 1542, Vicente Maçip (Catedral de Valencia)

________________________________________________________
94
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS

(mostrada en la Figura 10 A en la página 131).

Muestra 2. Tríptico de la Magdalena, siglo XVI, Maestro de Alzira (Figura
38 A, página 187).
Muestra 3. Altar de Cinctorres, siglo XVI, atribuido a Bernat Serra (Figura
38 B, página 187).
Muestra 4. Altar del Muro de Alcoi, siglo XVII, Jerónimo Rodríguez de
Espinosa (Figura 10 B, página 131).

1.4 Instrumentación

Los análisis cromatográficos por HPLC-Fluorescencia se lle varon a

cabo utilizando un Cromatógrafo líquido Modelo 1100 (Agilent
Technologies, Waldbronn, Alemania) equipado con un inyector manual
(bucle 20 ìL), una bomba cuaternaria, desgasificador de vac ío on-line, horno
para la columna y un detector de fluorescencia. El software utilizado para
controlar al equipo y visualizar los resultados fue “Agilent Chemstation, for
LC, Rev. A 09.03-847”.
La resolución de la mezcla de los ácidos grasos se llevó a cabo en una
columna Zorbax XBD-C18 (longitud 15 cm, diámetro interno 4,6 mm, 5 ìm
de tamaño de partícula, tamaño de poro 80 Å, superficie 180 m2 /g,
temperatura máxima 60ºC, intervalo entre 2 y 9, extremo doblemente
encapsulado y carga de carbono 10 %), con una precolumna con el mismo
relleno, fijando la temperatura a 30ºC. La composición de la fase móvil se
modifica según el gradiente mostrado en la Tabla 4, circulando a 1 mL.min -1 .
Las longitudes de onda de excitación y de emisión se fijaron en 340 nm y
450 nm, respectivamente [271].

Tabla 4. Programa del gradiente cromatográfico y protocolo de limpieza.

tiempo (min) eluyente A eluyente B
0 90 10
12 72 28
gradiente para 20 70 30
la resolución 22 65 35
31 63 37
35 53 47
38 45 55
50 35 65
protocolo de 52 0 100
limpieza 58 0 100
60 90 10

1.5 Tratamiento previo de muestras y patrones

En primer lugar, las muestras se hidrolizaron para romper los enlaces

peptídicos y descomponer el biopolímero proteínico. Los aminoácidos

________________________________________________________
95
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS

obtenidos se derivatizan con el propósito de formar los derivados detectables

por Fluorescencia. La mezcla resultante se introdujo en el sistema
cromatográfico para la separación y cuantificación de los analitos.

1.5.1 Hidrólisis de las proteínas

La muestra sólida (0,5-1 mg), procedente de patrones o extraídas de

obras pictóricas, se introdujo en un minivial de 0,3 mL hecho de vidrio
resistente al calor y a la presión, y con tapón fuertemente enroscado para
evitar el escape de compuestos de su interior (Supelco, Bellofonte, PA,
USA) y fue tratado con ácido clorhídrico 12 mol.L-1 durante 24 horas a
110ºC [162]. A continuación se evaporó el disolvente, y el residuo sólido se
redisolvió en 0,25 mL de ácido clorhídrico 0,1 mol.L-1 , agitando para
favorecer la disolución de los aminoácidos. Esta operación se repitió tres
veces, reuniendo posteriormente los extractos en un tubo Pyrex. Tras el
secado a 70ºC, el sólido obtenido se redisolvió en 0,2 mL de ácido
clorhídrico 0,1 mol.L-1 . Sobre esta disolución se efectuó la reacción de
derivatización.

1.5.2 Procedimiento de derivatización

En un tubo Pyrex se introdujeron 0,2 mL de la mezcla de aminoácidos,

0,1 mL del tampón borato y 0,4 mL de la disolución de OPA/2-ME [271].
Tras agitación durante cuatro minutos, la mezcla se hizo pasar a través de un
filtro de Nylon de tamaño de poro 0,45 ìm, e inmediatamente una al ícuota
de 20 ìL se inyect ó en el sistema cromatográfico.
Con el objetivo de suprimir la influencia de los pigmentos sobre la
cuantificación de los aminoácidos, se repitió el procedimiento, pero
utilizando 0,2 mL de la disolución de Na2 EDTA a pH=9, en vez de ácido
clorhídrico 0,1 mol.L-1 como disolvente para los analitos. El reactivo
añadido secuestra los cationes metálicos, que ya no interferirán en la
determinación de los aminoácidos [160]. Este tratamiento se empleó
únicamente con las muestras procedentes de obras pictóricas.

________________________________________________________
96
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. CERAS NATURALES

2. Desarrollo de una metodología analítica para la caracterización de

ceras naturales en obras pictóricas a partir de su contenido en ácidos
grasos e hidrocarburos mediante cromatografía gaseosa

El método analítico que se detalla a continuación permitió la

diferenciación de las ceras naturales más habituales en muestras de interés
artístico y arqueológico (cera de abeja, carnauba, ceresina), a partir de la
cantidad relativa de alcanos lineales y ácidos grasos, y su caracterización en
una muestra procedente de una obra pictórica. Inicialmente se propuso un
procedimiento de derivatización de los grupos carboxílicos, con el objetivo
de incrementar su volatilidad, y se establecieron las condiciones de GC para
la resolución de los ácidos grasos e hidrocarburos. Posteriormente, se
sugirieron las condiciones de hidrólisis de las ceras, y la extracción de los
analitos. La mezcla obtenida se analiza por GC por el método analítico
propuesto, tras lo que se determina la cantidad relativa de cada ácido graso e
hidrocarburo. El tratamiento estadístico aplicado a los resultados obtenidos
permitió diferenciar de cada cera natural patrón, y su identificación en la
muestra extraída de una obra pictórica.

2.1 Reactivos y disolventes

Los siguientes reactivos y disolventes se utilizaron para el tratamiento

previo de las muestras: cloroformiato de etilo (ECF, pureza >98%, Fluka,
Buchs, Suiza), piridina absoluta (Fluka), ácido clorhídrico 37% para análisis
(Scharlau), bicarbonato sódico para análisis (NaHCO3, Panreac), cloroformo
(CHCl3 , pureza >98%, Fischer), etanol absoluto para análisis (Fischer),
acetona (grado HPLC, Carlo Erba). El agua empleada (grado nanopure II) se
generó en el laboratorio con un equipo de producción de agua nanopure
(Sybron-Barnstead, Dubuque, IA, USA).
Las disoluciones utilizadas se prepararon de la siguiente manera: se
mezclan 0,1 mL de ECF en 10 mL de CHCl3 en un tubo Pyrex
(1%ECF/CHCl3 ), y se disuelve bicarbonato de sodio en agua hasta
saturació n (NaHCO3 /agua)

2.2 Patrones y sustancias de referencia

Los siguientes patrones de hidrocarburos (abreviados CiH) se

emplearon para el estudio analítico propuesto: n-eicosano (C20H, pureza
>97%), n-heneicosano (C21H,>98%), n-docosano (C22H, >98%), n-
tricosano (C23H, >98%), n-tetracosano (C24H, >99%), n-pentacosano
(C25H, >99%), n-hexacosano (C26H, >99%), n-heptacosano (C27H, >99%),
n-octacosano (C28H, >98%), n-nonacosano (C29H, >99%), n-
hentriacontano (C30H, >99%), n-tritriacontano (C33H, >99%), n-
________________________________________________________
97
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. CERAS NATURALES

tetratriacontano (C34H, >97%), n-pentatriacontano (C35H, >99%), todos

ellos reactivos patrón para GC y suministrados por Fluka, así como n-
triacontano (C30H, >99%) y n-dotriacontano (C32, >97%), estándar para
GC, y adquiridos de Sigma. Se preparó asimismo una disolución que
contiene 1 mmol.L-1 de cada hidrocarburo en cloroformo.
Los ácidos grasos (FA) patrón que se enumeran a continuación se
utilizaron para el estudio analítico: ácido mirístico (C14), palmítico (C16),
esteárico (C18), araquídico (n-eicosanoico, C20), behénico (n-docosanoico,
C22), lignocérico (n-tetracosanoico, C24), todos ellos pureza 99% para GC
(Aldrich), así como ácido oleico (C18:1, pureza GC, Fluka), y ácido cerótico
(C26, pureza >95). Se preparó una disolución de 1 mmol.L-1 de cada ácido
carboxílico disolviendo la cantidad adecuada en etanol, seguido de
calentamiento para favorecer la disolución de los analitos más hidrofóbicos
(lignocérico y cerótico).
Los patrones de ceras naturales seleccionados para el estudio analítico
fueron: cera de abeja (origen animal), carnauba (vegetal) y ceresina
(mineral), obtenidas en forma sólida a partir de RCM (Productos de
conservación, Barcelona, España).
Con el objetivo de evaluar la influencia de la degradación de las ceras
naturales en su caracterización, éstas se sometieron a un tratamiento de
envejecimiento acelerado por irradiación UV. Para ello se disolvió la
muestra sólida en cloroformo, y se extendió posteriormente sobre un
portaobjetos, el cual se irradió empleando una lámpara OSRAM L36/37 a
350-400 nm y 36 W, durante cuatro semanas a una distancia de 12 cm [18].

2.3 Descripción de la muestra extraída de una obra de arte

La muestra real se obtuvo a partir de la superficie de una obra pictórica

de Carmen López (México) en 2003 (Muestra 5), perteneciente al Instituto
de Restauración del Patrimonio , Universidad Politécnica de Valencia. Se
trata de una oleorresina en tabla de 20 x 20 cm. La toma de muestra se
realiza por triplicado, en el ángulo de la pintura, donde se encuentra
mezclada con un pigmento rojo.

2.4 Instrumentación

La instrumentación utilizada fue un cromatógrafo gaseosa Hewlett-

Packard 6890 (Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA), con detector de
ionización de llama. La temperatura del inyector se mantiene a 250ºC,
mientras que la del detector se fijó en 300ºC. La separación cromatográfica
se realizó a través de una columna capilar de sílice fundida TRB-1701, 14%
ciano-propil-fenil-silicona (longitud 30 m, diámetro interno 0,25 mm, y 0,15
ìm de espesor de pel ícula). La temperatura inicial fue de 100ºC, y se aplicó
________________________________________________________
98
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. CERAS NATURALES

un gradiente de 40ºC.min -1 hasta 275ºC ( 4,5 min), temperatura que se

mantuvo durante 25 minutos, hasta elución completa de los analitos [165]. El
gas portador utilizado fue una corriente de helio circulando a un caudal
constante a 1,5 mL.min -1 , produciendo una presión en la cabeza de columna
de 115 kPa.
El volumen inyectado fue 1,5 µL, con un divisor de flujo de 1/20.

2.5 Tratamiento previo de muestras y patrones

Las ceras naturales y las muestras reales se someten a hidrólisis ácida

para liberar los ácidos grasos de los ésteres, los cuales se modifican con
etilcloroformiato para obtener los derivados etilados de cada ácido graso
para incrementar su volatilidad. Posteriormente, la mezcla de hidrocarburos
y derivados de los ácidos carboxílicos se analiza por GC, obteniendo las
intensidades de los picos cromatográficos correspondientes a cada analito.

2.5.1 Tratamiento de las muestras de ceras naturales

La muestra sólida (0,5-1 mg), patrón o procedente de una obra

pictórica, se introdujo en un minivial de 0,3 mL (descrito en el apartado
1.5.1), donde se añadió 0,1 mL de HCl 12 mol.L-1 . La mezcla se calentó a
110ºC en estufa durante 16 horas, tras lo que el disolvente se evaporó
[163,165]. Tras enfriamiento, se adicionaron 100 ìL de agua y 100 ìL de
cloroformo y se agitó para favorecer la extracción. Los ácidos grasos y los
hidrocarburos permanecieron en la fase orgánica, la cual se separó y se
introdujo en un minivial. Después de evaporar el disolvente, el residuo
sólido se sometió al protocolo de derivatización descrito en e l siguiente
apartado.

2.5.2 Procedimiento de derivatización de los ácidos grasos

Una cantidad de 100 ìL de la disoluci ón que contiene la mezcla de

ácidos grasos se introdujo en un microvial y se desecó en estufa a 60ºC.
Posteriormente, el residuo sólido obtenido se disolvió en 50 ìL de
etanol/piridina (4:1), se añadieron 8 ìL de ECF, se agit ó vigorosamente y se
sometió a ultrasonicación durante 10 s. Después se adicionaron 50 ìL de la
disolución saturada de NaHCO 3 y 50 ìL de ECF 1% en CHCl 3 . Los
derivados formados de los ácidos grasos se extrajeron en la fase orgánica, de
la cual 1,5 ìL se introdujo en el sistema cromatogr áfico [163,165].

________________________________________________________
99
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. CERAS NATURALES

2.5.3 Análisis de hidrocarburos y ácidos grasos patrón

Para comprobar el tiempo de retención se inyectó en el cromatógrafo

gaseosa directamente 1,5 ìL de la disoluci ón clorofórmica que contiene una
mezcla 1 mmol.L-1 de los siguientes hidrocarburos: n-eicosano, n-
heneicosano, n-docosano, n-tricosano, n-tetracosano, n-pentacosano, n-
hexacosano, n-heptacosano, n-octacosano, n-nonacosano, n-triacontano, n-
hentriacontano, n-dotriacontano, n-tritiacontano, n-tetratriacontano y n-
pentatriacontano.
Con el propósito de establecer los tiempos de retención de los
etilésteres de los ácidos grasos, se introdujo en un minivial 0,1 mL de la
disolución en etanol 1 mmol.L-1 de los siguientes analitos: ácido mirístico,
palmítico, oleico, esteárico, araquídico, behénico, lignocérico y cerótico.
Tras evaporar el disolvente, el residuo obtenido se trató como se indica en el
apartado 2.5.2.

________________________________________________________
100
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. ACEITES SECANTES

3 . Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización de

aceites secantes en obras de arte mediante cromatografía de líquidos
acoplada a un detector de absorción UV-Visible y Fluorescencia

A continuación se expone la metodología analítica empleada en el

estudio comparativo sobre la diferenciación de los aceites secantes más
comunes en pinturas al óleo (aceite de linaza, nuez y adormidera) por HPLC-
UV y fluorescencia, y su caracterización en muestras procedentes de pinturas
al óleo. En primer lugar, se propuso la derivatización de ácidos grasos patrón
para incrementar las propiedades absortivas o fluorescentes, así como la
optimización de las condiciones cromatográficas para separar y cuantificar
adecuadamente los derivados formados. Posteriormente se sugirió un
procedimiento para liberar y extraer los ácidos grasos de la matriz de
triglicéridos. Para comprobar el efecto del deterioro en la compos ición de los
aceites secantes, se tomaron patrones frescos y envejecidos. Los valores
obtenidos de proporción relativa de ácidos grasos permitieron la
discriminación entre las diversas clases de aglutinantes lipídicos y su
caracterización en muestras extraídas de obras pictóricas.

3.1 Reactivos y disolventes

Los siguientes reactivos y disolventes fueron utilizados para el

tratamiento previo de la muestra: 2-nitrofenilhidrazina (2-NPH), (pureza >
97%, Aldrich), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida hidroclorada
(1-EDC.HCl) (grado síntesis, Merck), piridina absoluta (Fluka, Buchs,
Suiza), 4-bromometil-7-metoxicumarina (Br-Mmc) (pureza >97%, Aldrich),
éter 18-corona-6 (pureza 99,5%, Aldrich), hidrogenocarbonato de potasio
(pureza 98%, Aldrich), ácid o clorhídrico 37% para análisis (Fischer),
hidróxido de potasio para análisis (Scharlau, Barcelona, España), etanol
absoluto para análisis (Fischer), metanol para análisis (Carlo Erba), n-hexano
para análisis (Fischer), acetonitrilo grado HPLC (Carlo Erba), acetona (para
análisis,Scharlau). El agua empleada (grado nanopure II) se generó en el
laboratorio con un equipo de producción de agua nanopure (Sybron-
Barnstead, Dubuque, IA, USA).
Las disoluciones de reactivos preparadas fueron: HCl 3 mol.L-1 en
agua, KOH 15% p/v en metanol/agua (80:20 v/v), 2-NPH 0,02 mol.L-1 en
acetonitrilo/ácido clorhídrico 0,1 mol.L-1 en metanol (50:50 v/v), 1-
EDC.HCl 0,25 mol.L-1 en etanol con 3% de piridina, Br-Mmc 0,11 g/100
mL en acetona y éter 18-corona-6 0,07 g/100 mL en acetonitrilo. Las dos
últimas se almacenaron a 20ºC en la oscuridad.
Los siguientes disolventes se emplearon en la preparación de las fases
móviles para la separación cromatográfica: metanol grado HPLC (Carlo
________________________________________________________
101
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. ACEITES SECANTES

Erba), propanol grado HPLC (Scharlau), agua nanopure, ácido acético

glacial (pureza 99,99%, Aldrich).

3.2 Patrones y sustancias de referencia

Los ácidos grasos (FA) utilizados en el estudio analítico fueron:

mirístico (C14), palmítico (C16), esteárico (C18), araquídico (C20), todos
ellos pureza >99% (Aldrich, Saint-Louis, MO USA) y oleico (C18:1), pureza
GC, suministrado por Fluka.
Se preparó una disolución de ácidos mirístico, palmítico, oleico y
esteárico 0,25 mmol.L-1 de cada uno de ellos en etanol, así como una
disolución de ácido araquídico 1 mmol.L-1 en etanol.
Las muestras patrón seleccionadas para el estudio analítico
correspondieron a los aceites secantes más habituales en obras pictóricas:
aceite de linaza, nuez y adormidera, (Kremer Pigmente, Aichstetten,
Alemania). Con el fin de comprobar el efecto de la degradación de los
aceites secantes sobre la composición de los aceites frescos, tres muestras de
patrones se extendieron sobre un portaobjetos y se sometieron a tres
tratamientos de deterioro:
- Envejecimiento acelerado térmicamente: la lámina de vidrio se introdujo en
una cámara climática Dycometal DI-110 a 50ºC con humedad relativa de
40% durante cuatrp semanas [289].
- Envejecimiento acelerado por irradiación UV: la muestra se irradió con una
lámpara fluorescente OSRAM L36/37, a 350-400 nm y 36 W a una distancia
de 12 cm durante cuatro semanas [18].
- Envejecimiento natural: los portaobjetos se almacenaron durante 5 años a
temperatura de 5ºC sin efectuar ningún tratamiento [163].

3.3 Descripción de muestras procedentes de obras de arte

Las muestras procedentes de obras de arte se obtuvieron por erosión

cuidadosa con un escalpelo sobre la s capas superficial y pictórica (en áreas
deterioradas) de las siguientes obras pictóricas elaboradas al óleo:

Muestra 6. Crucifixión, óleo sobre canva, siglo XVII, anónimo aunque

atribuido a Tintoretto (Museo Mariano, Basílica de la Virgen de
los Desamparados, Valencia).
Muestra 7. Santa Teresa, siglo XVIII, anónimo (Museo Mariano, Basílica
de la Virgen de los Desamparados, Valencia ).
Muestra 8. Santa Marta, siglo XVI anónimo (Museo de la Villajoyosa,
Alicante).
Muestra 9. Obra inclasificada muy deteriorada, siglo XVI, Yañez de la
Almedina (Catedral de Valencia ).
________________________________________________________
102
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. ACEITES SECANTES

Muestra 10. Obra inclasificada muy deteriorada, siglo XVI, Yañez de la

Almedina (Catedral de Valencia ).
Muestra 11. La Virgen intercede en presencia de la Trinidad, 1655-1726,
Palomino, (Museo Mariano, Basílica de la Virgen de los
Desamparados, Valencia).
Muestra 12. Boceto del lienzo bocaporte del nicho de la Virgen,1942-
1943, Ramón Stolz, (Mueso Mariano, Basílica de la Virgen de
los Desamparados, Valencia).
Muestra 13. La Virgen de los Desamparados entre ángeles que portan
baldaquino y niños inocentes con velas, siglo XVI, pintura
al óleo sobre panel (Museo Basílica de la Virgen de los
Desamparados, Valencia).
Muestra 14. La Virgen de los Desamparados, anónimo (Museo Mariano
Basílica de la Virgen de los Desamparados, Valencia) (Figura
26, página 163).

3.4 Instrumentación

El estudio analítico de aceites secantes mediante HPLC-UV-Visible se

llevó a cabo en un Cromatógrafo líquido Modelo 1100 (Agilent
Technologies, Wald-brom, Alemania) equipado con un inyector manual
(bucle 20 ìL), una bomba isocr ática y un detector de absorbancia UV-
Visible en onda variable. La separación de los ácidos grasos se efectuó en
una columna Zorbax XDB-C8 (longitud 15 cm, diámetro interno 4,6 mm, 5
ìm de tama ño de partícula, tamaño de poro 80 Å, superficie 180 m2 /g,
temperatura máxima 60ºC, rango de pH=2-9, extremo doblemente
encapsulado, carga de carbono 7,5 %). El software empleado para controlar
el equipo y visualizar los resultados fue “Agilent Chemstation for LC, Rev.
A 08.03-47”. La fase móvil empleada fue una mezcla metanol/agua/n-
propanol/ácido acético (80/14/5/1), circulando a 1,2 mL.min-1 a temperatura
ambiente. Para la detección se fijó la lectura a 400 nm.
El análisis de ácidos carboxílicos por HPLC-Fluorescencia se llevó a
cabo mediante la instrumentación y fase estacionara expuestas en el apartado
1.4 de este Capítulo. La composición de la fase móvil se modifica según un
gradiente, desde metanol/agua (90/10) hasta (100/0) en 25 minutos y
manteniendo durante 10 minutos, circulando a 1,5 mL.min -1 . Las longitudes
de onda de excitación y de emisión se fijaron en 325 nm y 395 nm,
respectivamente.

3.5 Tratamiento previo de muestras y patrones

En primer lugar, las muestras se someten a hidrólisis con el objetivo de

liberar los ácidos grasos de los triglicéridos de los aceites secantes, los cuales
________________________________________________________
103
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. ACEITES SECANTES

se derivatizan posteriormente para ser detectables, en su caso, por absorción

UV-Visible o Fluorescencia. La mezcla resultante se inyecta en el sistema
cromatográfico para su resolución y cuantificación de los analitos.

3.5.1 Hidrólisis de los aceites secantes

La muestra sólida (0,5-1 mg), procedente de patrones y muestras se

introdujo en un microvial de 0,3 mL (Supelco, Bellofonte, USA), se
añadieron 0,1 mL de HCl 6 mol.L-1 y se calentó posteriormente la mezcla a
110ºC durante 24 horas [163]. Después de enfriar, se adicionaron 0,25 mL
de n-hexano, y a continuación se agita para favorecer la extracción. Esta
etapa se repitió tres veces, tras lo que las fases orgánicas obtenidas se
vertieron en un tubo Pyrex (Bibi Sterilin, Staff, UK), tras lo que el disolvente
se evaporó por calentamiento a 70ºC. El residuo sólido obtenido se somete al
proceso de derivatización adecuado.

3.5.2 Formación de los derivados absorbentes de los ácidos grasos

La mezcla de ácidos grasos obtenida en el tubo Pyrex se disolvió en

0,1 mL de etanol, y se añadieron posteriormente 0,1 mL de la disolución
prepara de 2-NPH y 0,2 mL de 1-EDC.HCl [219,221,222]. La mezcla se
calentó en un horno de microondas (Firstline, 2450 MHz, 1300 W), donde
además se introdujo un vaso de precipitados de 250 mL de agua, a 20 % de
potencia (260 W), durante 6 minutos. Seguidamente se añadieron 50 ìL de
la disolución de KOH 15%, y se volvió a calentar la mezcla bajo las mismas
condiciones durante 3 minutos. Posteriormente se vertieron 50 ìL de la
disolución de HCl 3 mol.L-1 , con el objetivo de acidificar la disolución
resultante. Por último, la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante dos
minutos, se filtró y se enfrió con agua corriente. La disolución resultante se
hizo pasar a través de un filtro de Nylon de 0,45 ìm y se introdujo
directamente en el sistema cromatográfico una alícuota de 20 ìL de la
disolución obtenida.

3.5.3 Formación de los derivados fluorescentes de los ácidos grasos

En el tubo Pyrex donde se encontraban los ácidos grasos se añadió una

punta de espátula de KHCO3 en polvo, así como 0,25 mL de Br-Mmc y 0,1
mL de éter 18-corona-6 [215,224]. A continuación la disolución se calentó
en baño de agua a 55ºC durante 25 minutos en ausencia de luz [215].
Posteriormente, se diluyó la mezcla con 0,25 mL de acetona y se hizo pasar
a través de un filtro de Nylon de 0,45 ìm para separar la suspensi ón formada
por el KHCO3 y se introdujo en el sistema cromatográfico una alícuota de 20
ìL de la disoluci ón resultante.
________________________________________________________
104
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

4. Desarrollo de una metodología de caracterización de aglutinantes

proteicos y oleosos mediante espectrometría de masas por infusión
directa

La metodología analítica que se presenta a continuación se empleó

para la identificación de proteínas y aceites secantes mediante infusión
directa en un espectrómetro de masas, sin etapa de derivatización o
separación previa. En este caso se propone el empleo de los perfiles
aminoácidos y los perfiles de los ácidos grasos obtenidos tras la hidrólisis de
las proteínas y aceites secantes, para la identificación de aglutinantes
proteicos y oleosos, respectivamente. Posteriormente, los dichos perfiles
obtenidos se tratarán estadísticamente para diferenciar entre los diversos
patrones, y caracterizar el aglutinante presente en las muestras extraídas de
obras pictóricas.

4.1 Reactivos y disolventes

Se utilizaron los siguientes reactivos y disolventes para el tratamiento

previo de las muestras: ácido clorhídrico 37 % para análisis (Scharlau),
hidróxido de potasio (para análisis, Merck), metanol (grado HPLC, Carlo
Erba), etanol absoluto para análisis (Fisher), n-propanol (grado HPLC,
Scharlau) y n-hexano (grado análisis, Fisher Chemicals). El agua empleada
se generó en el laboratorio, con un equipo de producción de agua nanopure
(Sybron-Barnstead, Dubuque, IA, USA).
Se prepararon las siguientes disoluciones: HCl 0,1 mol.L-1 en agua
nanopure, KOH 240 mmol.L-1 en n-propanol y KOH 40 mmol.L-1 en n-
propanol.

4.2 Patrones y sustancias de referencia

Se utilizaron los siguientes aminoácidos (AA) patrón para el estudio

analítico: alanina (ala), arguinina (arg), ácido aspártico (asp), ácido
glutámico (glu), cisteína (cys), glicina (gly), histidina (his), isoleucina (ile),
leucina (leu), lisina (lys), metionina (met), fenilala nina (phe), prolina (pro),
4-hidroxi-prolina (4-OH-pro), serina (ser), treonina (thr), triptófano (trp),
tirosina (tyr) y valina (val) (grado GC, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA).
Las disoluciones de AA se prepararon disolviendo la cantidad adecuada de
patrón en HCl 0,1 mol.L-1 en agua nanopure.
Los ácidos carboxílicos (FA) empleados fueron: caprílico (C8), láurico
(C12), mirístico (C14), palmítico (C16), oleico (C18:1) y esteárico (C18).
Las disoluciones de ácidos grasos se prepararon disolviendo la cantidad
apropiada de analito en KOH 40 mmol.L-1 en n-propanol/metanol 85/15.
Las proteínas seleccionadas para estudio analítico fueron los patrones
________________________________________________________
105
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

expuestos en el apartado 1.2 de este Capítulo, mientras que los aglutinantes

oleosos fueron los aceites secantes envejecidos naturalmente, y mediante
tratamiento acelerado térmicamente y por irradiación UV, tal y como se
detalla en el apartado 3.2 del presente Capítulo.

4.3 Descripción de las muestras procedentes de obras de arte

La toma de muestra se realizó con ayuda de un escalpelo sobre zonas

deterioradas de las obras pictóricas de manera a tomar parte de la superficie
junto a la capa pictórica.
Las obras de arte seleccionadas fueron pinturas decoradas en témpera
o temple citadas en el apartado 1.3 y al óleo descritas en el apartado 3.3 de
este Capítulo como Muestras 6, 11, 12, 13, 14, así como de las siguientes:

Muestra 15. Escultura de San Juan en madera policromada, fechada en los

siglos XVI-XVII, anónimo (Gran Tarajal, Tenerife).
Muestra 16. Retrato de Santa Teresa, al óleo, siglo XVII, anónimo,
(colección privada).
Muestra 17. Murales decorados al óleo en la cúpula de la Iglesia de Nuestra
Señora del Remedio de Málaga, siglo XVII, anónimo.
Muestra 18. Colección de pinturas en la Capilla del Ecce Homo, óleos sobre
lienzo adheridos al muro, siglo XVIII, anónimo) Pego,
Comunidad Valenciana, España) (Figura 36 A, página 185).
Muestra 19. Techo policromado de la Cámara Dorada en la edificio de la
Lonja de Valencia, de 18 x 7,20 m que consiste en 670 piezas
doradas y policromadas, Juan del Poyo, Bartolomé Santalínea,
Julián Sancho, Juan y Andrés Canón, Domingo Mínguez,
Antonio Gerau, 1418-1461 (Figura 36 B, página 185).

4.4 Instrumentación

El estudio analítico de proteínas y aceites secantes se llevó a cabo

utilizando un espectrómetro de masas HP1100, provisto de una trampa de
iones, con carga máxima 3 x 104 cuentas y tiempo máximo de recolección de
300 ms, equipado con un electronebulizador (ESI). Se emple ó nitrógeno del
99,99% de pureza como gas nebulizador y como gas secante (Generador
GasLab NG LCMS20, Equcien, Madrid, España).
Para el análisis de proteínas la disolución de aminoácidos se infundió
con un caudal de 0,3 mL.h-1 mediante el empleo de una jeringa impulsada
por una bomba de jeringa (KD Scientific, Holliston, MA, USA). Los
parámetros instrumentales fueron los siguientes: presión del nebulizador 25
psi, temperatura 250ºC, flujo de gas 8 L.min -1 , voltaje del capilar 3,5 kV. El
espectro se masas se registró entre 50 y 300 m/z, en modo ion positivo,
________________________________________________________
106
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

enfocando a 90 m/z, y los datos se adquirieron en 1 minuto.

En el estudio de aceites secantes, la mezcla de ácidos grasos,
previamente extraídos, se introdujo en el nebulizador a través de un capilar
de sílice fundida (Supelco, Bellofonte, PA, USA) de longitud 80 cm y
diámetro interno de 75 ìm , dado que se observó que quedaban retenidos en
el tubo previamente empleado en el caso de las proteínas. La infusión se
realizó empleando un equipo de electroforesis (HP 3D, Agilent
Technologies), aplicando una presión externa de 2 bar. El líquido envolvente
fue una mezcla de ácido acético 0,1 % en agua/metanol 50/50 circulando a 4
ìL. Las condiciones de trabajo del espectr ómetro de masas se fijaron en:
presión del nebulizador 25 psi, temperatura 200ºC, flujo del gas de secado 5
L.min -1 , voltaje del capilar 3,5 kV, los voltaje s de las máscaras de la trampa
iónica fueron de 1; 2; -26,8 y -6 V, respectivamente [290]. El detector
realizó un barrido entre 100-400 m/z, enfocando a 255 m/z, en modo ion
negativo. Para cada medida, los datos se adquirieron durante 3 minutos, para
reducir la influencia en el resultado final de posibles oscilaciones de la señal.

4.5 Tratamiento estadístico de los datos experimentales

Los datos experimentales se analizaron estadísticamente mediante un

método de análisis supervisado de datos, el Análisis Discriminante Lineal
(LDA). Esta herramienta quimiométrica permite la construcción de un
modelo capaz de pronosticar la pertenencia de una muestra a una categoría
previamente definida, a partir de sus variables predictoras [291].
El modelo de LDA se construye a partir de un conjunto de muestras de
categoría conocida, denominado conjunto de entrenamiento. La asignación
de categoría debe de ser exhaustiva e inequívoca. Una vez se obtiene el
modelo, éste se utiliza para la predicción de la categoría de pertenencia de
las muestras de categoría desconocida.
La matriz de datos del conjunto de entrenamiento es de dimensiones
nxp (siendo n el número de muestras y p las variables predictoras) que se
agrupan en k categorías. La capacidad clasificatoria del LDA se basa en un
algoritmo que calcula unas funciones discriminantes (DF), a partir de la
combinación lineal de las variables originales normalizadas (VN), que
maximizan la varianza entre categorías (máxima separación entre grupos), a
la vez que minimizan la varianza en el interior de las categorías (máxima
compactación inter grupo).
El factor supervisor del modelo es la lambda de Wilks (ëW ) que se
define como:

Sintra
λW =
Sinter

________________________________________________________
107
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Donde Sintra y Sinter representa la varianza total de casos dentro de cada

categoría y entre diferentes categorías, respectivamente. La optimización del
modelo de LDA repercute en la minimización del factor ëW .
La primera DF es la que mejor diferencia a los grupos (Figura 5), y
sucesivamente cada nueva función discriminante es la que proporciona una
discriminación superior entre las categorías. Las funciones discriminantes
son ortogonales entre ellas. El número de DF obtenidas se corresponde con
el número de variables originales o de categorías menos uno,
seleccionándose el valor inferior. El modelo proporciona los coeficientes
estandarizados (aDF;VN ), los cuales indican el peso que cada variable ejerce
sobre cada función discriminante:

DF1 = a1;1 VN1 + a1;2 VN2 + … + a 1;N VNp

Las funciones discriminantes sustituyen a las variables originales

como indicadores de las características de los objetos, y proporcionan una
mayor información acerca de su pertenencia a las diversas categorías.

Figura 5. Construcción de la primera función discriminante para diferenciar entre 4 objetos

pertenecientes a dos categorías.

La representación gráfica de los objetos estadísticos en el espacio de

las funciones discriminantes, los mostrará agrupados por categorías. El
gráfico de puntuaciones se traza habitualmente sobre dos o tres primeras
funciones discriminantes.
Para pronosticar la pertenencia de un determinado objeto a una de las
categorías, se calcula el valor de las puntuaciones para cada función
discriminantes, y el modelo le asigna la categoría cuyo centroide se
encuentra a menor distancia. En la representación gráfica, la muestra de

________________________________________________________
108
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

categoría desconocida aparece junto a los demás casos de su categoría.

Las variables originales consideradas para la construcción del modelo
se controlan mediante un algoritmo de selección por pasos. La entrada de
una variable en el modelo se produce si disminuye el valor de ëW de forma
significativa, utilizando el test F de Snedecor con un nivel de significación
de á = 0,05, y a su vez otra variable original sale del modelo si su exclusión
no aumenta el factor supervisor significativamente, bajo un nivel de
significación de á=0,1. La selección se detiene cuando ninguna variable
cumple los criterios de entrada o de salida.
El análisis estadístico por LDA se llevó a cabo mediante el empleo del
software SPSS (v.12.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
En el marco del estudio analítico propuesto, las abundancias relativas
de cada aminoácido o ácido carboxílico y como variables predictoras las
originales una vez normalizadas; las categorías serían cada tipo de proteína o
de aceite secante; mientras que como objetos estadísticos se toma cada
réplica analizada de las muestras.

4.6 Tratamiento previo de muestras y patrones

Las muestras patrón y procedentes de obras artísticas se sometieron a

una hidrólisis previa para descomponer las macromoléculas (proteínas y
triglicéridos), y obtener sus unidades básicas (aminoácidos y ácidos grasos,
respectivamente). Posteriormente éstos últimos se extrajeron en el medio
adecuado, y se introdujeron directamente en el espectrómetro de masas, sin
efectuar ninguna etapa derivatización o de separación.

4.6.1 Aglutinantes proteicos

La muestra sólida (0,5-1 mg), procedente de patrones o muestras

reales se hidrolizó en medio ácido, tal y como se destalla en el apartado 1.5.1
de este Capítulo. El sólido obtenido se redisolvió en 1 mL de HCl 0,1
mol.L-1 y 1 mL de etanol. A continuación la mezcla se infundió directamente
en el espectrómetro de masas.

4.6.2 Aglutinantes oleosos

La muestra sólida (0,5-1 mg), procedente de patrones y muestras

reales, se introdujo en un microvial de 0,3 mL y 1 cm de diámetro
(Supelco), al que se adicionaron 170 ìL de KOH 240 mmol.L -1 en n-
propanol y 30 ìL de metanol. Posteriormente la mezcla se calent ó en placa
calefactora hasta completa evaporación del disolvente. El sólido restante se
acidificó por adición de 0,2 mL de HCl 6 mol.L-1 y los ácidos grasos se
extrajeron con 0,2 mL de n-hexano. Tras la evaporación del disolvente
________________________________________________________
109
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

orgánico, el sólido obtenido se disolvió en 170 ìL de KOH 40 mmol.L -1 en

n-propanol y 30 ìL de metanol. La mezcla se agitó en baño de ultrasonidos
durante 2 minutos para favorecer la solubilidad de los analitos, y a
continuación se infundió directamente en el espectrómetro de masas.

________________________________________________________
110
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. RESINAS TERPÉNICAS

5. Caracterización de los constituyentes de barnices de violines y laúdes

italianos de la época renacentista mediante cromatografía gaseosa
acoplada a espectrometría de masas

A continuación se detalla la metodología analítica que se aplicó para la

caracterización de compuestos orgánicos en barnices de instrumentos de
cuerda mediante GC/MS. En primer lugar se estudió una colección de
materiales descritos como ingredientes en recetas de barnices, para obtener
los tiempos de retención y espectro de masas de los compuestos principales.
Para ello se propuso un procedimiento de derivatización de las muestras,
consistente en la transmetilación de los grupos carboxílicos, para aumentar la
volatilidad de las sustancias ácidas, así como un segundo protocolo de
sililación de alcoholes para favorecer su detección. Posteriormente, se
analizaron las muestras de capas filmógenas que recubren la superficie de
tres instrumentos de cuerda italianos del Renacimiento y a partir de los
compuestos detectados se propuso una hipótesis sobre los materiales
utilizados en su elaboración.

5.1 Reactivos y disolventes

El reactivo empleado para la derivatización fue hidróxido de (m-

trifluorometilfenil)trimetilamonio 0,1 mmol.L-1 en metanol (Meth Prep II,
Alltech, Paris, France) , y N,O-bis[trimetilsilil] trifluoroacetamida +
trimetilclorosilano 99/1 v/v, (BSTFA + TMCS) (Alltech).
Los disolventes utilizados fueron: diclorometano (para análisis,
>99,5%, Sigma) y piridina (para análisis, >99,0%, Sigma).

5.2 Materiales de referencia

La selección de los materiales de referencia se realizó a partir de de un

minucioso estudio de recetas de barnices de objetos de madera, elaboradas
en Italia, Francia y Alemania, fechadas entre los siglos XIV-XVIII, así como
de recetas modernas de barnices tradicionale s. Los materiales utilizados en el
estudio analítico fueron seleccionados a partir de los nombrados un número
mayor de veces en las recetas consultadas. El dammar se añadió a la lista
pese a que no aparece en barnices renacentista, debido a su amplio uso en
rebarnizados del siglo XIX.
Los ingredientes finalmente considerados para el estudio analítico
fueron los siguientes: aceite de trementina y de lavanda (Prolabo, Paris,
Francia), colofonia (tres muestras con diferente grado de envejecimiento),
trementina de Venecia, (HMB, Paris, Francia), una segunda muestra de
trementina de Venecia, benjuí, dos muestras de copal de Manila, cinco
muestras de goma laca con diferentes grados de purificación (blanca,
________________________________________________________
111
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. RESINAS TERPÉNICAS

platinada, platinada descerada, cereza y komerlack) y dammar, obtenidos de

Art & Conservation, Paris, Francia, (estas sustancias se encontraban
almacenadas en el Laboratorio del Museo de la Música de París durante más
de diez años), alcanfor, dos tipos de sandaraca y mastic (procedentes de la
colección botánica del siglo XIX, del Centro de Investigación y Restauración
de los Museos de Francia, muestras envejecidas naturalmente y de origen
desconocido).
Los aceites esenciales y la trementina de Venecia se presentaron en
estado líquido, y el resto de los materiales patrón son sólidos.

5.3 Descripción de los instrumentos de cuerda analizados

Las muestras procedentes de instrumentos de cuerda se tomaron, con

ayuda de una lupa binocular y erosionando cuidadosamente con un
escalpelo, a partir de la superficie barnizada de tres instrumentos de cuerda
pertenecientes a la Colección del Museo de la Música de París (descritos a
continuación y mostrados en la Figura 6). Los violines fueron previamente
observados bajo luz visible y ultravioleta, para evitar que la muestra tomada
provenga de una zona rebarnizada o reparada. En todos los casos se extrajo
la menor cantidad de barniz posible, y en un área donde no afecte sus
propiedades estéticas.

Muestra V1. Se trata del laúd occidental más antiguo que se conoce [292], y
fue fabricado entre 1529-1559 en Bologna (Italia), por el luthier Laux Maler.
Su longitud es de 809 mm. La caja de resonancia tiene 9 lados y mide 510
mm, mientras que la caja mediana tiene una anchura de 288 mm. La tabla
está compuesta por madera de Picea excelsa. Probablemente, el barniz sea el
original.
El laúd está almacenado y no se encuentra expuesto públicamente en
el museo (número de inventario E.2005.3.1.).
Muestra V2. Tiorba (instrumento musical de cuerda parecido al laúd pero
de grandes dimensiones) fabricada en Padua (Italia), en 1606 por el luthier
Wendelio Venere. Su longitud total es de 1941 mm. La caja de resonancia,
de 620 mm de longitud y 413 mm de ancho, tiene 35 lados de madera de tejo
(Taxus bacata), separados por redes de madera de color claro, y está
protegida por una capa de ébano. La tabla armónica está constituida por dos
partes de madera de Picea abies, mientras que el caballete está hecho de
madera dura tintada de negro (no original). El mango es de madera resinosa
y está chapado con madera de Piratinera guianensis en la parte posterior,
con dos haces de siete tiras de marfil. La placa de teclas está fabricada en
palisandro de río (Dalbergia nigra). El enclavijado doble es de madera de
color claro (probablemente tilo), chapado con madera de Piratinera
guianensis en la superficie, con dos tiras de marfil por el borde. El barniz se
________________________________________________________
112
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. RESINAS TERPÉNICAS

encuentra en buen estado y es seguramente el original.

La tiorba se encuentra actualmente en exposición pública (número de
inventario E.548).
Muestra V3. Violín “Sarasate”, fabricado en 1724 en Cremona (Italia), por
el luthier Antonio Stradivarius. Su longitud total es de 598 mm y la caja de
resonancia mide 358 mm. El fondo está compuesto por dos placas de madera
de arce, decorado con ondas crecientes hacia el exterior. La tabla superior
está formada por dos partes de madera de picea, cuyas venas se ensanchan
hacia el borde. Las bridas son de madera de arce ondulada, mientras que las
teclas, el cordelero y el botón están fabricados en ébano, y las cla vijas en
palisandro. El mango original se alargó con un calzo, una barra y un montaje
durante el siglo XX. El barniz es de color anaranjado, causado por la
presencia de partículas de HgS [59]. En la caja de resonancia aparece una
etiqueta impresa, con el siguiente texto: “Antonius Stradivarius
Cremonensis/Faciebat Anno 1724”, seguido de “A+S”. Otra inscripción en
el clavijero indica “P.S.”.
El violín está actualmente en exposición pública (Número de
inventario E.1729).

V1) a) V1) b) V2) V3)

Figura 6. Imágenes de los instrumentos musicales estudiados: V1) laúd de Maler, a) vista
parcial anterior, b) vista posterior; V2) tiorba de Venere; V3) violín de Stradivarius.

________________________________________________________
113
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. RESINAS TERPÉNICAS

5.4 Instrumentación

La instrumentación utilizada fue un cromatógrafo de gases HP 5890

(Agilent Technologies, Inc), acoplado a un espectrómetro de masas QCG
con trampa de iones (Thermo-Finnigan Inc, Waltham, MA, USA). La
separación cromatográfica de los analitos se realizó a través de una columna
capilar CP-5 Sil de bajo sangrado/MS, de 30 m de longitud, 0,25 mm de
diámetro interno y 0,25 ìm de espesor de película). El gas portador fue una
corriente de helio a un flujo constante de 1,3 mL.min-1 .
La temperatura del inyector del GC se fijó en 300ºC. La temperatura
inicial del horno fue de 40ºC, mantenida durante 1 min. Posteriormente se
aplica un gradiente de 10ºC.min -1 hasta llegar a 180ºC, y a partir de ahí otro
a 4ºC.min -1 , hasta alcanzar los 325ºC, temperatura que se mantiene durante
8 minutos. La ionización de los analitos en el espectrómetro de masas se
produjo bajo condiciones estándar a 70 eV. El detector midió por ciclos de 1
s, realizando un barrido de 50 a 850 m/z. El software Xcalibur 1.4 (Thermo-
Finnigan) fue empleado para la integración de los picos cromatográficos y la
visualización de los espectros de masas.
El volumen inyectado fue de 1 ìL, en modo sin divisi ón de flujo.

5.5 Procedimiento experimental

Los materiales de referencia patrón sólidos se pulverizaron en un

mortero de ágata, y se tomó una pequeña cantidad de muestra patrón para los
análisis, mientras que en el caso de los líquidos se tomó una gota con un
cuentagotas. En las muestras heterogéneas, se seleccionaron las zonas de
color más claro. Por su parte, las muestras reales se dividieron en dos,
tomando una única parte para su estudio analítico.
La primera etapa del tratamiento de muestras consistió en una
transesterificación/metilación de los analitos, y a continuación el producto
obtenido se sometió a una segunda reacción para obtener los derivados
sililados.
Las muestras se introdujeron en un microvial, al que se añadieron 200
ìL de Meth Prep II en el caso de las muestras patrón, y 50 ìL para las
muestras reales. La mezcla se calentó durante 16 horas en una estufa a 80ºC,
y tras enfriar se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos. El líquido se
evaporó bajo atmósfera de nitrógeno a 40ºC. El sólido remanente se disolvió
en 200 ìL de diclorometano en el caso de las muestras patr ón o en 5 ìL p ara
las muestra procedentes de los instrumentos de cuerda. Por último, 1 ìL de
la disolución se analizó por GC/MS, mientras que el resto se reservó para la
siguiente etapa de derivatización.
Para la sililación se introdujeron 50 ìL de la al ícuota metilada , en el
caso de los patrones (4 ìL para las muestras reales), y se evapor ó el
________________________________________________________
114
 IV. PARTE EXPERIMENTAL. RESINAS TERPÉNICAS

diclorometano a 40ºC bajo atmósfera de nitrógeno. El residuo sólido se

redisolv ió en 50 ìL de BSTFA+TMCS y 5 ìl de piridina (para las muestras
de barnices 20 ìL y 2 ìL, respectiv amente). La mezcla se calentó en placa a
70ºC durante 15 minutos, y se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos, tras
lo que el derivatizante se evaporó a 40ºC bajo atmósfera de nitrógeno.
Posteriormente el sólido resultante se disolvió en 50 ìL de diclorom etano en
el caso de muestras de materiales de referencia y 4 ìL para las muestras
reales. En ambos casos, 1 ìL de la al ícuota sililada se utilizó para el análisis.
La comparación de los cromatogramas obtenidos antes y después de la
sililación permite establecer la presencia de grupos hidroxilo en moléculas
correspondientes a picos cromatográficos desplazados.

5.6 Interpretación de los espectros de masas

La interpretación de los espectros de masas obtenidos se realizó a

través de la comparación con los datos bibliográficos, así como con
bibliotecas de espectros NIST y Wiley.
Los picos cromatográficos más importantes obtenidos a partir del
análisis de cada uno de los materiales de referencia se almacenaron para la
construcción de un banco de espectros de masas adecuado al estudio
realizado. Posteriormente, la comparación entre los espectros de masas de
los picos cromatográficos obtenidos al analizar las muestras reales y los
almacenados en la biblioteca, permitió la identificación de las sustancias
presentes en los barnices de los instrumentos de cuerda estudiadas, y emitir
hipótesis acerca de las resinas utilizadas en su elaboració n.

________________________________________________________
115
 IV. PARTE EXPERIMENTAL - RESINAS SINTÉTICAS POR Py-GC/MS

6. Caracterización de resinas sintéticas utilizadas en obras de arte

modernas mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría
de masas con pirólisis previa

La metodología analítica detallada a continuación se propuso para la

caracterización de polímeros sintéticos por pirólisis-GC/MS. La muestra
sólida se introduce en el pirolizador directamente sin tratamiento previo ni
derivatizante. El estudio de los pirogramas obtenidos a través del análisis de
los patrones permite establecer los fragmentos que caracterizan cada
polímero sintético. Finalmente, el método propuesto se aplicó a muestras
procedentes de una obra pictórica moderna. A partir del correspondiente
pirograma se obtuvo la información para caracterizar la resina polimérica
utilizada, así para proponer la presencia de diversos aditivos.

6.1 Patrones

Los polímeros sintéticos utilizados para el estudio analítico, junto a sus

características físicas, proveedor y número de inventario se detallan en la
Tabla 5. Todos ellos pertenecen a la Colección de Materiales de Referencia
almacenada en el Doerner Institut, Bayerische Staatgemäldesammlungen,
Munich, Alemania, organismo encargado de la restauración, conservación y
mantenimiento de las obras depositadas en las Pinacotecas del Estado de
Baviera.

6.2 Descripción de las muestras procedentes de obras de arte

Las muestras procedentes de obras de arte se tomaron con un

escalpelo a partir de una pintura sobre lienzo del pintor alemán Baselitz
“Senta”, 1992/1993, (100,5 x 71 cm), perteneciente a la Bayerische
Staatgemäldesammlungen, Munich, Alemania , con número de inventario
1785. La toma de muestra se realizó en la superficie de una zona cercana al
marco. Las dos réplicas se tomaron de dos zonas coloradas con un pigmento
acrílico en azul y negro, respectivamente.

6.3 Instrumentación

La instrumentación utilizada para el estudio analítico fue un montaje

compuesto por un Pirolizador de punto de Curie Pyromat V.1.08 (GSG Meß-
und Analysengeräte, Bruchsal, Alemania), conectado a un Cromatógrafo de
Gases 6890N (Agilent), acoplado a un espectrómetro de masas MSD, 5975C
Inert mass (Agilent). La separación cromatográfica se realizó a través de una
columna capilar HP 5MS de bajo sangrado con relleno de (5%
fenil)metilpolisiloxano, dimensiones: 30 m de longitud, 250 ìm de di ámetro
________________________________________________________
116
 IV. PARTE EXPERIMENTAL - RESINAS SINTÉTICAS POR Py-GC/MS

Tabla 5. Características de las resinas poliméricas analizadas y origen.

número de
resina aspecto color proveedor (año)
inventario
polivinilos
poliestireno
trozos pequeños
Kraton G 1950 blanco desconocido (1996) 90.39.09
(gomoso)
Kraton G 1957 esferas pequeñas (duras) blanco desconocido (1998) 90.39.10
resina de hidrocarburos saturada
Arkon P90 trozos pequeños blanco desconocido (1998) 90.39.12
resina de indeno-benzofurano
trozos y polvo
cumarona marrón desconocido 90.39.3
(homogéneo)
acetato de polivinilo
Mowilith 20 trozos pequeños y polvo blanco Fa (Hoest) 90.39.17.1
Mowilith 30 trozos pequeños blanco desconocido ( 1984) 90.39.17.2
Mowilith 40 esferas pequeñas (duro) blanco desconocido ( 1984) 90.39.17.3
Mowilith 50 esferas pequeñas (duro) blanco Kremer Pigmente 90.39.17.4
Constr. Mat. Ltd.
PVAc AYAA trozos blanco 90.39.8.1
(Brooklyn) (1988)
PVAc AYAF esferas pequeñas blanco 90.39.8.3
Constr. Mat. Ltd.
PVAc AYAT esferas pequeñas blanco 90.39.8.4
(1987)
PVAc AYA trozos blanco 90.39.8.2
transparente
Palmer Cement compacto desconocido 90.39.19.1
incoloro
Butiral de polivinilo
Mowital B20H polvo blanco desconocido ( 1980) 90.39.18.1
Poliacrílico
Paraloid* muy viscoso rojo Berkes no tiene
Pigmento de
titanio con base en tubo (pastoso) blanco Golden Acrylics 18.11.1
acrílica
Polímeros de condensación
Alquídicas
Alkyd líquido solidificado amarillo Kremer Pigmente 90.39.15
Resinas cetónicas
AW2 polvo blanco desconocido 90.39.13
AW2 compacto rojo desconocido 90.39.14
amarillo Museo Estatal de Baja
Keton N pastillas 90.39.16
claro Sajonia (Hannover)
Laropal A81 esferas pequeñas (duro) blanco desconocido 90.39.11
Fenol-formaldehido
Resina Fenólica trozos grandes negro desconocido 90.39.6
Resina Fenólica cristales y polvo rojo-marrón desconocido 90.39.4
Poliacroleína
trozos y polvo Bender y Hobein
Akroid rojo 90.39.1
(homogéneo) (München)
*resina liquida, el resto son materiales sólidos

________________________________________________________
117
 IV. PARTE EXPERIMENTAL - RESINAS SINTÉTICAS POR Py-GC/MS

interno y 0,25 µm de espesor de película, y temperatura máxima de 325ºC.

El gas portador fue una corriente de helio a un flujo constante de 0,5
mL.min -1 (15 cm.s-1 ). El modo de inyección fue sin división de flujo.
La cámara del pirolizador está inicialmente a 200ºC y la pirólisis se
realiza a la temperatura seleccionada durante 10 s. La temperatura del
inyector se fijó a 250ºC, produciendo una presión inicial sobre la cabeza de
la columna de 89 k Pa. La temperatura inicial del horno fue de 50ºC,
mantenida durante 2 minutos, posteriormente se aplicó un gradiente de
10ºC.min -1 hasta los 320ºC (29 min). La ionización se realizó en condiciones
estándar a 70 eV, a un voltaje de 200 V. La temperatura de la fuente se fijó a
250ºC, mientras que la del cuadrupolo se estableció en 100ºC. El detector
realizó un barrido de iones 42 a 550 m/z, con 2,87 ciclos por segundo.

6.4 Procedimiento experimental

La muestra se introdujo en el crisol, con la ayuda del escalpelo,

añadiendo la menor cantidad posible de materia. Posteriormente el crisol se
encajó interior de un cilindro hueco de vidrio, el cual se situó en la jeringa
del pirolizador.
La pirólisis se realizó mediante el método del punto de Curie . Para el
estudio analítico realizado, se disponen crisoles correspondientes para 590;
650 ó 764ºC.
Los crisoles se sometie ron a un protocolo de limpieza después de cada
pirólisis, consistente en al vado durante 20 minutos con metanol (grado
HPLC, Fischer) y seguidamente 20 minutos con tetrahidrofurano (grado
HPLC, Fischer), a ultrasonidos. La jeringa del pirolizador se limpia de igual
manera.
La toma de muestra se realizó en función de las características de la
resina patrón:
- Kraton G1650, Kraton G1657, Arkon P90, Mowilith 20, Mowilith 30,
PVAc-AYAA, Palmer Cement, Pigmento acrílico, Alkyd, AW2 (90.39.14),
Laropal A81: la alícuota se obtuvo cortando la resina patrón con un
escalpelo.
- Resina de cumarona, Mowital B20H, AW2 (90.39.13), Resina fenólica
(90.34.4), Akroid: se tomó directamente un grano del polvo.
- Mowilith 40, Mowilith 50, PVAc-AYAF, PVAc-AYAT, PVAc-AYA: la
resina se reblandeció mojando con etanol, y posteriormente la alícuota se
obtuvo cortando con un escalpelo.
- Paraloid: la muestra se tomó con una micropipeta.
- Keton N, Resina fenólica (90.34.6) : se pulverizó un trozo del patrón en un
mortero de ágata, y se introdujo en el crisol una partícula del polvo.

________________________________________________________
118
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

119
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

1. Caracterización de proteínas empleadas como aglutinantes en obras

de arte pictóricas mediante cromatografía líquida con detector de
Fluorescencia

Las proteínas están entre los primeros materiales naturales que fueron
utilizados con finalidad decorativa, por lo que aparecen en numerosos
objetos artísticos. Estas sustancias se aplican como aglutinantes,
consolidantes y cubrientes para pigmentos desde la antigüedad y su uso da
lugar a las técnicas artísticas de témpera y temple . Debido a su importancia
se consideran analitos de interés en el campo de la conservación/
restauración, por lo que existen diversas metodologías para la
caracterización de de proteínas en obras de arte. En su mayor parte se basan
en la descomposición del biopolímero proteico, seguido de la identificación
y cuantificación de los aminoácidos obtenidos por cromatografía gaseosa
[18,32,160-162] y de líquidos [212], así como por electroforesis [198].
Habitualmente se realiza una reacción de derivatización, para adecuar las
propiedades de los analitos a las requeridas por la técnica utilizada.
El estudio analítico de las proteínas también se realiza sobre otros
tipos de muestras, principalmente biológicas y alimenticias. En estos casos
las metodologías van generalmente dirigidas a la cuantificación de los
aminoácidos. La técnica analítica más utilizada para el análisis de material
proteico es la cromatografía líquida, con detector de fluorescencia [265-271]
o espectrometría de masas [255,274-280].
La metodología analítica sugerida se fundamenta en el análisis de los
aminoácidos procedentes del material proteico, mediante la cromatografía
líquida, con un detector de Fluorescencia. La primera etapa consiste en la
descomposición de la proteína mediante una hidrólisis ácida, seguida de la
extracción de los aminoácidos con un disolvente adecuado. La mezcla
obtenida se derivatiza a temperatura ambiente con un agente fluorógeno (o-
ftaladehido) en medio básico, y se analiza por HPLC-Fluorescencia.
En general, durante la etapa de hidrólisis se produce una alteración de
la composición de aminoácidos. Así pues, la asparaguina y la glutamina se
hidrolizan a ácido aspártico y glutámico, respectivamente, mientras que este
último experimenta parcialmente una ciclación, dando lugar al ácido
piroglutámico. Por su parte, el triptófano se destruye durante el ataque ácido,
por lo que no aparecerá en los análisis de las proteínas [160,162].
El trabajo realizado se centró en la optimización de los parámetros de
la derivatización (tiempo de reacción, concentración de los reactivos), así
como las condiciones de la separación cromatográfica (eluyentes, flujo,
programa de gradiente). Posteriormente se midieron los parámetros
analíticos de la metodología desarrollada, como la sensibilidad, intervalo
lineal y límite detección.

_____________________________________________________________
121
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

El método analítico sugerido propone el empleo de o-ftaladehido, un

reactivo ampliamente utilizado, que se caracteriza por su corto tiempo de
reacción sin necesidad de calentamiento y el cual permite alcanzar elevados
valores de sensibilidad y selectividad. Las proteínas seleccionadas para el
estudio analítico fueron las más habituales en obras pictóricas decoradas en
témpera o temple, como albúmina, caseína, gelatina de porcina y bovina, y
huevo. La caracterización se efectuó en función de la proporción relativa de
aminoácidos. Para aumentar la fiabilidad en la distinción del material
proteico, los datos obtenidos se tratan estadísticamente con una herramienta
quimiométrica, el Análisis por Componentes Principales. Finalmente, para
evaluar la capacidad de predicción de la metodología sugerida, se analizaron
muestras reales, procedentes de obras pictóricas pertenecientes al Patrimonio
Cultural Valenciano.
Por otra parte, los cationes metálicos procedentes de los pigmentos
introducidos por el artista para proporcionar la coloración a la obra de arte,
pueden formar complejos con ciertos aminoácidos, impidiendo su posterior
derivatización y alterando la proporción de aminoácidos característica de
cada proteína. Algunos autores han propuesto la adición previa de EDTA, el
cual secuestra aquellos cationes reactivos, evitando su interferencia [160].
La metodología analítica propuesta presenta la ventaja respecto a las
que utilizan cromatografía gaseosa, ya que permite la identificación de la
arguinina, la cual queda retenida en la columna capilar de sílice fundida. Por
otra parte, su principal desventaja reside en que no se cuantifican la prolina
ni la 4-hidroxiprolina, que actúan como marcadores en las algunas proteínas,
aunque la caracterización se realiza de igual forma a través del tratamiento
estadístico.

1.1 Optimización del procedimiento experimental

1.1.1 Obtención de los aminoácidos a partir de la muestra

Los aminoácidos se obtienen a partir de la descomposició n del

biopolímero proteico. Así pues, la muestra se somete a hidrólisis catalizada
por el ácido clorhídrico 1:1, calentando a 110ºC durante 24 horas, un
protocolo de ruptura de enlaces peptídicos de probada eficacia y utilizado en
la identificación de proteínas presentes en obras de arte [160,162]. En el
marco del presente trabajo se propuso el uso de una concentración de HCl de
12 mol.L-1 , para acrecentar la velocidad y cuantitatividad de la reacción, así
como para reducir el impacto de una hipotética evaporación de parte del
ácido clorhídrico durante el proceso de calentamiento.
Los protocolos más habituales de extracción de los aminoácidos de la
matriz se basan en la evaporación del medio de hidrólisis, seguido de la

_____________________________________________________________
122
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

adición de 50 ìL de cloroformo y 50 ìL de agua, donde los aminoácidos

pasarán preferentemente a la fase más polar [160,162]. La modificación
propuesta consiste en utilizar únicamente una fase polar, para evitar la
pérdida de analitos, ya que no se encuentran en la muestra interferentes
apolares. El disolvente para la extracción se acidifica, ya que la solubilidad
de los aminoácidos aumenta de forma general al alejarse de neutro,
fundamentalmente en medio ácido [16]. El ácido clorhídrico resulta
especialmente adecuado, ya que se evapora fácilmente sin dejar residuo y el
anión cloruro es una entidad química con elevada inercia.

1.1.2 Optimización de la etapa de derivatización

El reactivo o-ftalaldehido es un derivatizante ampliamente utilizado

para modificar los aminoácidos como tratamiento previo a su análisis
mediante HPLC con detector de fluorescencia. En este sentido, Soufleros et
al. han propuesto un método analítico, empleando OPA/2-ME, dirigido a la
cuantificación de aminoácidos libres en vinos, validado en términos de
linealidad, repetibilidad y reproducibilidad [271].
La modificación propuesta consiste en primer lugar en la variación de
la concentración y cantidad de reactivo que se utiliza para la derivatización.
Los aminoácidos se obtienen tras la extracción en forma de residuo sólido, el
cual se disuelve en un volumen adecuado de agua acidificada para favorecer
la disolución y proporcionar el medio de reacción, mientras que las
condiciones experimentales propuestas por Soufleros et al. están ajustadas
para muestras líquidas [271]. Con el fin de reducir la dilución de los
aminoácidos, se propone el empleo de la mitad de volúmenes de reactivos y
muestras, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad. Sin embargo, la
cantidad total de o-ftalaldehido en el medio no se modifica para no afectar a
la cuantitatividad y sensibilidad de la derivatización, por lo que se duplica su
concentración en la disolución de reactivo.
El tiempo de reacción es un parámetro importante dentro de la
metodología analítica, y exige un compromiso entre el grado de avance de la
reacción y de la descomposición de los derivados formados. Por otra parte,
la derivatización transcurre a temperatura ambiente, por lo que el control del
tiempo de reacción resulta clave para obtener valores adecuados de
reproducibilidad. Con el fin de optimizar este parámetro, se aplicó la
metodología sugerida a 0,2 mL de una mezcla 1,25 mmol.L-1 (0,25 ì mol) de
cuatro aminoácidos: alanina (apolar), serina (polar), histidina (básico) y
glicina (no quiral) , empleando tiempos de derivatización de 1 a 6 min
(Figura 7).

_____________________________________________________________
123
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

Figura 7. Valores para las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los OPA-
derivados de los aminoácidos histidina, serina, alanina y glicina, obtenidos mediante la
metodología propuesta a diversos tiempos de reacción. Valores de la media y desviación
estándar de 5 medidas independientes.

Los resultados obtenidos muestran que el rendimiento de la reacción

permanece constante a partir de los tres minutos, por lo que se toma un valor
de cuatro minutos como tiempo de reacción óptimo.

1.1.3 Optimización de las condiciones cromatográficas

La separación de los derivados OPA-amino ácidos se llevó a cabo bajo

las condiciones cromatográficas y de detección fluorescente propuestas por
Soufleros et al. [271], utilizando como fase estacionaria una columna Zorbax
XDB C18, con 15 cm de longitud. Bajo estas condiciones la presión
soportada por la columna fue de 200 bares a tiempo 0 del gradiente, por lo
que se redujo el caudal a la mitad (1 mL.min -1 ). Para conservar el poder
resolutivo de la fase móvil (Tabla 4 en el apartado 1.5 de l Capítulo III), el
programa de gradiente se modifica para duplicar los tiempos de los puntos
de inflexión. Así pues, se consigue reducir la presión en la entrada de la
columna a niveles adecuados, aunque la separación se alarga hasta 45
minutos.
El uso de un horno termostático permite estabilizar la temperatura, y
evitar que sus oscilaciones afecten a la capacidad de separación de la
columna y por ello a la reproducibilidad de la metodología propuesta. El
estudio de la temperatura (entre 10 y 50ºC) se llevó a cabo mediante el
análisis de una mezcla de cuatro aminoácidos (alanina, serina, histidina y
glicina, 1,25 mmol.L-1 de cada uno de ellos). El uso de bajas temperaturas
incrementa de forma considerable la presión ejercida por la bomba, mientras
que al aumentar la temperatura no se aprecian mejoras significativas de la
_____________________________________________________________
124
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

resolución cromatográfica. Así pues, se selecciona como valor óptimo la

temperatura intermedia de 30ºC.

1.2 Identificación de los aminoácidos y determinación de los parámetros

analíticos del método

Con el propósito de comprobar la validez de los resultados obtenidos

se evaluaron los parámetros analitos del método. Así pues, se determinan los
parámetros de selectividad, sensibilidad, linealidad, y límite de detección
para los siguientes aminoácidos: alanina, arguinina, ácido aspártico, ácido
glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, serina, tirosina, treonina, triptófano y valina. Por su parte, la
prolina, 4-hidroxiprolina y cisteína no se incluyeron en el estudio analítico,
debido a la inestabilidad de los derivados que forman con el OPA, mientras
que las amidas asparagina y glutamina se excluyen debido a que se
descomponen durante la etapa de hidrólisis.
1.2.1 Identificación de los aminoácidos

La metodología analítica se aplicó a una mezcla de aminoácidos 0,8

mmol.L-1 de cada uno, bajo las condiciones de derivatización y separación
cromatográficas optimizadas (Figura 8).

Figura 8. Cromatograma obtenido a partir del análisis de una mezcla 0,8 mmol.L-1 de cada
uno de los siguientes aminoácidos: alanina (ala), arguinina (arg), ácido aspártico (asp), ácido
glutámico (glu), glicina (gly), histidina (his), isoleucina (ile), leucina (leu), lisina (lys),
metionina (met), fenilalanina (phe), serina (ser), tirosina (tyr), treonina (thr), triptófano (trp) y
valina (val). Condiciones de separación: fase móvil circulando como el gradiente expuesto en
la Tabla 4 a 1 mL.min-1, a 30ºC y longitud de onda de excitación 340 nm y de emisión 450
nm.

_____________________________________________________________
125
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

La identificación de cada analito se llevó a cabo mediante

comparación de los tiempos de retención, obtenidos previamente por el
análisis de cada aminoácido de forma independiente.
Los resultados obtenidos indican que la mezcla de aminoácidos se
resuelve adecuadamente en 45 minutos bajo las condiciones optimizadas,
proporcionando picos cromatográficos con un perfil gaussiano. La glicina y
la lisina muestran dobles picos [271], este último probablemente debido a la
presencia de dos grupos aminos en su estructura, por lo que se formarán el
mono- y di-OPA-derivados.

1.2.2 Determinación de los parámetros analíticos del método

El intervalo lineal, la sensibilidad y el límite de detección de la

metodología sugerida se determinaron para los siguientes aminoácidos de
interés analítico (por orden de elución): ácido aspártico, histidina, ácido
glutámico, serina, lisina, arguinina, glicina, treonina, alanina, tirosina,
metionina, valina, fenilalanina, isoleucina y leucina. La selectividad
alcanzada se puede apreciar en la Figura 8, donde los analitos aparecen
adecuadamente separados. Como patrón interno se utilizó 0,1 ìmol de
triptófano, mientras que la concentración de los analitos se expresa como
cantidad de aminoácido en el tubo de reacción. En el caso de la glicina y la
lisina, se toma la suma de las áreas de los dos picos cromatográficos que
proporcionan. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Parámetros analíticos de la metodología propuesta para la identificación y

cuantificación de los aminoácidos estudiados. (n=13)
A(AA)/A(trp)= intervalo lineal límite de
AA R2
(a±sa )· [AA] (ì mol) + (b±sb) (nmol) detección* (nmol)
ordenada en
pendiente
el origen
asp 5,8 ±0,1 -0,04±0,02 0,998 0,4-1000 0,12
his 8,75±0,05 -0,02±0,01 0,9995 0,4-660 0,08
glu 7,10±0,05 0,03±0,01 0,9991 0,4-660 0,10
ser 8,55±0,05 0,02±0,01 0,9992 0,4-660 0,08
lys 16,9±0,3 0,11±0,07 0,996 0,4-660 0,04
arg 10,4±0,3 0,12±0,05 0,993 0,4-660 0,06
gly 15,9±0,3 0,00±0,06 0,998 0,4-660 0,04
thr 6,55±0,05 -0,02±0,01 0,9990 0,4-1000 0,10
ala 8,15±0,05 -0,02±0,02 0,9991 0,4-1000 0,08
tyr 7,6±0,4 0,04±0,04 0,994 0,4-660 0,08
met 12,10 ±0,15 0,03±0,02 0,998 0,4-330 0,06
val 12,10 ±0,15 0,00±0,02 0,998 0,4-330 0,06
phe 8,1±0,1 -0,01±0,01 0,9990 0,4-660 0,08
ile 5,80±0,05 0,05±0,02 0,9990 0,4-1000 0,12
leu 6,70±0,15 0,05±0,03 0,996 0,4-660 0,10
*calculado como el triple del cociente entre la desviación del blanco y la sensibilidad.
_____________________________________________________________
126
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

La sensibilidad proporcionada por cada derivado varía en función del

aminoácido de origen, probablemente debido a diferentes valores de
rendimiento fluorescente o grado de avance máximo de la derivatización.
Los parámetros analíticos del método resultan adecuados para el
estudio que se propone. En especial, el bajo límite de detección alcanzado
permite el estudio analítico de cantidades pequeñas de muestra, sin conllevar
una incertidumbre elevada en la medida.

1.3 Estudio analítico de patrones de aglutinantes proteicos

Algunas metodologías analíticas proponen la caracterización de

proteínas a partir de la proporción relativa de aminoácidos [18, 32,161]. En
otros casos se sugiere el cálculo del cociente entre la cantidad de cada
amimoácido y uno seleccionado como referencia, usualmente la alanina
[160,162]. Así pues, se evita que el error en la medida de algún analito,
afecte en exceso a los demás. En el marco del presente estudio, se propone el
empleo de la leucina como aminoácido de referencia, debido a su
estabilidad, ausencia de grupos reactivos y reproducibilidad en su análisis
[271].
Dada la cantidad de variables que se manejan para la identificación de
proteínas, la comparación directa entre los valores obtenidos puede resultar
confusa [18,32,161]. Algunos autores han sugerido el tratamiento
quimiométric o de los datos mediante Análisis por Componentes Principales,
el cual manipula y ordena la información para maximizar la varianza
explicada y agrupar las muestras en función de la causa de varianza, en este
caso el origen de las proteínas.

1.3.1 Análisis de las proteínas patrón

La metodología sugerida se aplica sobre las proteínas más habituales

en pinturas decoradas en témpera o temple : albúmina, caseína, gelatina
porcina y bovina, y huevo. Los resultados obtenidos a partir del análisis de
esa última se muestra en la Figura 9.
Los resultados muestran que la metodología propuesta proporciona
adecuados valores de sensibilidad y selectividad, al ser aplicada a muestras
procedentes de proteínas. Por otra parte, no se observaron interferencias
entre los picos cromatográficos y otras sustancias de la matriz.

_____________________________________________________________
127
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

Figura 9. Cromatograma obtenido a partir del análisis de la mezcla de aminoácidos extraídos

de la proteína de huevo. Condiciones de derivatización y separación cromatográfica se fijaron
como en la Figura 8.

1.3.2 Caracterización de los aglutinantes proteicos

Los valores de los cocientes entre las áreas de los picos

cromatográficos de los aminoácidos y la leucina (A(AA)/A(leu)), obtenidos
a partir de la aplicación de la metodología propuesta a cada proteína se
muestran en la Tabla 7. Paralelamente, se analizaron muestras procedentes
de la clara y la yema del huevo por separado, obteniendo resultados
similares.
Los resultados muestran desviaciones estándar más elevadas que el
caso del análisis de los aminoácidos patrón, debido a la incertidumbre
añadida por el tratamiento de la muestra, y a la variabilidad intrínseca de la
composición de la proteína [16].
Para los aminoácidos de cadena carbonada apolar se encontraron
valores de error superiores a los demás, probablemente debido a la ausencia
de grupos reactivos que puedan experimentar reacciones paralelas. Por su
parte, los cocientes calculados para la glicina y la lisina presentan valores de
desviación estándar relativa elevadas, ya que ambos valores son el resultado
de la suma de las áreas de dos picos cromatográficos, por lo que la

_____________________________________________________________
128
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

incertidumbre también se añade. Por otra parte, los valores obtenidos para
los aminoácidos hidrofílicos ácidos (asp y glu), representan tanto su propio
contenido como el de sus correspondientes amidas (asn y gln,
respectivamente), en la estructura de la proteína, por lo que su determinación
también se asocia una incertidumbre superior.

Tabla 7. Valores de los cocientes A(AA)/A(leu) obtenidos aplicando el método analítico

propuesto mediante HPLC-Fluorescencia, para cada proteína estudiada.
aminoácido A(AA)/A(leu)
albúmina caseína gelatina bovina gelatina porcina huevo
asp 0,37±0,07 0,3±0,1 0,3±0,1 0,1±0,1 0,013±0,006
his 0,30±0,09 0,4±0,1 0,06±0,05 0,3±0,02 0,13±0,03
glu 0,9±0,3 1,1±0,6 0,8±0,9 0,8±1,0 0,007±0,005
ser 0,6±0,2 0,4±0,2 0,03±0,04 0,01±0,02 0,04±0,02
lys 3±1 3,6±0,7 7±1 6,7±0,7 0,05±0,03
arg 1,6±0,3 0,77±0,08 4,2±0,6 5,4±0,7 1,0±0,2
gly 6±2 2,1±0,6 50±20 80±20 0,84±0,08
thr 0,5±0,1 0,41±0,06 0,20±0,01 0,3±0,1 0,24±0,03
ala 0,8±0,1 0,7±0,3 4,7±0,7 5,2±0,8 2,0±0,1
tyr 0,48±0,9 0,46±0,07 0,06±0,02 0,11±0,04 0,43±0,08
met 0,64±0,03 0,40±0,03 0,29±0,05 0,36±0,06 0,35±0,05
val 1,0±0,1 0,7±0,1 0,7±0,1 0,8±0,1 1,2±0,1
phe 0,62±0,06 0,44±0,05 0,50±0,05 0,53±0,08 0,40±0,03
ile 0,7±0,1 0,59±0,07 0,7±0,1 1,0±0,2 0,9±0,1
Valores de la media y desviación estándar a partir de 3 medidas independientes .

La cantidad relativa encontrada para los aminoácidos apolares como

valina, isoleucina y fenilalanina fueron semejantes para las proteínas
estudiadas, por lo que no aportan información significativa para la
identificación de las proteínas por comparación directa del contenido de
aminoácidos.
Las gelatinas se diferencian por su elevado contenido en glicina, y en
menor medida también contienen más alanina, arguinina y lisina que las
demás proteínas. Por otra parte, su contenido en aminoácidos es muy
semejante, y su distinción resulta relativamente compleja. Esto se debe a que
ambas proceden del colágeno de piel animal, donde ambas cumplen la
misma funcionalidad, como el mantenimiento de la estructura. Sin embargo,
se aprecia que la gelatina porcina contiene una cantidad ligeramente más
elevada de glicina, isoleucina, metionina, histidina y tirosina.
Las proteínas de albúmina y caseína se diferencian de la s otras tres
proteínas patrón a partir de su proporción de glicina, lisina, arguinina,
alanina, y en menor medida de treonina y metionina. Entre ellas, se
distinguen a través del mayor contenido en glicina, arguinina y treonina de la
albúmina.

_____________________________________________________________
129
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

Los resultados obtenidos para la clara y la yema de huevo son

difícilmente distinguibles entre ellos y de su mezcla, a causa de su semejante
proporción relativa para la mayoría de los aminoácidos estudiados. Así pues,
se considera únicamente el contenido proteico en la mezcla de yema y clara
de huevo. Por su parte, dicha proteína de huevo es claramente diferenciable
de los demás aglutinantes a partir de la baja cantidad de lisina, glicina y
ácido glutámico, a la vez que presenta valores intermedios para la arguinina
y alanina.
Con el propósito de incrementar la fia bilidad en la diferenciación de
las proteínas, se propone un tratamiento quimiométrico de los datos
mediante Análisis por Componentes Principales (PCA) [291]. Las variables
seleccionadas para la construcción del modelo son las proporciones relativas
de los aminoácidos incluidos en la Tabla 6, excluyendo el ácido glutámico,
debido que se modifica en parte proporcionando ácido piroglutámico, (14) y
como objeto se selecciona cada réplica de proteína patrón analizada (25). La
representación gráfica de las puntuaciones obtenidas para los dos primeros
PC muestra una agrupación definida de los objetos en función del origen de
la proteína, con un nivel de varianza explicada por el modelo del 99%
(Figura 12). Así pues, el modelo quimiométrico construido proporciona una
adecuada herramienta para la caracterización de los aglutinantes proteicos a
partir de la proporción relativa de aminoácidos.

1.4 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte

Con el objetivo de determinar la validez de la metodología propuesta,

ésta se aplicó a la identificación de aglutinantes proteicos en muestras reales,
procedentes de obras pictóricas decoradas mediante témpera o temple y
pertenecientes al Patrimonio Cultural Valenciano.
La Figura 10 muestra la imagen de dos de las obras pictóricas
seleccionadas para el estudio analítico: “Retablo de San Miguel”, realizada
por Vicente Maçip en 1542 y “Altar del Muro de Alcoi”, por Jerónimo
Rodríguez de Espinosa en el siglo XVII.
La caracterización de los materiales presentes en una muestra real,
presenta la dificultad de la reducida cantidad de muestra usualmente
disponible, lo que exige una sensibilidad elevada, así como la presencia de
otras sustancias, como barnices, aditivos y pigmentos, que pueden provocar
interferencias durante la etapa derivatización y de separación
cromatográfica. En efecto, la obtención de valores de proporción relativa de
aminoácidos distorsionada por estos factores, puede conducir a una
incorrecta clasificación de la proteína presente en la muestra. La influencia
de los pigmentos se eliminó mediante la adición de EDTA al medio de
reacción.
_____________________________________________________________
130
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

A) B)

Figura 10. Obras pictóricas A) “Retablo de San Miguel”, 1542, Vicente Maçip (Muestra 1) y
B) “Altar del Muro de Alcoi”, siglo XVI, Maestro de Alzira (Muestra 4).

1.4.1 Aplicación de la metodología a muestras reales

Las muestras provenientes de obras pictóricas elaboradas mediante la

técnica decorativa de témpera o de temple , citadas en el apartado 1.3 de l
Capítulo IV, se analizaron a través de la metodología sugerida. Así pues, en
la Figura 11 se representa el cromatograma obtenido a partir del análisis de
la mezcla de aminoácidos extraídos tras la hidrólisis de la muestra
procedente de la pintura “Retablo de San Miguel”, realizada en 1542 por
Vicente Maçip.
Los resultados obtenidos indican que la mezcla de los aminoácidos se
resuelve adecuadamente sin interferencias cromatográficas por parte de otras
sustancias de la matriz. Asimismo, la sensibilidad alcanzada permite la
medida de las áreas de los picos correspondientes a los analitos sin incluir
una incertidumbre elevada.

_____________________________________________________________
131
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

Figura 11. Cromatograma obtenido del análisis de la muestra de la obra pictórica “Retablo de
San Miguel” (c), empleando el método sugerido mediante HPLC-Fluorescencia, comparado
con el cromatograma obtenido en el análisis de los aminoácidos patrón (a), (Figura 8) y del
análisis de clara de huevo (b) (Figura 9).

_____________________________________________________________
132
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

1.4.2 Caracterización de aglutinantes proteicos

Los valores de los cocientes de las áreas de los picos cromatográficos

de los aminoácidos respecto al de la leucina (A(AA)/A(leu)), se muestran en
la Tabla 8.

Tabla 8. Valores calculados de A(AA)/A(leu) y aglutinante proteico asignado para las

muestras procedentes de obras pictóricas decoradas en témpera o temple.
aminoácido A(AA)/A(leu) Muestra
1 2 3 4
asp 1,2±0,5 2,0±0,3 2±1 2,6±0,4
his 2,0±0,8 2,2±0,2 0,13±0,01 0,11±0,03
glu 0,0±0,0 0,4±0,1 2,1±0,7 2,4±0,7
ser 0,2±0,2 0,4±0,2 0,5±0,1 0,38±0,5
lys 0,39±0,01 3,6±0,7 1,0±0,3 0,9±0,3
arg 1,6±0,6 1,3±0,4 3,0±0,4 1,6±0,2
gly 9±5 2,1±0,6 25±5 14,0±0,7
thr 0,5±0,2 0,52±0,05 0,6±0,3 0,53±0,02
ala 2,5±0,9 2,3±0,5 2,6±0,9 1,9±0,3
tyr 0,0416±0,0001 0,46±0,07 0,12±0,02 0,14±0,04
met 0,08±0,01 0,40±0,06 0,2±0,1 0,4±0,1
val 1,2±0,1 0,7±0,1 1,0±0,1 1,2±0,2
phe 0,38±0,3 0,44±0,5 0,45±0,04 1,2±0,2
ile 0,70±0,05 0,59±0,07 0,7±0,2 1,7±0,2
probablemente
proteína huevo huevo huevo
huevo
Valores de la media y desviación estándar para tres análisis independientes para tres muestras
diferentes, tomadas con un escalpelo de la superficie de la obra pictórica.

Los resultados muestran que la incertidumbre asociada a los valores

obtenidos a partir del análisis de muestras reales es en general superior que
para las proteínas patrón. Esto se debe principalmente a la considerable
complejidad y heterogeneidad de los materiales en las obras de arte. Dado
que la presencia de otras sustancias como aditivos y pigmentos, pueden
afectar a la etapa de envejecimiento, el deterioro no haya afectado de igual
manera a toda la superficie decorada. Asimismo, una distribución no
homogénea de pigmento, puede que éstos influyan de forma diferente en
cada muestra analizada.
Para la caracterización de los aglutinantes proteic os, los valores de
A(AA)/A(leu) para cada muestra real analizada se introdujeron en el modelo
quimiométrico por PCA, considerando cada una de ellas como un nuevo
objeto. La posición de cada uno de ellos en el gráfico de puntuaciones
resultante proporciona una hipótesis acerca de la proteína que contienen. Los
resultados obtenidos indican que la proteína de huevo está presente en las
cuatro muestras analizadas (Figura 12). Sin embargo, en el caso de la
Muestra 3, el objeto se encuentra algo alejado los patrones.
_____________________________________________________________
133
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS

Figura 12. Gráfico de puntuaciones correspondiente al análisis por componentes principales

de los valores de cantidad relativa de aminoácidos, obtenidos mediante la aplicación de la
metodología propuesta al estudio de : patrones de a) albúmina, c) caseína, b) gelatina bovina,
p) gelatina porcina, e) huevo, muestras reales 1; 2; 3 y 4 sin tener en cuenta la influencia de
los pigmentos s1), s2), s3), y s4), mediante la modificación del método con la adición de
EDTA s1+), s2+), s3+), s4+).

Con el propósito de evaluar la posible influencia de los pigmentos en

la caracterización de las proteínas, las muestras reales se analizaron
siguiendo la metodología analítica propuesta, utilizando la disolución de
EDTA como disolvente para los aminoácidos. En estas condiciones, los
cationes metálic os quedarán secuestrados y no interferirán en derivatización
de los analitos. A partir de los valores obtenidos de cantidad relativa
mediante esta modificación, se caracterizan los aglutinantes proteicos
presentes en las muestras, introduciendo los valores obtenidos en el modelo
quimiométrico por PCA. Así pues, los resultados obtenidos se representan en
el correspondiente gráfico de puntuaciones (Figura 12). En el caso de las
Muestras 1; 2 y 4, no se aprecia influencia de los pigmentos en la
caracterización de las proteínas, mientras que en la Muestra 3, mediante esta
variante, se observa una concordancia mayor con los patrones de proteína de
huevo. A partir de este resultado, se puede plantear que la discordancia
inicialmente obtenida en la caracterizació n de la Muestra 3, se debe a la
interacción de los aminoácidos con los pigmentos.

_____________________________________________________________
134
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

2. Caracterización de ceras naturales en obras pictóricas a partir de su

contenido en ácidos grasos e hidrocarburos mediante cromatografía
gaseosa

Las ceras naturales son materiales utilizados desde la antigüedad como

aglutinantes, consolidantes y cubrientes para colorantes, en obras pictóricas
decoradas mediante encáustica [2,7,23,32,33]. Asimismo, se han empleado
como materiales sellantes y aislantes del agua debido a su hidrofobicidad,
por lo que se encuentran en numerosos objetos arqueológicos, como en
vasijas, tumbas y materiales antiguos de construcción [7,21,27]. Debido a su
importancia y su presencia en numerosos objetos artísticos, se han realizado
numerosos estudios acerca de su caracterización y de procesos de
envejecimiento [26].
Algunos autores proponen metodologías basadas en la pirólisis-GC-
MS de la muestra sólida [22,23], así como mediante una derivatización con
trimetilsilanos y análisis de los derivados formados por cromatografía
gaseosa [21,22,171].
En el marco del presente estudio, se sugiere la caracterización de las
ceras a partir de los compuestos principales, los alcanos lineales y los
ésteres. La metodología se basa en la hidrólisis ácida de la muestra para
liberar los ácidos grasos, la extracción de éstos últimos y los hidrocarburos
de la matriz, la formación los etilderivados de los ácidos carboxílicos por
adición de etilcloroformiato, y por último la separación cromatográfica,
identificación y cuantificación de los analitos. El reactivo ECF se utiliza
ampliamente como agente derivatizante en el estudio analítico de aceites
secantes, debido a su cuantitatividad, rapidez de la reacción, además de tener
lugar a temperatura ambiente [163,165]. Sin embargo, este derivatizante ha
sido poco usado para la caracterización de ceras. Por su parte, los
hidrocarburos son lo suficientemente volátiles para análisis por GC, por lo
que no resulta necesaria su modificación. El inconveniente principal de la
metodología propuesta radica en que la etapa de hidrólisis impide la
obtención de información acerca de la estructura de los ésteres. Asimismo, la
presencia de aceites secantes en la muestra puede alterar la proporción de
ácidos grasos, y distorsionar la identificación de las ceras.
Las ceras naturales se diferencian en función de la cantidad relativa de
ácidos grasos e hidrocarburos. Para aumentar la fiabilidad de la
caracterización, los valores obtenidos se tratan estadísticamente con una
herramienta quimiométrica, el Análisis por Componentes Principales. Por
último, la evaluación de la capacidad del procedimiento de análisis sugerido,
se llevó a cabo mediante su aplicación para caracterizar un aglutinante
ceroso presente en una muestra perteneciente a una obra pictórica.

_____________________________________________________________
135
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

2.1. Separación cromatográfica de hidrocarburos y ácidos grasos

2.1.1 Identificación de los alcanos lineales

La mezcla de hidrocarburos patrón 1 mmol.L-1 de cada uno de ellos en

cloroformo se inyectó, directamente en el sistema cromatográfico,
resolviéndose bajo las condiciones indicadas en el apartado 2.5.3 de l
Capítulo IV. El cromatograma resultante se representa en la Figura 13.

Figura 13. Cromatograma obtenido para el análisis mediante GC de una disolución 1

mmol.L-1 de: 1) n-eicosano, 2) n-heneicosano, 3) n-docosano, 4) n-tricosano, 5) n-tetracosano,
6) n-pentacosano, 7) n-hexacosano, 8) n-heptacosano, 9) n-octacosano, 10) n-nonacosano, 11)
n-triacontano, 12) n-hentriacontano, 13) n-dotriacontano, 14) n-tritriacontano, 15) n-
tetratriacontano y 16) n-pentatriacontano.

Los resultados obtenidos muestran que los hidrocarburos son eluidos

en orden creciente de hidrofobicidad (número de átomos de carbono) a
tiempos de retención manejables (30 minutos) y sin solapamiento. Su
sensibilidad también resulta adecuada para este tipo de análisis.

2.1.2 Identificación de los ácidos grasos

La disolución 1 mmol.L-1 de ácidos grasos se sometió al proceso de

derivatización por ECF (expuesto en el Capítulo IV, apartado 2.5.2).
Posteriormente los derivados se extrajeron en cloroformo y se introdujeron

_____________________________________________________________
136
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

en el sistema cromatográfico. El cromatograma obtenido se muestra en la

Figura 14.

Figura 14. Cromatograma resultante del análisis por GC de una disolución 1mmol.L-1 en
etanol de una mezcla de los siguientes ácidos grasos: a) mirístico, b) palmítico, c) oleico, d)
esteárico, e) araquídico, f) behénico, g) lignocérico y h) cerótico.

Los derivados de los ácidos carboxílicos presentan tiempos de

retención suficientemente separados entre sí, mayores al aumentar la
longitud de la cadena carbonada (menor volatilidad), siendo el más elevado
14 min para el ácido cerótico. Únicamente los ácidos oleico y esteárico
aparecen a tiempos de retención próximos, pero son cuantificables por
separado. La sensibilidad obtenida es adecuada para este tipo de análisis.
Los hidrocarburos y los derivados de los ácidos grasos eluyen en la
misma zona del cromatograma, pero cada una de las sustancias aparece a
diferentes tiempos de retención, sin interferir entre ellas.

2.2 Estudio analítico de ceras naturales patrón

2.2.1 Análisis de ceras naturales

La metodología sugerida se aplica sobre las ceras naturales más

utilizadas en encáustica: cera de abeja, carnauba y ceresina. La identificación
de las sustancias se realiza a partir de los tiempos de retención obtenidos
para cada analito patrón. El cromatograma resultante del análisis de la cera
de abeja se muestra en la Figura 15.
Los resultados muestran que el método analítico sugerido proporciona
adecuados valores de sensibilidad y selectividad, al ser aplicada a muestras
procedentes de ceras naturales Por otra parte, no se observaron interferencias
entre los picos cromatográficos de los analitos y otras sustancias de la
matriz. En todos los casos, se observa que la cantidad de hidrocarburos es
_____________________________________________________________
137
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

superior a la de ácidos carboxílicos, y para la ceresina el contenido en ácidos

grasos es todavía más reducido.

Figura 15. Cromatograma obtenido del análisis de una muestra de cera de abeja por GC/FID
mediante la metodología propuesta. Picos cromatográficos de los hidrocarburos: 1) C20H, 2)
C21H, 3) C22H, 4) C23H, 5) C24H, 6) C25H), 7) C26H, 8) C27H, 9) C28H, 10) C29H, 11)
C30H, 12) C31H, 13) C32H, 14) C33H, 15) C34H y 16) C35H, y de los etilderivados de los
ácidos grasos: a) C14, b) C16, c) C18:1, d) C18, e) C20, f) C22, g) C24 y h) C26.

2.2.2 Caracterización de ceras naturales

2.2.2.1 Ceras patrón no envejecidas

La cantidad relativa de hidrocarburos y ácidos grasos se establece a

partir del cálculo de los cocientes entre las áreas de los picos
cromatográficos correspondientes a los alcanos lineales y del n-heptacosano
(A(H)/A(C27H)), así como la relación entre las áreas de los picos
cromatográficos correspondientes a los etilderivados de los ácidos grasos y
el etiléster del ácido palmítico (A(FA)/A(C(16)), respectivamente. El n-
heptacosano se utiliza como referencia, debido a que está presente en gran
cantidad en todas las ceras analizadas y es el hidrocarburo central, mientras
que el ácido palmítico se selecciona debido también a que está en elevada
proporción en las ceras analizables, y no posee dobles enlaces reactivos
[163,165]. Los valores obtenidos de A(H)/A(C27H) y A(FA)/A(C16) para
cada cera analizada mediante la metodología propuesta se muestran en la
Tabla 9.

_____________________________________________________________
138
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

Tabla 9. Cocientes entre las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los
hidrocarburos C20H-C35H y al n-heptacosano, y de los etilderivados de los ácidos grasos
C14-C26 con relación al área del pico cromatográfico correspondiente al etiléster del ácido
palmítico, para las tres ceras estudiadas.
A(H)/A(C27H)
hidrocarburo cera de abeja carnauba ceresina
n-eicosano 0,008±0,003 0,12±0,8 0,13±0,04
n-heneicosano 0,04±0,02 0,4±0,2 0,5±0,1
n-docosano 0,04±0,02 0,8±0,2 1,0±0,2
n-tricosano 0,18±0,01 1,1±0,2 1,4±0,2
n-tetracosano 0,06±0,01 1,2±0,1 1,4±0,2
n-pentacontano 0,40±0,01 1,0±0,3 1,3±0,1
n-hexacosano 0,05±0,01 0,9±0,2 1,12±0,04
n-octacosano 0,039±0,003 0,8±0,1 0,77±0,03
n-nonacosano 0,55±0,02 0,8±0,1 0,66±0,05
n-triacontano 0,03±0,01 0,6±0,1 0,48±0,05
n-hentriacontano 0,55±0,04 0,6±0,1 0,40±0,06
n-dotriacontano 0,011±0,003 0,3±0,1 0,24±0,04
n-tritriacontano 0,09±0,03 0,26±0,08 0,16±0,03
n-tetratriacontano 0,02±0,01 0,12±0,04 0,09±0,02
n-pentatriacontano 0,001±0,002 0,1±0,1 0,07±0,02
A(FA)/A(C16)
ácido graso cera de abeja carnauba ceresina
mirístico 0,0073±0,0003 0,18±0,06 0,1±0,1
oleico 0,13±0,03 1,0±0,2 1,6±0,9
esteárico 0,090±0,006 1,4±0,2 0,9±0,3
araquídico 0,010±0,002 1,4±0,2 3±1
behénico 0,03±0,01 1,3±0,1 4±3
lignocérico 0,21±0,02 1,12±0,04 3±3
cerótico 0,04±0,03 0,77±0,03 1±1
Valores de la media y desviación estándar a partir de 5 medidas independientes .

Los resultados obtenidos muestran una mayor variabilidad en los

cocientes calculados para los ácidos carboxílicos, por lo que se sugiere que
la cantidad relativa de hidrocarburos es más fiable para la caracterización de
las ceras naturales. Esto se debe probablemente a la mayor estabilidad de los
alcanos lineales, causada por la ausencia en su estructura de puntos
reactivos. Asimismo, la menor cantidad de ácidos carboxílicos provoca una
mayor incertidumbre asociada a la medida.

2.2.2.2 Ceras patrón envejecidas

Las muestras procedentes de ceras naturales sometidas al proceso de

envejecimiento por irradiación UV (discutido en el apartado 2.2 del Capítulo
IV) se analizaron mediante la metodología propuesta. Con el propósito de
comprobar el efecto del proceso de degradación aplicado sobre las muestras,
los resultados obtenidos con los de las muestras sin proceso de deterioro, se
_____________________________________________________________
139
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

calcularon los valores para A(H)/A(C27H) y A(FA)/A(C16) (Tabla 10).

Tabla 10. Cocientes calculados entre el área de los picos cromatográficos de los alcanos
lineales C20H-C35H y el n-heptacosano, y de los etilderivados de los ácidos grasos C14-C26
y del ácido palmítico, para las muestras de cera de abeja, carnauba y ceresina, envejecidas
mediante irradiación UV.
A(H)/A(C27H)
hidrocarburo cera de abeja carnauba ceresina
n-eicosano 0,007±0,002 0,05±0,01 0,019±0,003
n-heneicosano 0,044±0,014 0,35±0,10 0,21±0,03
n-docosano 0,06±0,02 0,82±0,13 0,62±0,06
n-tricosano 0,22±0,04 1,11±0,13 1,08±0,08
n-tetracosano 0,10±0,03 1,15±0,07 1,16±0,06
n-pentacontano 0,46±0,02 1,11±0,03 1,15±0,04
n-hexacosano 0,09±0,02 0,90±0,06 1,10±0,03
n-octacosano 0,06±0,02 0,61±0,07 0,78±0,08
n-nonacosano 0,53±0,05 0,65±0,03 0,71±0,01
n-triacontano 0,04±0,01 0,38±0,05 0,51±0,01
n-hentriacontano 0,48±0,07 0,44±0,02 0,46±0,01
n-dotriacontano 0,022±0,002 0,24±0,2 0,278±0,005
n-tritriacontano 0,08±0,01 0,22±0,01 0,20±0,01
n-tetratriacontano 0,017±0,004 0,10±0,01 0,127±0,003
n-pentatriacontano 0,016±0,002 0,09±0,02 0,09±0,02
A(FA)/A(C16)
ácido graso cera de abeja carnauba ceresina
mirístico 0,008±0,001 0,08±0,03 0,12±0,5
oleico 0,03±0,03 0,14±0,06 0,33±0,10
esteárico 0,17±0,02 0,87±0,11 0,9±0,3
araquídico 0,032±0,005 0,5±0,2 1,0±0,3
behénico 0,04±0,01 0,6±0,2 2,3±0,4
lignocérico 0,21±0,05 1,2±0,3 2,9±0,5
cerótico 0,05±0,03 0,5±0,3 1,0±0,6
Valores de la media y desviación estándar a partir de 5 medidas independientes .

Los resultados obtenidos muestran que las proporciones relativas de

hidrocarburos y ácidos carboxílicos no experimentan grandes variaciones.
Esta constatación se debe principalmente a que la mayoría de
compuestos estudiados son moléculas saturadas, por lo que su reactividad no
es muy elevada. Asimismo, la irradiación UV en las condiciones de
envejecimiento acelerado aplicadas en este trabajo, no favorece el proceso de
sublimación, que es la principal causa de variación en la cantidad de
hidrocarburos [26].

_____________________________________________________________
140
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

2.2.2.3 Tratamiento quimiométrico de los datos

Los datos obtenidos se tratan estadísticamente mediante Análisis por

Componentes Principales, lo que permite un aprovechamiento más eficaz de
la información, y por tanto una mayor fiabilidad en la diferenciación de las
ceras naturales.
Las variables seleccionadas para la construcción del modelo son los
valores calculados de A(H)/A(C27H) y de A(FA)/A(C16) (indicados en la s
Tablas 9 y 10). Los datos obtenidos para los ácidos lignocérico y cerótico,
debido a que su proporción en ceresina es muy elevado, lo que provocaría
distorción en el modelo. Asimismo, se descarta el ácido oleico, ya que su
doble enlace le vuelve más vulnerable a los procesos de envejecimiento,
sobre todo a los causados por la irradiación UV [7], por lo que se incluyen
finalmente en el modelo estadístico 19 variables. Los objetos estadísticos son
cada una de las réplicas analizadas de las tres ceras (abeja, carnauba y
ceresina), frescas y envejecidas, en total 30. La representación gráfica de las
puntuaciones de los dos primeros componentes principales se expone en la
Figura 16.

Figura 16. Gráfico de puntuaciones para los PC1 y PC2 a partir del PCA de los valores
obtenidos en el análisis por GC, aplicando la metodología propuesta, de: b) cera de abeja, ca)
carnauba, ce) ceresina, b*) cera de abeja envejecida, ca*) carnauba envejecida y ce*) ceresina
envejecida. Las réplicas consisten en cinco análisis independientes de cada muestra. Varianza
explicada por el modelo 80 %.

En el gráfico de puntuaciones obtenido se aprecia claramente una

separación entre las diferentes categorías, mientras que los objetos que

_____________________________________________________________
141
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

difieren únicamente del estado de envejecimiento de la muestra aparecen

solapados. Esta observación está en concordancia con la observación
realizada en cuanto a la semejanza ente los valores de A(H)/A(C27H) y
A(FA)/A(C16) de las ceras naturales patrón frescas y envejecidas. Por otra
parte los objetos correspondientes a la ceresina tienen una dispersión
elevada, mientras que los de la cera de abeja aparecen más concentrados. La
causa de ello radica en la mayor variabilidad en la compos ición de la
ceresina.

2.2.3 Diferenciación de las ceras naturales basada únicamente en la

cantidad de hidrocarburos

En numerosas ocasiones, el artista aplica mezclas de sustancias para

decorar la superficie de las obras pictóricas, por lo que es habitual encontrar
en las muestras reales junto a las ceras otros materiales como pigmentos,
aditivos, plastificantes, proteínas, aceites secantes y resinas naturales o
sintéticas. La presencia de la mayor parte de estos compuestos en la matriz
no afecta a la caracterización de las ceras naturales por la metodología
sugerida, excepto en el caso de los aglutinantes lipídicos. Así pues, la
hidrólisis liberará también los ácidos grasos de los triglicéridos, los cuales
serán analizados junto a los ácidos carboxílicos procedentes de las ceras,
distorsionando el modelo construido por PCA.
Con el objetivo de evitar la influencia de los aceites secantes en la
identificación de las ceras, se propone la aplicación de un nuevo tratamiento
estadístico por Análisis de Componentes Principales, teniendo en cuenta
únicamente las proporciones relativas de los hidrocarburos. Así pues, las
variables sele ccionadas fueron los valores A(H)/A(C27H) (15), y los objetos
estadísticos las réplicas analizadas de cada muestra de cera no envejecida (5
de cada una, en total 15). El gráfico de puntuaciones resultante se representa
en la Figura 17.
Los resultados muestran que cada categoría aparece separada de
diferenciada de las demás, por lo que este segundo modelo también resulta
adecuado para la caracterización de ceras naturales.
En este caso, los objetos estadísticos de la ceresina y carnauba están
igualmente dispersos, mientras que los de la cera de abeja aparecen más
concentrados. Esto se debe a la menor variabilidad de la cantidad de
hidrocarburos en la cera de origen animal. Por otra parte, la ceresina aparece
mucho menos dispersa, ya que en su caso la incertidumbre asociada a las
medidas de la cantidad relativa de los ácidos carboxílicos era muy elevada.

_____________________________________________________________
142
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

Figura 17. Gráfico para las puntuaciones correspondientes a los PC1 y PC2 construidos
aplicando un estudio estadístico por PCA a los datos obtenidos del análisis cromatográfico de
las siguientes ceras naturales patrón: b) cera de abeja, ca) carnauba y ce) ceresina. Las réplicas
consisten en cinco análisis independientes de cada muestra. Varianza explicada por el modelo
94%.

2.3 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte

Con el propósito de establecer la capacidad predictora de la

metodología propuesta, ésta se aplicó para la caracterización la cera natural
empleada por el artista en la elaboración de una obra de arte parteneciente al
Patrimonio Cultural Mexicano. Se trata de una oleorresina sobre Tabla de 20
cm x 20 cm (descrita en el apartado 2.3 en el Capítulo IV), y la muestra se
obtiene con un escapelo a partir de una zona que contiene pigmento rojo.

2.3.1 Aplicación de la metodología a muestras reales

Las muestras procedentes de la obra pictórica se analizaron por GC

mediante la metodología propuesta. El cromatograma resultante se muestra
en la Figura 18.
Los resultados obtenidos indican que los alcanos lineales y los ácidos
grasos se eluyen sin interferencias por parte de otras sustancias de las matriz.
Asimismo, la sensibilidad del método analítico sugerido permite la medida
del área de los picos cromatográficos correspondientes a los analitos, sin
asociar una incertidumbre elevada.

_____________________________________________________________
143
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

Figura 18. Cromatograma obtenido del análisis de una muestra procedente de una obra de
arte pictórica por GC/FID, mediante la metodología propuesta (b), comparado con el obtenido
para la cera de abeja (a) (Figura 15). Picos cromatográficos de los hidrocarburos: 1) C20H, 2)
C21H, 3) C22H, 4) C23H, 5) C24H, 6) C25H), 7) C26H, 8) C27H, 9) C28H, 10) C29H, 11)
C30H, 12) C31H, 13) C32H, 14) C33H, 15) C34H y 16) C35H, y de los etilderivados de los
ácidos grasos: a) C14, b) C16, c) C18:1, d) C18, e) C20, f) C22, g) C24 y h) C26.

2.3.2 Identificación de la cera natural presente en la muestra real

Los valores de los cocientes A(H)/A(C27H) y A(FA)/A(16),

calculados a partir del análisis por GC de la muestra real, se exponen en la
Tabla 11.

_____________________________________________________________
144
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. CERAS NATURALES

Tabla 11. Cocientes calculados entre el área de los picos cromatográficos de los alcanos
lineales C20H-C35H y el n-heptacosano, y de los etilderivados de los ácidos grasos C14-C26
y del ácido palmítico, para la muestra real.

hidrocarburo A(H)/A(C27H) ácido graso A(FA)/A(C16)

n-eicosano 0,07±0,09 mirístico 0,6±0,1
n-heneicosano 0,5±0,4 oleico 0,4±0,1
n-docosano 0,12±0,07 esteárico 0,6±0,3
n-tricosano 0,2±0,1 araquídico 0,2±0,2
n-tetracosano 0,2±0,1 behénico 0,1±0,2
n-pentacosano 0,4±0,2 lignocérico 0,3±0,4
n-hexacosano 0,3±0,2 cerótico 0,2±0,2
n-octacosano 0,2±0,1
n-nonacosano 0,73±0,05
n-triacontano 0,2±0,1
n-hentriacontano 0,60±0,06
n-dotriacontano 0,1±0,1
n-tritriacontano 0,2±0,1
n-tetratriacontano 0,06±0,05
n-pentatriacontano 0,1±0,1
cera natural en la muestra cera de abeja
Valores de la media y desviación estándar a partir de 3 medidas independientes.

Las desviaciones estándar asociadas a las proporciones relativas para

hidrocarburos y ácidos carboxílicos son mayores que en el caso de las ceras
naturales patrón. Este comportamiento está justificado por la considerable
heterogeneidad de las muestras. Asimismo, la composición química se
modifica debido a los procesos de degradación causados por agentes
externos como la humedad, el calor, la luz solar, agentes medioambientales,
etc, cuyos mecanismos son poco conocidos [7,12,26] aumentando la
complejidad de la muestra. Los ácidos carboxilicos son en general más
sensibles al deterioro [27], y su envejecimie nto puede verse influenciado por
los pigmentos [165], lo que introduce mayor variabilidad en su cantidad
relativa.
La caracterización de la cera natural presente en la muestra se lleva a
cabo a partir de los valores obtenidos de A(H)/A(C27H) así como
A(FA)/(C16) en el primer modelo construido por PCA, y únicamente los
datos calculados de A(H)/A(C27H) para el segundo PCA [291]. En ambos
casos, la representación de las puntuaciones de los PC1 y PC2 indica que la
muestra real contiene cera de abeja.

_____________________________________________________________
145
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

3. Caracterización de aceites secantes mediante cromatografía líquida

acoplada a un detector de absorción UV-Visible y Fluorescencia

Los aceites secantes son materiales filmógenos ampliamente presentes

en obras de arte pictóricas, y empleados en el ámbito de la conservación y
restauración de objetos artísticos. Debido a su importancia, estos materiales
oleosos han sido extensamente estudiados por los especialistas en Química
Analítica cuyo interés se centra en los materiales presentes en obras de arte,
por lo que se han desarrollado una amplia variedad métodos de análisis de
estas sustancias. Las metodologías existentes están basadas principalmente
en la hidrólisis de los triglicéridos para liberar los ácidos grasos, seguido de
una esterificación, o bien efectuar una única etapa mediante
transesterificación, cuyos derivados obtenidos se analizan por cromatografía
gaseosa [163].
El estudio de ácidos grasos también se realiza sobre otra clase de
muestras, notablemente de origen biológico y alimenticio. Sin embargo, en
estos casos las metodologías desarrolladas están dirigidas a la cuantificación
de los ácidos carboxílicos, habitualmente mediante cromatografía de
líquidos. La detección se lleva a cabo principalmente mediante la evaluación
de la absorbancia [220-223], fluorescencia [238-243] o por espectrometría
de masas [205,214,217,223,243-248]. Los ácidos grasos se someten en estos
casos a una etapa previa de derivatización para adecuarlos al detector
seleccionado, si resultara necesario.
Los métodos analíticos propuestos se basan en el análisis de los ácidos
grasos presentes en las muestras mediante la cromatografía líquida de alta
resolución, con detección en un caso por UV-Visible y en otro mediante
Fluorescencia. En primer lugar, la muestra se somete a hidrólisis ácida para
liberar los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos, y posteriormente,
éstos se separan por extracción líquido/líquido y se derivatizan por
calentamiento mediante un agente cromógeno (2-NPH) o fluorescente (Br-
Mmc). La mezcla de ácidos grasos se resuelve en el sistema cromatográfico,
previa optimización de las fases estacionaria y móvil, tras lo que los analitos
se cuantifican por medio del detector adecuado.
El trabajo realizado se centró en la optimización de los parámetros de
reacción (disolvente, pH, concentración, tiempo y temperatura), así como las
condiciones de separación cromatográfica y detección (gradiente, fases
móviles, longitudes de onda). Asimismo se determinaron los parámetros
analíticos como la sensibilidad, el intervalo lineal y el límite de detección.
La etapa de optimización se realizó utilizando los ácidos grasos principales
en los aceites secantes envejecidos: palmítico, esteárico, oleico y mirístico.
Los aglutinantes frescos también contienen grandes cantidades de ácido
_____________________________________________________________
146
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

linolénico y linoleico pero su proporción disminuye drásticamente debido a

su oxidación durante el proceso de secado, por lo que no se consideran
esenciales para el estudio analítico propuesto.
La resolución de la mezcla de los ácidos grasos mediante HPLC
presenta la ventaja de la separación de los ácidos oleico y esteárico, los
cuales, debido a su semejante volatilidad, aparecen en cromatografía gaseosa
casi solapados. Los derivatizantes 2-NPH y Br-Mmc son selectivos y forman
derivados con elevada sensibilidad, además de reaccionar con los grupos
carboxílicos en condiciones de calentamiento no extremo, lo que permite el
control del tiempo de reacción.
Los aglutinantes oleosos seleccionados fueron los más habituales en
obras pic tóricas, los aceites de linaza, nuez y adormidera, todos ello
deteriorados mediante envejecimiento natural y acelerado por calentamiento
y por irradiación UV. La caracterización de los aglutinantes se efectuó en
función de la cantidad relativa de ácidos grasos. Por último, con el fin de
evaluar el método propuesto, se analizaron muestras reales, procedentes de
obras pictóricas pertenecientes al Patrimonio Cultural Valenciano.

3.1 Optimización del procedimiento experimental

3.1.1 Obtención de los ácidos grasos a partir de la muestra

Los ácidos grasos se liberan mediante una hidrólisis ácida por medio
de una reacción de ácido clorhídrico concentrado sobre los triglicéridos a
110ºC durante 16 h, un método de ruptura de ésteres eficaz y utilizado en la
identificación de aglutinantes en obras de arte [163]. Sin embargo, para el
presente trabajo se aumentó la concentración de ácido clorhídrico a 12
mol.L-1 , para incrementar la velocidad y cuantitatividad de la reacción, así
como evitar problemas relacionados con la posible evaporación de parte del
ácido clorhídrico durante el proceso de calentamiento.
La separación de los ácidos grasos de la matriz se efectúa
habitualmente mediante evaporación previa del hidrolizado, y la adición de
50 ìL de agua y 50 ìL de cloroformo. Los analitos se disolverán
preferentemente en la fase más apolar [163]. El disolvente orgánico que se
emplea para la extracción de los ácidos grasos es un parámetro de gran
importancia para el método analítico. En efecto, un líquido no muy apolar,
puede arrastrar parte de la fase acuosa e introducir compuestos hidrofílicos
que pueden interferir en la identificación de los ácidos grasos, mientras que
un disolvente demasiado hidrofóbico puede no extraer completamente a los
ácidos carboxílicos más polares. Se evaluó la capacidad de extracción de
diclorometano, cloroformo y n-hexano.

_____________________________________________________________
147
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

En los dos primeros casos, al añadir el líquido se forma una emulsión

inestable en la interfase, y se aprecia que éste toma una coloración
amarillenta, semejante al hidrolizado. Esta observación muestra que parte de
la fase acuosa se introdujo en la fase orgánica, reconfirmado por el hecho
que, tras la evaporación del disolvente apolar, queda un residuo líquido de
mucha menor volatilidad, probablemente agua. Además, la similar
coloración dificulta la toma de la fracción orgánica. Sin embargo, el n-
hexano conserva su coloración transparente tras ser añadido, forma una
interfase más estable y nítida, y no se observa la entrada del hidrolizado
dentro de la fase orgánica. No obstante, debido a la elevada apolaridad del n-
hexano, la extracción de los ácidos carboxílicos menos hidrofóbicos se
producirá con un rendimiento menor.
En la Tabla 12 se resumen las características de los disolventes, junto a
las observaciones obtenidas en la optimización de la extracción
líquido/líquido.

Tabla 12. Características de los disolventes empleados y observaciones realizadas durante la

extracción líquido/líquido.
disolvente CH2Cl2 CHCl3 n-hexano
características
momento dipolar (D) 1,55 1,15 0
hidrofobicidad moderada elevada muy elevada
solubilidad en agua (g/100 mL) 1,3 0,8 inmiscible
densidad (g.cm-3) 1,325 1,48 0,6548
T ebullición (ºC) 39,8 62 69
observaciones
coloración al interaccionar con amarillenta amarillenta incolora
la fase acuosa
interfase emulsión inestable emulsión inestable nítida
residuo líquido tras evaporación sí sí no

Los resultados obtenidos indican claramente que se produce mediante

el empleo de n-hexano una separación más adecuada de ambas fases y por
tanto una mejor eliminación de la matriz.
En el marco del trabajo realizado, se propone la extracción directa
desde el hidrolizado, para evitar la pérdida de analitos durante la
evaporación. El volumen añadido de disolvente orgánic o se eleva a 250 ìL,
y se propone repetir la extracción líquido/líquido varias veces, reuniendo las
fases orgánicas obtenidas, con el objetivo de incrementar la cuantitatividad.
Así pues, se espera separar la totalidad de los ácidos grasos de la matriz,
evitando que permanezcan en el hidrolizado.
Para la determinación de los parámetros de recuperación, se toma una
muestra de aceite de linaza envejecido térmicamente, tratada mediante el
procedimiento experimental propuesto. Así pues, se realizan sucesivas

_____________________________________________________________
148
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

extracciones líquido/líquido sobre el hidrolizado, hasta que ya no se observa

la presencia de analito. En la Tabla 13, se exponen los valores de
recuperación obtenidos para cada una de las extracciones.

Tabla 13. Rendimiento del procedimiento propuesto a cada una de las extracciones
líquido/líquido.
ácido graso mirístico palmítico oleico esteárico
1ª extracción (60±20)% (59±14)% (60±20)% (61±14)%
2ª extracción (84±9)% (80±4)% (90±20)% (84±5)%
3ª extracción (95±7)% (90±10)% (95±8)% (93±8)%
4ª extracción (99±2)% (96±8)% total (99±2)%
5ª extracción total total total total
valores de la media y desviación estándar obtenidas a partir de 3 medidas independientes .

Los resultados obtenidos muestran que la extracción repetida tres

veces representa un adecuado equilibrio entre una elevada recuperación y un
excesivo alargamiento de la duración del tratamiento previo.

3.1.2 Optimización de la etapa de derivatización

3.1.2.1 Reacción un agente cromógeno: 2-nitrofenilhidrazina

El método propuesto incluye una etapa de derivatización con 2-

nitrofenilhidrazina, se trata de un agente cromógeno ampliamente utilizado
para la determinación de compuestos carboxilados, para obtener las
correspondientes nitrofenilhidrazidas de los ácidos grasos. La elección de
este reactivo deriva del método propuesto por H. Miwa et al. [220,221].
En este caso, la mezcla de ácidos carboxílicos extraídos, disuelta en
etanol, reacciona con el 2-NPH.HCl en medio acuoso, catalizado por la
mezcla EDC.HCl y piridina en etanol, de acuerdo con H. Miwa et al.
[220,221,222]. Sin embargo, el reactivo utilizado en el presente trabajo es 2-
nitrofebilhidrazina no clorihidratado, cuya principal diferencia consiste en
que no se disuelve en agua.
En primer lugar se examinó la solubilidad de la 2-nitrofenilhidrazina
en una serie de disolventes y mezclas, cuyo resultado se muestra en la Tabla
14.
Los resultados obtenidos muestran que la 2-nitrofenilhidrazina es
soluble en acetona, cloroformo y acetonitrilo/metanol (50/50). Para
determinar cual resulta más adecuado como medio de reacción, el
procedimiento experimental se aplica sobre 0,1 mL de una disolución 0,25
mmol.L-1 de ácido mirístico (0,025 ìmol). En medio acetona no se observa
ninguna reacción, mientras que en cloroformo se obtiene un pico
cromatográfico de área 38±7 u.a. y en acetonitrilo/metanol (50/50 v/v) de
_____________________________________________________________
149
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

185±3. Este último se selecciona como disolvente de para el reactivo 2-NPH,

debido a la solubilidad y sensibilidad que proporciona.

Tabla 14. Solubilidad de la 2-NPH en diversos líquidos y mezclas .

disolvente solubilidad
agua no
acetona sí
metanol no
etanol no
acetonitrilo no
cloroformo sí
hexano no
metanol/agua no
etanol/agua no
acetonitrilo/agua (50/50 v/v) no
acetonitrilo/metanol (50/50 v/v) sí
acetonitrilo/etanol (50/50 v/v) no

La influencia de la concentración de protones en el medio se estableció

mediante un estudio de cuantitatividad a diversos pH. En estudios anteriores
la derivatización transcurre en medio ácido, proporcionado por el mismo 2-
NPH.HCl [220-222]. El método se aplicó a 0,1 mL de una disolución 0,25
mmol.L-1 de ácido mirístico, ajustando el disolvente del reactivo 2-NPH a
pH 2,3 y pH 7. Las áreas cromatográficas de los picos obtenidos son de
185±3 y 63±3 u.a., respectivamente. Así pues, el disolvente más adecuado
para la 2-NPH se establece como una mezcla de HCl 0,01 mol.L-1 en
metanol y acetonitrilo (50/50 v/v). La disolución obtenida presenta una
coloración anaranjada.
Algunos autores plantean etapas de calentamiento a temperaturas
elevadas durante un prolongado periodo de tiempo [220,221]. En el presente
trabajo se sugiere un calentamiento mediante horno microondas, con el
objetivo de reducir el tiempo de reacción. Así pues, para evitar que la mezcla
reactiva reciba un exceso de energía, se selecciona una baja potencia, 260 W,
que además es fácilmente alcanzable por el horno sin que se produzcan
fluctuaciones de energía. Para reducir aun más la potencia recibida por la
muestra, se propone la introducción de un vaso de precipitados con 250 mL
de agua a temperatura ambiente dentro del microondas. Con estas
condiciones se pasó a la optimización del tiempo de reacción, aplicando la
metodología analítica a una mezcla de ácido palmítico y esteárico 0,25
mmol.L-1 en etanol (0,025 ìmol en el tubo de reacci ón). Los valores
obtenidos para el área de los picos cromatográficos de ambos analitos se
representan en la Figura 19.

_____________________________________________________________
150
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

Figura 19. Representación gráfica del área de los picos cromatográficos de las hidrazidas del
ácido palmítico ( ) y esteárico ( ) en función del tiempo de reacción. Valores de la media y
desviación estándar de 5 medidas independientes.

Los resultados obtenidos muestran que las áreas permanecen

aproximadamente constantes a partir de 6 minutos, por lo que se sugiere que
coincide con el máximo rendimiento de la formación de las hidrazidas y se
toma como valor óptimo de tiempo de reacción. La duración de la etapa de la
derivatización es considerablemente menor al calentamiento en baño de agua
(20 minutos) [220-222]. Tras la reacción de derivatización, la mezcla
presenta una coloración naranja -amarillento.
Tras la derivatización es conveniente destruir el exceso de reactivo,
mediante la adición de 50 ìL de KOH y calentamiento [220 -222], de lo
contrario la línea base experimenta una elevación progresiva a partir de 6
minutos, que puede interferir en la medida de los picos cromatográficos. En
este caso, el calentamiento se realiza en las mismas condiciones que la
reacción de derivatización. El tiempo óptimo de reacción se establece
mediante el estudio de la elevación de la línea base y de la estabilidad de las
hidrazidas a diferentes tiempos de reacción (Figura 20). Para este estudio se
aplicó el método analítico a una disolución de de ácido mirístico 0,25
mmol.L-1 (0,025 ìmol en el tubo de reacci ón).
A partir de 3 minutos se observa que la elevación de la línea base
alcanza valores asumibles sin afectar a la estabilidad del derivado formado.
El cambio de pH provoca una alteración brusca de la coloración, que pasa a
violeta oscuro.
Tras el proceso de derivatización, el pH de la mezcla es fuertemente
básico, por lo que no es directamente introducible en el sistema
cromatográfico, ya que un exceso de iones hidróxidos puede ser causa un
deterioro irreversible de la columna. El procedimiento se modifica mediante
la adición de 50 ìl de HCl 3 M para acidificar el medio. La mezcla se vuelve
_____________________________________________________________
151
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

amarillenta, y se aprecia un precipitado de KCl, insoluble en el medio de

reacción. La suspensión se elimina filtrando la disolución, la cual ya es
directamente inyectable en el sistema cromatográfico.
Las propuestas relativas a la optimización del método permiten
obtener resultados fiables, sensibles y reproducibles, con un reducido tiempo
de reacción y en condiciones no agresivas para los reactivos y la
instrumentación.

Figura 20. Representación gráfica de la elevación de la línea base a 6 minutos (a) y el área
del pico cromatográfico correspondiente al ácido mirístico (b) en función del tiempo de
calentamiento, para la eliminación del exceso de 2-NPH. Valores de la media y desviación
estándar de 5 medidas independientes.

_____________________________________________________________
152
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

3.1.2.2 Reacción con un agente fluorógeno:

4-bromometil-7-metoxicumarina

El reactivo 4-bromometil-7-metoxicumarina es un derivatizante de

amplio uso en el análisis de compuestos con grupos carboxílicos,
especialmente ácidos grasos, mediante HPLC con detector de fluorescencia.
En este sentido es de destacar el trabajo de Lam y Grushka, estos autores han
propuesto condiciones de derivatización que proporcionan resultados
adecuados para los análisis previstos en el presente trabajo [240].
La reacción se produce en baño de agua a 55ºC, en este caso no se
propone el empleo de horno de microondas, ya que el medio de reacción
(acetona y acetonitrilo), no contiene enlaces excitables por irradiación. En
este caso no es necesaria una reacción posterior para eliminar el exceso de
reactivo, ya que éste no interfiere posteriormente en la separación
cromatográfica [240].
La cantidad de reactivo utilizado para la derivatización fue
considerada excesiva, dado el reducido contenido de analitos en muestras de
origen artístico [7]. Así pues, se toman 0,1 mL de una disolución patrón cuya
concentración total de ácidos grasos es de 1 mmol.L-1 , por lo que en el tubo
de Pyrex se encuentran 0,0001 mmol. Al introducir los 0,5 mL de la
disolución de Br-Mmc 0,11 g/100 mL, se añaden 0,002 mol de reactivo. La
adición de la mitad de Br-Mmc no modifica la sensibilidad y permite
consumir una cantidad menor de reactivo.

3.1.3 Optimización de las condiciones cromatográficas

3.1.3.1 Separación cromatográfica de las hidrazidas

La resolución de la mezcla de las hidrazidas correspondientes a los

ácidos grasos resulta una etapa fundamental para la identificación y
cuantificación de los analitos, por lo que resulta primordial que los
parámetros instrumentales estén ajustados de forma adecuada.
La fase estacionaria seleccionada para la separación cromatográfica
fue una columna apolar Zorbax XDB-C8. Para la resolución de la mezcla de
las hidrazidas de los ácidos estudiados (de mirístico a esteárico), a través de
una fase estacionaria hidrofóbica, se ha sugerido como fase móvil una
mezcla metanol/agua 86/14 en modo isocrático [220]. No obstante, en las
condiciones utilizadas el tiempo de retención fue excesivo, y a medida que
se reduce la proporción de agua, la disminución del tiempo de retención
resulta muy dependiente de la cantidad de metanol, por lo que éstos oscilan
con facilidad. La modificació n que se propone consiste en la adición de un
alcohol más hidrofóbico, manteniendo la cantidad de agua constante, por lo
_____________________________________________________________
153
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

que se estudió la influencia del etanol, n-propanol y n-butanol en varias

proporciones. Finalmente, la modificación de la fase móvil in icial, con un 5
% de n-propanol, manteniendo la cantidad de agua, permitió la obtención de
tiempos de retención estables y adecuados (15 min para el ácido esteárico,
de mayor hidrofobicidad).
Las propiedades absortivas de las hidrazidas están influenciadas por el
pH del medio. A pH>12, presentan una coloración violeta intensa (máximo a
600 nm), mientras que a pH inferiores a 8,5 el máximo de absorción se
desplaza progresivamente al azul [221] (Figura 21).

Figura 21. Espectro de absorción de acetato de 2-nitrofenilhidrazida (se derivatizó una

cantidad de 0,5 ìL). El medio de reacción se ajustó al cada pH con ácido clorhídrico 3 mol.L-
1
, a partir de la mezcla obtenida tras la etapa de adición de KOH. Se midió entre los siguientes
pH: 1) 13,85; 2) 10,5; 3) 8,5; 4) 6,5 y 5) 4,5.

Por otro lado, la naturaleza de la fase estacionaria obliga a fijar el pH

entre 3 y8 para evitar su deterioro. Con esta restricción, las condiciones
ideales resultan a pH 4 y detección a 400 nm, bajo las cuales se observa un
máximo de absorbancia a pH 4 y 400 nm [221]. La absorción de los
analitos presenta otro máximo a 230 nm [221], pero se desecha debido a que
es una zona del espectro donde absorbe el metanol, así como subproductos
de la derivatización, que provocan una elevación de la línea base a partir de
6 minutos.

_____________________________________________________________
154
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

La adición de ácidos minerales, como el clorhídrico, para la ajustar el

pH de la fase móvil [220], se encuentra totalmente desaconsejada, debido a
que, incluso a bajas concentraciones, puede atacar a la instrumentación
cromatográfica. Para la acidificación de la fase móvil se propone en este
caso la adición de ácido acético glacial, el cual es no agresivo y permite fijar
el pH con seguridad.

3.1.3.2 Resolución de los aductos cumarina-ácido graso

La resolución de la mezcla de ácidos grasos derivatizados con Br-

Mmc se lleva a cabo por cromatografía líquida de fase reversa, utilizando
mezclas de metanol/agua para la elución. Dada la hidrofobicidad de la fase
estacionaria y la apolaridad de los analitos (creciente de mirístico a
esteárico), algunos autores han sugerido como fase móvil una mezcla
metanol/agua 85/15 en modo isocrático [240].
En el presente trabajo se propuso como fase estacionaria una columna
apolar Zorbax XDB-C18 [293]. Con el objetivo de reducir el tiempo de
retención, y mejorar la separación, se realizó un amplio estudio de gradientes
metanol/agua, comprobando la influencia de los parámetros tales como
proporción inicial, pendiente y proporción final. El gradiente de
metanol/agua, de 90/10 a 100/0 en 25 minutos se encontró el más adecuado
en términos de tiempo de retención (15 minutos para el ácido esteárico),
separación y perfil de pico cromatográfico.
La temperatura puede influir en la resolución de la mezcla a través de
la entalpía del proceso de desorción del analito de la columna y su disolución
en la fase móvil, y de la variación de la viscosidad del líquido eluyente.
Como resultado, la temperatura influirá sobre el perfil y el tiempo de
retención de los picos cromatográficos.
El uso de un horno termostático permite controlar la temperatura y
evitar que su propia variación intra día pueda afectar a la reproducibilidad
del método propuesto. El estudio realizado consistió en aplicar el método
sugerido a una mezcla de ácidos mirístico, palmítico, oleico, esteárico y
araquídico 0,25 mmol.L-1 en cada uno de ellos (0,025 ìmol en el tubo de
reacción), a temperaturas de 2ºC a 55ºC. La presión sobre la bomba aumenta
considerablemente al enfriar la fase móvil, mientras que la fase estacionaria
se deteriora progresivamente a altas temperaturas. Por ello se desaconseja el
uso continuado de temperaturas extremas para la separación cromatográfica.
En la Figura 22 se muestra la dependencia del tiempo de retención sobre la
temperatura.

_____________________________________________________________
155
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

t(elución)
(min)
30

25

20

15

10

0
0 10 20 30 40 50 60
T (ºC)
Figura 22. Representación gráfica del tiempo de retención de los ácidos mirístico ( ),
palmítico (x), oleico (+), esteárico ( ) y araquídico ( ) en función de la temperatura del
horno termostático.

El tiempo de retención disminuye al aumentar la temperatura, sin que

se llegue a producir inversión, mientras que la separación entre el palmítico
y el oleico es máxima a 30ºC. Así pues, esta temperatura intermedia se tomó
como adecuado para la separación cromatográfica de los derivados de los
ácidos grasos estudiados.
Las longitudes de onda de excitación y emisión, las cuale s ejercen una
marcada influencia en la sensibilidad y reproducibilidad del método
analítico, se optimizaron mediante un procedimiento iterativo. El máximo de
excitación anteriormente propuesto se estableció en 325 nm [293], desde del
cual se toma el espectro de emisión, cuyo máximo se encuentra a 395 nm. A
partir de este valor se traza el espectro de excitación, el cual presenta un
máximo a 325 nm. Así pues, las longitudes de onda de excitación y
excitación se fijan a 325 nm y 395 nm, respectivamente.

3.2 Identificación de los ácidos grasos y determinación de los

parámetros analíticos del método

Con el objetivo de establecer la validez de la metodología sugerida, se

determinaron los parámetros analíticos, como la selectividad, linealidad,
sensibilidad y límite de detección, para los ácidos grasos que se utilizan para
la caracterización de los aceites secantes (mirístico, palmítico, oleico y
_____________________________________________________________
156
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

esteárico).

3.2.1 Identificación de los ácidos grasos

Ambas metodologías desarrolladas se aplican al análisis de una mezcla

de patrones de ácidos mirístico, palmítico, oleico, esteárico y araquídico, con
una cantidad de cada uno de ellos de 0,025 ìmol, empleando las
condiciones de derivatización y separación cromatográficas previamente
optimizadas (Figura 23). La identificación de cada uno de los ácidos grasos
se realizó a partir de medidas de cada analito de forma independiente y
comparando posteriormente los tiempos de retención obtenidos.

Figura 23. Cromatogramas obtenidos de una mezcla (0,025 ìmol) de los ácidos mirístico
(C14), palmítico (C16), oleico (C18:1), esteárico (C18) y araquídico derivatizados con 2-NPH
bajo las condiciones optimizadas de derivatización y separación cromatográfica para análisis
por: a) HPLC-UV-Visible, b) HPLC-Fluorescencia.

_____________________________________________________________
157
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

Ambas metodologías presentan picos cromatográficos con un perfil

gaussiano, y no se observan interferencia s entre ellos ni con otras sustancias.
El tiempo de retención aumenta a medida que se incrementa la longitud de la
cadena carbonada del ácido graso (más hidrofobicidad), y disminuye al
introducir insaturaciones.
La resolución cromatográfica en el caso de la metodología propuesta
para HPLC-UV-Visible resulta más adecuada, ya que los ácidos palmítico y
oleico están más separados y los tiempos de retención son ligeramente
menores. Por otra parte, los picos cromatográficos obtenidos por HPLC-
Fluorescencia son más estrechos, lo que implica un número superior de
platos teóricos.

3.2.2 Parámetros analíticos de las metodologías propuestas

El intervalo lineal y los parámetros de sensibilidad de las metodologías

sugeridas para el análisis de los ácidos grasos (mirístico, palmítico, oleico y
esteárico) se determinan utilizando como patrón interno una cantidad de
0,025 ìmol de ácido araquídico (Tabla 15). La concentración de los analitos
se expresa como cantidad de ácidos grasos añadida al tubo de reacción.

Tabl a 15. Parámetros analíticos de las metodologías propuestas para la identificación y

cuantificación de los ácidos grasos estudiados.
HPLC-UV-Visible
intervalo límite de
ácido A(FA)/A(ara)=
R2 lineal detección*
graso (a±sa )· [FA] (ìmol) + (b±s b)
(nmol) (nmol)
ordenada en
pendiente
el origen
mirístico 32,0 ±0,3 -0,01±0,04 0,9993 3-300 1,5
palmítico 31,9±0,4 -0,02±0,05 0,9991 3-300 1,5
oleico 26,9±0,1 0,03±0,05 0,9990 3-300 1,5
esteárico 25,4±0,2 0,01±0,04 0,9994 3-300 1,5

HPLC-UV-Fluorescencia
mirístico 32,9 ±0,3 0,07±0,02 0,9990 0,1-180 0,06
palmítico 31,7±0,7 0,05±0,06 0,9990 0,1-180 0,06
oleico 29,1±0,5 0,06±0,02 0,9992 0,1-180 0,06
esteárico 22,9±0,3 0,09±0,02 0,9997 0,1-180 0,06
n=6
*calculado como el triple del cociente entre la desviación del blanco y la sensibilidad.

Los dos métodos analíticos sugeridos para el análisis de ácidos grasos

presentan adecuados valores de sensibilidad, intervalo lineal y límites de
detección. Sin embargo, con las medidas de fluorescencia se obtiene una
sensibilidad 25 veces superior a la absorción UV-Visible.
_____________________________________________________________
158
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

3.3 Estudio analítico de los aceites secantes patrón

Las metodologías más extendidas para la identificación de los aceites

secantes están fundamentadas en el cálculo del cociente de las áreas de los
picos cromatográficos correspondientes a los ácidos grasos saturados,
palmítico y esteárico. La justificación del uso de este parámetro se basa en la
invariabilidad del cociente (C16)/(C18) durante el envejecimiento, debido a
la estabilidad proporcionada por la ausencia de dobles enlaces [7,294]. El
cálculo de la proporción relativa de dos ácidos grasos permite contrarrestar
el error sistemático introducido en las diferentes etapas de tratamientos de la
muestra.
Otros autores proponen el uso del cociente (C18)/(C16) como
parámetro identificativo de los aceites secantes [163]. En efecto, el error
sistemático asociado a un cociente es menor cuando el denominador es
mayor, como lo muestra la siguiente expresión:

 x  yε( x ) − xε( y )
ε  =
y y2

En los aglutinantes lipídicos estudiados (aceite de linaza, nuez y

adormidera) la cantidad de ácido palmítico es en todos los casos superior a la
de esteárico [163], por lo que se deduce que el cociente (C18)/(C16)
presentará un error menor. Dado que además resulta igualmente adecuado
para la caracterización de los aceites secantes, se toma en este caso también
como parámetro identificativo.
Los ácidos grasos insaturados experimentan una mayor reactividad
ante la oxidación, por lo que su cantidad en la muestra se reducirá de forma
significativa tras el envejecimiento. Sus correspondientes proporciones
relativas no resultan adecuadas para la caracterización del aceite secante,
pero son útiles para el estudio del envejecimiento. Así pues, la comparación
de las cantidades relativas de ácidos grasos permite tanto la caracterización
de aglutinante lipídico como analizar la influencia del envejecimiento en la
composición química.

3.3.1 Aplicación de los métodos analíticos propuestos a patrones de

aceites secantes

Las metodologías propuestas se aplicaron sobre muestras procedentes

de patrones de tres clases de aceites secantes (linaza, nuez y adormidera)
ampliamente utilizados para la decoración de pinturas al óleo. Se estudiaron
_____________________________________________________________
159
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

muestras de aceite secante fresco, así como sometidas a diversos

tratamientos de envejecimiento: natural, acelerado térmicamente y por
irradiación UV (descritos en el apartado 3.2 de l Capítulo IV). Los
cromatogramas correspondientes al estudio de aceite de linaza mediante
HPLC-UV-Visible y HPLC-Fluorescencia se muestran en las Figuras 24 y
25, respectivamente.

Figura 24. Cromatograma obtenido por la separación de los ácidos grasos

derivatizados con 2-NPH/1-EDC.HCl bajo las condiciones optimizadas, y extraídos
tras la hidrólisis de muestras procedentes de aceite de linaza patrón envejecido: a)
naturalmente durante cinco años, b) acelerado térmico, c) bajo irradiación. Las
condiciones instrumentales de HPLC-UV-Vis son análogas a las expuestas en la
Figura 23.

En ambos casos los picos cromatográficos correspondientes a los

ácidos grasos estudiados aparecen sin interferencias por parte de otras
sustancias presentes en los aceites patrón. Por otra parte, los resultados
muestran que la sensibilidad del método es suficiente en ambas
_____________________________________________________________
160
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

metodologías para la cuantificación de los ácidos grasos procedentes de los

aglutinantes lipídicos patrón.

Figura 25. Cromatograma obtenido por la resolución una mezcla de los ácidos grasos
derivatizados con 4-bromometil-7-metoxicumarina en condiciones optimizadas, obtenida a
partir de una muestra procedente de aceite de linaza sometido a envejecimiento: a) natural
durante 5 años, b) acelerado térmicamente, c) acelerado por irradiación UV. Condiciones
cromatográficas análogas a las expuestas en la Figura 23.

3.3.2 Caracterización de los aceites secantes

Los cocientes entre las áreas de los picos cromatográficos

correspondientes a los ácidos grasos y el ácido palmítico se determinan para
cada aceite secante patrón (linaza, nuez y adormidera), teniendo en cuenta si
el aceite es fresco o sometido a tratamiento de envejecimiento (natural o
acelerado térmicamente o por irradiación UV). Los resultados obtenidos
empleando la técnica de cromatografía líquida con detección por absorción
_____________________________________________________________
161
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

UV-Visible y Fluorescencia se muestran en la Tabla 16 y 17,

respectivamente.

Tabla 16. Valores de los cocientes (C14)/(C16), (C18:1/C16) y (C18/C16), obtenidos

aplicando la metodología propuesta empleando HPLV-UV-Visible, para cada aglutinante
lipídico estudiado y clase de envejecimiento aplicado.
aceite envejecimiento C14/C16 C18:1/C16 C18/C16
secante
linaza fresco 0,03±0,02 2,6±0,3 0,54±0,01
natural 5 años 0,035±0,005 0,16±0,03 0,55±0,05
térmico 0,029±0,008 0,19±0,03 0,61±0,03
irradiación UV 0,03±0,02 0,02±0,03 0,54±0,02
nuez fresco 0,030±0,003 2,03±0,01 0,30±0,01
natural 5 años 0,019±0,003 0,18±0,04 0,32±0,01
térmico 0,030±0,012 0,36±0,04 0,34±0,05
irradiación UV 0,020±0,017 0,010±0,008 0,31±0,04
adormidera fresco 0,06±0,03 1,36±0,01 0,18±0,01
natural 5 años 0,017±0,008 0,035±0,004 0,21±0,01
térmico 0,094±0,0003 0,14±0,02 0,21±0,02
irradiación UV 0,009±0,002 0,013±0,006 0,190±0,003
Valores de la media y desviación estándar a partir de 5 medidas independientes .

Tabla 17. Valores de los cocientes entre las áreas de los picos correspondientes a los ácidos
carboxílicos de interés y el ácido palmítico, obtenidos aplicando la metodología propuesta
para el análisis por HPLV-UV-Fluorescencia a cada aglutinante lipídico estudiado y clase de
envejecimiento aplicado.
aceite envejecimiento C14/C16 C18:3/C16 C18:2/C16 C18:1/C16 C18/C16
secante
linaza fresco 0,03±0,01 7±1 3±1 3,5±0,5 0,48±0,05
natural 5 años 0,04±0,01 - - 0,20±0,01 0,49±0,01
térmico 0,014±0,004 - - 0,21±0,05 0,59±0,03
irradiación UV 0,05±0,01 - - 0,07±0,01 0,49±0,03
nuez fresco 0,03±0,02 2±1 8±1 2,0±0,3 0,28±0,03
natural 5 años 0,06±0,03 - - 0,18±0,04 0,31±0,03
térmico 0,015±0,005 - - 0,26±0,07 0,31±0,06
irradiación UV 0,02±0,01 - - 0,03±0,01 0,29±0,05
adormidera fresco 0,04±0,03 0,04±0,04 3±1 1,7±0,2 0,16±0,03
natural 5 años 0,021±0,009 - - 0,04±0,02 0,21±0,04
térmico 0,04±0,01 - - 0,088±0,007 0,24±0,03
irradiación UV 0,011±0,003 - - 0,029±0,002 0,19±0,01
Valores de la media y desviación estándar a partir de 5 medidas independientes .

Ambas metodologías analíticas propuestas aplicadas al estudio de

aceites secantes frescos y envejecidos arrojan resultados semejantes.
Los ácidos poliinsaturados se encuentran en grandes proporciones en
las muestras frescas, y su cantidad disminuye drásticamente durante el
proceso de deterioro. Los ácidos linoleico (triinsaturado) y linoleico
_____________________________________________________________
162
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

(diinsaturado) llegan a desaparecer completamente durante el proceso de

secado, por lo que no se encontrarán en muestras reales. Este resultado
coincide con la descripción del proceso de deterioro expuesto en el apartado
1.4.4 del capítulo III).
En todos los casos el ácido oleico se encuentra en proporciones
elevadas en las muestras de aceite fresco, y su concentración se reduce
drásticamente al envejecer, debido al doble enlace presente en su estructura.
Esto resulta aún más acusado en el envejecimiento por irradiación UV, por
lo que se considera que este tratamiento resulta más agresivo para el aceite
secante. Por otra parte, no se establece relación entre el cociente
(C18:1)/(C16) y el origen de la muestra, por lo que este parámetro se
considera únicamente orientativo acerca del proceso de deterioro de la
muestra.

Figura 26. Obra pictórica “La Virgen de

los Desamparados”, anónimo y perte-
neciente al Museo Mariano de la Basílica
de los Desamparados, Valencia)

El aceite de linaza es el aglutinante lipídico más rico en ácidos grasos

con dobles enlaces, especialmente linolénico, coincidiendo con sus
superiores propiedades secantes. Por su parte, el aceite de nuez contiene
principalmente ácido linoleico, y en menor medida linolénico y oleico, por lo
_____________________________________________________________
163
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

que su proceso de deterioro es algo más lento. El aceite de adormidera

contiene mucha menor proporción de ácidos carboxílicos con dobles enlaces,
por lo que experimenta los mecanismos de degradación mucho más
lentamente y se considera como semisecante.
El ácido mirístico se encuentra en todos los casos en una cantidad muy
reducida, y además no se deduce relación clara entre el cociente C14/C16 y
el origen del aceite o el tipo de envejecimiento, por lo que se considera que
no aporta información significativa.
El cociente esteárico/palmítico varía claramente en función del origen
de la muestra, y resulta prácticamente independiente del tratamiento de
envejecimiento. Esto se debe a la falta de dobles enlaces en su estructura, lo
que aumenta su resistencia frente a los procesos de degradación del aceite
secante. Por lo tanto, se considera que el cociente (C18)/(C16) es el
parámetro discriminante adecuado para la caracterización de los diferentes
aglutinantes oleosos.

3.4 Estudio analítico de muestras procedentes de obras de arte

Con el propósito de establecer la capacidad de caracterización de las

metodologías sugeridas, se analizaron muestras procedentes de pinturas al
óleo.
La Figura 26 muestra una de las obra pictórica seleccionadas para el
estudio analítico, titulada “La Virgen de los Desamparados”, anónimo y
perteneciente al Museo Mariano de la Basílica de los Desamparados,
Valencia (Muestra 14).
Las muestras procedentes de obras de arte presentan mayor dificultad
en su estudio que los patrones, debido a la presencia en la matriz de otras
sustancias como pigmentos, barnices y aditivos, que pueden interferir en la
identificación del aglutinante lipídico aplicado por el artista. Otro
impedimento añadido consiste en la baja proporción relativa de aceite
secante y la reducida cantidad de muestra disponible (<1 mg), por lo que se
exige una sensibilidad elevada.

. 3.4.1 Aplicación de los métodos propuestos a una muestra de

pintura al óleo

Las muestras procedentes de las obras pictóricas fueron sometidas a

los procedimientos experimentales propuestos con el fin de caracterizar los
aceites secantes que contienen. En la Figura 27 se muestran los
cromatogramas correspondientes al estudio analítico de la muestra
procedente de la obra pictórica “Crucifixión”, anónima, pero asignada a
Tintoretto.
_____________________________________________________________
164
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

Figura 27. Cromatograma obtenido a partir de una muestra procedente de la pintura al óleo
“Crucifixión”, del siglo XVII, anónima aunque asignada a Tintoretto, mediante las
metodologías propuestas por a) HPLC-UV-Visible y b) HPLC-Fluorescencia.

Ambas metodologías propuestas son lo suficientemente sensibles y

selectivas para el estudio analítico de muestras procedentes de obras
pictóricas, ya que los picos obtenidos son cuantificables y no interfieren con
otras sustancias de la matriz.

_____________________________________________________________
165
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

3.4.2 Identificación del Caracterización de aglutinantes lipídicos en

muestras procedentes de obras pictóricas al óleo

La caracterización de los aceites secantes en muestras procedentes de

obras pictóricas al óleo, descritas en el apartado 3.3 del capítulo IV
(Muestras de 6 a 10), se llevó a cabo a partir de la proporción relativa de
ácidos grasos. Así pues, los valores de los cocientes mirístico/palmítico,
oleico/palmítico y esteárico/palmítico, obtenidos al aplicar las metodologías
analíticas propuestas por HPLC-UV-Visible y HPLC-Fluorescencia se
muestran en la Tabla 18 y 19, respectivamente.

Tabla 18. Valores para los cocientes de las áreas de los picos cromatográficos respecto al del
ácido palmítico, obtenidos mediante estudio analítico por HPLC-UV-Visible.
muestra C14/C16 C18:1/C16 C18/C16 aceite secante sugerido
6 0,10±0,01 0,10±0,06 0,7±0,2 linaza
7 0,08±0,04 0,08±0,07 0,33±0,02 nuez
8 0,21±0,07 0,26±0,10 0,53±0,07 linaza
9 0,08±0,02 1,1±0,2 0,55±0,10 linaza
10 0,07±0,03 0,08±0,02 0,66±0,16 linaza
Valores de la media y desviación estándar obtenidos a partir de tres medidas independientes
de tres muestras diferentes tomadas de la obra de arte.

Tabla 19. Valores calculados para los cocientes mirístico/palmítico, oleico/palmítico y

esteárico/palmítico a partir de la metodología analítica propuesta empleando HPLC-
Fluorescencia.
muestra C14/C16 C18:1/C16 C18/C16 aceite secante sugerido
6 0,11±0,01 0,5±0,1 0,43±0,06 linaza
7 0,22±0,03 0,5±0,2 0,35±0,05 nuez
8 0,18±0,04 0,6±0,3 0,45±0,05 linaza
9 0,20±0,08 0,28±0,07 0,7±0,1 linaza
10 0,28±0,05 0,35±0,09 0,43±0,08 linaza
11 0,33±0,09 0,38±0,09 0,7±0,2 linaza
12 0,6±0,1 0,6±0,1 0,51±0,09 linaza
13 0,4±0,1 0,5±0,2 0,55±0,06 linaza
14 0,18±0,7 0,2±0,1 0,6±0,2 linaza
Valores de la media y desviación estándar obtenidos a partir de tres medidas independientes
de tres muestras diferentes tomadas de la obra de arte.

Los resultados obtenidos muestran que las desviaciones estándar

encontradas en las muestras reales son más elevadas que en el caso de los
aceites secantes patrón, debido a la considerable complejidad y
heterogeneidad de las obras de arte pictóricas [7]. Asimismo, la discrepancia
entre los resultados proporcionados por las dos metodologías puede ser
debida a la misma falta de homogeneidad de las muestras.
Los cocientes calculados para las muestras procedentes de obras
pictóricas no coinciden con los obtenidos con los obtenidos a partir de los
_____________________________________________________________
166
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ACEITES SECANTES

aceites secantes patrón envejecidos. En efecto, los procesos de deterioro que

experimentan las muestras reales difieren de los tratamientos aplicados. En
general, una obra de arte no se expone a elevadas temperaturas, excepto en
incendios ocasionales, ni tampoco recibe grandes dosis de radiación UV, al
exhibirse habitualmente dentro de edificios (museos, castillos, iglesias,
monasterios, etc) donde se encuentran resguardadas de la luz sola r directa.
Por otra parte, las muestras de aceites secantes degradadas sin tratamiento
tampoco se pueden considerar representativo, ya que las muestras de
aglutinantes oleosos se dejaron degradar naturalmente durante cinco años,
mientras que las pinturas de al óleo estudiadas tienen como mínimo tres
siglos. Los procesos de envejecimiento que experimenta una muestra real
está determinada por las agresiones medioambientales (humedad, oxígeno,
microorganismos, agentes químicos, temperatura, luz solar, etc), que
dependen de las historia de la obra de arte y son habitualmente desconocidas
y difícilmente modelizables [7,12]. Además, los pigmentos inorgánicos
presentes en la obra pictórica pueden acelerar o retardar la degradación de
algunos ácidos grasos [18].
Los cocientes oleico/palmítico y mirístico/palmítico, obtenidos son en
todos los casos más elevados que los obtenidos en los aceites secantes
envejecidos, probablemente debido a la protección de los cationes metálicos
de los pigmentos, o a las diferencias entre los mecanismos naturales y
artificiales de envejecimiento.
Los valores de C18/C16 para todas las muestras se mantienen entre
0,43 y 0,7, excepto en el caso de las muestras 2 y 4. Esto indica que la
mayoría de obras de arte decoradas al óleo se empleó aceite de linaza,
debido principalmente a sus superiores propiedades secantes. En la Muestra
7 se caracterizó aceite de nuez, probablemente aplicado por el artista para
obtener un secado más lento. Por otro lado, el aceite de adormidera no se
detectó en ninguna muestra real.

_____________________________________________________________
167
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

4. Caracterización de aglutinantes proteicos y oleosos mediante

espectrometría de masas por infusión directa

Los aglutinantes proteicos y oleosos cumplen importantes funciones

en la obra artística, y son materiales aprecia dos en el campo de la
conservación y restauración, debido principalmente a sus capacidades
filmógenas. Estas sustancias han sido ampliamente estudiadas y se dispone
de diversas metodologías dirigidas a la identificación de proteínas y aceites
secantes en muestras procedentes de obras pictóricas, principalmente
mediante GC [160,162,163,165] y HPLC [212], tal y como se detalla en los
apartados 2.2 y 2.4 del Capítulo III. No obstante, los procedimientos
experimentales incorporan etapas intermedias de derivatización y de
separación previa s a la detección, que pueden afectar a principalmente a la
exactitud, precisión y linealidad del método, y por tanto a la fiabilidad de la
caracterización.
Los parámetros analíticos de una metodología dependen de la
exactitud y precisión de cada una de las etapas involucradas. Por lo tanto, la
simplificación del procedimiento experimental mediante la eliminación de
etapas intermedias, permitirá minimizar la introducción de fuentes de
varianza y aumentar la sencillez, rapidez, robustez, reproducibilidad,
precisión y exactitud del método analítico.
Las etapas intermedias que se introdujeron en el estudio analítico de
proteínas y aceites secantes son la extracción, derivatización y separación
cromatográfica. La etapa de derivatización es habitualmente imprescindible
para la detección en HPLC [212,220,240] y para aumentar la volatididad de
los analitos en GC [160,162,163,165]. La aportación de incertidumbre se
debe a los parámetros de la reacción, como cuantitatividad, variabilidad de l
rendimiento e inestabilidad de los derivados. Por su parte, la etapa de
resolución cromatográfica puede introducir fuentes de varianza, debido a la
manipulación de disolventes y sales que pueden afectar a los derivados
analizados, así como interferencias por parte de otras sustancias de la matriz
o de productos secundarios de la reacción. En general, la introducción de
etapas cuyos procedimientos sean largos y complejos, pueden causar pérdida
de precisión debido a errores experimentales. Asimismo, estas etapas
consumen generalmente reactivos y disolventes tóxicos, por lo que su
exclusión proporciona una metodología más sostenible y respetuosa con el
medio ambiente.
El método de análisis de aglutinantes que se propone está basado en la
hidrólisis de las proteínas o aceites secantes, la extracción de los
aminoácidos o ácidos grasos, respectivamente, y su detección mediante la
espectrometría de masas. La nebulizació n e ionización de la disolución de la
_____________________________________________________________
168
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

muestra se realizan mediante una fuente de electronebulización (ESI),

evitando la fragmentación de las sustancias introducidas, las cuales se
identifican a partir del ion con m/z equivalente a su masa molecular y se
cuantifican a partir de la abundancia relativa del correspondiente ion. El
método propuesto tiene la ventaja de permitir la identificación de todos los
aminoácidos, incluyendo la arguin ina, que no se identifica en GC [160,162]
así como la prolina, 4-hidroxiprolina y cisteína, que no se detectan en HPLC
(apartado 1 del presente Capítulo). El análisis por espectrometría de masas
directa permite la identificación de todos los ácidos grasos, incluso de
cadena corta o insaturados. El principal inconveniente radica en que no se
pueden caracterizar simultáneamente otros materiales que pueden estar
presentes en las muestras procedentes de obras pictóricas, como barnices o
ceras.
El trabajo realizado se centró en el estudio de la etapa de tratamiento
de la muestra (hidrólisis, extracción y empleo del disolvente adecuado) así
como en la optimización de las condiciones instrumentales del espectrómetro
de masas, como presión y temperatura del nebulizador, caudal de la corriente
del gas secante, anchura del barrido, masa enfocada y polaridad del detector.
Por último, la cantidad relativa de aminoácidos o ácidos grasos se
considera como parámetro característico de cada clase de aglutinante. Los
datos obtenidos para cada patrón se utilizan para la construcción de un
modelo estadístico mediante Análisis Discriminante Lineal (LDA), una
herramienta quimiométric a que permite aumentar la fiabilidad de la
caracterización. Finalmente, la metodología propuesta se aplicará sobre
muestras reales pertenecientes al Patrimonio Cultural Valenciano.

4.1 Optimización del tratamiento de muestra

4.1.1 Aglutinantes proteicos

La optimización de las condiciones de hidrólisis para muestras que

contienen proteínas se detallan en el apartado 1.1.1 del presente Capítulo.
La detección se realiza bajo polaridad positiva, por lo que los analitos
deben de estar totalmente protonados para obtener una sensibilidad óptima.
El HCl 0,1 mol.L-1 en agua es un excelente disolvente para los aminoácidos
(apartado 1.1.1 del presente Capítulo), y mantiene una cantidad suficiente de
protones en el medio. Sin embargo, la entrada de agua en el nebulizador del
espectrómetro de masas no resulta adecuada, debido a su elevada tensión
superficial y la baja volatilidad. Así pues, la mezcla de aminoácidos se
disuelve en 2 mL de una mezcla HCl 0,1 mol.L-1 en agua/etanol 1:1.
La posible influencia de la hidrólisis sobre los analitos se estudio
mediante el análisis cuantitativo de cada uno de los aminoácidos
_____________________________________________________________
169
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

(1 mmol.L-1 ) por separado, antes y después de ser sometidos al proceso de

hidrólisis (detallado en el apartado 1.5.1 del Capítulo IV), sin que se
observaran modificaciones significativas de la sensibilidad.

4.1.2 Aglutinantes oleosos

La descomposición de los triglicéridos se realiza mediante una

saponificación [18]. Las condiciones experimentales fueron optimizadas
para el análisis de aceites, completando la reacción en un tiempo en
alrededor de 2 minutos, contrariamente a las 16 horas para la hidrólisis ácida
(expuesta en el apartado 3.1.1 del presente Capítulo).
Las sales carboxílicas obtenidas son insolubles en disolventes
apolares, por lo que se acidifica el residuo sólido para producir los
correspondientes ácidos grasos. Estos últimos se extraen con n-hexano
(apartado 3.1.1 de este capítulo), que permite dejar atrás las interferencias
polares, así como el cloruro de potasio formado.
La detección se realizó bajo polaridad negativa, por lo que los analitos
se introdujeron desprotonados en un medio fuertemente básico. Por otra
parte, la inyección de disoluciones salinas concentradas en el espectrómetro
de masas es desaconsejable, por lo que los ácidos grasos se disuelve en KOH
40 mmol.L-1 en n-propanol/metanol 85/15. Este medio proporciona una
adecuada desprotonación y disolución de los ácidos grasos, sin resultar
dañino para la instrumentación.
La mezcla de analitos se introdujo en el nebulizador a través de un
capilar de sílice fundida, impulsada por la aplicación de presión externa. La
automatización del impulso de la disolución de la muestras hacia el
nebulizador proporciona una elevada estabilidad en el caudal de entrada, y
por tanto aumenta la reproducibilidad del método analítico. Por otra parte, el
volumen de muestra introducido se reduce hasta 0,1 mL, por lo que los
analitos se diluyen en una menor cantidad de líquido, aumentando la
sensibilidad.

4.2 Identificación de los analitos

4.2.1 Aminoácidos

La identificación de los analitos se realizó bajo ambas polaridades

(positiva y negativa), ya que los aminoácidos tienen la capacidad tanto de
captar como liberar protones. La detección en forma de cationes proporcionó
una mayor sensibilidad en las medidas, en este caso la identificación de los
aminoácidos se realizará partir de los correspondientes aductos [AA+H]+ con
[M+H]+ m/z. Tal y como se detalla en la sección 1 de este Capítulo,
_____________________________________________________________
170
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

glutamina, asparaguina y triptófano desaparecen durante la hidrólisis, por lo

que no se consideran en el estudio analítico. Leucina, isoleucina y 4-
hidroxiprolina tienen la misma masa molecular, por lo que sus iones se
solapan en el espectro de masas. La diferenciación de dichos analitos que se
propone está basada en la comparación de los espectros de masas de segundo
grado (MS2 ), obtenidos a partir de la fragmentación de los iones
moleculares. Así pues, la isoleucina y la leucina siguen siendo
indistinguibles, mientras que la 4-hidroxiprolina proporciona un MS2
claramente diferenciado. No obstante, en las muestras de proteínas patrón no
se encontró 4-hidroxiprolina, por lo que este aminoácido no se incluye en el
estudio analítico. Asimismo, leucina e isoleucina se consideraron de forma
conjunta.
Los aminoácidos seleccionados para el estudio analític o, el etiquetado
de sus correspondientes iones y sus masas moleculares se exponen en la
Tabla 20.

Tabla 20. Parámetros analíticos de los aminoácidos estudiados.

amino ácido masa molecular (g.mol-1)
glicina 75,07
alanina 89,09
serina 105,09
prolina 115,13
valina 117,15
treonina 119,12
cisteína 121,15
leucina+isoleucina 131,17
ácido aspártico 133,10
lisina 146,16
ácido glutámico 147,13
metionina 149,21
histidina 155,16
fenilalanina 165,19
arguinina 174,20
tirosina 181,19
La equivalencia entre los iones y los aminoácidos se comprobó mediante análisis
independientes de cada uno de ellos.

4.2.2 Ácidos grasos

Los ácidos grasos se detectan en el espectrómetro de masas

aprovechando sus propiedades ácidas bajo polaridad negativa, por lo que se
introducen en el nebulizador en forma de carboxilato. Cada analito se detecta
como ion R-COO-, del valor m/z equivalente a [M-H]-.
La espectrometría de masas permite la identificación de numerosos
ácidos grasos, incluyendo los ácidos grasos poliinsaturados inestables
causantes de las propiedades secantes, así como los productos de
_____________________________________________________________
171
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

descomposición como los ácidos de cadena corta y los ácidos dicarboxílicos.

Estos últimos, son doblemente ácidos y en este caso se detectan a partir del
ion monodesprotonado de masa molecular [M-H]-. Los ácidos grasos
seleccionados para el estudio analítico, sus correspondientes iones y masas
moleculares se detallan en la Tabla 21.

Tabla 21. Parámetros analíticos de los ácidos grasos estudiados.

Ácido graso Ion [M-H] (m/z)
caprílico (C8) 143*
pelargónico (C9) 157
cáprico (C10) 171
subérico (diC8) 173
eicosanoico (C11) 185
azelaico (diC9) 187
láurico (C12) 199*
sebácico (diC10) 201
mirístico (C14) 227*
palmitoleico (C16:1) 253
palmítico (C16) 255*
linolénico (C18:3) 277
linoleico (C18:2) 279
oleico (C18:1) 281*
esteárico (C18) 283*
* La equivalencia entre los iones y los ácidos grasos indicados se comprobó mediante análisis
independientes de cada uno de ellos.

4.3 Optimización de los parámetros instrumentales

4.3.1 Detección de los aminoácidos

Las condiciones instrumentales se optimizaron empleando como

muestra la mezcla de aminoácidos procedente de la hidrólisis de gelatina
bovina. El barrido del detector (50-300 m/z) cumple ampliamente el
intervalo de masas de los analitos, y se deja un margen superior para detectar
posibles productos secundarios o péptidos.
La precisión y la sensibilidad de las medidas disminuyen para iones de
masas moleculares alejados de la masa molecular (m/z) a la que se focalizan
las medidas. Un estudio realizado a varios valores mostró que este efecto era
mucho más acusado para los iones ligeros, por lo que para el presente
estudio se comprobó que los mejores resultados se obtuvieron empleando
como masa molecular enfocada un valor de 90 m/z.
La optimización de la temperatura se realizó entre 80ºC y 350ºC. Las
representaciones gráficas de los valores del logaritmo de abundancia relativa
frente a la temperatura de secado se pueden observar en la Figura 28.

_____________________________________________________________
172
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Figura 28. Logaritmo decimal de las abundancias relativas de los iones correspondientes a los
aminoácidos a partir de la hidrólisis de una gelatina bovina, detectados mediante
espectrometría de masas directa en función de la temperatura. Condiciones instrumentales
optimizadas, presión del nebulizador 25 psi y caudal del gas secante 8 L.min-1. Aminoácidos
(numerados en orden de masa molecular): A): (7) cisteína, (13) histidina, (15) arguinina, (16)
tirosina, B) (1) glicina, (2) alanina, (3) serina, (5) valina, (6) treonina, (9) ácido aspártico, (12)
metionina, C) (4) prolina, (8) isoleucina y leucina, (11) ácido glutámico, (10) lisina y (14)
fenilanalina.

_____________________________________________________________
173
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Los resultados muestran tres grupos de aminoácidos con diferente

comportamiento frente a la temperatura. Para la cisteína, histidina, arguinina
y tirosina, altas temperaturas de secado proporcionan elevadas
sensibilidades, probablemente debido a que se produce una volatilización y
nebulización de los analitos más completa. En el caso de glicina, alanina,
valina, treonina, ácido aspártico y metionina, el incremento de temperatura
provoca una disminución de la señal analítica, debido posiblemente a una
aceleración de procesos de descomposición. Los aminoácidos prolina,
isoleucina y leucina, ácido glutámico, lisina y fenilalanina no resultan
excesivamente influenciados por la temperatura, ya que los dos efectos
detallados más arriba se compensan. Finalmente, el valor intermedio de
250ºC se tomó como temperatura de nebulización óptima.
Se optimizó la presión de nebulización entre 10 y 50 psi (Figura 29).

Figura 29. Logaritmo decimal de las abundancias relativas de los iones correspondientes a los
aminoácidos obtenidos a partir de la hidrólisis de una gelatina bovina, detectados mediante
espectrometría de masas directa, en función de la presión del nebulizador. Condiciones
instrumentales, temperatura de 250ºC y caudal del gas secante 8 L.min -1. Aminoácidos (en
orden de masa molecular): (1) glicina, (2) alanina, (3) serina, (4) prolina, (5) valina, (6)
treonina, (7) cisteína, (8) isoleucina y leucina, (9) ácido aspártico, (10) lisina, (11) ácido
glutámico, (12) metionina, (13) histidina, (14) fenilalanina, (15) arguinina y (16) tirosina.

_____________________________________________________________
174
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Los resultados obtenidos muestran que la presión del nebulizador no

presenta una influencia significativa sobre la sensibilidad. No obstante, para
la instrumentación no resulta aconsejable el empleo de elevadas presiones,
por lo que se seleccionó un valor intermedio (25 psi).
Finalmente, se estudió la influencia del caudal del gas de secado en la
señal en el intervalo comprendido entre 3 y 10 L.min -1 (Figura 30).

Figura 30. Logaritmo decimal de las abundancias relativas de los iones correspondientes a los
aminoácidos obtenidos aplicando la metodología propuesta a una muestra de gelatina bovina,
detectados mediante espectrometría de masas directa en función del caudal del gas secante.
Condiciones instrumentales optimizadas, temperatura de 250ºC y presión del nebulizador 25
psi. Aminoácidos indicados como en la Figura 29.

Los datos obtenidos muestran que el caudal del gas secante no es

significativo a partir de 5 L.min -1 , por lo que para asegurar una sensibilidad
adecuada, se escogió un caudal de 8 L.min-1 .

4.3.2 Detección de los ácidos grasos

Los parámetros instrumentales se fijaron tras su optimización a partir

del análisis de muestras de aceites mediante espectrometría de masas directa
a una temperatura de trabajo de 200ºC, presión del nebulizador a 25 psi, y e l
caudal de la corriente de gas portador a 5 L.min -1 [290]. La optimización de
_____________________________________________________________
175
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

los potenciales del capilar y de las máscaras fue realizada de forma

automática por el instrumento a partir del análisis de la mezcla de ácidos
grasos obtenidos por hidrólisis de una muestra procedente de aceite de
adormidera patrón envejecido térmicamente (expuesto en el apartado 3.2 del
Capítulo IV).
El barrido del detector seleccionado fue de 100 a 400 m/z, el cual
cubre ampliamente el intervalo de masas moleculares de ácidos grasos, y se
deja un margen superior para detectar posibles productos secundarios. El
detector se enfoca a 255 m/z, correspondiente a ion palmitato, debido a que
se suele tomar como referencia en la caracterización de aceites secantes
[163,165].

4.4 Estudio analítico de las muestras patrón

4.4.1 Análisis de proteínas

La metodología analítica se aplicó al estudio de una muestra

procedente de patrones de los aglutinantes proteicos más extendidos en
decoración de témperas y temples: gelatina porcina y bovina, caseína,
proteína de huevo y albúmina (descritas en el apartado 1.2 del Capítulo IV).
La señal obtenida se promedia durante un minuto, para reducir la influencia
de las posibles oscilaciones de caudal durante la detección. El espectro de
masas resultante del análisis de albúmina se representa en la Figura 31.

Figura 31. Espectro de masas obtenido a partir del análisis de la mezcla de aminoácidos
extraídos por hidrólisis de una muestra patrón de albúmina. Condiciones instrumentales:
temperatura de trabajo 200ºC, presión del nebulizador 25 psi y caudal del gas 5 L.min-1,
ionización por ESI. Aminoácidos indicados como en la Tabla 20.

_____________________________________________________________
176
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Los resultados muestran que cada aminoácido se detecta sin

solapamiento con el resto (excepto para el caso de leucina e isoleucina), ni
hay interferencias con otras sustancias de la matriz, pese a no haber etapa
previa de separación. Tampoco se encontraron restos de péptidos u
oligómeros no hidrolizados de proteínas. La sensibilidad proporcionada
también se consideró adecuada para esta clase de muestras.

4.4.2 Análisis de aceites secantes

El método analítico sugerido se aplicó a muestras procedentes de

muestras de patrones de los aglutinantes más habituales en pinturas al óleo:
aceites de linaza, nuez y adormidera, envejecidas naturalmente durante 5
años, así como por tratamiento acelerado térmicamente y por radiación UV
(descritas en el apartado 3.2 del Capítulo IV). El espectro de masas
resultante del análisis de aceite de adormidera envejecido térmicamente se
muestra en la Figura 32.
Debido a la elevada resolución del espectrómetro de masas, los iones
correspondientes a los ácidos grasos aparecen sin solapamiento entre ellos,
incluso aquellos que se diferencian tan sólo en un doble enlace. Asimismo,
no se observan interferencias con otras sustancias de la matriz, ni la
presencia de iones de masa elevada con una abundancia relativa
significativa, correspondientes a triglicéridos parcialmente hidrolizados.

Figura 32. Espectro de masas obtenido a partir del análisis de aceite de adormidera
envejecida térmicamente. Condiciones instrumentales: temperatura de trabajo 200ºC, presión
del nebulizador 25 psi, caudal del gas secante 5 L.min-1, ionización mediante ESI. Los ácidos
grasos se indican a través de sus masas moleculares (Tabla 21).
_____________________________________________________________
177
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

4.5 Caracterización de patrones de aglutinantes

4.5.1 Diferenciación entre aglutinantes proteicos

La caracterización de las proteínas se basa en un tratamiento

estadístico mediante Análisis Discriminante Lineal, que proporciona una
clasificación quimiométrica.
Las categorías definidas para el LDA son las 5 clases de proteínas,
(caseína, albúmina, huevo, gelatina bovina y gelatina porcina). El conjunto
de entrenamiento está constituido por los objetos correspondientes a las
muestras y cada una de sus réplicas. Por lo tanto, se dispone de 83 objetos
estadísticos, repartidos en las 5 categorías siguientes: albúmina, caseína,
huevo, gelatina bovina y gelatina porcina , tomando 23; 14; 12; 22 y 7
objetos, respectivamente. Por su parte, las variables consideradas son los
iones correspondientes a los 16 aminoácidos estudiados (Tabla 20). La
matriz de datos resultante es de 83x16.
Para reducir la influencia de la masa de muestra inicial tomada, se
optó por normalizar las variables mediante dos procedimientos : A) en el
primero los valores de abundancia relativa para cada aminoácido (Ab(AA))
se divide por la suma de los valores de abundancia relativa de todos los
aminoácidos, y B) en el segundo la abundancia relativa de cada analito se
corrige calculando su cociente con la masa molecular del correspondiente
aminoácido MW(AA), y posteriormente cada valor Ab(AA)/MW(AA)
obtenido se divide por la suma de las abundancias relativas corregidas de
cada ion.
Ab( AA)
A) Ab( AA)NA = 16

∑ Ab( AA)
i =1
i

Ab( AA)
MW ( AA)
B) Ab( AA) NB = 16
Ab( AA) i
∑
i= 1 MW ( AA) i

En primer lugar, se construyó un modelo mediante LDA utilizando las

variables normalizadas mediante el primer procedimiento de normalización
(A). El gráfico de las puntuaciones de las dos primeras funciones
discriminantes muestra una separación suficiente entre los objetos
correspondientes a cada categoría, excepto en el caso de la s gelatinas de vaca
y de cerdo que aparecen mezclados. Debido a ello, se reconstruye un nuevo

_____________________________________________________________
178
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

modelo, reuniendo los objetos de las gelatinas en una nueva categoría

denominada “gelatina animal” (Modelo I), en este caso los 4 grupos
aparecen correctamente separados. La fase de selección excluye la s variables
treonina, isoleucina+leucina, ácido glutámico, ácido glutámico, fenilalanina
y arguinina, por lo que el modelo se construye a partir de las abundancias
relativas normalizadas de los iones correspondientes a los siguientes
aminoácidos : glicina, alanina, serina, prolina, valina, cisteína, ácido
aspártico, lisina, metionina, histidina y tirosina. Los valores de los
coeficientes estandarizados para las tres primeras funciones discriminantes y
las coordenadas del centroide de cada uno de las categorías se expresan en
las Tablas 22 y 23, respectivamente. El gráfico de puntuaciones de las dos
primeras funciones discriminantes construidas para este modelo exhibe una
correcta resolución de la nube de objetos estadísticos en función de las
cuatro categorías. (En este caso, no se representa el gráfico obtenido, porque
se continúa la optimización del modelo).

Tabla 22. Coeficientes estandarizados de cada aminoácido para cada función discriminante
obtenidos en la construcción del Modelo I por LDA, para la caracterización de los
aglutinantes proteicos utilizando las variables normalizadas por el procedimiento A.
función discriminante
aminoácido 1 2 3
gly 0,807 0,315 0,257
ala -0,380 0,16 -1,632
ser 2,07 1,219 -0,100
pro 1,054 -0,418 0,852
val -0,965 -0,150 0,686
thr excluida
cys -0,115 0,578 0,314
ile+leu excluida
asp 0,768 -0,404 -0,173
lys 0,037 -0,123 0,645
glu excluida
met -0,210 -0,745 -0,191
his -0,988 -0,239 0,159
phe excluida
arg excluida
tyr -0,160 0,686 0,965

Tabla 23. Puntuaciones de los centroides de cada categoría (proteína) para el Modelo I.
función discriminante
categoría 1 2 3
albúmina -7,066 -1,743 -1,797
caseína -2,09 -1,315 3,020
gelatina animal 8,417 -0,699 -0,519
huevo -2,174 7,122 -0,083

_____________________________________________________________
179
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

En segundo lugar, se construye un nuevo modelo de LDA utilizando

las variables normalizadas por el segundo procedimiento (B), y las cuatro
categorías definidas anteriormente (albúmina, caseína, proteína de huevo y
gelatina animal) (Modelo II). El proceso de selección de variables originales
excluye las abundancias relativas correspondientes a los mismos
aminoácidos que el Modelo I. El gráfico de puntuaciones de las dos primeras
funciones discriminantes se muestra una separación entre las diversas
categorías que supera la obtenida en el caso del Modelo I, aumentando
ligeramente la distancia entre los centroides. Los valores obtenidos para los
coeficientes estandarizados y de las coordenadas de los centroides se
detallan en la Tabla 24 y 25, respectivamente.

Tabla 24. Coeficientes estandarizados para cada variable original, obtenidos a partir de la
construcción del Modelo II por LDA, para la caracterización de proteínas utilizando las
variables normalizadas por el procedimiento B.
función discriminante
aminoácido 1 2 3
gly 0,801 0,355 0,229
ala -0,355 -0,126 -0,512
ser 0,221 1,227 -0,062
pro 0,961 -0,325 0,878
val -0,902 -0,027 0,714
thr excluida
cys -0,073 0,576 0,310
ile+leu excluida
asp 0,812 -0,0384 -0,121
lys 0,000 -0,037 0,675
glu excluida
met -0,212 -0,785 -0,148
his -1,029 -0,246 0,144
phe excluida
arg excluida
tyr 0,002 0,775 0,928

Tabla 25. Puntuaciones de los centroides de cada categoría (proteína) para el Modelo II.
función discriminante
categoría 1 2 3
albúmina -7,170 -1,848 -1,722
caseína 8,391 -0,782 -0,517
gelatina animal -2,851 -1,092 3,305
huevo -2,020 7,160 -0,255

Finalmente, se construye un nuevo modelo matemático empleando

como variables originales las abundancias relativas de los iones
correspondientes a los aminoácidos seleccionados para el Modelo II. Para
minimizar el aporte de información errónea, se repite la normalización

_____________________________________________________________
180
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

llevada a cabo mediante el procedimiento B), pero considerando únicamente

las abundancias relativas corregidas de los siguientes aminoácidos : glicina,
alanina, serina, prolina, valina, cisteína, ácido aspártico, lisina, metionina,
histidina y tirosina, por lo que la matriz de datos tiene como dimensiones
83x11 (Modelo III). El modelo estadístico finalmente obtenido proporciona
una adecuada separación entre los objetos pertenecientes a diferentes
categorías y centroides, mucho mayor que la obtenida en los dos Modelos
anteriores. Los valores de coeficientes estandarizados de las variables
originales sobre las tres primeras funciones discriminantes y las coordenadas
de los centroides de las cuatro categorías se muestran en las Tablas 26 y 27,
respectivamente. El gráfico de puntuaciones de los objetos estadísticos en el
espacio de las dos primeras funciones discriminantes se representa en la
Figura 33.

Tabla 26. Coeficientes estandarizados para cada variable original para las tres primeras
funciones discriminantes, obtenidos a partir de la construcción del Modelo III por LDA, para
la caracterización de proteínas utilizando las variables normalizadas por el procedimiento B.
función discriminante
aminoácido 1 2 3
gly 0,984 0,607 0,158
ala 0,184 -0,118 0,834
ser -0,963 1,050 0,063
pro 2,178 -0,096 0,230
val excluida
cys 0,930 0,433 -0,154
asp 1,801 -0,298 0,466
lys 1,469 0,011 0,018
met 0,212 -0,745 0,413
his excluida
tyr 0,576 0,720 -0,638

Tabla 27. Puntuaciones de los centroides de cada categoría (proteína) para el Modelo II.
función discriminante
categoría 1 2 3
albúmina -8,207 -2,366 1,087
caseína 8,852 0,371 0,738
gelatina animal -0,023 -1,508 -2,339
huevo -7,501 8,035 -0,218

La diferenciación entre las gelatinas de vaca y de cerdo se llevó a cabo

mediante la construcción de un modelo quimiométrico, tomando como
muestras las réplicas de las gelatinas bovina y porcina, considerando
únicamente estas dos categorías, y como variables originales las abundancias
relativas correspondientes a los iones de los 16 aminoácidos estudiados
normalizados mediante el procedimiento B (Modelo IV). En este caso el

_____________________________________________________________
181
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

proceso de selección de variables por pasos incluye para el modelo los

siguientes aminoácidos: glicina, alanina, treonina, isoleucina+leucina, ácido
glutámico histidina y arguinina. El modelo por LDA proporciona una única
función discriminante, a lo largo de la cual se situan los objetos estadísticos,
claramente separados por categorías (Figura 34). Los valores de los
coeficientes estandarizados de cada variable original para la función
discriminante y las coordenadas de los centroides de las categorías
correspondientes a las gelatinas se muestran en la Tabla 28.

Figura 33. Gráfico de puntuaciones para los DF1 y DF2 obtenidos aplicando un LDA a los
resultados obtenidos a partir del análisis por espectrometría de masas directa de albúmina,
caseína, proteína de huevo y gelatina animal.

Figura 34. Gráfico de puntuaciones unidimensional para la función discriminante

proporcionada por el modelo LDA a partir de los datos de abundancia relativa de los iones
correspondientes a los aminoácidos a partir del análisis por espectrometría de masas directa
de gelatina de cerdo y de vaca.

_____________________________________________________________
182
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Tabla 28. Coeficientes estandarizados para cada variable y puntuaciones los centroides de las
dos categorías consideradas.
punt uaciones del centroide
aminoácido coeficientes estandarizados categoría DF
gly -1,028 gelatina bovina 5,617
ala 3,761 gelatina porcina -1.787
thr 1,754
ile+leu 1,438
glu 1,765
his -4,065
arg 5,072

4.5.2 Diferenciación entre aglutinantes oleosos

La caracterización de los aglutinantes que se propone , consiste en la

construcción de un modelo quimiométrico mediante LDA a partir del
análisis de los perfiles de aceites secantes obtenidos mediante espectrometría
de masas.
Los objetos estadísticos considerados para el conjunto de
entrenamiento, con los que se construye el modelo quimiométrico, son las
réplicas analizadas para cada clase de aceite secante patrón y de
envejecimiento, en total 82, distribuidos tal y como se indica en la Tabla 29.

Tabla 29. Número de muestras patrón para cada aglutinante lipídico patrón y clase de
envejecimiento.
envejecimiento
acelerado acelerado por
aceite secante natural (5 años) nº de objetos
térmicamente irradiación UV
linaza 15 8 9 32
adormidera 4 12 12 28
nuez 7 8 7 22
nº de objetos 26 28 28
nº total de objetos=82

La clasificación de las muestras se realizó de acuerdo a su origen

independientemente del envejecimiento experimentado. Las variables
originales a partir de las cuales se clasifican la s muestras son las abundancias
relativas de los iones correspondientes a los 15 ácidos grasos estudiados,
cuyos valores de m/z ([M-H]-) se exponen en la Tabla 21.
Con el objetivo de evitar que la diferencia de cantidad de muestra
tomada en dos réplicas influya en el resultado, se propone la normalización
de las variables mediante tres procedimientos: C) las abundancias relativas
para cada carboxilato se dividen por la suma de las abundancias relativas de
todos los ácidos grasos, D) los valores de abundancia relativa se dividen los
la suma de las abundancias relativas de los ácidos grasos saturados

_____________________________________________________________
183
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

(caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico y esteárico), ya que debido a

su estabilidad, se considera que la variabilidad será menor, y E) los valores
de abundancia relativa de cada ácido graso se dividen por las abundancias
relativas de cada uno de los demás ácidos grasos y, para cada par de iones, se
toma únicamente un cociente, para eliminar variables correlacionadas. Así
pues, a partir de los 15 ácidos grasos se obtienen 105 cocientes.
A partir de los datos obtenidos se construyeron tres modelos
quimiométricos por LDA, tomando como variables los valores normalizadas
por los tres procedimientos anteriormente descritos. La matriz de datos fue
82x15 para las normalizaciones C) y D), mientras que para la E) fue de
82x105. En todos los casos el modelo construido proporcionó dos funciones
discriminantes. El último modelo fue el que resolvió más adecuadamente la
nube de puntos estadísticos, diferenciando correctamente cada objeto
estadístico en función de la clase de aceite secante (linaza, nuez y
adormidera), con una ëW =0,201 (Figura 35). Los valores de los coeficientes
estandarizados para las 12 variables originales que influyen más sobre las
funciones discriminantes se muestran en la Tabla 30.

Figura 35. Gráfico de puntuaciones de las dos funciones discriminantes calculadas por el
modelo construido por LDA, a partir de los resultados obtenidos del análisis de muestras de
(o) linaza, (+) nuez, ( ) adormidera, mediante espectrometría de masas directa.

La función discriminante 1 diferencia el aceite de adormidera de los

otros aglutinantes oleosos, y está influenciado principalmente por los
siguientes cocientes de abundancias relativas: palmítico/cáprico,
palmitoleico/ subérico, esteárico/subérico y oleico/linoleico. Por su parte, la
función discriminante 2 discrimina entre el aceite de linaza y de nuez, y
_____________________________________________________________
184
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

depende esencialmente de los cocientes palmitoleico/azelaico,

sebácico/azelaico, linolénico/pelargónico y palmítico/cápric o.

A) B)

Figura 36.A) Imagen de la Capilla del Ecce Homo (Pego, Comunidad Valenciana), B) Techo
policromado del Salón Dorado de la Lonja de Valencia.

Tabla 30. Coeficientes estandarizados de los cocientes de abundancias relativas más

importantes para el modelo construido por LDA, para la diferenciación entre las clases de
aceite secante, considerando lo ácidos grasos expuestos en la Tabla 20 y normalización de la
abundancia relativa por el procedimiento E).
función discriminante
cocientes entre los ácidos grasos 1 2
diC8/C9 -0,629 -0,425
C18:3/C9 0,141 0,763
C14/C10 -1,358 -0,002
C16/C10 4,275 0,712
C16:1/diC8 -3,176 -0,593
C16/diC8 1,956 -0,078
C18/diC8 -2,430 -0,588
diC8/diC9 -0,442 -1,473
C18:2/diC9 0,135 1,522
diC10/C12 1,473 0,273
C16/diC10 -1,084 -0,489
C18:1/C18:2 3,05 0,677

_____________________________________________________________
185
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

Con el objetivo de estudiar la influencia del deterioro en los aceites

secantes se construyó un nuevo modelo de LDA, utilizando las variables
normalizadas por el procedimiento E), y considerando como categorías, el
tratamiento de envejecimiento aplicado (natural, acelerado térmicamente y
degradado por irradiación UV), sin tener en cuenta el origen vegetal. Así
pues, la matriz de datos tendrá una dimensión de 82x105.
El modelo estadístico por LDA calcula dos funciones discriminantes,
las cuales permiten la separación de las tres categorías consideradas. Como
se muestra en la Figura 37, los objetos estadísticos se encuentran
adecuadamente agrupados por la clase de tratamiento de degradación
experimentado.

Figura 37. Gráfico de puntuaciones para las DF1 y DF2, calculadas a partir del estudio
estadístico por LDA, de las muestras procedentes de aceites secantes patrón envejecidas
(naturalmente, y acelerado térmicamente y por irradiación UV), analizadas por espectrometría
de masas directa.

En el gráfico de puntuaciones trazado se aprecia que la función

discriminante 1 permite diferenciar el envejecimiento natural de los
tratamientos de deterioro acelerado, mientras que la función discriminante 2
distingue entre las muestras de aceites secantes patrón envejecidas mediante
tratamiento por UV y las muestras degradadas mediante los otros dos
procedimientos. Los valores de los coeficientes estandarizados para 14
cocientes seleccionados con más influencia sobre las funciones
discriminantes se muestran en la Tabla 31.
Los resultados muestran que la función discriminante 1 está
constituida principalmente por las proporciones oleico/linolénico,
_____________________________________________________________
186
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

oleico/subérico, subérico/caprílico y linolénico/pelargónico. Por otra parte,

las variables originales con más peso sobre la segunda función discriminante
son los cocientes palmitoleico/pelargónico, palmítico/pelargónico,
linoleico/subérico y oleico/subérico.

A) B)

Figura 38. Obras pictóricas realizadas en el siglo XVI: A) “Tríptico de la Magdalena”

(Maestro de Alzira) y B) “Altar de Cinctorres” (Bernat Serra).

Tabla 31. Coeficientes estandarizados de las 14 variables originales más importantes para el
modelo construidos mediante tratamiento estadístico de los datos por LDA, para la
diferenciación de los diversos tratamientos de envejecimiento experimentados por los aceites
secantes patrón.
función discriminante
cocientes entre los ácidos grasos 1 2
C10/C8 -1,590 -0,720
diC8/C8 2,149 0,928
C12/C9 0,774 0,375
C16:1/C9 0,779 -2,732
C16/C9 -0,902 1,803
C18:3/C9 -1,505 0,491
C18:1/C9 1,396 0,588
C11/C10 -0,081 -0,762
diC9/C10 0,235 -0,754
C18:2/diC8 1,576 1,301
C18:1/diC8 -3,046 -1,087
C14/C12 -0,756 1,003
C18:2/C16:1 -0,038 -0,737
C18:1/C18:3 3,179 0,969

_____________________________________________________________
187
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. PROTEÍNAS Y ACEITES SECANTES

4.6 Aplicación de la metodología propuesta a muestras procedentes de

obras pictóricas

4.6.1 Témperas y temples

Con el propósito de comprobar la capacidad de la metodología

sugerida para la caracterización de aglutinantes proteicos en muestras reales,
se aplicó al estudio de las obras pictóricas decoradas en témpera o temple ,
analizadas mediante HPLC-Fluorescencia en el Capítulo 1 de la presente
Memoria. La Figura 38 muestra dos de las obras pictóricas del siglo XVI a
partir de las cuales se obtuvieron las muestras analizadas: “Tríptico de la
Magdalena”, realizada por el Maestro de Alzira (Muestra 2) y “Altar de
Cinctorres”, por Bernat Serra (Muestra 3).
Los resultados obtenidos muestran que los aminoácidos aparecen en
los espectros de masas con sensibilidad adecuada y sin interferencias con
otras sustancias presentes en la matriz. Al aplicar los modelos constituidos
sobre las muestras de obras pictóricas, sus correspondientes aglutinantes
fueron clasificados como proteína de huevo, al igual que en los estudios
anteriores expuestos en el apartado 1 del presente Capítulo.

4.6.2 Pinturas al óleo

El modelo de LDA construido para la identificación del aglutinante

lipídico, se aplicó para la caracterización de aceites secantes en obras
pictóricas decoradas al óleo, las cuales se indican en apartado 4.3 del
Capítulo IV. La Figura 36 muestra dos de los elementos del Patrimonio
Cultural a partir de los cuales se obtuvieron dos de las muestras analizadas,
la Capilla del Ecce Homo (siglo XVIII, Pego, Comunidad Valenciana)
(Muestra 18) y el techo policromado del Salón Dorado de la Lonja de
Valencia (siglo XV) (Muestra 19).
En todos los casos se identificó el aglutinante oleoso empleado como
aceite de linaza. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos en
el apartado 3.4.2 del presente Capítulo, aplicando las técnicas de HPLC-UV-
Visible y HPLC-Fluorescencia. La espectrometría de masas permitió
aumentar la rapidez de la metodología y reducir la incertidumbre de los
valores obtenidos debido a la simplificación del tratamiento de muestra,
principalmente la exclusión de etapas de derivatización y de resolución, sin
que ello conllevara una disminución de la sensibilidad. Se empleó una menor
cantidad de reactivos tóxicos que en el caso de la HPLC, disminuyendo el
impacto medioambiental.

_____________________________________________________________
188
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

5. Caracterización de los constituyentes de barnices de violines y laúdes

italianos de la época renacentista mediante cromatografía gaseosa
acoplada a espe ctrometría de masas

El barniz en las obras de arte desempeña generalmente una función de

protección de la superficie. En el caso de los instrumentos musicales, la capa
filmógena forma parte del objeto artístico, ya que ejerce una gran influencia
sobre su apariencia y propiedades sonoras. Sin embargo, el barniz
experimenta procesos de degradación, generalmente asociados a la oxidación
progresiva de las sustancias que lo componen y que están causadas,
principalmente, por agentes medioambientales externos, lo que conduce a la
necesidad de su restauración. En estos casos, resulta esencial modificar lo
menos posible la composición química de la capa filmógena original [5].
El conocimiento acerca de los barnices que recubren la superficie de
los instrumentos musicales de cuerda de la época renacentista, como los
ingredientes aplicados en su elaboración, la estructura y la estratigrafía de las
capas, permite alcanzar una mayor información acerca de las técnicas
antiguas de barnizaje, para poder adaptar las condiciones de conservación,
exposición y evaluar su eventual fragilidad en el caso de volver a ser
reutilizados por un músico. Asimismo, un conocimiento más extenso acerca
de la naturaleza del barniz puede resultar útil para proponer tratamientos de
restauración/conservación adecuados, y que sean lo más respetuoso posible
con la composición química de la capa filmógena original [5].
El estudio analítico propuesto consiste en la identificación de las
sustancias presentes en una serie de materiales de referencia (aceites
esenciales y secantes, resinas terpénicas, bálsamos, goma laca, y material
resinoso de origen animal), principalmente ácidos grasos e
hidroxicarboxílicos y compuestos terpénicos y aromáticos, así como
alcoholes, aldehidos y cetonas. Consecuentemente se establece la
identificación de tales componentes en las muestras procedentes de barnices
de instrumentos de cuerda de la época renacentista.
El método de análisis de estas sustancias, que se propone por GC/MS,
está basado en una etapa inicial la transesterificación y metilación de los
grupos carboxílicos, mediante la adición de un reactivo de amonio
cuaternario ((m-trifluorometilfenil) trimetilamonio), seguido de una segunda
etapa de sililación por adición de N,O-bis[trimetilsilil]trifluoroacetamida +
trimetilclorosilano (99/1 v/v) (BSTFA+TMCS) para bloquear los grupos
hidroxilo. Después de cada etapa se introdujo una alícuota en el sistema
cromatográfico para la separación e identificación de sus compuestos a partir
de los tiempos de retención y los espectros de masas obtenidos, mediante
comparación con datos bibliográficos y bibliotecas generales de espectros.

_____________________________________________________________
189
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Los espectros de masas de los picos cromatográficos más intensos,

obtenidos a partir del análisis de cada material de referencia se introducen en
una biblioteca de espectros, junto a otras características como el tiempo de
retención, el nombre (si ha sido posible la identificación), el ingrediente del
que proviene y la intensidad relativa en orden decreciente. Los picos
cromatográficos de la s muestras reales se compararon con los almacenados
en la biblioteca de espectros, con el objetivo de identificar el máximo
número posible de sustancias en los barnices. Cuando se detectan varias
sustancias de un ingrediente, se sugiere que éste fue utilizado en la
elaboración de la correspondiente capa filmógena.
Las limitaciones del método radican principalmente en la variabilidad
natural de la composición química de los materiales de referencia y las
posibles diferencias con los ingredientes del barniz, que depende de factores
diversos como la localización geográfica, la época de la cosecha y de los
tratamientos experimentados durante la elaboración del propio barniz
(calentamiento, disolución, purificación e interacción con otros
ingredientes). El envejecimiento de las muestras modificará la estructura de
las moléculas presentes, aumentando su grado de oxidación y
polimerización.

5.1 Optimización del método de análisis de los materiales de

referencia

Los materiales de referencia están compuestos por sustancias con

grupos carboxílicos no volátiles y en algunos casos en forma de polímeros,
por lo que no son directamente analizables por GC/MS. Así pues, la fase de
transesterificación introducida produce la ruptura de los enla ces
intermolecula res y la metilación de los ácidos carboxílicos. El uso de un
transesterificante como el m-trifluorometilfenil)trimetilamonio en metanol,
permite obtener los derivados con una única etapa [77].
La optimización de las condiciones de la derivatización se lle vó a cabo
mediante el estudio de la influencia de la temperatura y tiempo de reacción,
mediante análisis a varios valores, manteniendo los demás parámetros
inalterados (Tabla 32 y 33, respectivamente). Como referencia se toma el
área del pico cromatográfic o correspondiente al ácido deshidroabiético
(DHA) en la resina de colofonia, en la muestras con mayor grado de
envejecimiento.
Los resultados obtenidos muestran que la temperatura óptima de
trabajo de 80ºC, mientras que un tiempo de reacción de 18 h fue considerado
para la reacción.

_____________________________________________________________
190
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Tabla 32. Áreas del pico cromatográfico equivalente al derivado metilado del ácido
deshidroabiético para la resina de colofonia más envejecida a varias temperaturas.
T (ºC) 60 70 80 90 100
Área del pico ME-DHA (unidades 80±8 93±5 100±3 98±4 95±6
arbitrarias)
V= 0,2 ml y tiempo de reacción 36 h.
Desviación estándar para tres medidas independiente.

Tabla 33. Áreas del pico cromatográfico del derivado metilado del ácido DHA para la resina
de colofonia más envejecida a varios tiempos de reacción.
Tiempo (h) 6 12 15 18 36
Área de pico ME-DHA 70±10 85±9 97±4 99±2 100±3
(unidades arbitrarias)
V= 0,2 ml y T=80ºC
Desviación estándar para tres medidas independientes.

La segunda derivatización propuesta consiste en bloquear los

hidroxilos por sililación por adición de un grupo trimetilsilano (TMS,
–Si(CH3 )3 ). Esta modificación altera la polaridad, la volatilidad y la masa
molecular de la molécula, e incrementa la resolución en la columna capilar
seleccionada para el estudio analítico. Por otra parte, la modificación de las
propiedades provoca un cambio en el tiempo de reacción. Así pues, las
moléculas con uno o más grupos alcohol serán fácilmente discernibles
mediante la comparación de los cromatogramas anterior y posterior a la
sililación. Por otro lado, los alcoholes proporcionan espectros de masas
complejos, y habitualmente sin el pico molecular, ya que pueden perder
fácilmente agua y forman aductos con otras sustancias polares. La molécula
sililada presenta dos picos característicos a M-15 y M-90, cuya detección
permiten el cálculo de la masa molecular de forma inmediata. Asimismo, el
bloqueo de los grupos hidroxilos evita las reorganizaciones de los iones y
generación de aductos características de los alcoholes.
La evaporación se desarrolla en condiciones suaves, atmósfera de
nitrógeno y a 40ºC, para evitar que las sustancias se oxiden o se volatilicen y
sean arrastradas por la corriente de gas secante. El disolvente seleccionado
fue el diclorometano, ya que su polaridad intermedia permite solubilizar los
derivados involucrados en el estudio analítico.
La idoneidad del volumen de disolvente utilizado (200 ìL de
cloroformo), se estudio mediante un análisis previo de las muestras patrón
por GC/FID. En todos los casos se obtuvieron sensibilidades adecuadas sin
saturar al detector.

_____________________________________________________________
191
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

5.2 Caracterización de los compuestos en esencias y resinas naturales

patrón

El análisis de las muestras procedentes de los patrones, a través del

procedimiento mediante GC/MS expuesto anteriormente, poporciona el
cromatograma para cada uno de ellos, junto a los espectros de masas de los
picos cromatográficos más importantes. Así pues, los resultados obtenidos
para cada uno de los materiales patrón se almacenaron en forma de
biblioteca de espectros.
En primer lugar, los estudios cromatográficos de cada resina se
realizaron tras el protocolo de metilación y posteriormente la misma alícuota
metilada se sometió al procedimiento de sililación y se analizó por GC/MS.
Los resultados obtenidos permitieron establecer las características más
importantes de los diferentes cromatogramas para cada tipo de resina. Se
tomaron los espectros de masas correspondientes a los picos cromatográficos
más intensos de cada resina analizada, los cuales se almacenan en la
biblioteca de datos, incluyendo la totalidad de la información disponible
acerca del correspondiente compuesto a través del siguiente protocolo:
nombre de la molécula (si se ha identificado), tiempo de retención, orden
decreciente de intensidad y material objeto de análisis. Estas características,
que se incluyen en la Tabla 34, facilitan la identificación de los ingredientes
estudiados, tanto en las muestras reales procedentes de barnices de
instrumentos de cuerda, como para ulteriores análisis de los mismos
materiales en otras clases de muestra.
Los estudios analíticos realizados por GC/MS para cada una de las
resinas patrón proporción asimismo información satisfactoria sobre la
composición química de las mismas. A continuación se exponen, para cada
material, los compuestos detectados que se han identificado
inequívocamente a partir de su tiempo de retención y espectro de masas. Las
sustancias obtenidas coinciden con los constituyentes descritos para cada
material estándar, expuestos en el Capítulo III, apartados 1.5.4 y 1.5.5. En
principio, los resultados obtenidos proporcionan suficientes datos para la
caracterización de resina natural (Tabla 34).
Los aceites esenciales (esencia de trementina y aceite de lavanda),
presentan una gran cantidad de moléculas volátiles (monoterpenos, alcoholes
monoterpénicos y sesquiterpenos) y, en menor medida, moléculas más
pesadas, probablemente polímeros formados a partir de los anteriores. Los
compuestos más ligeros no estarán presentes en las muestras envejecidas,
debido a su evaporación, por lo que únicamente las sustancias más pesadas
podrán atestiguar el uso de estos materiales. En la esencia de trementina se
identificaron los siguientes compuestos: á-pineno, â-pineno, mirceno,
valenceno, cariof ileno, cariofileno oxidado, neocloveno, 3-(6,6-dimetil-2-
_____________________________________________________________
192
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

metilenciclohex-3-enilideno)-1-metil butil acetato, mientras que en la

esencia de lavanda se identificaron las siguientes sustancias: á-pineno, â-
pineno, mirceno, linalol, borneol, acetato de linalilo, valenceno, cariofileno,
cariofileno oxidado, neocloveno, 3-(6,6-dimetil-2-metilenciclohex-3-
enilideno)-1-metil butil acetato y metil sandaracopimarato.
El alcanfor contiene una mezcla de compuestos ligeros con núcleos
aromáticos, los cuales se evaporarán durante el envejecimiento.
El bálsamo de benjuí es una mezcla de sustancias ligeras con núcleos
aromáticos, las cuales posiblemente se evaporen sin dejar indicios de su
presencia. No obstante se detectó un compuesto de mayor masa molecular
(336 g.mol-1 ) el cual es lo suficientemente pesado como para permanecer tras
el envejecimiento.
Los compuestos identificados en la colofonia fueron: los ácidos
pimárico, sandaracopimárico, palústrico, isopimárico, DHA, abiético,
neoabiético, y los derivados oxidados 7-oxo-DHA, 15-hidroxi-7-oxo-DHA,
así como otros diterpenoides hidroxilados. La composición relativa de la
resina depende de la clase de colofonia y de su grado de deterioro. Así pues,
en las muestras más envejecidas abundarán más los hidroxi- y oxoderivados
del DHA, mientras que la concentración de abiético disminuye.
La trementina de Venecia está constituida por los siguientes
compuestos: á-terpineol, careno, i-elemeno, epimanol, pimaral, ácidos
palústrico, isopimárico, 6-deshidrodeshidroabiético, abiético y neoabiético,
así como larixol y acetato de larixilo. Se trata de la única resina que contiene
estos dos últimos compuestos, por lo que la detección de estos compuestos
en una muestra, indicará directamente la presencia de trementina de Venecia.
Comparte una elevada cantidad de sustancias con la resina de colofonia, por
lo que su distinción puede resultar en ocasiones confusa.
La sandaraca está constituida por diterpenoides labdanos (ácidos y
alcoholes). Los compuestos más característicos son los ácidos agático y
comúnico, y además contienen los ácidos sandaracopimárico y 7-oxo-DHA.
La composición química relativa varía en función del origen de la resina.
El copal de Manila está constituido igualmente por ácidos y
alcoholes diterpenoides labdanos, principalmente ácido comúnico, agático y
sus análogos. Asimismo se identificaron los ácidos sandaracopimárico,
abiético y 7-oxo-DHA. La cantidad relativa de cada compuestos está muy
influenciada por la clase de copal estudiado.
En las muestras procedentes de goma laca se detectó ácido
deshidroabiético, abiético ácido jalárico y una gran cantidad de otros ácidos
grasos y sesquiterpenos hidroxilados de compuestos de estructura semejante,
junto a sus correspondientes isómeros. Casi todas las moléculas poseen
grupos hidroxi que dificultan su separación y la obtenció n de los
correspondientes espectros de masas. La composición química de la goma
_____________________________________________________________
193
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

laca depende en gran medida de su grado de purificación.

En la muestras de mastic se identificó una fracción diterpénica
compuesta por ácido comúnico, ácido 6-deshidrodeshidroabiético, ácido
deshidroabiético, abiético, 7-oxo-DHA, así como una mezcla de
triterpenoides ácidos y neutros como á -amirina, ácido oleanónico, aldehido
oleanónico, isomasticadienoic o, masticadienoico y morónico. Este último es
específico del la resina de mastic y se toma como compuesto característico.
La muestra de dammar contiene una mezcla de triterpenoides ácidos y
neutros, de los cuales se identificaron los siguientes: dammaradienona,
dammaradienol, ácido dammarenólico, hidroxidammarenona, aldehido
oleanónico, ácido ursónico y aldehido ursónic o.

5.3 Caracterización de los materiales en barnices de instrumentos

musicales de cuerda de la época renacentista

El estudio minucioso de los cromatogramas obtenidos a partir de las

muestras procedentes de instrumentos musicales permitió confirmar la
presencia de sustancias correspondientes a los ingredientes analizados, así
como otras procedentes de resinas no consideradas en el presente trabajo,
aditivos y materiales introducidos por contaminaciones modernas.
Los cromatogramas (TIC) resultantes de la muestra procedentes del
laúd de Maler y el violín de Stradivarius se muestran en la Figura 39. El
cromatograma resultante del análisis de la tiorba de Venere presenta gran
semejanza con el obtenido del Stradivarius.
En los tres casos, se encuentran ácidos grasos que eluyen entre 23-24
minutos, y diterpenoides entre 24 y 36 minutos. Además, en el caso del laúd
de Maler, aparecen picos cromatográficos correspondientes a triterpenoides a
partir de 37 minutos. La relación entre la cantidad de de ácidos grasos y la de
terpenoides es inferior en el laúd de “Maler” que en la tiorba de Venere y el
violín de Stradivarius.

_____________________________________________________________
194
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Figura 39. Cromatogramas (TIC) obtenidos a partir del análisis de la fracción orgánica del
barniz procedente de un laúd de Maler (parte superior) y de un violín de Stradivarius (parte
inferior). Los compuestos característicos de los aceites secantes se indican en amarillo, los
diterpenoides en verde y los triterpenoides en rojo. Las sustancias señaladas en gris
corresponden a contaminantes modernos.

5.3.1 Aceites secantes

Los ácidos grasos y los productos de degradación (ácidos

dicarboxílicos) procedentes de aceites secantes se identificaron en las tres
muestras reales estudiadas. Por otra parte, la presencia de ceras se rechazó,
debido a la ausencia de otros de sus constituyentes como los hidrocarburos.
De ahí se establece que el material graso detectado proviene íntegramente
_____________________________________________________________
195
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

del aglutinante lipídico sin interferencias. El cociente palmítico/esteárico

calculado para las muestras reales fue de 1,40 y 1,57 para el Maler y el
Stradivarius, por lo que se deduce la presencia de aceite de linaza en el
barniz. En la muestra del Venere la proporción obtenida fue de 1,98, en este
caso se supone que contiene también aceite de linaza, aunque con menor
seguridad [7].
Los resultados indican que el disolvente empleado en la elaboración
del barniz en los tres casos fue aceite de linaza, lo que implica que el
barnizaje de la superficie de los instrumentos de cuerda estudiados incluyó
una larga etapa de secado, dando lugar a una capa muy fina.

5.3.2 Resinas terpénicas

Los parámetros analíticos de la biblioteca de espectros, tales como el

tiempo de retención, iones más importantes del espectro de masas y su
identific ación se incluyen en la Tabla 34, mientras que su presencia en los
diferentes materiales de referencia y muestra procedente del barniz de los
instrumentos musicales estudiados se discute en la Tabla 35.
Los tres barnices analizados presentan una amplia variedad de
diterpernoides, con tiempos de retención entre 23 y 35 minutos. Las
muestras reales tienen en común los picos cromatográficos más intensos de
este grupo, correspondientes a los ésteres metílicos de los ácidos 7-oxo-DHA
y 15-OH-7-oxo-DHA, (compuestos nº 59 y 60 de la Tabla 34), así como
otros derivados de los anteriores (compuestos nº 62; 63; 67 y 68 en la Tabla
34) [77,94]. Los dos primeros son característicos de resinas de Pinaceae
muy oxidadas [64,84], categoría a la que pertenecen la colofonia y la
trementina de Venecia. Otras sustancias de tipo pimarano y abietano también
pudieron ser caracterizadas, a pesar de la baja intensidad de sus
correspondientes picos cromatográficos, debido a su desaparición progresiva
causada por el envejecimiento natural.

5.3.2.1 Muestra procedente del barniz de un laúd de Maler

El análisis de la muestra reveló la presencia de derivados oxidados de

los compuestos característicos de resinas de Pinaceae. Los picos
cromatográficos correspondientes a los labdanoides, larixol y acetato de
larixilo, específicos de la trementina de Venecia. No obstante, debido al
avanzado grado de envejecimiento, no se puede establecer si estas sustancias
estaban presenten en el barniz original y se oxidaron completamente, o si
nunca formaron parte de la capa filmógena. Por ello, se deduce que para la
elaboración del barniz se utilizó una resina diterpénica proveniente de
Pinaceae, sin especificar si se trata de colofonia o trementina de Venecia.
_____________________________________________________________
196
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

El análisis de la muestra reveló la presencia de una abundante fracción

triterpénica, con once sustancias detectadas que no coinciden con las
identificadas en el dammar y mastic patrón.
El estudio de los espectros de masas de los cuatro compuestos más
importantes de la fracción triterpénica (nº 74; 75; 83 y 86 de la Tabla 34),
muestra un pico intenso a 218 m/z, seguido de uno menos intenso a 203 m/z.
Estos fragmentos son característicos de una ruptura primaria de un
triterpenoide pentacíclico, con un doble enlace en la posición 12 (series 12-
urseno y 12-oleaneno), a través de un mecanismo retro-Diels-Alder, seguido
de la pérdida de un grupo metilo [178,295]. Dos de los compuestos
considerados (nº 83 y 86 de la Tabla 34), identificados como â- y á-
amirenona, respectivamente, se encuentran presentes en el elemi de Manila
(Canarium luzonimicum o C. commune), copal mexicano (Bursera cuneata )
[85] y en franquincienso eritreo (Boswellia sp.) [178], perteneciente a la
familia Burseaceae. Por su parte, los compuestos nº 74 y 75 (Tabla 34), se
identificaron como 24-noroleana-3,12-dieno y 24-norursa-3,12-dieno,
respectivamente, a partir de sus espectros de masas y orden de elución, las
cuales se han detectado en las resinas Boswellia carterii, B. serrata y B.
rivae [295], así como en muestras arqueológicas resinosas, caracterizadas
como olíbano, encontradas en tumbas egipcias fechadas en 1897-1844 A.C.
[178].
Los compuestos nº 72 y 73 (Tabla 34) (de masa molecular 392) están
relacionados con los nº 74 y 75 (Tabla 34) (de masa molecular 394). La
comparación entre los espectros de masas sugiere que sus estructuras se
diferencian en una insaturación, por lo que se identifican como el 24-
noroleana-3,9(11),12-trieno y 24-norursa-3,9(11),12-trieno, respectivamente
[295], los cuales no han sido anteriormente detectadas en muestras
procedentes de objetos históricos. La aparición de estas sustancias se debe
probablemente a modificaciones experimentadas por los compuestos
iniciales de la capa filmógena, debido al envejecimiento natural (desde el
suglo XVI), degradación térmica durante la preparación del barniz o durante
la misma inyección de la muestra en el sistema cromatográfico.
Los resultados obtenidos permiten sugerir que la fracción triterpénica
del barniz proviene de una resina o goma resina de la especie Burseaceae, y
posiblemente del género Boswellia. No es posible una caracterización más
precisa acerca del origen botánico de esta resina triterpénica, debido a la
ausencia de biomarcadores de la resinas fresca de Burseaceae, y a la falta de
información sobre los productos de degradación de esta clase de material.
La presencia de resinas triterpénicas en el barniz de un laúd de Maler
de 1529-1555, puede relacionarse con los ingredientes “elemi” e “incienso”,
citados en recetas de barnices de los siglos XIV-XVII. Aunque en la
actualidad, la denominación “elemi” se utiliza generalmente para el elemi de
_____________________________________________________________
197
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Manila (C. luzinicum), en textos antiguos la misma palabra se empleaba para

referirse, entre otros, a resinas procedentes de árboles pertenecientes al
género Icica, así como al elemi africano (o franquincienso africano),
proveniente del Boswellia frereana [296].

5.3.2.2 Muestra procedente del barniz de un violín de Stradivarius

El análisis de la fracción orgánica del barniz del violín de Stradivarius

permitió la identificación de los labdanoides acetato de larixilo (nº35),
larixol (nº29) y el sesquiterpenoide epimanool (nº18) (en la Tabla 34),
específicos de la trementina de Venecia, además de otros diterpenoides
característicos de la resinas procedentes de Pinaceae. Estos resultados
muestran que la trementina de Venecia es uno de los constituyentes del
barniz. Sin embargo, no se puede establecer si además está mezclada con
colofonia, u otras resinas de pino [84,297].
Se detectaron asimismo una serie de triterpenoides (nº73; 74 y 75 en la
Tabla 34), cuyos correspondientes picos cromatográficos presentan una
intensidad muy baja, los cuale s provienen probablemente de una
contaminación. Por ello, no es posible asegurar ni tampoco rechazar la
presencia de una fracción triterpénica.

5.3.2.3 Muestra procedente de la capa filmógena de la tiorba de

Venere

Los resultados obtenidos a partir del análisis por GC/MS de la muestra

procedente de la tiorba de Venere son semejantes a los del Stradivarius. La
detección de acetato de larixilo muestra asimismo que la trementina de
Venecia forma parte del barniz, sin que se pueda exclu ir la presencia de otras
resinas de tipo Pinaceae. La comparación de la intensidad de los picos
cromatográficos de los pimaranos y abietanos correspondientes a los ácidos
7-oxo-DHA y 15-OH-7-oxo-DHA, muestra que la resina diterpénica de la
tiorba está en un estado de oxidación más avanzado que en el caso del
Stradivarius. Esta observación es coherente con el hecho que la tiorba de
Venere fue elaborada 120 años antes que el violín de Stradivarius.
Los triterpenoides detectados cuyos picos cromatográficos presentan
baja intensidad (nº73;74 y 75 en la Tabla 34) provienen probablemente de
una contaminación, por lo que, al igual que en el caso del barniz del
Stradivarius, no se puede llegar a una conclusión definitiva acerca de la
presencia de una fracción triterpénica en la capa filmógena.

_____________________________________________________________
198
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Tabla 34. Parámetros analíticos almacenados en la biblioteca de espectros acerca de las

sustancias encontradas en los materiales de referencia y en las muestras reales, a partir de su
análisis por GC/MS a través de la metodología propuesta (numeradas en orden creciente de
tiempo de retención a partir de 7,50 minutos).
T.R. nombre masa iones más abundantes (m/z)
nº
(min) (propuesto) molecular (proporción relativa (%))
136(10); 121(20); 107(20)
1 7,84 mirceno [67] 136
93(75); 91(90); 67(100)
176(10); 174 (100);
2 8,76 no identificado 176
156(10); 127 (20)
137 (15); 121 (20);
3 8,80 linalool [69] 154
105 (15); 93 (80); 91(100)
136 (55); 121 (55);
4 10,19 á-terpentinol 154
107 (10); 93 (100); 91 (80)
316 (60); 121 (70);
5 10,38 careno 136
93 (100); 91 (95); 77 (60)
6 10,89 no identificado 204 203 (80); 184 (10); 174 (100)
137 (10); 121 (20);
7 11,10 acetato de linalilo [69] 196
105 (15); 93 (70); 91(100)
8 12,49 no identificado 264 -------
204(40);189(50);161(100);
9 13,44 valenceno o semejante 204
133(55),119(55);105(70);91(95)
204(10);189(20);161(25);133(45)
10 13,55 cariofileno o semejante 204
119(35);105(60); 91(100)
204(10);189(20);161(30);121(60)
11 13,63 â-elemeno 204
105 (65); 91 (100)
12 14,40 no identificado 180 -------
13 15,44 cariofileno oxidado 220 121 (20); 105 (45); 91 (100)
236 (30); 204 (30); 176 (100);
14 15,56 neocloveno o semejante 236
161 (95);105 (60)
15 16,80 no identificado 208 208 (100); 177 (75); 146 (20)
250 (30), 235 (35), 190 (55)
16 17,51 no identificado 250
175 (100); 119 (50)
3-(6,6-dimetil-2-
17 17,56 metilenciclohex-3- 248 248 (10); 188 (50); 173 (100)
enilideno)-1-metilbutil
acetato
272(20);257(80);244(30);229(20)
18 22,35 epimanool [74] 290
202(30);190(30);175(30);161(30)
270 (100); 242 (20); 227 (55);
19 23,65 no identificado 270
199 (95);185 (30)
diterpenoide 298(80);283(30);241(35);227(40)
20 24,86 310
no identificado 216 (100);213 (30)
diterpenoide 316 (5);300(95);285(100);
21 25,02 316
no identificado 203 (40);189 (30)
316(10);286(70);271(35);257(60)
diterpenoide
22 25,20 no identificado 316 253(50);243(30);239(30);201(30);
187 (30)
316(70);301(40);241(85);12 (75)
23 25,25 metil cis-comunato [82] 316
105 (80); 91 (100)
diterpenoide 304 (5); 289 (100); 257 (30)
24 25,33 no identificado, sin -OH 304 230 (30); 215 (25); 207 (20)
_____________________________________________________________
199
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

R.T. nombre masa iones más abundantes (m/z)

nº
(min) (propuesto) molecular (proporción relativa (%))
25 25,38 pimaral o semejante 286 286(90); 291(100); 253(30); 241(90)
316(30);301(30);257(40);241(20)
26 25,57 metil pimarato [74] 316
180 (20); 121 (100)
metil trans-comunato 316(50);301(60);256(50);241(80)
27 25,77 316
[84] 175 (70); 105 (75); 91 (100)
metil sandaracopimarato 316(40);301(50);287(25);257(30)
28 25,85 316
[74,82] 241 (35);121 (100)
301(10);288(20);273(30);275(60)
29 25,86 larixol [74] 306
121 (50); 105(60);91(95);79 (100)
diterpeno 316(10);301(25);287(30);256(35)
30 26,55 no identificado 316 241 (40); 188 (30); 121 (100)
316(30);301(15);287(15);256(70)
31 26,56 metil palustrato [74] 316
241 (100); 227 (10); 187 (10)
316(45);301(95);257(15);
32 26,69 metil isopimarato [74] 316
241(100);185 (25)
312(50);237(100);197(85);
33 27,00 metil 6-deshidro-DHA 312
195(70)
34 27,14 metil DHA [74] 316 314 (10); 299 (20); 239 (100)
288(10);270(30);255(100);242(40)
35 27,71 acetato de larixilo [74] 348
227 (30); 200 (40); 185 (70)
316(10);274(40);256(25);161 (25)
36 27,75 no identificado 316
121 (100)
316(40);273(10);256(100);241(50)
37 28,10 metil abietato [74,82] 316
213 (30); 185 (30)
336(10);289(20);255(25);227(30)
38 28,31 no identificado, sin –OH 336 211(30);204(100);189(95);119(60)
305(10);302(15);287(40);255 (80)
39 28,33 no identificado, sin -OH -
227 (90); 211 (100)
40 28,80 no identificado 336 335 (100); 266 (45); 202 (25)
41 28,83 no identificado, sin –OH 320 320(5);302(30);287(85); 227 (100)
300(50);287(15);268(25);240 (20)
42 28,84 no identificado, sin-OH 300
225 (100)
diterpenoide
43 28,88 312 312 (10); 297 (20); 237 (100)
no identificado
diterpenoide
44 29,02 342 342 (100); 185 (60)
no identificado
316(95);30 (10);257(20);241 (20)
45 29,09 metil neoabietato [74] 316
187(20);181(40);148(60);135(100)
362(10);247(35);330(10);315 (30)
46 29,19 no identificado, sin OH 362 303(75);288(100);261(90);201(60)
175 (60); 121 (95)
47 29,20 no identificado 336 336 (10); 276 (65); 121 (100)
48 29,36 no identificado 364 364(15);304(95);161(40);121(100)
362(5);347(35);330(25);315 (20)
49 29,69 no identificado, sin OH 362 302 (70); 189 (70); 121 (100)
319(20);301(20);274(30);256 (40)
50 29,71 no identificado 319
241 (70); 189 (40); 121 (100)
344 (20);299(25);262(30);225 (80)
51 29,74 no identificado 344 91 (95); 77 (100)

_____________________________________________________________
200
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

R.T. nombre masa iones más abundantes (m/z)

nº
(min) (propuesto) molecular (proporción relativa (%))
52 29,87 no identificado, con OH 312 312 (25); 237 (100); 195 (25)
diterpenoide
53 30,07 314 314(70);299(100);257(35);177(25)
no identificado
diterpenoide 314(40);254(100);239(40);197(10),
54 30,12 314
no identificado 183 (20)
332(5);317(10);303 (55); 289 (70)
55 30,20 no identificado, con OH 332
258 (90); 201 (75); 91 (100)
56 30,34 metil 15-OH-DHA 330 330(10);315(70);255(100);237 (20)
diterpenoide
57 30,46 314 314 (20); 299 (45); 262 (100)
no identificado
362(5);347 (35);330(20);315 (30)
58 30,82 dimetil agatato [82] 362
302(65);271(45);189(60); 121(100)
328(30);296(15);268(15);
59 31,12 metil 7-oxo-DHA [74] 328
253(100);241(20)
319 (20); 303 (95); 289 (60);
60 31,88 no identificado, sin OH - 271(50);243 (60);107 (65);91(100)
61 32,26 metil 15-metoxi-DHA 344 344 (70), 329 (100), 269 (40)
posible metilación de nº
62 32,41 326 326(30);215(70);204 (95);109(100)
59 y 65 [94]
posible metilación de nº
63 32,65 59 y 65 [94] 326 326(50);294(20);251 (100);185(30)
370(30);340(70);325(50);173(70);
64 33,07 no identificado -
91(100)
65 34,03 metil 15-OH-7-oxo-DHA 344 329 (100); 269 (15); 187 (15)
diterpenoide
66 34,13 no identificado 328 328 (60), 253 (100)
posible metilación de nº
67 35,10 356 356 (5); 245 (60);205 (100)
59 y 65 [94]
posible metilación de nº 372 (80); 165 (40); 152 (100);
68 36,35 59 y 65 [94] 372 112(50)
69 36,42 no identificado - -------
362 (60);347 (100); 225 (20);
70 37,03 no identificado 362
209(40)
358(90);315(80);205(70);95(95);
71 37,49 no identificado 410 79(100)
posiblemente 24-nor 392 (100); 377 (40); 185 (30);
72 38,01 oleana-3,9(11),12-trieno 392
174(40); 157 (40)
[295]
posiblemente 24-norursa-
73 38,84 3,9(11),12-trieno [295] 392 392(100);377(20);255 (20);225(30)
posiblemente 24- 394 (10);379 (5);218 (100);203(60)
74 39,08 noroleana-3,12-dieno 94
189 (30)
[178,295]
posiblemente 24-norursa- 394(10);379 (5); 218 (100);203(20)
75 39,78 3,12-dieno [178,295] 394 189 (20)
triterpenoide no
76 41,67 454 -------
identificado
triterpenoide no
77 42,10 identificado 422 -------

_____________________________________________________________
201
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

R.T. nombre masa iones más abundantes (m/z)

nº
(min) (propuesto) molecular (proporción relativa (%))
triterpenoide no
78 42,21 424 424(40);409(100);298 (20);257(50)
identificado
triterpenoide no
79 42,61 426 426(30);411(100);393 (70);259(40)
identificado
80 43,10 semejante a lupenona 424 424 (100), 313 (60), 205 (90)
triterpenoide no
81 43,33 426 426(30); 411(100); 393(70); 259(50)
identificado
posiblemente 24-norursa-
82 43,38 408 408 (60); 393 (30); 232 (100)
3,12-dien-11-ona [295]
83 43,42 â-amirenona [53,85] 424 424 (20); 218 (100)
424(90);409(10);381(15); 313(70)
84 43,49 dammaradienona [53] 424
205 (100); 189 (70)
426 (40); 408 (15); 315 (30)
85 43,89 dammaradienol [53] 426
207(80); 189 (100)
424 (20);409 (10); 218 (100)
86 44,06 á-amirenona [53] 424 203(30);189 (25)
426(10);408(30);393(25);218(100);
87 44,25 á-amirina [53] 426
203 (70); 189 (40)
metil dammarenolato
88 45,13 472 454(45); 411(20); 385(100); 343(20)
[53]
468 (20); 409 (10); 262 (30),
89 46,38 metil moronato [53] 468
248(50); 203 (30); 189 (100)
90 46,67 metil oleanonato [53] 468 468 (20); 262 (60); 203 (100)
hidroxidammarenona 424 (80);409 (10);355 (85); 311(70);
91 46,70 442
[53] 298 (55); 205 (100)
aldehido olenanónico
92 46,92 438 438(10);409(10);232(25); 203(100)
[53]
468 (10); 409 (5); 262 (100);
93 47,46 metil ursonato [53] 468
203(75); 133 (50)
94 47,63 aldehido ursónico [53] 468 438 (10);232(20);203(100);133(70)
metil 468 (10);453(100);435 (10);
95 47,76 468
isomasticadienonato [53] 421(50);393 (10);257 (20)
triterpenoide no
96 48,24 422 422(5);410(10);391(5);203(100)
identificado
metil masticadienonato 468 (10); 453 (100); 435 (10);
97 48,80 468
[53] 421(40); 393 (10); 257 (100)

_____________________________________________________________
202
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

Tabla 35. Información almacenada en la biblioteca de espectros acerca de la presencia las

sustancias encontradas en cada muestra real y material de referencia* (numerados como en la
Tabla 34).
*materiales de referencia: 1=esencia de trementina, 2=esencia de lavanda, 3=benjuí,
4=colofonia, 5=trementina de Venecia, 6=sandaraca 7=copal de Manila, 8=mastic,
9=dammar. Para mayor claridad, los resultados obtenidos del análisis del alcanfor y la goma
laca no se incluyen, ya que no se encontraron en las muestras procedentes de los barnices.
nº Maler Strad Venere 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 X X
2 X
3 X
4 X
5 X
6 X
7 X
8 X
9 X X
10 X X
11 X
12 X
13 X X
14 X X X X
15 X
16 X X X
17 X X X
18 X X
19 X
20 X
21 X
22 X
23 X
24 X
25 X
26 X
27 X X X
28 X X X X X X
29 X X
30 X
31 X X X X X
32 X X X X
33 X X X X
34 X X X X X X
35 X X X
36 X
37 X X X X X
38 X
39 X
40 X
41 X
42 X X X
43 X X X X
44 X
45 X X X
46 X
47 X
48 X
49 X
50 X
_____________________________________________________________
203
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. BARNICES DE INSTRUMENTOS DE CUERDA

nº Maler Strad Venere 1 2 3 4 5 6 7 8 9

51 X
52 X X
53 X
54 X X
55 X
56 X X X
57 X X
58 X X
59 X X X X X X X
60 X
61 X X X
62 X
63 X X X X X
64 X
65 X X X X
66 X X X
67 X
68 X
69 X
70 X
72 X
73 X X X
74 X X X
75 X X X
76 X
77 X
78 X
79 X
80 X
81 X
82 X
83 X
84 X
85 X
86 X
87 X
88 X
89 X
90 X
91 X
92 X X
93 X
94 X
95 X
96 X
97 X

_____________________________________________________________
204
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

6. Caracterización de resinas sintéticas utilizadas en obras de arte

modernas mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría
de masas con pirólisis previa

Las resinas sintéticas son una amplia categoría de materiales modernos

con una extensa gama de propiedades, ampliamente utilizados desde el siglo
XIX en la elaboración de obras de arte pictóricas, así como en tratamientos
de restauración y conservación de obras artísticas más antiguas, por lo que
están presentes en numerosos objetos de interés artístico/histórico. La
diferenciación entre los diversos materiales poliméricos utilizados por el
artista o el restaurador resulta de gran importancia para la propuesta de
tratamientos de conservación/restauración adecuados [6].
La metodología analítica propuesta para el análisis de los polímeros
sintéticos está basada en la pirólisis directa de la muestra sólida sin
tratamiento previo ni adición de reactivo derivatizante, seguido de la
separación de los fragmentos por cromatografía gaseosa y su identificación a
partir de sus correspondiente espectros de masas. En primer lugar se analiza
una amplia colección de diversas resinas sintéticas utilizadas con propósitos
artísticos (descritas en el apartado 1.6 del Capítulo III y expuestas en la
Tabla 5 en el apartado 6.1 del Capítulo IV), almacenando la información
acerca de los fragmentos característicos en cada caso, así como de otras
sustancias minoritarias detectadas.
Las condiciones instrumentales aplicadas fueron previamente
optimizadas en un estudio anterior para la caracterización de pigmentos
sintéticos en obras pictóricas, debido a que en muestras reales ambas clases
de materiales se estudian conjuntamente. No obstante, se estableció la
temperatura ideal para la pirólisis para cada una de las resinas poliméricas
consideradas. Finalmente el método analítico sugerido se utilizó para la
caracterización de las resinas sintéticas en las muestras procedentes de
pinturas artísticas, mediante la comparación de los fragmentos encontrados
con los característicos de los patrones. Asimismo se identificaron otros
materiales orgánicos, como aceites secantes, ceras y plastificantes.

6.1 Estudio de resinas sintéticas patrón

El análisis de las muestras procedentes de los patrones, a través del

procedimiento mediante Py-GC/MS expuesto con anterioridad, proporciona
el pirograma de cada uno de ellos, junto con los espectros de masas de los
picos cromatográficos más importantes.
La influencia de la temperatura sobre la ruptura térmica se estudió
mediante la comparación, para cada resina sintética (Tabla 5 del apartado 6.1
del Capítulo IV), de los pirogramas obtenidos a tres temperaturas (590; 650
y 794ºC). Para las resinas de poliestireno (Kraton G), resina de
________________________________________________________
205
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

hidrocarburos saturada (Arkon P90), resina de indeno-benzofurano (resina

de cumarona), acetatos de polivinilo (Mowilith, PVAc, Palmer Cement),
butiral de polivin ilo (Mowital B20H), polímero cetónico (AW2, Laropal
A81), resinas fenólicas y poliacroleínas, no se encontraron diferencias
significativas entre los fragmentos proporcionados por la pirólisis a las
temperaturas consideradas. No obstante, para los polímeros de base de
pigmento acrílico, Paraloid y Keton N, se aprecian diferencias en los
compuestos detectados.
Los fragmentos obtenidos permiten obtener información útil para
evaluar la estructura de cada polímero, la presencia de posibles
contaminantes y la caracterización de la correspondiente resina sintética en
muestras. Así pues, los fragmentos denominados característicos equivalen a
los monómeros de la correspondiente resina sintética, y resultan los más
útiles para su caracterización. Otras sustancias detectadas corresponden a
derivados de unidades mayores o resultado de reorganizaciones de los
productos formados tras la pirólisis.
La relación de los fragmentos detectados en el ámbito de este amplio
estudio, junto a su presencia en cada una de las muestras (patrones y reales)
se expone en las Tablas 36 y 37, respectivamente.

6.1.1 Polímeros de vinilo

Las resinas polivinílicas estudiados fueron las siguientes: un polímero

de estireno-etileno/butileno-estireno (SEBS) (dos versiones comerciales:
Kraton G1650 y Kraton G1657), una resina de hidrocarburos saturada
(nombre comercial Arkon P90), una resina de indeno-benzofurano
(cumarona), acetato de polivinilo (tres versiones comerciales: Mowilith,
PVAc y Palmer Cement), butiral de polivin ilo (Mowital B20H) y resinas
acrílicas (Paraloid y una pigmento blanco de titanio con base acrlilica). Las
resinas se exponen en la Tabla 5 del apartado 6.1 del Capítulo IV de la
presente memoria.
Ambos derivados comerciales de polímero de SEBS muestran una
elevada cantidad del estireno, considerado como el fragmento característico,
y tolueno. Los demás monómeros (etileno y butileno), no aparecen debido a
su baja masa molecular y elevada vola tilidad. En la muestra de Kraton
G1657 se encuentran además trazas de hidrocarburos, probablemente
provenientes del tamizado utilizado en la purificación.
Los fragmentos característicos del Arkon P90 son alquilciclohexanos
saturados como el metilciclohexano, etilciclohexano, 1-etil-3-
metilciclohexano, (1-metiletil)ciclohexano y 1-etil-4-metilciclohexano,
procedentes de la estructura policíclica saturada de la resina. Otros
fragmentos identificados fueron alquilciclohexeno, indeno y
decahidronaftaleno.
Los compuestos identificativos de la resina de cumarona detectados a
________________________________________________________
206
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

través del análisis por Py-GC/MS fueron: benzofurano, indeno,

metilbenzofurano y metilindeno, las unidades monoméric as de las resinas.
Otras moléculas encontradas fueron compuestos con anillos aromáticos.
Los productos pirolíticos de los acetatos de polivinilo son el ácido
acético, procedente del polímero y el benceno, producto de reorganización
de fragmentos menores. Otras sustancias identificadas en los pirogramas
fueron naftaleno, metilnaftaleno, bi-fenilo y un amplio grupo de
alquilbencenos. En el Palmer Cement se encuentran asimismo benzaldehido
y acetofenona, procedentes probablemente el disolvente del polímero. Las
tres clases de acetato de polivinilo serían indistinguibles en una muestra real.
El pirograma del derivado de l butiral de polivinilo Mowital B20H,
presenta como fragmentos característicos el butanal, obtenido a partir de la
descomposición del polímero, y el benceno resultado de reaorganizaciones
de fragmentos análogos a los producidos en el acetato de polivinilo. Otras
sustancias detectadas fueron: ácido butanoico, benzaldehido, 3-penten-2-ona
y una serie de alquil derivados del benceno.
El estudio de una pintura de titanio de base acrílica se llevó a cabo con
el objetivo de ampliar la información acerca del comportamiento de los
poliacrílicos en la pirólisis. Los fragmentos característicos fueron los
siguientes monómeros acrílicos: metil acrilato, metil metacrilato, etil
metacrilato, isobutil acrilato, butil acrilato, isobutil metacrilato, butil
metacrilato. Asimismo se detectó el antioxidante butil hidroxitolueno. La
temperatura de pirólisis influye de forma considerable sobre el resultado. A
590ºC, se producen una gran cantidad de compuestos con núcleos
aromáticos como etilbencenos y naftaleno, así como ciclohexadienonas
polisustituidos y otras moléculas de elevado peso molecular no identificadas.
Sin embargo a 650ºC la cantidad de compuestos detecta dos es mucho menor,
mientras que a 764º se produce una situación in termedia.
El polímero de Paraloid se estudió para su identificación y establecer a
que clasificación pertenece. Los productos de pirólisis característicos fueron
los siguientes: metil acrilato, metil metacrilato, etil metacrilato y ácido
metacrílico. No obstante, los compuestos más abundantes fueron etil
metacrilato y metil acrilato, por lo que se propone que se trata de Paraloid
B72. Asimismo se encuentran alquilbencenos, probablemente procedentes
del disolvente o de reorganizaciones durante la pirólisis. Por otro lado el
perfil de los pirogramas depende de la temperatura de ruptura térmica
aplicada. A 590 y 764ºC se forman 1-(4-etilfenil)etanona y diversas
sustancias de alto peso molecular, así como indicios de plastificante. A
650ºC no se detectaron estos compuestos. De forma general, para los
polímeros acrílicos la pirólisis a 590ºC proporciona un número mayor de
fragmentos.

________________________________________________________
207
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

6.1.2 Polímeros de condensación

Para el presente estudio se analizaron los siguientes polímeros de

condensación: resina alquídica, resinas cetónicas (cuatro productos
comerciales: AW2 en polvo con número de inventario 90.34.13; AW2 en
forma compacta, nº de inventario 90.34.14; Keton N y Laropal A81), resinas
de fenol formaldehido (dos versiones comerciales, con número de inventario
90.39.4 y 90.39.6) y acroleína (Akroid). Las resinas y números de inventario
corresponden a los expuestos en la Tabla 5 del apartado 6.1 del Capítulo IV.
En la resina alquídica se detectó gran cantidad de ácido ftálico, junto a
compuestos fenólicos, probablemente derivados de este último, restos de
ácido oleico, ácidos carboxílicos cortos y derivados con carbonilo. El ácido
ftálico se considera como el fragmento característico.
Los pirogramas obtenidos en los análisis de la muestra de AW2 en
polvo (nº 90.34.13) muestran los siguientes de fragmentos característicos,
que resultan claramente procedentes de un polímero cetónico: ciclohexanol,
ciclohexanona y diversos correspondientes alquilderivados. Además se
detectaron ciclohexenos, santeno, octahidropentalenos y otros hidrocarburos
policíclicos saturados.
En la muestra procedente de la resina de AW2 en forma compacta (nº
90.34.14), se identificó una serie de monómeros acrílicos (isobutil
metacrilato, 2-metilpropil metacrilato, 2-etilhexil metacrilato) y derivados
alquilbencénicos, mientras que no se detectaron fragmentos característicos
de resinas cetónicas. Probablemente se trate de un material acrílico
erróneamente etiquetado.
Los fragmentos característicos detectados en Keton N fueron los
mismos a los encontrados en la AW2: ciclohexanol, ciclohexanona y
alquilciclohexanonas. Asimismo se encontraron moléculas de santeno,
octahidropentaleno, triciclododecenos y otras sustancias no identificadas de
elevado peso molecular. En este caso, se detecta un mayor número de
fragmentos característicos tras pirólisis a 764ºC.
La resina de Laropal A81 contiene una mezcla de sustancias, de las
cuales se identificaron únicamente Z-1-1(butenil)azirina, 2,2-dimethyl-1S-
propandiol, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropanal, metil 2,2-dimetil-3-hidroxi
propanato, benzonitrilo y una considerable cantidad de sustancias no
identificadas. Los fragmentos considerados como característicos son los más
intensos, el metil 2,2-dimetil-3-hidroxipropanato, dos picos a t=10,214 y
t=13,92 min, y cuyo pico molecular aparece a 187 y 287, respectivamente.
El benzonitrilo no se puede utilizar como característico, ya que aunque
contiene un nitrógeno, se encuentra en numerosos pigmentos sintéticos.
Las sustancias características de la resina fenólica nº 90.39.4 fueron
una amplia variedad de alquilfenoles. Otros fragmentos detectados fueron
alquilciclohexenos, alquilbenzaldehido y gran cantidad de alquilbencenos,
así como naftalenos y metanoazulenos de elevado peso molecular. Por su
________________________________________________________
208
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

parte la otra resina fenólica estudiada (nº 90.39.6) contiene una elevada
cantidad de alquilfenoles (fragmentos característicos), así como
hidroxibenzaldehidos y alquilbencenos.
La resina poliacroleína (Akroid) está compuesta por una compleja
mezcla de diversas sustancias como alquilbencenos, alquilfenoles,
metoxibencenos, metoxifenoles, benzaldehidos y otros derivados cetónicos.
La unidad monomérica acroleína es muy volátil y tiene un bajo peso
molecular, por lo que no se detectó en el pirograma. En este caso no se
considera ningún fragmento característico.

6.2 Estudio de muestras procedentes de una obra pictórica moderna

La información proporcionada por el análisis de los polímeros patrón

de resinas sintéticas se utilizó para la caracterización de la resina presente en
una obra pictórica del artista alemán contemporáneo Georg Baselitz (“Senta
1992/1993), representada en la Figura 40. El autor, nacido el 1937 en
Deutschbaselitz (Sajonia, Alemania) se considera como uno de los máximos
exponentes de la pintura contemporánea en Alemania . Las muestras se
obtuvieron de una zona de color azul y otra de color negro. En ambos casos
se presupone que el artista empleó un poliacrílico, por ser el material
frecuentemente utilizado por el autor.

Figura 40. Imagen de la

obra pictórica moderna:
“Georg Baselitz, Senta”,
1992/1993, pintura sobre
lienzo, 100,5 x 71 cm,
Bayerische
Staatsgemäldesammlungen,
número de inventario 1785.

________________________________________________________
209
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

El estudio meticuloso de los pirogramas obtenidos a partir del análisis

de las muestras artísticas permitió confirmar la presencia de compuestos
correspondientes a las resinas sintéticas patrón, así como aditivos y otros
materiales utilizados en pintura artística. Los pirogramas resultantes del
estudio de la muestra coloreada de azul (a 590ºC) y la de pigmento negro (a
764ºC) se representan en la Figura 41.

Figura 41. Pirogramas (TIC) resultantes del análisis de muestras procedente de una pintura de
Baselitz, (“Senta”, 1992/1993), en el primer caso de un área con pigmento azul (a) y otro con
coloración negra (b). Los compuestos característicos se indican con rectángulos de la
siguiente manera: aceites secantes en amarillo, resinas cetónicas en rojo, acrílicas en verde y
fenólicas en azul. Las regiones con una distribución continua de hidrocarburos se muestran
con una línea horizontal. Asimismo se indican los siguientes aditivos: el antioxidante butil
hidroxitolueno ( ) y el plastificante éster ftálico (+).

En ambos casos se detectó una amplia cantidad de hidrocarburos. Se

encontró una serie de alcanos lineales de número par e impar de átomos de
carbono, por lo que se excluye que provengan de la cera de abeja. La
distribución de hidrocarburos indica que probablemente sean restos de
parafina. Asimismo se detectó en ambas muestras el aditivo antioxidante
butil hidroxitolueno y los monoterpenos canfeno y á-canfolenal.
Los compuestos alquilbencénicos detectados en los pirogramas de
todos los polímeros estudiados y en las muestras artísticas son
________________________________________________________
210
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

probablemente el resultado de reorganizaciones de fragmentos menores, por

lo que su presencia no aporta información significativa para la
caracterización de las resinas sintéticas.

6.2.1 Área pigmentada de azul

La detección de ácidos grasos de cadena corta y aldehidos no permite

establecer por sí sola la presencia de material oleoso, ya que no se
encuentran ácidos carboxílicos más largos. Asimismo se encontró éster
ftlálico, ampliamente utilizado como aditivo plastificante.
La detección de una serie de compuestos característicos de las resinas
cetónicas (ciclohexanona, 2-metilciclohexanona y 2-etilciclohexanona)
indica la presencia de resinas cetónicas de tipo AW2 o de Keton N. Por otra
parte, la detección de metil propil metacrilato no resulta criterio suficiente
para establecer la presencia de una resina poliacrílica.

6.2.2 Área pigmentada de negro

La detección de ácidos esteárico, oleico, palmítico y sus productos de

degradación como ácidos grasos de cadena corta, aldehidos y cetonas,
permiten deducir la presencia de material oleoso en la muestra analizada.
La muestra analizada contiene los siguientes fragmentos
característicos de polímeros cetónic os: ciclohexanona, 2-metilciclohexanona,
4-metilciclohexanona y 2-etilciclohexanona. La presencia de estos
compuestos permite proponer el uso de resinas cetónicas como AW2 o
Keton N para la decoración de la superficie de la obra pictórica. Asimismo
se detectaron compuestos fenólicos, pero como los anillos aromáticos
pueden formarse posteriormente mediante reorganizaciones, no se puede
establecer la presencia de una resina de fenol-formaldehido.

________________________________________________________
211
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

Tabla 36. Parámetros analíticos de los fragmentos obtenidos a partir del análisis de las muestras patrón y procedentes de obra pictórica moderna mediante Py-GC-MS. Se
indican los siguientes datos: orden y tiempo de elución bajo las condiciones de separación cromatográfica aplicadas; denominación (si se ha identificado) o relación carga
masa (m/z) del ion molecular (IM); iones más intensos en el espectro de masas.
iones más iones más
nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
1 2,503 acetona 43; 58; 44 26 4,038 ácido metacrílico 86; 69; 45
2 2,509 metil acrilato 55; 42; 43 27 4,038 etilciclohexano 83;55;112
3 2,523 2-butanona 42; 72; 71 28 4,197 3-metilenciclohepteno 93; 79; 91
4 2,672 butanal 43;44;72 29 4,205 2-hexenal 55; 49; 83
5 2,863 ácido acético 43;44;60 30 4,217 etilbenceno 91;106;77
6 2,932 1-hepteno 43;55; 54 31 4,540 1,3-dimetilbenceno 91;106;77
7 2,939 benceno 78;51;50 32 4,600 no identificado 95; 82;67
8 2,991 3-penten-2-ona 43; 69; 84 33 4,710 2-heptanona 43; 58; 71
9 3,043 metil-metacrilato 69;100;99 34 4,72 ciclohexanol 57; 82; 67
10 3,218 metilciclohexano 83;55;96 35 4,758 butil acrilato 55; 56; 73
11 3,315 Z-1-1(butenil)azirina 97; 82; 47 36 4,863 1-etil-3-metilciclohexano 97;55;126
12 3,340 4-metilciclohexeno 81; 67; 96 37 4,868 estireno 104; 78; 51
13 3,517 1-metilciclohexeno 81; 73;96 38 4,900 ciclohexanona 55; 42; 98
14 3,538 tolueno 91;92; 65 39 4,918 xileno 91; 106; 104
15 3,560 no identificado - IM=138 81;97;67 40 4,920 n-heptanal 70; 43; 42
16 3,598 etil metacrilato 69 99 86 41 4,931 no identificado - IM=125 85; 55; 125
17 3,603 n-hexanal 44 56 43 42 5,048 1-etil-4-metilciclohexano 97; 55; 69
18 3,632 1-metil-4-propilbenceno 105; 134; 91 43 5,102 metil 2,2-dimetil-3-hidroxi-propanato 102; 87; 73
19 3,671 1,3-ciclohexadieno 79; 78; 94 44 5,277 (1-metiletil)ciclohexano 82;83;55
20 3,725 1-octeno 70; 55; 56 45 5,310 (1-metiletil)benceno 105; 96; 110
21 3,798 2,2-dimetilpropanal 56; 55; 43 46 5,340 no identificado - IM=126 55;83;97
22 3,851 isobutil acrilato 43;56;73 47 5,425 2,2-dimetil-1S-propanodiol 56, 55; 73
23 3,873 ácido butanoico 60; 74; 43 48 5,430 no identificado 67; 83; 82
24 3,926 3-hidroxi-2,2-dimetilpropanal 56 57 54 49 5,446 no identificado - IM=150 83;55;65
25 3,980 1,3-dimetil-1-ciclohexeno 95; 67; 116 50 5,478 isobutil metacrilato 69;56; 87

_______________________________________________________________________________________________________
212
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

iones más iones más

nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
51 5,544 2-metilpropil metacrilato 69; 56; 87 79 6,441 2,6-dimetilciclohexanona 69; 57; 126
52 5,604 2,6-dimetil-2,4-heptadieno 107; 93; 91 80 6,486 ácido hexánico 60; 43; 73
53 5,606 3-metilciclohexanol 71; 81; 57 81 6,600 spiro[5,6]decano 67; 83; 96
54 5,679 2-metilciclohexanona 69; 68; 112 82 6,619 no identificado - IM=169 67; 83; 95
55 5,680 2-propenilbenceno 117;118;91 83 6,627 1-metil-4-propilbenceno 105; 134; 83
56 5,709 3-metilciclohexanona 69, 56; 112 84 6,636 no identificado - IM=148 122; 94; 54
57 5,799 trans-octahidro-1H-indeno 67; 96; 81 85 6,760 1,4-dimetilbenzeno 119; 105; 134
58 5,802 4-metilciclohexanona 55; 112; 56 86 6,778 (2-metilprop-1-enil)ciclohexa-1,5-dieno 91; 119; 77
59 5,808 propilbenceno 91;120;92 87 6,789 1-metoxi-4-metilbenceno 122; 121; 77
60 5,808 isopropilbenceno 105; 77; 106 88 6,795 4-etil-1,2-dimetilbenceno 119; 105; 134
61 5,822 cis-biciclo[4.3.0]noneno 79;80;65 89 6,807 2-metil-cis-octahidropentaleno 81; 96; 55
62 5,849 benzaldehido 104;105;77 90 6,836 1-metil-2-(1-metiletil)benceno 119; 134; 91
63 5,979 1-metil-3-etilbenceno 105;120;77 91 6,89 1-etenil-2-metilbenceno 117;118;116
64 6,017 1,2,3-trimetilbenceno 105;120;91 92 6,911 canfeno 93; 67; 91
65 6,086 no identificado - IM=125 89; 57; 115 93 6,917 biciclo[3.3.1]nonano 81; 96; 54
66 6,107 cis-octahidropentaleno 67; 54; 82 94 6,971 no identificado - IM=142 102; 55; 98
67 6,114 â-pineno 93; 69; 91 95 7,004 indano 117;91;63
68 6,120 fenol 94; 66; 65 96 7,020 1-propenilbenceno 117;118;116
69 6,142 butil metacrilato 69; 87; 56 97 7,086 octahidro-5-methylindeno 81;98;65
70 6,169 no identificado - IM=118 104; 94; 76 98 7,114 2-hidroxibenzaldehido 122;65;93
71 6,173 [1H]-3a,4,5,6,7,7a-hexahidroindeno 79;80;93 99 7,136 indeno 115;116;89
72 6,185 etilmetilbenceno 105; 121; 69 100 7,150 1-propinilbenceno 115;116;91
73 6,185 benzonitrilo 69; 57; 56 101 7,190 3-etenil-ciclohexanona 81; 67; 96
74 6,191 á-metilestireno 118;117;103 102 7,196 1,3-dietilbenceno 119;105;134
75 6,313 cis-octahidro-1H-indeno 81;67;80 103 7,234 no identificado - IM=156 57; 72; 156
76 6,333 2-pentilfurano 81; 60; 138 104 7,306 no identificado - IM=122 79; 94; 122
77 6,391 1,2,4-trimetilbenceno 105; 120; 77 105 7,318 2-metilfenol 108; 107; 77
78 6,406 benzofurano 118; 89; 63 106 7,319 trans-decahidronaftaleno 138; 67; 95

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213
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

iones más iones más

nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
107 7,327 1,4-dietilbenceno 119; 105; 134 132 8,165 2,6-dimetil-2,5-ciclohexadieno 65; 136; 105
108 7,415 octahidro-4,7-metano-1H-indeno 95;67;79 133 8,171 2-metilpropenil)ciclohexa-1,5-dieno 81; 119; 134
109 7,417 1,2-dietilbenceno 105; 119; 134 134 8,247 2-etilciclohexanona 55; 98; 42
1-butilciclohexeno o octahidro-5-
110 7,485 81;96;67 135 8,260 hidrocarburo no identificado 57;70;55
metilindeno
111 7,498 acetofenona 105;77;120 136 8,347 santeno 93; 91; 77
cis-2-
112 7,529 79;95;121 137 8,377 á-camfenal 103; 93; 67
metilenbisciclo[5.2.1.0(2,6)]nonano
113 7,618 4-metilfenol 107; 108; 77 138 8,467 2-hidroxi-4-metilbenzaldehido 136;135;77
114 7,774 1-etenil-3-etilbenceno 117; 132; 115 139 8,502 no identificado - IM=144 73; 89; 101
3-metil-2-butenilbenceno o
115 7,823 2-metoxifenol 109; 124; 81 140 8,607 131; 146; 91
(1,1-dimetil-2-propenil)benceno
116 7,830 no identificado - IM=150 81;121;67 141 8,700 no identificado - IM =186 59; 115; 72
117 7,833 o-isopropeniltolueno 132; 117; 115 142 8,703 2,4-dimetilfenol 107; 122; 121
118 7,835 2-nonanona 58; 55; 143 8,712 1,4-dihidronaftaleno 130;115;129
119 7,864 ácido heptánico 43; 55; 57 144 8,717 2-metilindeno 130;115;129
120 7,887 endo-triciclo[5.2.1.0(2,6)]decano 95; 67; 79 145 8,743 4-metiltriciclo[5.2.1.0(2.6)]decano 81;65;79
121 7,941 no identificado - IM=150 81;121;65 146 8,764 1-etenil-4-metoxibenceno 134; 91; 121
122 7,966 7-metilbenzofurano 131;130;103 147 8,809 1-hidroxi-4-metilbenzaldehido 136; 135; 107
123 7,968 2-metilprop-1-enil)ciclohexa-1,3-dieno 91; 134; 119 148 8,827 1,2-dihidronaftaleno 128;129;130
124 7,983 cis-decahidronaftaleno 67;81;97 149 8,972 no identificado -IM=143 71; 53; 89
125 8,001 n-C11H24 57; 43;71 150 8,973 etilfenol 107; 122; 77
126 8,042 2-metilbenzofurano 131;132;104 151 9,149 2,3-dimetilfenol 122; 107; 77
127 8,047 nonanal 57; 43; 56 152 9,200 naftaleno 128;127;126
128 8,078 2,6-dimetilfenol 122; 107; 77 153 9,217 no identificado - IM=160 128; 121; 91
129 8,096 feniletanona 81; 109; 43 154 9,235 ácido caprílico 60; 73; 43
130 8,125 1-metilbiciclo[3.2.1.0]octan-6-ona 93; 108; 92 155 9,248 3-metilenundecano 70;55;83
131 8,162 no identificado - IM=158 72; 43; 56 156 9,280 1-fenil-2-propin-1-ona 130;102;76

_______________________________________________________________________________________________________
214
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

iones más iones más

nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
157 9,327 ácido graso no identificado 43; 58; 60 181 10,920 2-metilnaftaleno 142,141,115
158 9,330 1-dodeceno 55; 44; 65 182 11,034 1-metoxi-2-metilfenol 150; 143; 77
159 9,344 2-decanona 43; 58; 56 183 11,058 ácido ftálico 104; 76; 50
160 9,359 3,4-dimetilfenol 107; 122; 121 184 11,238 1-(3-metoxifenil)etanona 135; 150; 77
161 9,499 2,3,5-trimetilfenol 121; 136; 135 185 11,413 no identificado - IM=217 56; 99; 145
162 9,729 4-vinil-fenol 120; 91; 119 186 11,422 no identificado - IM=148 84; 55; 43
163 9,762 3-isopropilbenzaldehido 133; 148; 105 187 11,499 no identificado - IM=217 56; 99; 145
164 9,862 2-etilhexil metacrilato 55; 70; 57 188 11,566 2-(1,1-dimetiletil)-4-metilfenol 149 121 164
165 9,863 1,3-dihidro-2H-inden-2-ona 104;132;103 189 11,604 4-(1,1-dimetiletil)-2-metilfenol 149; 158; 121
166 9,908 3-etil-5-metilfenol 121; 136; 91 190 11,714 4-etenil-1,2-dimetoxibenceno 164; 91; 149
(1,3,4,5,6,7-hexahidro-1,1,S,S-
167 9,908 2-cumaranona 78;134;106 191 11,818 tetrametil-2S)-2H-2-4a- 148; 133; 77
metanonaftaleno
168 10,059 2-hidroxi-4,6-dimetilbenzaldehido 150; 149; 121 192 11,830 ácido cáprico 73; 60; 56
169 10,059 4-oxononanal 43; 85; 71 193 11,873 1,1’-bifenil 154,153;152
170 10,227 no identificado -IM=187 115; 69; 57 194 11,929 metil 3-fenil-2-propenato 131; 103; 162
171 10,354 1-(4-etilfenil)etanona 133; 148; 105 195 12,022 tetradeceno [IM=196] 55; 43; 69
172 10,399 trimetilfenol 121 136 135 196 12,152 tetradecano [IM=198] 55; 43; 57
[1S-(1á, 3aâ,4á, 8áâ)]decahidro-4,8,9-
173 10,448 3-fenil-3-propenal 131; 132; 103 197 12,283 91; 109; 81
trimetil-9-metilen-1,4-metanoazuleno
174 10,582 2,3-dihidro-2H-inden-1-ona 132;104;78 198 12,546 no identificado - IM=185 143; 129; 115
175 10,586 no identificado - IM=200 126; 67; 95 199 12,730 ácido 3-fenil-2-propenoico 147; 148; 103
176 10,663 ácido pelargónico 60; 73; 57 200 12,920 no identificado - IM=196 112; 67; 95
177 10,721 1-trideceno 55; 43; 69 201 12,957 no identificado - IM=257 56; 85; 131
bis(1,1-dimetiletil)-2,5-ciclohexadien-
178 10,770 1-metilnaftaleno 142,141,115 202 12,993 117; 220; 135
1,4-diona
179 10,777 2-metil-5-(1-metiletil)fenol 135; 148; 91 203 13,131 3,4-dimetoxibenzaldehido 166; 165; 77
180 10,831 tridecano 57; 43; 71

_______________________________________________________________________________________________________
215
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

iones más iones más

nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
2,6-ditercbutil-4-metilen-2,5-
204 13,144 161; 203; 185 228 15,040 benz[cd]indol-2(1H)-ona 169; 114; 141
ciclohexadien-1-ona
[7R-trans-cyn-cis-triciclo[7.3.0.0(2,6)]-
205 13,230 79; 78; 133 229 15,169 dibutil pentadienato 115, 171; 87
dodecanal
206 13,260 1-pentadeceno 55; 43; 57 230 15,245 no identificado - IM=228 134; 79; 194
207 13,354 pentadecano [IM=212] 57; 71; 43 231 15,291 1-heptadecino [IM=236] 55; 81; 67
208 13,404 no identificado - IM=192 111; 192; 67 232 15,372 8-heptadeceno [IM=238] 55; 43; 83
209 13,471 no identificado - IM=217 56; 87; 71 233 15,507 no identificado - IM=212 114; 56; 131
210 13,490 no identificado - IM=208 79; 149; 97 234 15,529 1-heptadeceno[IM=238] 55; 43; 57
211 13,493 no identificado - IM=180 79; 81; 162 235 15,569 no identificado - IM=287 56; 115; 131
212 13,495 no identificado - IM=192 79; 81; 94 236 15,611 heptadecano [IM=240] 57; 71; 43
(1á, 3aá, 7á, 8aâ)octahidro-1,9,9-
213 13,531 trimetil-4-metilen-1H-3a, 7- 105; 118; 87 237 15,678 no identificado - IM=201 127; 126; 98
metanoazuleno
214 13,542 butil hidroxitolueno 205; 220; 57 238 15,786 no identificado - IM=255 93; 152; 151
215 13,692 no identificado - IM=122 111; 122; 67 239 16,052 no identificado - IM=255 93; 152; 151
216 13,735 no identificado - IM=259 56; 85; 157 240 16,343 3,5-di-tercbutil-4-hidroxibenzaldehido 219; 234; 191
217 13,898 no identificado - IM=192 111; 192; 67 241 16,505 fenantreno 178; 55; 43
218 13,912 no identificado - IM=192 111; 192; 67 242 16,534 no identificado - IM=255 200; 149; 121
219 13,928 no identificado - IM=287 115; 56; 132 243 16,626 no identificado - IM=212 98; 67; 83; 81
220 13,969 no identificado - IM=287 56; 115; 132 244 16,773 no identificado - IM=245 115; 56; 58
221 14,345 1-metil-7-(1-metiletil)naftaleno 169; 184; 154 245 17,256 no identificado - IM=210 98; 95; 94
222 14,426 hidrocarburo no identificado 55; 43; 83 246 17,339 9-heptadecanona 57; 43; 71
223 14,464 no identificado - IM=226 113,56,141 247 17,612 2-heptadecanona 58; 43; 59
224 14,507 hexadecano [IM=226] 57; 43; 71 248 18,286 plastificante (ftalato) 149; 73; 43
225 14,554 no identificado - IM=206 111; 206; 81 249 18,334 ácido palmítico 73; 60; 43
226 14,925 no identificado - IM=210 98; 67; 131 250 18,459 no identificado - IM=268 225; 42; 114
227 14,927 no identificado - IM=192 98; 131; 67 251 19,516 heneicosano 57; 43; 71

_______________________________________________________________________________________________________
216
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

iones más iones más

nº T.R. (min) nombre nº T.R. (min) nombre
abundantes (m/z) abundantes (m/z)
252 19,560 2-nonadecanona 43; 58; 59 266 22,545 no identificado - IM=304 94, 111; 79
253 19,596 no identificado - IM=325 195; 194; 93 267 22,812 pentacosano [IM=352] 57; 43; 71
254 19,835 no identificado - IM=325 195; 194; 250 268 22,957 no identificado - IM=425 355, 115; 59
255 19,901 ácido oleico 55; 69; 83 269 23,224 2-etilhexil ftalato 149, 57; 167
256 20,129 ácido esteárico 43; 55; 73 270 23,561 hexacosano [IM=366] 57; 44; 43
257 20,390 docosano [IM=310] 57; 43; 71 271 23,823 no identificado - IM=425 115, 355; 242
258 20,644 no identificado - IM=324 228; 149; 148 272 24,281 heptacosano [IM=380] 44; 53; 71
259 20,825 hidrocarburo no identificado 43; 55; 98 273 24,978 octacosano [IM=394] 57; 71; 43
260 21,226 tricosano [IM=324] 57; 71; 43 274 25,649 nonacosano [IM=408] 57; 71; 43
261 21,453 no identificado - IM=146 109; 43; 123 275 26,296 triacontano [IM=422] 57; 71; 43
262 21,781 no identificado - IM=311 181; 134; 236 276 26,926 heneitriacontano [IM=436] 57; 71; 43
263 22,036 tetracosano [IM=338] 57; 71; 43 277 27,539 hidrocarburo no identificado 57; 71; 43
264 22,045 no identificado - IM=295 325; 65; 42 278 28,137 hidrocarburo no identificado 57; 71; 43
265 22,387 no identificado - IM=304 94; 111; 79

_______________________________________________________________________________________________________
217
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

Tabla 37. Fragmentos detectados a partir del análisis mediante Py-GC-MS en cada una de las muestras procedentes de resinas sintéticas patrón* y de la obra pictórica
moderna**. (La numeración de los fragmentos se corresponde con la de la Tabla 36). Los compuestos indicados con ( ) son los característicos de cada tipo de resina,
mientras que los marcados con (X) son otros compuestos detectados en el análisis.
*Materiales de referencia (denominación comercial): 1=Kraton G1650; 2=Kraton G1657; 3=Arkon P90; 4=resina de cumarona; 5=Mowilith; 6 =PVAc; 7=Palmer Cement;
8=Mowital B20H; 9=Pigmento Acrílico; 10=Paraloid; 11=AW2 (90.39.14); 12=AW2 (90.39.13); 13=Keton N; 14=Laropal A81; 15=Resina fenólica (90.39.4); 16=Resina
fenólica (90.39.36); 17=Alkyd y 18=Akoid.
**Muestras procedente de la obra pictórica de Baselitz de las áreas de coloración 19=azul y 20=negro.
nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 X 26
2 27
3 X X X X X X X 28 X
4 29 X
5 X X 30 X X X X X X
6 X 31 X X X X
7 X X X X 32 X
8 X 33 X
9 34
10 35
11 X 36
12 X X 37 X X X X X X X X X
13 X X 38
14 X X X X X X X X X X X X X X 39 X X X X X
15 X 40 X X X
16 41 X
17 X X X 42
18 X 43
19 X 44
20 X 45 X
21 X 46 X
22 47 X
23 X X 48 X
24 X 49 X
25 X 50 X
_______________________________________________________________________________________________________
218
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

nº 1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
51 X 84 X
52 X 85 X X
53 86 X
54 87 X
55 X X 88 X X
56 89 X X
57 X 90 X
58 91 X X X
59 X X 92 X
60 X 93 X
61 X 94 X
62 X X X X X 95
63 X X 96 X X
64 X X 97 X
65 X 98 X
66 X X 99 X
67 X 100 X X X
68 X 101
69 102 X X
70 X 103 X
71 X 104 X
72 X X 105 X X
73 X 106 X
74 X 107 X
75 X 108 X
76 X 109 X
77 X 110 X
78 111 X X
79 112 X
80 X X X 113 X X X
81 X 114 X
82 X 115 X
83 X 116 X
_______________________________________________________________________________________________________
219
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
117 X X 150 X X
118 X 151 X
119 X X 152 X X X X X X
120 X 153 X
121 X 154 X X
122 155 X
123 X 156 X
124 X 157 X
125 X X 158 X
126 159 X
127 X X 160 X
128 X 161 X
129 X 162 X
130 X 163 X
131 X 164
132 X 165 X
133 X 166
134 167 X
135 X 168 X
136 X 169 X
137 X X 170
138 X 171 X
139 X 172 X
140 X 173 X
141 X 174 X
142 X 175 X
143 X 176 X
144 177 X X
145 X 178 X X X
146 X 179
147 X 180 X
148 X X X X 181 X X
149 X 182 X

_______________________________________________________________________________________________________
220
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
183 X 216 X
184 X 217 X X
185 X 218 X
186 X 219
187 X 220 X
188 X 221 X
189 222 X X
190 X 223 X
191 X 224 X X
192 X 225 X
193 X X 226 X
194 X 227 X
195 X 228 X
196 X X 229 X
197 X 230 X
198 X 231 X
199 X 232 X X
200 X 233 X
201 X 234 X X
202 X 235 X
203 X 236 X X
204 X 237 X
205 X X 238 X
206 X X 239 X
207 X X 240 X
208 X 241 X
209 X 242 X
210 X 243 X
211 X 244 X
212 X 245 X
213 X 246 X
214 X X X X X X 247 X
215 X 248 X
_______________________________________________________________________________________________________
221
 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. RESINAS SINTÉTICAS

nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
249 X 264 X
250 X 265 X
251 X 266 X
252 X 267 X X
253 X 268 X
254 X 269 X
255 X X 270 X X
256 X 271 X
257 X X 272 X X
258 X 273 X
259 X 274 X
260 X X 275 X
261 X 276 X
262 X 277 X
263 X X 278 X

_______________________________________________________________________________________________________
222
VI. CONCLUSIONES

223
 VI. CONCLUSIONES

La investigación realizada ha permitido el desarrollo de diversas

metodologías analíticas para la caracterización de una amplia colección de
materiales orgánicos empleados en la elaboración de capas pictóricas y
barnices de obras de arte: proteínas, ceras naturales, aceites secantes, resinas
terpénicas y polímeros sintéticos, de acuerdo de los objetivos propuestos. En
dichas metodologías se utilizan las siguientes técnicas analíticas: HPLC-UV-
Visible, HPLC-Fluorescencia, GC/FID, GC/MS y Py-GC/MS, así como
espectrometría de masas directa. Las metodologías propuestas se aplicaron
con éxito para la identificación de los materiales estudiados en muestras
reales procedentes de obras pictóricas. Como conclusiones derivadas de este
extenso estudio se puede destacar:

1. La cromatografía líquida con detector de fluorescencia permite la

diferenciación entre proteínas utilizadas como aglutinantes proteicos, tales
como gelatina bovina, gelatina porcina, albúmina, caseína y huevo.
1.1 La reacción de los aminoácidos con el o-ftalaldehido proporciona
derivados fluorescentes con sensibilidad, límite de detección e intervalo
lineal adecuados para la detección de dichos analitos procedentes de los
patrones de proteínas y extraídos de muestras procedentes de obras
pictóric as.
1.2 Se establecieron las condiciones instrumentales del cromatógrafo
líquido (composición de las fases eluyentes, programa de gradiente, fase
estacionaria, flujo y temperatura), que permit ieron la separación de los
derivados de los aminoácidos, sin interferencias con otros compuestos de la
matriz.
1.3 La caracterización de las proteínas se realizó satisfactoriamente a
partir de la cantidad relativa de aminoácidos, calculados a partir del área del
pico cromatográfico del OPA-derivado de cada uno de ellos frente al OPA-
derivado de la leucina.
1.4 La metodología propuesta se ha evaluado mediante su aplicación a
una serie de muestras procedente de obras pictóricas decoradas en témpera,
donde se caracterizó proteína de huevo.

2. Se ha desarrollado un método cromatográfico para caracterizar ceras

naturales, como cera de abeja, carnauba y ceresina, de forma inequívoca,
tomando como parámetros identificativos la s cantidades relativas de
hidrocarburos y de ácidos grasos totales de los mismos.
2.1 Los ácidos carboxílicos precisaron una derivatización con
etilcloroformiato para obtener los correspondientes derivados volátiles. Se

______________________________________________________________
225
 VI. CONCLUSIONES

logró asimismo fijar las condiciones cromatográficas para separar

correctamente los hidrocarburos y los derivados etílicos de los ácidos grasos.
2.2 Se estableció una metodología de hidrólisis ácida y extracción con
un disolvente orgánico para la separación de los analitos del resto de los
compuestos de la matriz.
2.3 La caracterización de las ceras se fundamenta en el cálculo de los
cocientes de las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los
hidrocarburos entre C20H-C36H respecto al n-heptacosano, y los cocientes
de las áreas cromatográficas correspondientes a los etilderivados de los
ácidos mirístico, oleico, esteárico y araquídico respecto al etilderivado del
ácido palmítico. El tratamiento quimiométrico de los valores calculados,
mediante Análisis por Componentes Principales, proporciona una
discriminación adecuada entre cera de abeja, la cera de carnauba y ceresina.
Así pues, en el correspondiente gráfico de puntuaciones las muestras
analizadas aparecen agrupadas por la clase de cera.
2.4 Un nuevo tratamiento estadístico por PCA se llevó a cabo para
diferenciar las ceras naturales en presencia de otros materiales con ácidos
grasos. Así pues, se seleccionaron como variables estadísticas únicamente
los hidrocarburos, alcanzando una adecuada diferenciación entre los patrones
de ceras naturales estudiados.
2.5 El método analítico propuesto se aplicó con éxito a la
caracterización de cera natural en muestras procedentes de una oleorresina
sobre tabla.

3. Se ha propuesto con éxito una metodología para la caracterización de

aceites secantes mediante HPLC utilizando detectores de absorción UV-
Visible y de fluorescencia. Se seleccionaron muestras procedentes de
patrones de aceites secantes frescos y envejecidos para evaluar la influencia
del deterioro en la identificación de los aglutinantes oleosos.
3.1 El procedimiento establecido para liberar y separar los ácidos de
la matriz fue una hidrólisis ácida de los triglicéridos seguido de una
extracción líquido/líquido con hexano. El empleo de este disolvente apolar
mejora el procedimiento, ya que permite evitar la entrada de interferentes
polares en el sistema cromatográfico y proporciona cromatogramas menos
complejos.
3.2 Se llevó a cabo la optimización de los parámetros de la reacción
de derivatización de los ácidos grasos con 2-nitrofenilhidrazina (uso de
horno de microondas, potencia y tiempo de reacción) para la detección UV-
Visible y con 4-bromometil-7-metoxicumarina para la detección por
fluorescencia . En ambos casos, se obtuvieron límites de detección,
sensibilidades e intervalos lineales satisfactorios para la detección de los
analitos en los aceites secantes patrón y en las muestras de origen artístico.
La metodología que utiliza la detección de fluorescencia proporciona una

______________________________________________________________
226
 VI. CONCLUSIONES

sensibilidad superior a la metodología fundamentada en absorción UV-

Visible.
3.3 Se fijaron los parámetros cromatográficos tales como: fase
estacionaria, fase móvil (composición, programa de gradiente, flujo),
temperatura y longitudes de onda de trabajo del detector. En ambos casos, se
obtuvo una separación satisfactoria de los derivados de los ácidos grasos, sin
interferir entre ellos o con otros compuestos de la matriz, en un tiempo
inferior a quince minutos.
3.4 La diferenciación de los aceites de linaza, nuez y adormidera se
realizó a través del cociente entre las áreas de los picos cromatográficos
correspondientes del derivado de los ácidos esteárico y palmítico, el cual
permanece prácticamente independiente del grado de envejecimiento del
aglutinante oleoso, y varía en función de la clase de aceite secante.
3.5 Las metodologías optimizadas propuestas permitieron la
caracterización de aceite de linaza y de nuez en muestras procedentes de
diversas pinturas al óleo de la época renacentista.

4. El empleo de la espectrometría de masas directa permitió el desarrollo de

metodologías analíticas sin derivatización ni separación previa s para la
diferenciación de aglutinantes proteicos y oleosos.
4.1 Se estableció un procedimiento para la obtención de ácidos grasos
de los aceites secantes, basado en la saponificación de la muestra, seguido de
acidificación y separación de los ácidos grasos de la matriz a través de una
extracción líquido/líquido con hexano. Este procedimie nto experimental
permite obtener los ácidos grasos en un tiempo significativamente menor (5
minutos), al que se precisa en la hidrólisis ácida (un día).
4.2 Se optimizaron las siguientes condiciones instrumentales del
espectrómetro de masas: potencial del capilar y de las máscaras de la trampa
iónica, polaridad, masa enfocada, intervalo de barrido, presión y temperatura
de nebulización y caudal de la corriente del gas secante. Las condiciones
establecidas proporcionaron elevadas sensibilidad y reproducibilidad en la
detección de los aminoácidos y ácidos grasos.
4.3 La caracterización de los aglutinantes proteicos y oleosos se
realizó a través de un tratamie nto quimiométrico mediante Análisis
Discriminante Lineal efectuado sobre las cantidades de aminoácidos y ácidos
grasos, respectivamente, como variables estadísticas. En ambos casos, las
diferentes categorías de proteínas y aceites secantes se diferencian de forma
significativa, e incluso se logró discriminar entre las diferentes clases de
envejecimiento experimentado por los aceites secantes patrón.
4.4 Las metodologías sugeridas se aplicaron sobre muestras
procedentes de obras pictóric as decoradas en témpera y óleos, donde se
caracterizó para cada caso el correspondiente aglutinante utilizado. Estos
resultados coincid ieron con los encontrados en los estudios analíticos

______________________________________________________________
227
 VI. CONCLUSIONES

realizados por HPLC (Conclusiones 1.4 y 3.5).

5. El estudio de la fracción orgánica de barnices de instrumentos musicales

ha sido realizada utilizando la cromatografía gaseosa acoplada a la
espectrometría de masas, mediante la comparación entre los compuestos
detectados en materiales patrón y las sustancias encontradas en las muestras
reales.
5.1 Se seleccionaron como patrones un amplio grupo de materiales
descritos como ingredientes en recetas de barnices para objetos renacentistas
de madera, principalmente resinas terpénicas y aceites esenciales.
5.2 Se optimizaron las condiciones (temperatura y tiempo de reacción)
de derivatización por transmetilación de los compuestos con grupos
carboxílicos, para la obtención de los ésteres volátiles analizables por GC.
Asimismo se estableció un procedimiento experimental de sililación de
grupos hidroxi, que mejoró la resolución de los alcoholes y su detección en
el espectrómetro de masas.
5.3 Las condiciones instrumentales fijadas para el cromatógrafo de
gases, como la columna capilar y el programa de temperaturas permitieron la
separación de todos los compuestos de interés presentes en los patrones y las
muestras reales, un total de 97 compuestos en 11 patrones y varias muestras
procedentes de 3 instrumentos musicales, en un tiempo inferior a 60
minutos. La inyección sin división de flujo permitió incrementar la
sensibilidad del método, parámetro crucial debido a la reducida cantidad de
muestra disponible , a causa del elevado valor artístico de los instrumentos
musicales de cuerda estudiados.
5.4 La metodología propuesta permitió la identificación de una gran
variedad de compuestos en los materiales patrón, así como el
almacenamiento de la información obtenida sobre la s sustancias detectadas
(espectro de masas, tiempo de retención, identificación, material del que
provienen y orden decreciente de intensidad) en una base de datos con forma
de biblioteca de espectros.
5.5 Las muestras procedentes del barniz de una colección de
instrumentos de cuerda italianos de la época renacentista se analizaron
satisfactoriamente con el procedimiento desarrollado. La identificación de
los picos cromatográficos se realizó correctamente con la ayuda de la
biblioteca de espectros, que resultó de especial utilidad para los picos
cromatográficos con intensidades a nivel del ruido.
5.6 La información obtenida mediante la metodología analítica
propuesta permitió caracterizar una resina de Pinaceae y aceite de linaza en
los barnices de la tiorba de Venere y en el violín de Stradivarius, además de
una fracción triterpénica en el barniz del laúd de Maler.

6. El estudio analítico de resinas sintéticas se llevó a cabo siguiendo una

______________________________________________________________
228
 VI. CONCLUSIONES

metodología basada en la pirólisis-GC/MS, sin la adición de derivatizante ni

tratamiento de la muestra.
6.1 Se realizó la optimización de la temperatura de pirólisis entre las
temperaturas 590; 650 y 764ºC. En el caso de los polímeros acrílicos, a
590ºC se obtuvieron pirogramas con un mayor número de fragmentos
mientras que para la resina cetónica Keton N, se detectó un mayor número
de compuestos característicos a 764ºC. Para las demás resinas poliméricas
estudiadas (poliestireno, resina de hidrocarburos saturada, resina de indeno-
benzofurano, acetato de polivinilo, butiral de polivinilo, polímero cetónico,
resina de fenol-formaldehido y poliacroleína) no se encontraron diferencias
significativas en función de la temperatura.
6.2 Las condiciones instrumentales establecidas para el cromatógrafo y
el espectrómetro de masas resultan adecuadas para la resolución e
identificación de los 278 fragmentos detectados tras la ruptura térmica de las
18 clases de polímeros sintéticos y las muestras pictóricas estudiadas, en 29
minutos. Los fragmentos característicos detectados en los pirogramas son
sustancias cuya estructura es similar a la de la unidad monomérica de la
resina, por lo que proporcionan mayor fia bilidad para la caracterización del
polímero sintétic o.
6.3 La metodología analítica propuesta se aplicó al análisis de
muestras procedentes de una obra pictórica moderna elaborada por el pintor
alemán Baselitz (“Senta” 1992/1993). El estudio minucioso de los
pirogramas obtenidos reveló la presencia de fragmentos característicos de las
resinas cetónica, así como de parafina, aceite secante y plastificante.

______________________________________________________________
229
 PART B
FOR DOCTOR EUROPEUS MENTION
ANALYTICAL STUDY OF MATERIALS USED IN
VARNISHES, BINDING MEDIA AND
CONSOLIDANTS IN ARTWORKS BY
CHROMATOGRAPHIC AND SPECTROMETRIC
METHODS

231
 VII. SUMMARY

233
 SUMMARY. INTRODUCTION

1. Introduction

Artworks are made of a wide variety of materials. They must be

carefully chosen, handled and applied by the artist in order to establish the
aesthetical properties. Later, they can provide useful information to art
researchers about the artistic technique and period of the artist [7]. However,
these materials are degradated through the time by complex processes, due
to external conditions as moisture, temperature, environmental chemicals
and incorrect preservation conditions, as well as to interactions between the
own compounds of the pictorial artwork [8,37]. An adequate restoration and
preservation treatment must be applied to avoid the deterioration processes
and allow the conservation of the artwork. For these reason, a complet
analytic al study of the artistic object in order to obtain a maximum of
knowledge about the materials originally used by the artist is strongly useful
[165]. However, this study is difficult because of the effect of the
deterioration, the small quantity of sample avaliable, their complexity and
their low purity [32,162].
The organic materials traditionally used in the field of art are proteins,
waxes, drying oils and terpenic resins, obtained from natural species, due to
their accecibility and plenty. However, during the XIX Century synthetic
materials as polymeric resins were also incorporated to the field of art [7].
Proteins are biopolymers made of aminoacids linked by peptide bonds
[14]. They are among the first natural materials employed for ornamental
purposes and they can be found in a wide variety of historical and artistic
objects. They were employed as binding media, consolidants and covering
materials in pictorial artworks since the antiquity, in the specific pictorial
techniques tempera (with egg protein) and temple (gelatin) [1].
Waxes are organic materials made of a mixture of hydrocarbons, esters
(mono-, di- and tri-), alcohols, free fatty acids, aldehydes, ketones and
triterpenoids, all of them with high molecular mass [7]. They have been
widely used since the antiquity as binding media, consolidant and covering
material for pigment, in encaustic -make pictorial artworks. Likewise, due to
their high hydrophobicity, they have been employed as sealing and
waterproof materials, therefore they can be found in several archaeological
objects, as pottery, graves and building materials [23,26].
Drying oils are complex mixtures of triglycerides, which are triesters
of glycerine with medium sized fatty acids, mainly unsaturated acids, which
are for the most part lost during ageing (linolenic, linoleic and oleic) and
saturated acids (palmitic, stearic and myristic) [7,14]. They are widely used
in oil painting technique as binding media, consolidant and covering,
because of their drying properties: the fresh drying oil is a liquid where the
________________________________________________________
235
 SUMMARY. INTRODUCTION

pigment can be solved, and after applying over the surface of the artwork, it
polymerizes and becomes a rigid net where the pigments are agglutined and
protected [4].
Terpenic resins are made of mixtures of natural substances formed by
hydrocarbons formed by polymerization of isoprene, as well as their partial
oxidized derivatives, which shows alcohol, carbonyl or carboxylic groups
(terpenoids) [7]. These materials have been widely used as varnishes applied
as film coat over paintings or wood objects, as string musical instruments. Its
main function lies in to isolate the object from the environment and to avoid
the degradation of the internal layers. They can also be used to modify the
aesthetical properties by means of the addition of pigments. In the case of
string instruments, the varnish also provides mechanical protection, and can
also influence their sonority. Moreover, on the contrary that in paintings, the
varnish in string instruments is considered as a part of the artwork and can
not be removed [5].
Synthetic resins are materials obtained by industrial polymerization of
low-molecular weight molecules, mainly by radical or chemical
condensation pathway reactions, and were firstly synthesized during the
Industrial Revolution [6,7]. The most usual synthetic resins are polyolefines,
acetate polyvinyls, polyacrylics, alkyd, ketonic , phenol-formaldehyde,
polyacroleins, cellulose nitrate and polysiloxanes. Many of these polymeric
resins are widely used in artworks as binders, agglutinants, adhesives,
consolidants, covering material, varnishes and filler for missing parts in
restoration works. However, they can only be found in artworks elaborated
or restored after the 19th Century [6].
The analytical methodologies used in these studies are based on
techniques with high sensitivity, selectivity, versatility which allow to work
with small samples [7]. Then an extense variety of analytical techniques
have been used in order to characterize the organic materials in artworks.
The vibrational spectroscopic techniques, such as FTIR [138] and
Raman [149], allows the analysis of a small quantity of sample without
previous treatment and the possibility to simultaneously identify a wide
assortment of materials. On the other hand, separation techniques, coupled
with some sort of detection system, are used to obtain information of the
material in the sample by means of the compounds, due to its selectivity, low
sensitivity and reproducibility. Their identification provides the kind of
material, and the characterization is usually made by the relative amount of
the compounds [165] or the presence of several marker-molecules [162]. The
methodology of analysis usually includes a modification of the properties of
the compounds by a derivatization step treatment to improve the sensibility
of the analysis [165,212]. The most used resolutive techniques are
electrophoresis [197], size exclusion chromatography [209] , gas
________________________________________________________
236
 SUMMARY. AIMS

chromatography (GC) coupled with flame injector detector [163] or mass

spectrometry [96], pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry
[22,187] and liquid chromatography (HPLC) with UV-Visible [138] ,
fluorescence [212] and mass spectrometry [53] detection. However, mass
spectrometry is also able to provide by itself qualitative and quantitative
information about the compounds in the sample. For these reason, it can also
be used as analytical technique [275,290].

2. Aims

The general aim of this Doctoral Thesis was to develop methodologies

to characterize several organic materia ls used in the manufacturation,
restoration and/or preservation of artworks, as proteins, waxes, drying oils,
synthetic polymers and terpenic resins in historical varnishes of string
musical instruments. The selected analytical techniques were liquid
chromatography, gas chromatography and mass spectrometry. The specific
purposes for each study are detailed as follows:

1. Proposal of a methodology to analyze proteins by HPLC-Fluorescence.

- Optimization of the derivatization reaction to improve the fluorescent
properties of the aminoacids.
- To establish the adequate instrumental conditions for the chromatographic
separation of the analytes.
- Identification of each standard aminoacid and determination of the
analytical parameters of the method.
- Characterization of the proteins by means of the relative proportion of
aminoacids.
- Chemometric treatment of the obtained data by Principal Component
Analysis (PCA), in order to improve the realiability of the discrimination
between the proteins.
- Application of the suggested methodology to pictorial artworks.

2. Analytical study of natural waxes in artistic and archaeological objects by

gas chromatography (GC).
- Study of the derivatization reaction to increase the volatility of the fatty
acids.
- Identification of the fatty acids and hydrocarbons in the natural waxes by
GC/FID.
- Characterization of the waxes by means of the relative amount of fatty
acids and alkanes.

________________________________________________________
237
 SUMMARY. AIMS

- Selection of the reference compounds for the fatty acids and hydrocarbons,
in order to obtain their relative amount.
- Chemometric study of the information obtained by PCA, in order to
improve the reliability in the differentiation of the natural waxes.
- To verify the analytical procedure, the suggested methodology was applied
to artistic samples.

3. Proposal of methodologies using HPLC-UV-Visible and HPLC-

Fluorescence as analytical techniques to characterize drying oils employed
as binding media in pictorial artworks.
- Optimization of the experimental prodecure to release and extract the fatty
acids
- Choice of the adequate derivatization reagents to improve the absorptivity
or fluorecence of the fatty acids and optimization of the reaction conditions.
- Establish the parameters of the chromatographic resolution and detection of
the fatty acids derivatives.
- Identification of the carboxilic acids and comparison of the analytical
parameters of both methods.
- Characterization of the drying oils by means of the relative amount of fatty
acids.
- Application of the suggested method to oil painting samples.

4. Optimization of analytical methods to identify protein and oil binding

media without derivatization or separation step by direct mass spectrometry.
- To propose a treatment of hydrolysis of the samples and extraction of
aminoacids and fatty acids.
- Optimization of the instrumental conditions of the mass spectrometer to
identify the aminoacids and fatty acids.
- Differentiation of protein and oil binding media from the relative amount
of aminoacids and fatty acids, respectively, by means of a chemometric
treatment of the obtained data by Linear Discriminant Analysis.
- Application of the methodology of samples from artworks.

5. Analytical study of the organic fraction of varnishes of string instruments

by GC/MS.
- Choosing of reference materials included in recipe to elaborate varnishes
during the Renacentist period.
- Optimization of derivatization method and instrumental conditions of the
GC/MS.
- Identification of the substances present in the standard materials.
- Construction of a mass spectra database for this kind of compounds.
- Characterization of the molecules included in the real samples.
________________________________________________________
238
 SUMMARY. PROTEINS

- Application of the proposed method to samples from varnishes of

historical string instruments, including a unit of Stradivarius.

6. Analytical study of polymeric resins present in pictorial artworks by

pyrolysis-GC-MS.
- Study of the instrumental conditions of the thermic breakage of the
analytes.
- Identification of the fragments obtained by means of the analysis of the
standards of the synthetic polymers.
- Identification of the compounds detected in samples from samples from a
modern painting.
- Characterization of synthetic resins and organic additives in the samples
from pictorial artworks.

3. Results and discussion

3.1 Characterization of proteins in pictorial artworks through their

aminoacids relative amount by liquid chromatography with
fluorescence detection

The developed analytical procedure proposes an identification of the

proteins based on the relative amount of aminoacids, which were analyzed
by liquid chromatography with a fluorescence detector.
The first step lay in the decomposition of the protein biopolymer by
hydrolysis with concentrated hydrochloric acid at 110ºC for 16 h, followed
by the extraction of the obtained aminoacids with a polar acidic solvent, as
0.1 mol.L-1 aqueous HCl. The hydrolysis step produced an alteration of the
aminoacids content, so that asparagine and glutamine were turned to their
corresponding acids, aspartic and glutamic, respectively. This last can also
undergo a cyclation, turning into pyroglutamic acid. Moreover, the
tryptophan decomposes in an extreme acidic medium. Then these
aminoacids would not appear in the results [162].
Obtained aminoacids were derivatized at room temperature with o-
phthalaldehyde (OPA) as fluorescent reagent in basic borate buffer, using 2-
mercaptoethanol as catalyst. This reagent reacts with primary amines to
provide high sensitive fluorescent adduct, with short time derivatization
times and no needing of heating. However, cysteine and secondary
aminoacids proline and 4-hydroxyproline can not be analyzed, be to the poor
stability of their OPA-derivative [271].
The resolution of the OPA-aminoacids derivatives was performed by
reverse phase liquid chromatography, using an injection loop of 20 ìL. The
________________________________________________________
239
 SUMMARY. PROTEINS

stationary phase was a Zorbax XBD-C18 column, and mobile phase was a
gradient programmed between these two eluents: 5% of tetrahydrofurane in
water buffered at pH 5.8 with acetic acid/sodium acetate and methanol,
running at 1 mL.min-1 at 30ºC. Under these conditions, an adequate
resolution, without interfering substances, was obtained in 45 minutes. The
the detection was performed at 340 and 450 nm as excitation and emission
wavelengths, respectively [271].
The optimization of the derivatization parameters (reaction time,
reagent concentration) and the chromatographic conditions (solvents, flow,
gradient program, temperature) were optimized using a mixture 0.8 mmol.L-1
of the following standard aminoacids (elution order): aspartic acid, histidine,
glutamic acid, serine, lysine, arguinine, glycine, threonine, alanine, tyrosine,
methionine, valine, phenylalanine, isole ucine and leucine. Afterwards, the
analytical parameters of the methodology were determined for all the
aminoacids, using 0.1 ìmol tryptophan as internal standard. A satisfactory
sensitivity with a limit of detection of 0.08 nmol and an adequate linearity
between 4-330 nmol was obtained for almost the analytes. The analytical
parameters were found similar for all the studied aminoacids, however, 3-
times-higher sensitivity was found for glycine and lysine.
The proteins selected for the study were those most used in tempera or
temple pictorial artworks: albumin, casein, egg, beef gelatin and porcine
gelatin [162]. The characterization was carried out by means of the relative
amount of aminoacids, calculated as the quotient between the
chromatographic peak area corresponding to each aminoacid and leucine
(A(AA)/A(leu)). This last analyte was chosen as reference, due to the
stability of its derivative. In order to improve the reliability of the
differentiation, the obtained data were statistically treated with Principal
Component Analysis. The score plot of the two first principal components
shows the statistic objects grouped by their protein origin with high
resolution. Finally, in order to evaluate the capability of prediction of the
proposed methodology, it was applied to the characterization of samples
from artworks belonging to the Valencian Cultural Heritage. Samples from
four artistic paintings were analyzed and in all of them egg protein was
clearly identified.
Otherwise, it is quite known that the metallic cations, usually coming
from pigments, can complex aminoacids, preventing the derivatization [160].
This effect results in a variation of the relative amount of aminoacid
determined by HPLC-fluorescence, and may be a serious trouble for the
characterization. To avoid it, the analysis of the samples from artistic
artworks was repeated adding a solution of ethylenediamino tetraacetic acid
disodium at pH 9 in ammonia/ammonium chloride, in order to complex the

________________________________________________________
240
 SUMMARY. NATURAL WAXES

metallic cations. In this case, egg protein was also identified in the four
studied artworks, and better resolution was found.
The developed analytical procedure shows the advantage of the
detection of the arguinine, which is not possible in gas chromatography with
silica capillary column. Otherwise the main disadvantage is the no
quantification of the secondary aminoacids and cystein. However, the
characterization of the protein can be quite reliably performed with the 15
studied aminoacids by means of the chemometric treatment by Principal
Components Analysis .

3.2 Characterization of waxes by means of their relative amount of

linear alkanes and fatty acids in artworks by gas chromatography

The developed analytical method proposes the characterization of

natural waxes by analysis of the ir main constituents, linear alkanes (from 20
to 35 carbon atoms) and fatty acids (from 14 to 26 carbon atoms) using gas
chromatography with flame ionization detector.
The first step includes a treatment of the solid sample with
concentrated hydrochloric acid, at 110ºC for 16h, in order to break the ester
bond and release the fatty acids. Then these last compounds and the alkanes
were separated from the matrix by a liquid/liquid extraction with
chloroform/water, remaining in the organic phase. Furthermore, fatty acids
were turned in to their ethyl derivatives in order to improve their volatility
[163]. Alkanes are directly analyzable by gas chromatography and they do
no need any modification. Furthermore the solvent was evaporated and the
remaining solid was treated with ethyl chloroformate in ethanol/pyridine 4:1
v/v, a reagent widely employed to the ethylation of carboxylic and amine
groups, because of the reaction runs at room temperature with adequate
quantitativity and rapidity. Finally, the obtained mixture was extracted with
chloroform, and an aliquot of 1.5 ìL was injected into the chromatographic
system.
The separation by gas chromatography was performed in a capillary
column (14% cyano-propyl-phenyl-siloxane) as stationary phase, and the
carrie r gas was helium running at 1.5 mL.min -1 (constant flow). The injector
was made with a split ratio of 1:20. The initial temperature of the oven was
100ºC, and a gradient of 40ºC.min-1 was applied until 275ºC (nearly 4.4 min)
and this last temperature was mainta ined for 25 minutes. Under these
conditions , the analytes were satisfactorily separated in 30 minutes without
interferences between them and other compounds. The quantification was
carried out by flame injection with hydrogen and synthetic atmosphere, at
300ºC with adequate sensitivity [165].

________________________________________________________
241
 SUMMARY. NATURAL WAXES

Mixtures of standard hydrocarbons and fatty acids 1 mmol.L-1 were

studied in order to obtain the retention time of each analyte. The following
hydrocarbons were directly analyzed by gas chromatography: n-eicosane, n-
heneicosane, n-docosane, n-tricosane, n-tetracosane, n-pentacosane, n-
hexacosane, n-heptacosane, n-octacosane, n-nonacosane, n-triacontane, n-
dotriacontane, n-hentriacontane, n-tritriacontane, n-tetratriacontane and n-
pentatriacontane. On the other hand the considered fatty acids (myristic,
palmitic, oleic, stearic, arachidic, behenic, lignoceric and cerotic) were
derivatized with ethyl chloroformate prior to the analysis. In both cases, the
analytes were detected without interferences in 30 minutes, with adequate
sensitivity and resolution. Moreover, no interference was found between
carboxylic acids and linear alkanes.
Studied natural waxes chosen were those most employed in encaustic
pictorial technique, and from different origin, as beeswax (animal), carnauba
(vegetal) and ceresin (mineral) [7]. A small sample of each one was
analyzed, obtaining adequate sensitivity without interferences with other
compounds in the matrix.
For the three standard waxes, the quotient between the
chromatographic peak area of each linear alkane and n-heptacosane
(A(H)/A(C27H)), as well as the ratio between the chromatographic peak area
of each ethyl carboxylate and ethyl palmitate ((FA)/A(C16)). These
compounds were chosen as reference because of their high amount in the
three considered standard waxes. In order to enhance the reliability of the
characterization, the obtained values were statistically treated with Principal
Component Analysis. The score plot of the two first principal components
shows the statistic objects clearly grouped by wax origin with high
resolution. Finally, in order to evaluate the capability of prediction of the
suggested analytical method, it was applied to the characterization of a
sample from an oleoresin belo nging to the Mexican Cultural Heritage, where
beeswax was identified.
Waxes in pictorial artworks are often found mixed with other materials
as oils, proteins, resins, polymers, pigments, etc. Especially, oils contain
high amount of fatty acids, which are released during the acid hydrolysis and
are analyzed together with those from the wax, changing the relative amount
of carboxylic acids. In order to characterize the waxes in presence of oils, a
new PCA model was made, taking only the A(H)/A(C27H). The different
waxes appear even now separated. In this case, beeswax was also
characterized in the sample from the analyzed artistic sample.
This work introduces the use of ethyl chloroformate, which has not
previously used in wax analysis. However, its main disadvantage is the
lacking of information obtained about the structure of the triglycerides,
which decompose during hydrolysis.
________________________________________________________
242
 SUMMARY. DRYING OILS

3.3 Characterization of drying oils by liquid chromatography coupled

to UV-Visible and fluorescence detector

The developed methodologies propose the characterization of drying

oils used in pictorial artworks by means of the relative amount of fatty acids
determined by liquid chromatography with UV-Visible and fluorescence
detector.
The first step lies in the breakage of the ester bond by hydrolysis with
concentrated hydrochloric acid, heating at 110ºC for 16 h [165]. The fatty
acids were extracted via a three times liquid/liquid extraction with water and
hexane (optimized parameters), remaining in the hydrophobic phase. Then
the analytes were derivatized with a chromogen (2-nitrophenylhydrazine)
[220] or a fluorescent reagent (4-bromomethyl-7-methoxicoumarine) [240].
The resolution of the fatty acids mixture was also performed with different
condition, depending on the detector.
a) UV-Visible. The fatty acid mixture was derivatized with 2-
nitrophenylhydrazine (2-NPH), using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl
carbodiimide) hydrochloride as catalyst in acidic medium. The reaction was
carried out by heating with microwave oven at 260 W for 6 min, then a KOH
solution was added to stop the reaction, and the mixture was heated under
the same conditions for 3 minutes to decompose the by-products.
Furthermore, an aqueous solution of hydrochloride acid was added to acidify
the sample and to avoid the introduction of a basic solution into the injector.
Finally, the sample was filtered and was ready to the injection.
The chromatographic separation was performed using a hydrophobic
column Zorbax XDB-C8 as stationary phase, and the mobile phase was a
methanol/water/n-propanol/acetic acid 80/14/5/1 running under isocratic
mode at 1.2 mL.min -1 . Injection loop volume was 20 ìL and the wavelength
detection was fixed at 400 nm.
The work was focused in the optimization of the reaction parameters
(solvent, pH, concentration of reagent, use of microwave oven, time, power
and post-derivatization treatment) and the chromatographic conditions
(adequate solvent for elution, detection wavelength). The study was carried
out using a 0.25 mmol.L-1 solution of the more important fatty acids in aged
oil samples, myristic, palmitic, oleic and stearic. Under the proposed
conditions, the analytes provided gaussian shape chromatographic peaks,
and they were adequately resolved with enough sensitivity in 14 minutes.
b) Fluorescence. The fatty acid solution was derivatized by reaction
with 4-bromomethyl-7-methoxicoumarine (Br-Mmc), using 18-crown-6
ether and KHCO 3 as catalyst in acetone/acetonitrile 25/10 v/v medium. The
reaction was carried out by heating in a water bath at 55ºC for 25 minutes

________________________________________________________
243
 SUMMARY. DRYING OILS

protected from light [240]. The mixture was then filtered and ready for
injection.
The chromatographic resolution of the fatty acids-derivatives was
performed using as stationary phase an apolar column Zorbax XDB-C8. The
composition of the mobile phase changed following a gradient programmed
from methanol/water 90/10 to 100/0 in 25 minutes, and run at 1.5 mL.min -1
at 30ºC. Injection loop volume was 20 ìL and the excitation and emission
wavelenght were adjusted to 325 nm and 295 nm, respectively.
The parameters optimized were the concentration and volume of
reagents, as well as the parameters of the mobile phase (gradient program,
solvent, flow, temperature) and the emission wavelength. The optimization
was performed using the same solution and analytes as for UV-Visible
studies (0.25 mL.min-1 of myristic, palmitic, oleic and stearic acids). In this
case, gaussian shape chromatographic peaks were also obtained, with
satisfactory sensitivity and without interferences.
For both methodologies, the analytical parameters were determined for
each studied fatty acid, using arachidic acid as internal standard. Under UV-
Visible detection, an ample linerarity was found between 3 and 300 nmol,
with a limit of detection of 1.5 nmol. Under fluorescence detection, the
linearity interval was 0.1-180 nmol, and the detection limit was 0.06 nmol.
As seen, the HPLC-fluorescence methodology provides 25-times sensitivity
than with UV-visible detection. However, the analytes were better resolved
under HPLC-UV-Visible conditions, especially palmitic and oleic, which
appears close in HPLC-Fluorescence. Otherwise, the analytical parameters
were found quite similar for the considered fatty acids.
The studied drying oils were those most usually used in oil paintings
as binding media : linseed, walnut and poppy seed [165]. In order to evaluate
the effect of the ageing in the chemical composition of the drying oils, the
study was focused on the analysis of fresh liquid oils, as well as naturally
aged for 5 years [289] and by two artificial accelerated ageing treatment
(thermic [18] and UV irradiation [163]). The characterization of the drying
oils was based on the relative amount of fatty acids, which were calculated
as the quotient of the chromatographic peak area for each fatty acid and the
palmitic acid. The fresh drying oils samples contain high amounts of
unsaturated fatty acids, especially linolenic, linoleic and oleic acid, which
are lost during the ageing. Only oleic acid was found in the aged samples,
depending on the ageing treatment. Otherwise, myristic acid was found in all
the studied samples in too low amount to be used as an identification
parameter. On the other hand, the ratio stearic/palmitic remains roughly
constant for each kind of drying oil, despite the ageing treatment, so this
quotient was considered as characterizing parameter. Using both suggested

________________________________________________________
244
 SUMMARY. PROTEINS AND DRYING OILS

methodologies, the ratio (C18)/(C16) calculated for each standard was:

linseed oil 0,6; walnut oil 0.3 and poppy seed oil 0.2.
The capability of prediction of both methodologies was established by
applying them to the identification of the drying oil in samples from nine
samples from oil paintings from the Valencian Cultural Heritage. In eight
samples, linseed oil was characterized, whereas walnut oil was identified in
one artwork.

3.4 Characterization of protein and oil binding media by direct infusion

mass spectrometry

The purpose of the work detailed below was to propose a methodology

to characterize proteins and drying oils present in artworks as binding media
by means of the content in amino acids and fatty acids, respectively. The
detection was made through direct infusion mass spectrometry with
electrospray ionization (ESI), avoiding the fragmentation of the analytes.
The chosen standard agglutinants were the same as studied in section 1
(albumin, casein, egg, beef gelatin and porcine gelatin) and in section 3
(linseed, walnut, poppy seed, each one naturally and artificially aged via
thermic and UV-irradiation treatment). Analytical procedure was depending
on the kind of binding media:
a) Proteins. Samples were hydrolyzed with the procedure explained in
section 1. The extracted aminoacids were solved in ethanol/aqueous HCl 0.1
mol.L-1 , and then infused into the mass spectrometer at 0.3 mL.h-1 .
The parameters of the mass spectrometer were adjusted by
optimization with the following aminoacids, obtained after the hydrolysis of
a sample from beef gelatin (ordered by molecular mass): glycine, alanine,
serine, proline, valine, threonine, isoleucine, leucine, aspartic acid, lysine,
glutamic acid, methionine, histidine, phenylalanine, arguinine and tyrosine.
The sensitivity was found higher under positive polarity, a target mass of 90
m/z, with a scan range of 50-300 m/z. The parameters of the nebulizer were
optimized, by studying their influence over the sensitivity and
reproducibility, to: temperature 250ºC, gas pressure 25 psi and drying gas
flow rate 8 mL.min-1 . Under these conditions each aminoacid appeared as
their [M+H +] ion without interferences, and the quantitative data was the
abundance ion. Only leucine, isoleucine and 4-hydroxyproline appear at the
same molecular mass (132 m/z). Then mass spectrometry-mass spectrometry
(MS2 ) was applied to differentiate these three aminoacids. Leucine and
isoleucine were not distinguished even by MS2 , and 4-hydroxyproline was
not found in protein standard, this 132 m/z ion was assigned to isoleucine
and leucine mixture.

________________________________________________________
245
 SUMMARY. PROTEINS AND DRYING OILS

b) Drying oils. A saponification was proposed to release fatty acids

from the triglycerides. Samples were hydrolyzed with potassium hydroxide
240 mmol.L-1 in n-propanol/methanol 85:15 v/v by heating with heating
plate until solvent evaporation. Afterwards, the remaining solid was acidified
with concentrated hydrochloric acid in order to obtain the carboxylic acids.
Then they were extracted as described in section 3. Furthermore fatty acids
mixture is solved in potassium hydroxide 40 mmol.L-1 in n-propanol/
methanol 85:15 v/v, and then the mixture was infused into the mass
spectrometer through a fused silica capillary by external pressure at 2 bars
[290]. The solvent was less concentrated in order to avoid the introduction of
salts in the mass spectrometer.
The instrumental parameters of the mass spectrometer were adjusted
by optimization considering the following fatty acids, obtained after the
hydrolysis of a sample from poppy seed oil aged by thermic treatment
(ordered by molecular mass): caprylic, pelargonic, capric, suberic,
undecanoic , azelaic, lauric, sebacic, myristic, palmitoleic, palmitic, linolenic,
linoleic, oleic and stearic. As the analytes were deprotonable, they were
introduced in a basic medium into the mass spectrometer and detected under
negative polarity. Then fatty acids were identified as their [M-H]- ion, with
adequate resolution, as each fatty acid has a different molecular mass, and
without interferences form other compounds in the matrix. The quantitative
information was provided by the abundance ion. Target mass was 255 m/z
corresponding to the ion or palmitate, and the scan range was 100-400 m/z.
The parameters of the nebulizer were adjusted to: temperature 200ºC, gas
pressure 25 psi and drying gas flow 5 mL.min-1 .
The characterization of protein and oil binding media was made from
the relative amount of aminoacids and fatty acids, respectively. After
applying a normalization procedure, the obtained data were statistically
treatment with a supervised classificatory chemometric tool, Linear
Discriminant Analysis (LDA). Obtained results were:
a) Protein. The score plot of the two first discriminant functions shows
adequate separation between albumin, casein, egg protein and animal
gelatin. Therefore, another Principal Component Analysis was made
considering only beef and porcine gelatin, which were then satisfactorily
resolved.
b) Drying oils. The constructed model by LDA provided an adequate
resolution between linseed, walnut and poppy seed oil, despite their different
ageing.
The capability of the suggested methodologies to identify the
agglutinant in complexes matrix was established by applying them to
samples from pictorial artworks belonging to the Spanish Cultural Heritage.

________________________________________________________
246
 SUMMARY. TERPENIC RESINS

The same four samples as in section 1 containing protein binding media

were studied, where egg protein was also found in all of them. On the other
hand, nine samples from oil paintings were studied, in one of them walnut
oil was identified whereas linseed oil was characterized in the other eight
artworks.
The main advantage of the developed methodologies was the
suppression of the derivatization and the separation step. This simplification
of the experimental procedure results in an improvement of the
straightforwardness, reproducibility, speed and robustness. Moreover, as the
analytes were separated by their molecular mass, a high resolution found.

3.5 Characterization of the compounds in varnishes of Italian string

instruments by gas chromatography coupled to mass spectrometry

The aim of the work was the characterization of the organic

constituents of historical varnishes from ancient Italian string instruments, a
Maler lute ( 1529-1552), Venere theorbo (1606) and Stradivari violin
(1724) , kept in the Musée de Musique in Paris, by gas chromatography-mass
spectrometry. The work was performed in the laboratories of the Centre of
Research and Restoration of the French Museums, Musée du Louvre, Paris,
France.
The standards chosen for the analytical study were several materials
traditionally used in the elaboration of wood-object varnishes: essential
(turpentine and spike oil) and drying oils, additives (camphor and benzoin)
diterpenic resins (colophony, Venice turpentine, sandarac and Manila copal),
triterpenic resins (dammar and mastic) and animal resin (shellac). These
materials are mainly made of fatty and polyhydroxycarboxylic, terpenic and
aromatic acids, as well as alcohols, ketones and aldehydes [5,7].
The analytical procedure included a first step of methylation by
transesterification in order to break down the intermolecular bond and
improve the volatility of the analytes. The derivatization was carried out by
reaction with a quaternary ammonium ((m-trifluoromethylphenyl)
trimethylammonium) solved in methanol, at 80ºC for 16 h. Then a second
reaction was performed to block the alcohol groups by silylation. The
methylated sample was treated with N-O-bis[trimethylsilyl]
trifluoroacetamide and trimethylchlorosilane, as catalyst, (99/1 v/v) by
heating at 70ºC for 15 minutes. After each derivatization, an aliquot of 1 ìL
was injected into the gas chromatograph.
The chromatographic resolution was carried out in an apolar capillary
column Varian CP-Sil 5 CB Low Bleed/MS. Carrier gas was helium running
at a constant flow of 1.3 mL.min -1 . Injector temperature was 300ºC. Oven
initial temperature was 40ºC, maintained for 1.5 min during splitless
________________________________________________________
247
 SUMMARY. SYNTHETIC POLYMERS

injection. Then a 10ºC.min -1 gradient was applied until 180ºC, and another
gradient of 4ºC.min -1 was applied until 325ºC, temperature that was
maintained for 8 min. The mass spectrometry ionization was made under
standard conditions at 70 eV, and the detector scanned from 50 to 850 m/z.
Each standard and samples from string instrument varnishes were
analyzed following the detailed procedure, and their corresponding
compounds were identified by means of the retention time and the mass
spectrum. Then, for each standard, the mass spectrum of the highest
chromatographic peak was introduced in a database, together to other useful
information as the retention time, the name, reference material and the
relative intensity in decreasing order. Furthermore, the chromatographic
peaks found in the samples from historical violins were compared with those
stocked in the database, in order to identify them and propose hypothesis
about the reference materials in the varnishes.
The obtained results points to the use of linseed oil as solvent for the
varnishes. The hypothesis about the characterization of the resinic material
can be summarized as follows:
a) Maler Lute. Traces of highly oxidized Pinaceae resin, probably
Venice turpentine or colophony were found, as well as triterpenic
compound, perhaps coming from elemi.
b) Venere theorbo. Venice turpentine was a constituent of the varnish,
together or not with another Pinaceae resin. On the other hand, the sample
showed a highly oxidized state.
c) Stradivari violin. A Pinaceae resin, probably Venice turpentine was
characterized; however, the use of colophony can not be excluded.

3.6 Characterization of synthetic resins in modern artworks by

pyrolysis -gas chromatography-mass spectrometry

The purpose of work was the characterization of a wide range of

polymeric resins used in the elaboration of artworks from the 19th Century,
or in conservation or/and restoration treatment of ancient artistic or
archaeologic objects. These materials were studied by an analytical
procedure based on pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry. Then
the procedure was applied to samples from a modern pictorial artwork from
the German artist Georg Baselitz (“Senta 1992/93”), from the Munich
collection. The analytical study was carried out in the laboratories of the
Doerner Institut, Bayerische Staatsgemäldesammlungen, Munich, Germany.
The selected synthetic materials were resins build by carbon-double
radical polymerization (polystyrene, saturated hydrocarbon resin, inden-
benzofuran polymer, polyvinyl acetate, butanal polyvinyl, and polyacrylate)
and condensation polymers (ketonic resins, phenol-formaldehyde, alkyd and
________________________________________________________
248
 SUMMARY. SYNTHETIC POLYMERS

polyacrolein) [6,7].
The solid sample from standard or pictorial artwork was introduced in
a crucible and pyrolyzed by the Curie -point method at 590; 650 or 764ºC,
without previous treatment or derivatization. The fragments were then
introduced in splitless mode in the chromatographic system. The injector
temperature was 250ºC. The separation was performed in a (5%-phenyl-
methyl-polysiloxane) Low Bleed capillary column HP 5MS, and the gas
carrier was helium running at a constant flow of 0.5 mL.min -1 . The initial
oven temperature was 50ºC, maintained for 2 min, and then a 10ºC.min -1
gradient was applied until 320ºC (nearly 29 min). The mass spectrometry
ionization was made under standard conditions at 70 eV, and the detector
scanned from 42 to 550 m/z.
For each standard material, the compounds obtained by thermic
breakage were identified by means of their corresponding mass spectrum.
Furthermore, for each detected fragment, the information regarding on the
retention time, mass spectrum, name and standard material was stocked.
Special attention was paid over the fragments which structure is close to the
monomer of the synthetic resin, and which would be more useful to its
characterization in unknown samples. Furthermore, the chromatographic
peaks found in samples from modern artworks were compared with those
obtained by analysis of the standards, in order to propose hypothesis about
the materials in its composition.
The results obtained in the analysis from Baselitz artwork points to the
presence of ketonic resin. Some additives as drying oils, paraffin wax, an
antioxidant and a plastifiant were also identified.

________________________________________________________
249
VIII. ANALYTICAL STUDY OF
SYNTHETIC POLYMERS IN
ARTWORKS

251
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. EXPERIMENTAL

CHARACTERIZATION OF SYNTHETIC RESINS USED IN

MODERN ARTWORKS BY GAS CHROMATOGRAPHY
COUPLED WITH MASS SPECTROMETRY BY PREVIOUS
PYROLYSIS

1. Experimental

The analytical methodology explained as follows was proposed to

characterize synthetic resins by pyrolysis-GC-MS. The solid sample was
directly introduced into the pyrolyzer without previous treatment or
derivatization. Then the study of the pyrograms obtained by means of the
analysis of the standards allows to determine the fragments, which
characterize each synthetic polymer. Finally, the proposed method was
applied to samples from a modern pictorial artwork. The corresponding
pyrogram provided adequate information to characterize a polymeric resin
and several additives.

1.1 Standards

Synthetic resins selected for the analytic study, together to their

physical characteristics, supplier and inventory number, are exposed in the
Table 38. These polymers belong to the collection of standard reference
materials, stored in the Doerner Institut, Munich Paintings Collection
(Bayerische Staatsgemäldesammlungen), the institution in charge of the
restoration, conservation, care and maintenance of the artistic paintings
deposited in the Art Galleries and Museums of the State of Bavaria.

1.2 Description of the samples from artworks

Samples from artworks were taken by scalpering from a painting by

the German painter Georg Baselitz (“Senta”, 1992/1993), stored in the
restauratuion workshops of the Munich Paintings Collection (Bayerische
Staatsgemäldesammlungen), and supposed to be carried out in acrylic resin.
The two samples were taken from two zones on the surface, painted with
blue and black pigment, respectively, near the frame.

________________________________________________________
253
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. EXPERIMENTAL

Table 38. Origin and characteristics of the studied polymeric resins.

inventory
resin shape color supplier (year)
number
polyvinyl
polystyrene
Kraton G 1950 small pieces (gummy) white unknown (1996) 90.39.09
Kraton G 1957 small spheres (hard) white unknown (1998) 90.39.10
saturated hydrocarbon resin
Arkon P90 small pieces white unknown (1998) 90.39.12
indene-benzofurane resin
pieces and powder
cumarone brown unknown 90.39.3
(homogenous)
polyvinyl acetate
Mowilith 20 small pieces and powder white Fa (Hoest) 90.39.17.1
Mowilith 30 small pieces white unknown ( 1984) 90.39.17.2
Mowilith 40 small spheres (hard) white unknown ( 1984) 90.39.17.3
Mowilith 50 small spheres (hard) white Kremer Pigmente 90.39.17.4
Constr. Mat. Ltd.
PVAc AYAA pieces white 90.39.8.1
(Brooklyn) (1988)
PVAc AYAF small spheres white 90.39.8.3
Constr. Mat. Ltd.
PVAc AYAT small spheres white 90.39.8.4
(1987)
PVAc AYA pieces white 90.39.8.2
transparent
Palmer Cement compact unknown 90.39.19.1
colorless
Polyvinyl butyral
Mowital B20H powder white unknown ( 1980) 90.39.18.1
Polyacrylic
Paraloid* very viscous red Berkes ---
Acrylic-based
Titanium in tube (doughy) white Golden Acrylics 18.11.1
pigment
Condensation polymers
Alkyd
Alkyd solidified liquid yellow Kremer Pigmente 90.39.15
Ketonic resin
AW2 powder white unknown 90.39.13
AW2 compact red unknown 90.39.14
State Museum of
Keton N pastilles light yellow Lower Saxony 90.39.16
(Hannover)
Laropal A81 small spheres (hard) white unknown 90.39.11
Phenol-formaldehyde
Phenol Resin big pieces black unknown 90.39.6
Phenol Resin crystals and powder red-brown unknown 90.39.4
Polyacroleine
pieces and powder Bender and Hobein
Akroid red 90.39.1
(homogenous) (München)
*liquid resin, the other described standards are solid materials

________________________________________________________
254
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. EXPERIMENTAL

1.3 Instrumentation

Analyses were performed using the following instrumentation: a

Curie-point pyrolyzer Pyromat V.108 (GSG Meß- und Analysengeräte,
Bruchsal, Germany), connected to a gas chromatograph 6890N (Agilent),
coupled to a mass spectrometer MSD, 5975C Inert mass (Agilent). The
chromatographic resolution was achieved through a capilla ry column HPM
5MS/Low Bleed (5%-phenyl)methylpolysiloxane, (length: 30 m, internal
diameter: 250 ìm, film thickness: 0.25 ìm), and maximal temperature
325ºC. Carrier gas was helium running at a constant flow of 0.5 mL.min -1
(15 cm.s-1 . Injector was under splitless conditions.
The chamber of the pyrolyzer was firstly at 200ºC, and the pyrolysis
was achieved at the selected temperature for 10 s. Injection temperature was
adjusted to 250ºC, producing an initial pressure over the column cap of 89
kPa. The initial temperature of the oven was 50ºC, maintained for 2 min,
then a 10ºC.min -1 gradient was applied to 320ºC (29 min). Ionization was
performed under standard conditions at 70 eV, with a voltage of 200 V. The
temperature of the source was adjusted at 250ºC, whereas the temperature of
the quadrupole was 100ºC. The mass spectrometer was scanned in the 42-
550 m/z range, with 2.87 cycle.s-1 .

1.4 Experimental procedure

The sample was introduced in the crucible with a scalpel, adding as

less amount as possible. Then the crucible was fitted into a hollow glass
cylinder, which was set up in the pyrolyzer syringue.
Pyrolysis was achieved by Curie -point method. Crucibles for 590; 650
and 764ºC were available to perform the analytical study.
After each pyrolysis, crucibles were treated with the following clean-
up protocol: used crucibles were ultrasonicated in methanol (HPLC grade,
Fischer) and then other time with tetrahydrofurane (HPLC grade, Fischer).
Pyrolyzer syringue was cleaned following the same procedure.
Sampling was performed depending on the characteristics of the
standard polymeric resin:
- Kraton G1650, Kraton G1657, Arkon P90, Mowilith 20, Mowilith 30,
PVAc-AYAA, Palmer Cement, Acrylic Pigment, Alkyd, AW2 (90.39.14),
Laropal A81. The aliquot was obtained cutting the synthetic resin with a
scalpel.
- Coumarone resin, Mowital B20H, AW2 (90.39.13), Phenol Resin
(90.34.4), Akroid. A grain of powder was directly taken.
- Mowilith 40, Mowilith 50, PVAc-AYAF, PVAc-AYAT, PVAc-AYA. The
material was previously softened by drenching in ethanol, and then the
aliquot was obtained by cutting with a scalpel.
- Paraloid. Sample was taken with a micropipette.
________________________________________________________
255
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

- Keton N, Phenol Resin (90.34.6): a piece was powdered with an agatha

mortar, and a particle of the powder was taken.

2. Results and Discussion

Synthetic resins are a wide category of modern material with an

extensive variety of formulations and functionalities. These polymers have
been employed in the field of art since the 19th Century, as base-materials in
pictorial artworks, as well as in conservation/restoration treatment more
ancient artistic artworks, so that they can be found in a wide number of
objects with artistic or historical interest. The characterization of the several
kinds of synthetic materials used by the artist or the conservator is of the
utmost importance to propose adequate conservation and restoration
treatments [6].
The proposed analytical methodology to analyze synthetic polymers
is based on the direct pyrolysis of the solid sample, without previous
treatment or derivatization adding, followed by the resolution of the obtained
fragments mixture by gas chromatography and their individual identification
by means of their corresponding mass spectrum. Firstly, a wide set of several
synthetic resins used in artistic purpose (described in the section 1.6 of the
Chapter III and exposed in Table 38, section 1 of this Chapter), storing the
obtained information about the characteristic fragments of each material, as
well as about other minority detected compounds.
The applied instrumental conditions were previously optimized in an
earlier study to characterize synthetic pig ments in artworks, because these
materials are usually analyzed together in real samples. However, pyrolysis
temperature was optimized for each studied synthetic resin. Finally, the
suggested analytical methodology was applied to identify synthetic resin in
samples from artworks, by means of the comparison of the detected
fragments with those characteristic of each standard. Other organic
materials, as drying oil, waxes and plasticizer were likewise identified.

2.1 Study of standard synthetic resins

The analysis of samples from the standards, through the experimental

procedure by Py-GC-MS described previously, provided the corresponding
pyrogram, together with the mass spectrum of the most intense
chromatographic peaks.
The influence of the temperature on the thermic breakage was studied
by comparison, for each synthetic resin (Table 38 in section 1 of this
Chapter), of the pyrograms obtained by pyrolysis at 590; 650 and 764ºC. In
the case of polystyrene (Kraton G), saturated hydrocarbon resin (Arkon
P90), indene-benzofurane resin (coumarone resin), polyvinyl acetate
________________________________________________________
256
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

(Mowilith, PVAc, Palmer Cement), polyvinyl butyral (Mowital B20H),

ketonic polymer (AW2, Laropal A81), phenol-formaldehyde resin and
polyacroleine, no significant dissimilarities were found, in terms of
fragments detected in the pyrograms, at the considered temperatures.
However, the Acrylic-based Titanium pigment, Paraloid and Keton N
pyrograms are clearly dependent on the temperature pyrolysis.
The obtained fragments provided useful information about the
structure of each polymer, the presence of interferences or additives and the
characterization of the synthetic resin in a complex matrix. Therefore, the
fragments with a structure close to the monomer were considered as
characteristic, and were most helpful for the characterization of the
corresponding synthetic resin. Other detected fragments could be considered
as oligomers or the result of reorganization of some products formed during
the pyrolysis.
The list of the fragments detected in the scope of this wide study, is
detailed in Table 36 (Chapter V, section 6, heading table at the end of this
Chapter) indicating their retention time and most intense ion. The fragments
detected in each standard and modern painting samples are indicated in
Table 37 (Chapter V, section 6, heading table at the end of this Chapter).

2.1.1 Vinylpolymers

The following polyvinyl resins were studied: a styrene-

ethylene/butylene-styrene (SEBS) polymer (Kraton G1650 and Kraton
G1657 commercial version), a saturated hydrocarbon resin (commercial
name Arkon P90), one indene-benzofurane polymer (coumarone resin),
polyvinyl acetate (three commercial versions: Mowilith, PVAc and Palment
Cement), polyvinyl butyral (Mowital B20H) and polyacrylic resins (Paraloid
and a commercial acrylic -based Titanium pigment). These resins are
exposed in Table 38 (section 1 of this Chapter).
Pyrograms from SEBS commercial polymer analysis showed a high
amount of styrene, which was considered as the characteristic fragment, and
toluene. The other monomers (ethylene and butylene) do not appear, due to
their low molecular mass and high volatility. In the sample from Kraton
G1657, hydrocarbons were also found, probably coming from the sieving for
purification.
The characteristic fragments of Arkon P90 were saturated
alkylcyclohexanes, as methylcyclohexane, ethylcyclohexane, 1-ethyl-3-
methylcyclohexane, (1-methylethyl)cyclohexane and 1-ethyl-4-
methylcyclohexane, which come from the saturated polycyclic structure of
the resins. Other detected fragments were alkylcyclohexene, indene and
decahydronaphthalene.

________________________________________________________
257
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

The following compounds of coumarone resin were detected by Py-

GC-MS and considered as identifying: benzofurane, indene,
methylbenzofurane and methylindene, the monomer of the resin. Several
compounds with aromatic rings were also found.
The pyrolysis products of polyvinyl acetate were mainly acetic acid,
from the polymer, and benzene, formed by reorganization of smaller
fragments. Naphthalene, bi-phenyl and a wide group of alkylbenzenes were
also detected. However, in the Palmer Cement, acetophenone and
benzaldehyde, probably from the solvent of the polymer, could be as well
identified. These three kinds of polyvinyl acetate would probably be by this
way indistinguishable in a complex matrix.
The pyrogram of the polyvinyl butyral Mowital B20H shows as
characteristic fragments the following compounds: butanal, obtained from
the thermic breakage of the polymer, and benzene, formed from
reorganizations of other fragment, by the same way as in polyvinyl acetate.
On the other hand, butanoic acid, benzaldehyde, 3-penten-2-one and several
alkylbenzenes were also identified.
The study of an Acrylic -based Titanium pigment was performed in
order to enlarge the information about the behaviour of acrylic polymers
during the pyrolysis. The characteristic fragments were the following acrylic
monomers: methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate,
isobutyl acrylate, butyl acrylate, isobutyl methacrylate and butyl
methacrylate. The antioxidant butylated hydroxytoluene was as well
identified. The fragmentation was depending on the pyrolysis temperature.
At 590C, a wide amount of compound with aromatic rings, as ethylbenzene
and naphthale ne, as well as polysubstituted cyclohexadienones and other
high-weighted molecules not identified. However, at 650ºC a lower quantity
of compound was detected in the pyrogram, whereas at 764ºC there is an
intermerdiate situation.
The Paraloid polymer was studied in order to identify and classify it.
The pyrolysis fragments were: methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl
methacrylate and methacrylic acid. Nevertheless, the main compounds were
ethyl methacrylate and methyl acrylate, so that the sample was characterized
as Paraloid B72 (EMA/MA). Several alkylbenzenes, probably from the
solvent or by reorganizations during the pyrolysis, were also found. On the
other hand, the shape of the pyrogram depended on the temperature of the
pyrolysis. At 590ºC and 764ºC, 1-(4-ethylphenyl)ethanone, several high-
weighted compounds and traces of plasticizer, which were not detected at
650ºC. It can be assumed that acrylic polymers provided more fragments at
590ºC.

________________________________________________________
258
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

2.1.2 Condensation polymers

The following condensation polymers were analyzed for this study:

alkyd resin, ketonic resin (four commercial products: powdered AW2 with
inventory number 90.34.13; compact AW2 with inventory number 90.34.14;
Keton N and AW2), phenol-formaldehyde resin (two commercial products,
inventory numbers 90.39.4 and 90.39.6) and polyacroleine (Akroid). These
materials, together with their shape and inventory numbers are described in
the Table 38 (section 1 of this Chapter).
In alkyd resin was detected a large amount of phthalic acid, together to
phenolic compounds, which were probably formed from this last one, traces
of oleic acid, short fatty acids, and carbonyl compounds. Phthalic acid was
considered as characteristic fragment.
The pyrograms obtained by the analysis of the samples from powdered
AW2 (nº 90.34.13), showed the following characteristic fragments:
cyclohexanol, cyclohexanone and several alkylderivatives, which come
clearly from a ketonic polymer. Moerover, cycloxenes, santene, and other
saturated polycyclic hydrocarbons were besides detected.
By analysis of the sample from compact AW2 (nº 90.34.14), several
acrylic monomers (isobutyl methacrylate, 2-methylpropyl methacrylate and
2-ethylhexyl methacrylate) and alkylbenzenes were identified, whereas no
characteristic fragments of a ketonic resin were found. Probably, the studied
material was an acrylic polymer mistakenly labelled.
The characteristic fragments found in the Keton N polymer were the
same as in AW2: cycloxexanol, cyclohexanone and alkylcyclohexanones.
Other detected compounds were santene, octahydropentalene,
tricyclododecene and other high-weighted unidentified molecules. In this
case, more fragments were found after pyrolysis at 764ºC.
The following compounds were detected after Laropal A81 pyrolysis:
Z-1-1(butenyl)azirine, 2,2-dimethyl-1S-propanediol, 3-hydroxy-2,2-
dimethylpropanal, methyl 2,2-dimethyl-3-hydroxypropanate, benzonitrile
and a large amount of unidentified substances. The fragments considered as
characteristic were the most intense: methyl 2,2-dimethyl-3-
hydroxypropionate and two peaks at t=10.214 and t=13.92, which their
molecular ions appears at 187 and 287, respectively. Benzonitrile might not
used as characteristic, because it can be also found by pyrolysis of synthetic
pigments.
The characteristic substances of Phenol Resin nº 90.39.4 were a wide
variety of alkylphenols. Naphthalenes and high-weighted methanoazulenes
were also detected. Otherwise the other studied Phenol Resin (nº90.39.6)
provided by pyrolysis a large amount of alkylphenols (characteristic
fragments), as well as hydroxybenzaldehydes and alkylbenzenes.

________________________________________________________
259
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

The following compounds were detected in the pyrogram from

polyacroleine (Akroid) analysis: alkylbenzenes, alkylphenols,
metoxybenzenes, metoxyphenols, benzaldehydes and other ketones. In this
case, the monomeric unity of this polymeric resin (propenal) is very volatile
and low weighted, so that it could not be detected. For this material no
characteristic fragments were considered.

2.2 Study of samples from a pictorial modern artwork

The information provided by the analysis of the standard synthetic

polymers was employed to characterize the resin in a modern painting from
the contemporary German artist Georg Baselitz (“Senta”, 1992/1993)
(Figure 43). The author was born in 1937 in Deutschbaselitz (Saxony,
Germany) and is considered as one of the greatest exponents in the modern
artistic painting in Germany. The painting was supposed carried out in
acrylic paint, because it is a material often used by the artist. The samples
were obtained from two zones, stained in blue and black pigment,
respectively.

Figure 42. Pyrograms (TIC), from the analysis of the blue (a) and (b) samples from a Baselitz
painting (“Senta”, 1992/1993). Characteristic compounds are indicated with coloured
rectangles as follows: yellow for drying oil, red for ketonic polymer, green for polyacrylics
and blue for phenol-formaldehyde resins. Time regions with a continuous series of
hydrocarbons are marked with a horizontal straight line. The following additives are as well
marked: butylated hydroxytoluene ( ) (antioxidant) and phthalic ester (+) (plasticizer).
________________________________________________________
260
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

The thorough study of the pyrograms obtained from the analysis of the
artistic samples allow to establish the presence of compounds corresponding
to the standard synthetic resins, as well as some additives and other materials
in the painting. The pyrograms from the study of the blue dyed sample (at
590ºC), and black pigmented sample (at 764ºC), are shown in the Figure 42.
In both cases, a wide amount of hydrocarbons was detected. A series
of linear alkanes, even and odd, were identified, so that they do not probably
indicate the presence of beeswax. This n-alkane distribution indicated that
they can be considered as traces of paraffin. The antioxidant butylated
hydroxytoluene and the monoterpenes camphene and á-canphenal were also
detected.
The alkylbenzenes detected in the analysis of almost studied standards
are probably the result of reorganizations of other small fragments. For this
reason, they do not provide significant information for the characterization
of the synthetic resins.

Figure 43. Modern pictorial

artwork: “Georg Baselitz,
Senta”, 1992/1993, painting
on canvas, 100.5 x 71 cm,
Bayerische
Staatsgemäldesammlungen
Inventory number 1785

________________________________________________________
261
 VIII. SYNTHETIC POLYMERS. RESULTS AND DISCUSSION

2.2.1 Blue pigmented sample

The detection of short chain fatty acids and aldehydes is not enough to
establish the presence of oil material, because long fatty acids, as palmitic,
oleic or stearic acid have not been detected. Phthalic ester, a plasticizer
additive, was as well identified.
The detection of several characteristic fragments of ketonic resin
(cyclohexanone, 2-methylcyclohexanone and 2-ethylcyclohexanone) pointed
to the use of a ketonic polymer as AW2 or Keton N. On the other hand, the
detection of methylpropyl methacrylate is not sufficient to propose the use of
a polyacrylic resin.

2.2.2 Black pigmented sample

The detection of stearic, oleic and stearic acid, together to their

degradation products, as short fatty acids, aldehydes and ketones, so that a
drying oil was probably used in the painting.
The following fragments were identified in the sample:
cyclohexanone, 2-methylcyclohexanone and 2-ethylcyclohexanone,
characteristic of ketonic polymers, as AW2 or Keton N. This kind of resin
has been probably used to carry out the painting. Several phenol compounds
were also found, but as the aromatic rings can be formed by reorganization,
the presence of a phenol-formaldehyde resin can not be suggested.

Table 36. Analytical parameters of the obtained fragments by means of the study of the
samples from standards and from a modern pictorial artwork by Py -GC-MS. The following
information is indicated: order and elution time under the applied separation chromatographic
conditions; name (if identified) or m/z of the molecular ion (IM); most intense ions in the
mass spectrum.
Table 37. Detected fragments through the analysis by Py -GC-MS in each sample from
standard synthetic resin* and the modern painting**. (The numeration of the fragments
corresponds to that in Table 36). The compounds indicated with ( ) are those considered as
characteristic of each resin, whereas those marked with (X) are other substances detected in
the analysis.
*Reference materials (commercial name): 1=Kraton G1650; 2=Kraton G1657; 3=Arkon P90;
4=coumarone resin; 5=M owilith; 6 =PVAc; 7=Palmer Cement; 8=Mowital B20H; 9=Acrylic
Pigment; 10=Paraloid; 11=AW2 (90.39.14); 12=AW2 (90.39.13); 13=Keton N; 14=Laropal
A81; 15=Phenol Resin (90.39.4); 16=Phenol Resin (90.39.6); 17=Alkyd and 18=Akoid.
**Samples from a modern painting by Baselitz, pigmented in 19=blue and 20=black.

________________________________________________________
262
IX. CONCLUSIONS

263
 VI. CONCLUSIONS

The performed research has allowed the development of several

analytical methodologies to characterize a wide set of organic materials used
in the making of pictorial layers and varnishes in artworks: proteins, natural
waxes, drying oils, terpenic resins and synthetic polymers, according to the
proposed aims. These methodologies are based on the following analytical
techniques: HPLC-UV-Visible, HPLC-Fluorescence, GC/FID, GC/MS and
Py-GC/MS, as well as direct mass spectrometry. The proposed methods
were successfully applied to identify materials in real samples from pictorial
artworks. As conclusions derived from this extense study, the following
statements can be emphasized:

1. Liquid chromatography with fluorescence detector allows the

differentiation between proteins used as binding media, as bovine gelatine,
beef gelatine, albumin, casein and egg.
1.1 The reaction between the amino acids and o-phthalaldehyde
provides fluorescent derivatives with adequate sensitivity, detection limit
and linear interval, and useful to detect the analytes from the standard
proteins and extracted from samples from pictorial artworks.
1.2 The instrumental conditions of the liquid chromatograph (eluent
composition, gradient programm, stationary phase, flow and temperature)
were established. These fixed parameters provided an adequate separation of
the amino acid derivatives, without interferences with other compounds from
the matrix.
1.3 The characterization of the proteins was satisfactorily performed
by means of the relative amount of amino acids, calculated from the quotient
between the chromatographic peak area of each OPA-amino acid derivative
and the OPA-leucine.
1.4 The proposed methodology has been evaluated by means of its
application to a set of sample s from pictorial artworks made of tempera. In
these cases, egg protein was clearly characterized.

2. A chromatographic method to characterize natural waxes, as beeswax,

carnauba wax and ceresin has been developed. The unequivocal
identification was carried out using the relative amount of hydrocarbons and
fatty acid in each sample as characterizing parameters.
2.1 Carboxylic acids were derivatized with ethylchloroformate, in
order to obtain the corresponding volatile derivative. The chromatographic
conditions were also adjusted to adequately separate the linear alkanes and
the ethyl carboxylates.
2.2 A methodology based on the acid hydrolysis of the sample
________________________________________________________
265
 VI. CONCLUSIONS

followed by an extraction with an organic solvent, in order to separate the

analytes form the other compounds in the matrix, was performed.
2.3 The characterization of the natural waxes is based on the
calculation of the quotients of the area of the chromatographic peaks
corresponding to the linear alkanes from C20H-C35H by n-heptacosane, and
the ratio of the area of the chromatographic peaks corresponding to each
ethyl derivative of myristic, oleic, stearic and arachidic acids, by ethyl
palmitate. The chemometric treatment of the obtained values, by means of
Principal Component Analysis, provides an adequate discrimination between
beeswax, carnauba wax and ceresin. Therefore, the analyzed samples appear
in the score plot grouped by the kind of natural wax.
2.4 A second statistical treatment by PCA was performed to make a
distinction between the natural waxes, when they are mixed with other
materials containing fatty acids. Then, only the linear alkanes were chosen as
statistical variables. The standard natural waxes were also differentiated with
this chemometric model.
2.5 The proposed analytical method was successfully applied to the
characterization of natural wax in samples from an oleorresin pictorial
artwork.

3. A methodology to characterize drying oils using HPLC coupled to UV-

Visible and Fluorescence detectors has been achieved. Aged and fresh
standard drying oils from several origins (linseed, walnut and poppy seed)
were selected in order to evaluate the influence of the dammage in the
identification of the oil binding media.
3.1 The proposed experimental procedure to release and separate the
fatty acids from the matrix was an acid hydrolysis, followed by a
liquid/liquid extraction with hexane. The use of this apolar solvent improves
the procedure, because it reduces the incorporation of polar interferents in
the chromatographic system, and provides less complex chromatograms.
3.2 The optimization of the parameters of the derivatization reaction of
the fatty acids with 2-nitrophenylhydrazine (microwave oven, power and
reaction time) for the UV-Visible detection and with 4-bromo-7-
metilcoumarine for fluorescence detection, was carried out. In both cases,
satisfactory values of limit of detection, sensitivity and linear interval, for
the detection of the analytes in the stantard drying oils and in the samples
from artistic artworks were obtained. The fluorescence detection
methodology provided higher sensitivity than that based on UV-Visible
quantification.
3.3 Chromatographic parameters, as stationary phase, mobile phase
(composition, gradient program, flow), temperature and detector lengthwave.
In both cases, an adequate separation of the fatty acid derivatives was
obtained, without interferences between them or with other compounds in
________________________________________________________
266
 VI. CONCLUSIONS

the matrix, in less than 15 minutes.

3.4 The differentiation of linseed, walnut and poppy seed oils was
carried out by means of the quotient between the area of the
chromatographic peak corresponding to the derivatives of stearic and
palmitic acids. This parameter remains roughly constant from the ageing of
the oil binding media, and varies according to the kind of drying oil.
3.5 The optimized methodologies allow the characterization of linseed
and walnut oil in samples from several oil paintings from the Renacentist
period.

4. The use of direct mass spectrometry allows the development of analytical

methodologies without derivatization or resolution steps, to characterize
protein and oil paintings.
4.1 A procedure was established to release the fatty acids from the
drying oils, based on the saponification of the triglycerides, followed by an
acidification. The carboxylic acids were then separated from the matrix by a
liquid/liquid extraction with hexane. This experimental procedure allows to
obtain the fatty acids in a significatively smaller time (5 minutes) than under
acid hydrolysis conditions (24 hours).
4.2 The following instrumental conditions of the mass spectrometer
were optimized: capillary and skim of the ion trap voltage, polarity, target
mass, scan interval, nebulizer pressure, dry gas and nebulizer temperature.
The fixed conditions provided high sensitivity and reproducibility for the
detection and aminoacids and fatty acids.
4.3 The characterization of protein and oil binding media was achieved
by means of a chemometric treatment by Linear Discriminant Analysis
applying the obtained amount of amino acids and fatty acids, as statistical
variables. For both kinds of materials, the studied categories of protein and
drying oils were clearly differentiated. In the case of the drying oils, a
discrimination attending on the ageing treatment was even achieved.
4.4 The suggested methodology was applied to samples from tempera
or oil paintings, in order to characterize the binding media used in each one.
These results agreed with those obtained in the analytical studies carried out
by liquid chromatography (Conclusions 1.4 and 3.5).

5. The study of the organic fraction in varnishes from music instruments has
been achieved by means of gas chromatography coupled to mass
spectrometry. The comparison of the compounds detected in the standards
and those found in the samples from string instruments allows the
identification of the materials used in the elaboration of the varnishes.
5.1 A wide set of materials described in recipes of varnishes for
Renacentist wood objects was selected as standard. These materials were
mainly terpenic resins and essential oils.
________________________________________________________
267
 VI. CONCLUSIONS

5.2 A derivatization of the compounds with carboxylic groups, in

order to improve their volatility and allowing them to be analyzable by GC.
Then the reaction conditions, as temperature and reaction time were
optimized. Moreover, an experimental procedure was established to silylate
hydroxi groups, improving the chromatographic resolution and the mass
spectrometric detection.
5.3 The instrumental conditions adjusted for the gas chromatograph,
as the chosen capillary column and temperature program, allowed the
separation of the compounds of interest detected: 97 compounds in 11
standards and several samples from 3 ancient musical instruments, in less
than 60 minutes. The splitless injection allowed to reach a huge sensitivity, a
decisive parameter, due to the low amount of sample available, because of
the important artistic value of the studied string music instruments.
5.4 Proposed methodology could be used to detect an extense variety
of compounds in the stantard material. Then the obtained information about
each one (mass spectrum, retention time, identification, material from it
comes and decreasing intensity order) was stocked in a database.
5.5 Samples from varnishes of historical Italian string instruments
were successfully analyzed following the developed procedure. The
identification of the chomatographic peaks was carried out using the
database, which was found useful to rela te each peak with those from the
standards. The stocked mass spectra were especially useful to detect the
chromatographic peaks with low signal-to-noise ratio.
5.6 The obtained analytical methodology allowed to characterize a
Pinaceae resin and linseed oil in the varnish of the Venere theorbe and the
Stradivarius violin, and the same materials plus a triterpenic fraction were
detected in the varnish from the Maler luth.

6. The analytical study of synthetic resins was carried out following a

methodology based on the pyrolysis-GC-MS, without derivatizant to sample
treatment.
6.1 The optimization of pyrolysis temperature was performed; by
comparing the results applying 590; 650 and 764ºC. For polyacrylic resins ,
the obtained pyrograms provided more fragments when the thermic breakage
was at 590ºC, whereas in the case of the ketonic polymer Keton N more
chraracteristic fragments were detected under pyrolysis at 764ºC. The
analysis of the other synthetic polymers (polystyrene, saturared hydrocarbon
resin, indene-benzofurane resin, polyvinyl acetate, polyvinyl butyral,
ketyonic polymer, phenol-formaldehyde resin and polyacroleine) provided
similar results at the threes studied temperatures.
6.2 Instrumental conditions adjusted for the chromatograph and the
mass spectrometer were found suitable for the resolution and detection of
278 fragments provided after pyrolysis of 18 stantard synthetic polymers and
________________________________________________________
268
 VI. CONCLUSIONS

from the samples from a modern pictorial artwork, in nearly 29 minutes. The
characteristic fragments detected in the pyrograms are compounds with a
structure close that the monomer of the resin, reason why they allow the
identification of the corresponding synthetic polymer with more reliability.
6.3 The proposed analytical methodology was applied to the analysis
of samples from a modern pictorial artwork by the German painter Georg
Baselitz (“Senta, 1992/1993), supposed to be carried out in acrylic paint. The
thourough study of the obtained pyrograms revealed the presence of
characteristic fragments of ketonic resin, paraffin, drying oil and plasticizer,
instead of the expected acrylic markers.

________________________________________________________
269
 X.
BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

271
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[1] D.V. Thompsin, The Practice of Tempera Painting: Materials and

Methods, Dover Publications, Inc., New York, 1962
[2] E. Doxiadis, The Mysterious Fayum Portraits: Faces from Ancient
Egypt, first Ed, Thames & Hudson Ltd, London, 1995
[3] R.J. Gettens, L.G. Stout, Painting Materials, A short encyclopaedia, Ed.
D. Van Nostrand, New York, 1947
[4] R. Mayer, The Artist’s Handbook of Materials and Techniques, 5th Ed,
Viking Adult, New York, 1991
[5] J.P. Echard, Art et Chimie : The varnish of musical instruments:
concepts ans singularities, Proceedings of the ART et CHIMIE: Les
polymères Meetings, Paris (2002)
[6] M.T. Doménech-Carbó, A. Doménech-Carbó, J.V. Gimeno Adelantado
F. Bosch-Reig, Applied Spectroscopy 55(2001)1590
[7] J.S. Mills, R. White, The Organic Chemistry of Museum Objects,
2nd Ed., Butterworths, Oxford, 1994
[8] M. Matteini, A. Moles, La química en la restauración. Materiales en el
arte pictórico, Ed. Nerea, Guipúzcoa, 2001
[9] M.D. Petit, J.M. Maganto, Talanta 51(2000)727
[10] A Otto, B.R.T. Simoneit, Geochimica et Cosmochimica Acta
35(2001)3505
[11] M.L. Gómez, Examen científico aplicado a la conservación de obras
de arte , Ministerio de Cultura, Dirección general de bellas artes y
archivos, Instituto de Conservación y Restauración de Bienes Culturales,
Madrid, 1994
[12] M.P. Colombini, F. Modungno, R. Fuoco, A. Togazzi, Microchemical
Journal 73(2002)175
[13] Z. Yu, G.R. Stewart, W.W. Mohn, Applied and Environmental
Microbiology 66(2000)5148
[14] E. Primo Yúfera, Química orgánica básica y aplicada. De la molécula
a la industria. Tomo II, Ed. Reverté, Universidad Politécnica de
Valencia, Valencia, 1980
[15] K.P.C. Vollhardt, N.E. Schore, Química Orgánica, 2ª ed., Ed. Omega
Barcelona, 1994
[16] R. Lehninger, Principios de Bioquímica, Ed. Omega, Barcelona,
1984
[17] A. Karpowicz, Studies in Conservation 26(1981)153
[18] M.P. Colombini, F. Modugno, E. Menicagli, R. Fuoco, A. Giacomelli
Microchemical Journal 67(2000)291
[19] A. Nevin, S. Cather, D. Angalos, C. Fotakis, Analytica Chimica
Acta 573-574(2006)341
_____________________________________________________________
273
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[20] E. Hare, MASCA Newsletter 10(1974)1

[21] N. Garnier, C. Cren-Olive, C. Rolando, M. Regert, Analytical
Chemistry 74(2002)4868
[22] A. Asperger, W. Engewald, G. Fabian, Journal of Analytical and
Applied Pyrolysis 50(1999)103
[23] I. Bonaduce, M.P. Colombini, Journal of Chromatography A
1028(2004)297
[24] P.E. Kolattukudy, Chemistry and Biochemistry of Natural Waxes,
1ª Ed. Elsevier, Am sterdam, 1976
[25] L. Kunst, L.A. Samuels, Progress in Lipid Research 42(2003)51
[26] M. Regert, S. Colinart, L. Degrand, O. Decavallas, Archaeometry
43(2001)549
[27] E. Ciliberto, G. Spoto, Chemical Analysis 155(2000)200
[28] R. White, Studies in Conservation 23(1978)57
[29] J.R.Gaborit, J. Ligot, Sculptures en Cire de l’Ancien Egypte à l’Art
Abstrait, Ed. Reunion des Musées Nationaux, Paris, 1987
[30] C. Heron, N. Nemceck, K.M. Bonfield, Naturwissenschaften
81(1994)266
[31] M.P. Colombini, G. Giachi, F. Modugno, E. Ribechini, Microchemical
Journal 79(2005)83
[32] C. Marinach, M. C. Papillon, C. Pepe, Jounal of Cultural Heritage
5(2004)231
[33] H.G. Wiedermann, Bayer G., Analytical Chemistry 54(1982)619A
[34] J. Loveridge, The chemistry of bees, University of Bristol Ed., Bristol,
2005
[35] R.P. Evershed, S.N. Dudd, E.R. Gebhart, Journal of Archaeological
Science 30(2003)1
[36] E. Primo, Química Agrícola III: Alimentos. Ed. Alhambra, Madrid,
1972
[37] J.D.J. van den Berg, K.J.van den Berg, J.J. Boon, Journal of
Chromatography A 950(2002)195
[38] J. Mallégol, J. Lemaire, J.L. Gardette, Progress in Organic Coatings
39(2000)107
[39] J.D.J. Van den Berg, K.J. Van den Berg, J.J. Boon, Progress in
Organic Coatings 41(2001)143
[40] D. Erhardt, C.S. Tumosa, M.F. Mecklenburg, Studies in Conservation
50(2005)143
[41] D. Scalarone, M. Lazzari, O. Chiantore, Journal of Analytical and
Applied Pyrolysis 58-59(2001)503
[42] P. Fjällstrom, B. Andersson, C. Nilsson, K. Andersson, Industrial Crops
and Production 16(2002)173
[43] C. Sterberg, M. Svensson, M. Johannson, Industrials Crops and
Productions 21(2005)263
_____________________________________________________________
274
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[44] I. Mayumi, M. Koyano, International Biodeterioration and

Biodegradation 28(1991)23
[45] L. Osete-Cortina, Thesis: Study of glass and archaeological glaze
corrosion processes and characterization of film substances
traditionally used in their restoration, under the direction of M.T.
Doménech-Carbó, Polytechnic University of Valencia, A. Doménech-
Carbó and J.V. Gimeno-Adelantado, University of Valencia, 2006
[46] J. B. Howard, Crystalline Olefin Polymers, R.A.V. Raff and K.W.
Doak, Wiley-Interscience, New York, 1964
[47] H. Zollinger, Colour chemistry: syntheses, properties and applications
of organic dyes and pigments, VCH, Weinheim,1991
[48] A.I. Scott, Interpretation of the ultraviolet spectra of natural
products, Vol. 7, Pergamon Press, Oxford, 1964
[49] L.A. O’Neill, Paint Technology 27(1963)44
[50] M. W. Formo, Paints, varnishes and related products: discoloration
in “Bailey’s Industrial Oil and Fat Products”, Ed. John Wiley,
Chichester, UK, 1979
[51] M. Lazzari, O. Chiantore, Polymer Degradation Stability
65(1999)303
[52] J. Mallégol, J. Lemaire, J.L. Gardette, Studies in Conservation
46(2001)121
[53] G.A. Van der Doelen, Thesis: Molecular Studies of fresh and aged
triterpenoid varnishes, under the direction of J.J. Boon, AMOLF,
University of Amsterdam, 1999
[54] E. R.De la Rie, Studies in Conservation 33(1988)53
[55] J. Pérez-Castells, Anales de la Real Sociedad Española de Química
55(2005)
[56] J. Nagyvary, B. Halford. Chemical and Engineering News
52(2007)Nov22
[57] J. Nagyvary, J.M. Ehrman, Naturwissenschaften 75(1988)513
[58] C.Y. Barlow, P.P. Edwards, R.G. Millward, R.A. Raphael, J.D. David,
Nature 332(1988)313
[59] J.P. Echard, Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy
59(2004)1663
[60] A. von Bohlen, F. Meyer, Spectrochimica Acta Part B: Atomic
Spectroscopy 52(1997)1053
[61] A. von Bohlen, Journal of Trace and Microprobe Techniques
17(1999)177
[62] A. von Bohlen, Analytical Letters 37(2004)487
[63] C. Simmonet, V. Gibiat, J.L. Halary, Physical and chemical
properties and their vibrational consequences, oral communication,
Forum Acousticum, Sevilla, 2002
[64] F. Meyer, The Strad 103(1992)250
_____________________________________________________________
275
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[65] R. White, An Examination of varnishes from three 18 th Century

Musical Instruments, ICOM Committee for Conservation Repport
78/16/1, 5th Triennial Meeting Proceedings, Zagreb(1978) 1
[66] G.S. Fisher, Chemical Industry (1963)1761
[67] J.J.W. Coppen, J.M. Robinson, L.J. Mullin, Phytochemistry
27(1988)1731
[68] J.J.W. Coppen, J.M. Robinson, A.N. Kaushal, Phytochemistry
27(1988)2873
[69] V. Kubelka, J. Mitera, P. Zachar, Journal of Chromatography
74(1972)195
[70] E. Gildermeister, Die Ätherische Öle, 4th Ed., Ed. W. Treibs, Berlin ,
1956
[71] S. Hamm, J. Bleton, J. Connan, A. Tchapla, Phytochemistry
66(2005)1499
[72] A.F. Thomas, B. Willhalm, Tetrahedron Letters (1964)3177
[73] G. Chiavari, Chromatographia 41(1995)273
[74] L. Osete-Cortina, M.T. Doménech-Carbo, R. Mateo-Castro, J.V.
Gimeno-Adelantado, F. Bosch-Reig, Journal of Chromatography A
1024(2004)187
[75] K.J. van den Berg, J.J. Boon, I. Pastorova, L.F.M. Spetter, Journal of
Mass Spectrometry 35(2000)512
[76] E. Kenndler, F. Mairinger, Fresenius Journal of Analytical Chemsitry
338(1990)635
[77] S. Watts, E.R. de la Rie, Studies in Conservation 47 (2002) 257
[78] D. Scalarone, M. Lazzari, O. Chiantore, Journal of Analytical
and Applied Pyrolysis 61(2002)345
[79] J. S. Mills, R. White, Studies in Conservation 22(1977)12
[80] L. Osete-Cortina, M.T. Doménech-Carbó, Journal of Chromatography
A 1065(2005)265
[81] G. Van der Doelen, K.J. Van den Berg, J.J. Boon., N. Shibayama,
E.R. De la Rie, J.L. Genuit, Journal of Chromatography A 809(1998) 21
[82] D. Scalarone, M. Lazzari, O. Chiantore, Journal of Analytical
and Applied Pyrolysis 68-69(2003)115
[83] K. J.van den Berg, I. Pastorova, L. Spetter, J.J. Boon, State of
oxidation of diterpenoid pinaceae resins in varnishes, wax lining
material, 18th century resin oil paint, and a recent Koper resinate
glaze, in Proceedings of the 11th Trienal Meeting of ICOM,
James & James Publishers, Edinburgh, 1996, p.930
[84] D. Scalarone, M. Lazzari, O. Chiantore, Journal of Analytical and
Applied Pyrolysis 64(2002)345
[85] J. De la Cruz-Cañizares, María-Teresa Doménech-Carbó,
J.V. Gimeno-Adelantado, R. Mateo-Castro, F. Bosch-Reig,
Journal of Chromatography A 1093(2005)177
_____________________________________________________________
276
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[86] V.P. Papageorgiou, M.N. Bakola -Christanopoulou, K.K. Apazidou,

E.E. Psaros, Journal of Chromatography A 769(1997)263
[87] P. Vandenabeele, S. Bodé, A. Alonso, L. Moens, Spectrochim. Acta
Part A: Molecular Spectroscopy 61(2005)2349
[88] H.G.M. Edward, L.F.C. de Oliveira, A. Quye, Spectrochimica Acta
Part A: Mole cular Structure 57(2001)2831
[89] R. Singh, A. Jain, S. Panwar, D. Gupta, S.K. Khare, Dyes and Pigments
66(2005)99
[90] D. Fabbri, G. Chiavari, H. Ling, Journal of Analytical and Applied
Pyrolysis 56(2000)167
[91] B.E. van Wyck, Food Plants of the World , 1st Ed, Timber Press, Inc.,
Portland, Oregon, USA, 2005
[92] A. Doménech-Carbó, M.T. Doménech-Carbó, M.C. Saurí-Peris,
Talanta 66(2005)769
[93] G. D.Van der Doelen, K.J. van den Berg, J.J. Boon, Studies in
Conservation 43 (1998) 249
[94] I. Pastorova, K. J. Van den Berg, J.J. Boon, J.W. Verhoeven,
Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 43(1997)41
[95] K.J. van den Berg, Diterpenoid resins in varnishes in MolArt
Evaluation 98 Discussion papers, 1997, 9.97
[96] M.P. Colombini, F. Modugno, S. Giannarelli, R. Fuoco, M. Matteini,
Microchemical Journal 67(2000)385
[97] S. Zumbühl, R. Knochenmuss, S. Wülfert, F. Dubois, M.J. Dale, R.
Zenobi, Analytical Chemistry 70(1998)707
[98] F.J. Marner, A. Freyer, J. Lex, Phytochemistry 30(1991)3709
[99] http://www.kremer-pigmente.de/bindem04.htm
[100] http://www.kraton.com/Products/Kraton_G_SEBS_SEPS/
[101] http://www.freepatentsonline.com/6437038.html
[102] http://www.museumservicescorporation.com
[103] H. Wagner, H.F. Sarx, Lackkunstharze, Carl Hansen Verlag,
Munich, Alemania, 1950
[104] H. Kittel, Farben -Lack- und Kunststoff Lexikon,
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft M.B.H., Stuttgart,
Alemania, 1952
[105] Lucius, Brüning, Mowilith, Farbwerke Hoest A.G.,
Brüning, Frankfurt am Main, Alemania, 1959
[106] D. Stoye, W. Freitag, Lackharze: Chemie, Eigenschaften,
Anwendung, Ed. Hanser, Munich, Alemania, 1996
[107] O. Chiantore, M. Lazzari, Polymer 42(2001)17
[108] T. Learner, Studies in Conservation 46(2001)225
[109] J. Koller, U. Baumer, Restauro 1(2001)26
[110] http://www.basf.com/rawmaterials/pdfs/ed1032e.pdf
[111] http://www.kern-gmbh.de/kunststoff
_____________________________________________________________
277
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[112] C. M. Selwitz, Cellulose Nitrate in Conservation, Ed. Paul Getty

Institut, Los Ángeles, USA, (1988)
[113] H.M. Spurlin, High Polymers, Ed. Interscience, New York,
1955
[114] E.C. Worden, Technology of Cellulose Esters, Ed. Millburn.
New Jersey, 2981
[115] J. Barsha, Cellulose and Cellulose Derivatives, Eds. Ott, H.M.
Spurlin, and M.W. Graffin, Interscience, New York, 1954
[116] B. Hardman, Silicones in Encyclopedia of Polymer Science &
Engineering, 2 ed., J. Wiley & Sons, New York, 1989
[117] R. Feller, Conservation and Restoration of Pictorial Art, Ed.
Butterworths, 1976
[118] G.L. Stout, R.J. Gettens, Mouessin 17-18(1932)107
[119] G. Thompson, Recent Advances in Conservation, Ed. Thomson,
Butterworths, London, 1963
[120] R.G. Newton, S. Davison, Conservation of Glass, Ed.
Butterworth-Heinemann, Oxford, 1996
[121] R.L. Feller, Recent Advances in Conservation, Ed. Thomson,
Butterworths, London, 1963
[122] E. De Witte, M. Goessens-Landrie, E.J. Goethalls, K. Van Leberghe,
C. van Springel, ICOM Committee for Conservation Repport 81/16/4,
6th Triennal Meeting, Ottawa, 1981
[123] R. Breek, W. Froentjes, Studies in Conservation 20(1975)183
[124] M. Johnson, Nitrocellulose as a Conservation Hazard, The
American Institute for Conservation of Historic and Artistic
Works, Preprints, Fourth Annual Meeting, Dearborn, Michigan, USA
(1976) p.66
[125] S.P. Koob, The Conservator 6(1982)31
[126] E.T.G. Mibach, Conservation in Archaeology and the Applied Arts,
IIC, London (1975)55
[127] H.J. Plenderleith, A.E.A. Werner, The Conservation of Antiquities
and Works of Art, Oxford University, London, 1971
[128] J.F. Mills, The Care of Antiques, Ed. Arligton, London, 1694
[129] E. Dowman, Conservation in Field Archaeology, Ed. Methnen and
Co., Ltd., London, 1970
[130] S. Davison, A Reviews of Adhesives and Consolidants used on glass
Antiquities, Preprints of the contributions to the Paris Congress IIC,
Paris, France, 1984, p.191-194
[131] A. Moncrieff, Protecting Silver from Tarnishing, IIC News
4(1966)6
[132] J.L. Down, Studies in Conservation 29(1984)63
[133] M.J. Melo, S. Brazzi, M. Camaiti, O. Chiantore, F. Piacenti, Polymer
Degradation and Stability 66(1999)23
_____________________________________________________________
278
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[134] V. Arjunan, N. Puviarasan, S. Mohan, P. Murugesan, Spectrochimica

Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 67(2007)1290
[135] M. Odlyha, Thermochimica Acta 269-270(1995)705
[136] M.C.M. Moya-Moreno, D. Mendoza-Olivares, F.J. Amezquita-López,
J.V. Gimeno-Adelantado, F. Bosch-Reig, Talanta 50(1999)269
[137] F. Capitelli, S. Vinici, P. Paggio, P. Abbruscato, E. Princi, A.
Casadevall, J.D. Nosanchuk, E. Zanardini, Macromolecular
Bioscience 5(2005)49
[138] M. P. Colombini, A. Carmignani, F. Modugno, F. Frezzato, A.
Olchini, H. Brecoulaki., V. Vassilopoulo u, P. Karkanas, Talanta
63(2004)839
[139] H.G.M. Edwards, M.J.P. Falk, Spectrochimica Acta Part A:
Molecular Spectroscopy 53(1997)2685
[140] C.W. Beck, Science and Technology in the Service of Conservation,
Preprints of the IIC Washington Congress, (1984)104
[141] T. Learner, The Analysis of Synthetic Resins Found in
Twentieth Century Paint Media, in Resins Ancient and Modern,
M.M. Swright and J.H. Townsend, (Eds.), Scottish Society for
Conservation and Restoration Publications, Edinburgh, 1995
[142] J.L. Down, R.S. Williams, A Report on the Evaluation of Selected
Poly(vinyl acetate) and Acrylic Adhesives for use in Paper
Conservation, Proceedings of Symposium 88 in Conservation of
Historic and Artistic Works on Paper, 1994, Ottawa, Canada
[143] F. Capitelli, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis
71(2004)405
[144] M.T. Doménech-Carbó, F. Bosch-Reig, J.V. Gimeno-Adelantado,
V. Peris-Martínez, M.C.M. Moya-Moreno, Journal of Molecular
Structure 410-411(1997)559
[145] M.T. Doménech-Carbó, F. Bosch-Reig, V. Peris-Martínez,
J.V. Gimeno-Adelantado, Química Analítica 16(1997)223
[146] R.J. Meilunas, J.G. Bentsen, A. Steinberg, Studies in
Conservation 35(1990)51
[147] J. Glastrup, Studies in Conservation 40(1995)65
[148] P. Vandenabeele, B. Wheling, L. Moens, H. Edwards, M. De Reu,
G. Van Hooydonk, Analytica Chimica Acta 407(2000)261
[149] L. Burgio, J.H.C. Robin, Spectrochimica Acta Part A: Molecular
Spectroscopy 57(2001)1491
[150] H.G.M. Edwards, M.J. Falk, Journal of Raman Spectroscopy
28(1997)211
[151] G. Burrafato, M. Calabrese, A. Cosentino, A.M. Gueli, S.O. Troja,
A. Zuccarello, Journal of Raman Spectroscopy 35(2004)879
[152] D. Versan, P.P. Lottici, G. Antonioli, E. Campani, A. Vasoli, C.
Violante, Journal of Raman Spectroscopy 35(2004)694
_____________________________________________________________
279
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[153] H.G.M. Edwards, D.W. Farwell, S. Rozenberg, Journal of Raman

Spectroscopy 30(1999)361
[154] E.N. Dubis, A.T. Dubis, J.W. Morzycki, Journal of Molecular
Structure 511(1999)173
[155] H.G.M. Edwards, D. Farwell, Spectrochimica Acta Part A: Molecular
Spectroscopy 51(1995)2073
[156] E.H. Korte, H. Staat, Fresenius Journal of Analytical Chemistry
347(1993) 454
[157] M. Baker, D. von Endt, W. Hopwood, D. Erhardt, FT-IR
Microspectrometry: a Powerful Conservation Analysis Tool, in
Preprints of 16th Annual Meeting (New Orleans, 1988), p.1
[158] L. Toniolo. C. Colombo, S. Bruni, P. Fermo, A. Casolli, G. Palla,
C.L. Bianchi, Studies in Conservation 43(1998)201
[159] A. M. Morrow, N.S. Allen, M. Edge, D. Aldcroft, H. Jones,
Polymer Degradation and Stability 66(1999)95
[160] J. De la Cruz-Cañizares, M.T. Doménech-Carbó, J.V. Gimeno-
Adelantado, R. Mateo-Castro, F. Bosch-Reig, Journal of
Chromatography A 1025(2004)277
[161] A. Derieux, S. Rochut, M.C. Papillon, C. Pepe, Chemistry
4(2001)295-300
[162] J.V.Gimeno-Adelantado, R. Mateo-Castro, MT. Doménech-
Carbó, F. Bosch-Reig, A. Doménech-Carbó, J. De la Cruz-
Cañizares, M.J. Casas-Catalán, Talanta 56(2002)71
[163] R. Mateo-Castro, M.T. Doménech-Carbó, V. Peris-Martínez,
J.V. Gimeno-Adelantado, F. Bosch-Reig, Journal of Chromatography
A 778(1997)373
[164] R. Mateo-Castro, J.V. Gimeno-Adelantado, F. Bosch-Reig, A.
Doménech-Carbó, M.J. Casas-Catalán, L. Osete-Cortina,
J. de-la-Cruz-Cañizares, M.T. Doménech-Carbó, Fresenius
Journal of Analytical Chemistry 369(2001)642
[165] J.V. Gimeno-Adelantado, R. Mateo-Castro, M.T. Domenech-
Carbó, F. Bosch-Reig, A. Doménech-Carbó, M.J. Casas-Catalán,
L. Osete-Cortina, Journal of Chromatography A 922(2001)385
[166] M.T. Doménech, M.J. Casas-Catalán, A. Doménech-Carbó, R.
Mateo-Castro, J.V. Gimeno-Adelantado, F. Bosch-Reig,
Fresenius Journal of Analytical Chemistry 369(2001)571
[167] A. González-Casado, E.J. Alonso-Hernández., P. Espinosa, J.L.
Vílchez, Journal of Chromatography A 826 (1998) 49
[168] J. Gamazo, M.S. García, J. Simal, Food Control 14(2003)463
[169] R.C. De Souza, V. Zanon, F. Trombetta, M. Martinelli, E.
Bastos, Analytica Chimica Acta 505(2004)223
[170] T.C. Jenkins, T.C. Thies, E.E. Moseley, Journal of Agricultural
Food Chemistry 49 (2001) 2142
_____________________________________________________________
280
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[171] A. Asperger, W. Engewald, G. Fabia, Journal of Analytical Applied

Pyrolysis 61(2001)91
[172] J. Dron, R. Linke, E. Rosenberg, M. Schreiner, Journal of
Chromatography A 1047(2004)111
[173] M.P. Colombibi, F. Modugno, R. Fouco, A. Tognazzi, Microchemical
Journal 73(2002)175
[174] A. Tchapla, P. Méjanelle, J. Bleton, S. Goursaud, Journal of
Separation Science 27(2004)217
[175] M.T. Doménech-Carbó, S. Kuckova, J. de la Cruz-Cañizares, L.
Osete -Cortina, Journal of Chromatography A 1121(2006)148
[176] A. Casoli, P.C. Musini, G. Palla, Journal of Chromatography A
731(1996)237
[177] C.W. Beck, J. Greenlie, M.P. Diamond, A. M. Macchiarulo,
A.A. Hannenberg, M.S. Hauck, Journal of Archaeological
Science 5(1978)343
[178] C. Mathe, G. Culioli, P. Archier, C. Viellescazes, Journal of
Chromatrography A 1023(2004)277
[179] S. Hamm, E. Lesellier, J. Bleton, A. Tchapla, Journal of
Chromatography A 1018(2003)73
[180] S.M. Van Ruth, E.S. Shaker, P.A. Morissey, Food Chemistry
75(2001)177
[181] P. Bocchini, P. Traldi, Organic Mass Spectrometry 33(1998)1053
[182] F. Capitelli, T. Learner, O. Chiantore, Journal of Analytical and
Applied Pyrolysis 63(2002)339
[183] G. Chiavarri, D. Fabbri, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis
74(2005)39
[184] J. D. J. Van den Berg, J.J. Boon, Journal of Analyical and
Applied Pyrolysis 61(2005)45
[185] G. Chiavarri, D. Fabbri, S. Prati, Chromatographia 55(2002)611
[186] L. Osete -Cortina, M.T. Doménech-Carbó, Journal of Analytical
Applied Pyrolysis 76(2006)144
[187] Laura Osete-Cortina, M.T. Doménech-Carbó, Journal of
Chromatography A 1127(2006)228
[188] Y. Ishida, S. Wakamatsu, H. Yokoi, H. Ohtani, S. Tsuge, Journal of
Analytical and Applied Pyrolysis 49(1999)267
[189] S. Okuyama, T. Mitsui, Y. Ishida, H. Ohtani, S. Tsuge, Journal
of Analytical and Applied Pyrolysis 64(2002)187
[190] A. Piccirilli, D. Scalarone, O. Chiantore, Journal of Analytical
and Applied Pyrolysis 74(2005)33
[191] S. Pipatmanomai, C.A. Islas, I. Suelves, A.A. Herod, D.R. Dugwell,
R. Kandiyoti, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis 58-
59(2001)299

_____________________________________________________________
281
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[192] H. Mestdagh, C. Rolando, M. Sablier, J.P. Rioux, Analytical

Chemistry 64(1992)2221
[193] J. Odermatt, O. Ringena, R. Teucke, C. Reiter, M. Gerst, Appita
Journal 58(2005)462
[194] C.N. Cascaval, D. Rosu, Revue Roumaine de Chimie 36(1991)1331
[195] G. Garzo, J. Tamas, T. Szekely, K.Ujszaszi, Acta Chimica
Academiae Scientiarum Hungaricae 69(1971)273
[196] G. Chiavari, M. Ioele, S. Prati, P. Santopadre, Chromatographia
56(2002)763
[197] I. Surowiec, I. Kaml, E. Kenndler, Journal of Chromatograph A
1024(2004)1453
[198] I. Kaml, K. Vcelakova, E. Kenndler, Journal of Separation Science
27(2004)161
[199] S.M. Harrison, I. Kaml, V. Prokoratova, M. Mazanek, E.
Kenndler, Analytical and Bioanalytical Chemistry 382(2005)1520
[200] J.H.T. Luong, T. Rigby, K.B. Male, P. Brouvette, Journal of
Chromatography A 849(2000)255
[201] I. Karapanagiotis, American Laboratory 38(2006)36
[202] I. Karapanagiotis, D. Karapanagiotis, A. Tsakalof, Y.
Chryssoulakis, Journal of Liquid Chromatography and Retaled
Technologies 28(2005)739
[203] I. Karapanagiotis, M. Gika, A. Danielia, A. Tsakaloph,
Chemika Chronika 67(2005)31
[204] D.W. McMartin, K.M. Peru, J.V. Headley, M. Winkley, J.A.
Gillies, Journal of Chromatography A 952(2002)289
[205] A. Latorre, A. Rigol, S. Lacorte, Journal of Chromatography A
991(2003) 205
[206] S. Grcev, P. Schoenmakers, P. Iedema, Polymer 45(2004)39
[207] J.C.J.F. Tacx, N.L.J. Meijerink, K.W. Suen, Polymer
38(1997)5363
[208] M. L. Dias, E.B. Mano, C. Azuma, European Polymer Journal
33(1997)559
[209] D. Vareckova, S. Podzimek, J. Lebduska, Analytica Chimica Acta
557(2006)31-36
[210] T. E. Eremeeva, T. O. Bykova, V. S. Gromov, Journal of
Chromatography A 552(1990)67
[211] C.A. Maines, E.R. de la Rie, Progress in Organic Coatings
52(2005)39
[212] C.M. Grzywacz, Journal of Chromatography A 676(1994)177
[213] K. Funazo, M. Tanaka, Y. Yasaka, H. Takigawa, T. Shono, Journal of
Chromatography 481(1989)211
[214] M.J. Cooper, M.W. Andrews, Analytical Chemistry 46(1989)1974
[215] E. Grushka, H.D. Durst, E.J. Kikta, Journal of Chromatography
_____________________________________________________________
282
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

112(1975)673
[216] A. Mehta, A.M. Oeser, M.G. Carlson, Journal of Chromatography B:
Biomedical Sciences and Applications 719(1998)9
[217] D.S. Nichols, N.W. Davies, Journal of Microbiological Methods
50(2002)103
[218] N. E. Hoffman, J. C. Liao, Analytical Chemistry 48(1976)1104
[219] E. Vioque, P. Maza, F. Millán, Journal of Chromatography
331(1985)187
[220] H. Miwa, C. Hiyama, M. Yamamoto, Journal of Chromatography
321(1985)165
[221] H. Miwa, Journal of Chromatography A 881(2000)365
[222] H. Miwa, M. Yamamoto, T. Momose, Chemical and Pharmaceutical
Bulletin 28(1980)599
[223] R. Peters, J. Hellenbrand, Y. Mengerink, S. Van der Wal,
Journal of Chromatography A 1031(2004)35
[224] T. Toyo’oka, Analytica Chimica Acta 465(2002)111
[225] T. Yoshida, A. Uetake, H. Yamaguchi, N. Nimura, T. Kinoshita,
Analytical Biochemistry 173(1988)70
[226] M. Yamaguchi, S. Hara, K. Obata, Journal of Liquid Chromatography
18(1995)2991
[227] Y.Saito, T. Uchiyama, K. Sasamoto, K. Takata, Y. Ohkura, K. Uneo,
Analyica Chimica Acta 300(1995)243
[228] M. Saito, M. Chiyoda, T. Ushijima, K. Sasamoto, Y Ohkura,
Analytical Science 10 (1994) 669
[229] M. Iketa, K. Shimada, T. Sakaguchi, Journal of Chromatography
305(1984)261
[230] Y.M. Lee, H. Nakamura, T. Nakajima, Analytical Science 5(1989)205
[231] J. You, W. Zhang, Y. Zhang, Analytica Chimica Acta
416(2001)163
[232] Y. Yasaka, M. Tanaka , T. Shono, T Tetsumi, J. Katakawa,
Journal of Chromatography 508(1990)133
[233] K. Akasaka, H. Ohrui, H. Meguro, Analyst 118(1993)765
[234] H. Tsuchiya, T. Hayashi, H. Naruse, N. Tagaki, Journal of
Chromatography 231(1982)247
[235] M. Yamaguchi, R. Matsunaga, K. Fukuda, M. Nakamura, Journal of
Chromatography 414(1987)275
[236] A. Takadate, T. Masuda, C. Tajima, C. Murata, M. Irikura, S. Goya,
Analytical Science 8(1992)663
[237] A. Takadate, T. Masusa, C. Murata, C. Haratake, A. Isobe, M. Irikura,
Analytical Science 8(1992)695
[238] H. Cisse, R. Farinotti, Journal of Chromatography 225(1981)509
[239] J.S. Yoo, V.L. Mc Guffin, Journal of Chromatography 627(1992)87
[240] S. Lam, E. Grushka, Journal of Ch romatography 158(1978)207
_____________________________________________________________
283
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[241] W. Elbert, S. Breitenbach, A. Neftel, J. Hahn, Journal of

Chromatography 328(1985)111
[242] W. Dünges, Analytical Chemistry 49(1977)442
[243] J.L. Shen, C. Hummert, B. Luckas, Fresenius Journal of Analytical
Chemistry 357(1997)101
[244] D. Perret, A. Gentilli, S. Marchese, M. Sergi, L. Caparossi, Rapid
Communications in Mass Spectrometry 18(2004)1989
[245] K. Nagy, A. Jakab, J. Fekete, K. Vekey, Analytical Chemistry
76(2004)1935
[246] R.E. Calaf, J. Peña, S. Paytubi, M. Carrascal, M. Posada, M. Gelpi,
J. Abian, Journal of Agricultural Food and Chemistry
49(2001)5085
[247] M. Jemal, Z. Ouyang, D.S. Teitz, Rapid Communications in Mass
Spectrometry 12(1998)429
[248] J. Sajiki, J. Yonekubo, Analytica Chimica Acta 465(2002)417
[249] K. Takamura, T. Fuse, K. Arai, F. Kusu, Journal of Electroanalytical
Chemistry 468(1999)53
[250] A. Kotani, F. Kusu, K. Takamura, Analytica Chimica Acta
465(2002)199
[251] S. Ikenoya, O. Hiroshima, M. Ohmae, K. Kawabe, Chemical and
Pharmaceutical Bulletin 28(1980)2941
[252] K. Shimada, C. Sakayori, T. Nambara, Journal of Liquid
Chromatography 10 (1987) 2177
[253] A. Vasanits, I. Molnár-Perl, Journal of Chromatography A
832(1999)109
[254] R.G. Granberg, LC Magazine 2(1984)776
[255] K. Petritis, C. Elfakir, M. Dreux, Journal of Chromatography A
961(2002)9
[256] J. You, W. Lao, Q. Ou, X. Sun, Journal of Chromatography A
848(1999)117
[257] R. Gatti, M.G. Gioia, A.M. Di Petra, Analytica Chimica Acta
474(2002)11
[258] Y. Huang, H. Matsunaga, A. Toriba, T. Santa, T. Fukushima,
K. Imai, Analytical Biochemistry 270(1999)257
[259] G.P. Palace, C.H. Phoebe, Analytical Biochemistry 244(1997)393
[260] A.J. Shah, V. de Biasi, S.G. Taylor, C. Roberts, P. Hemmanti,
R. Munton, A. West, C. Routledge, P. Camilleri, Journal of
Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications
735(1999)133
[261] D.P. Manica, J.A. Lapos, A.D. Jones, A.G. Ewig, Analytical
Biochemistry 322(2003)68
[262] J. You, Y. Shan, L. Zhen, L. Zhang, Y. Zhang, Analytical
Biochemistry 313(2003)17
_____________________________________________________________
284
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[263] P. Herbert, M.J. Cabrita, N. Ratola, O. Laureano, A. Alves,

Journal of Food Engineering 66(2005)315
[264] H. Sultana, R. Onodera, M.M. Or-Rashid, S. Wadud, Journal of
Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications
755(2001)321
[265] A. Vasanits, D. Kutlán, P. Sass, I. Molnár-Perl, Journal of
Chromatography A 870(2000)271
[266] T. P. Piepponen, A. Skujins, Journal of Chromatography B:
Biomedic al Sciences and Applications 757(2001)277
[267] H.P. Fitznar, J.M. Lobbes, G. Kattner, Journal of Chromatography
A 832(199)123
[268] G.P.M.A. Hardy, F.J. Van Hermet, A.J. Meijer, J. Goudmits,
Analytical Biochemistry 291(2001)297
[269] C. S. Yang, P.J. Tsai, W.Y. Chen, W.J. Tsai, J.S. Kuo, Journal of
Chromatography B 734(1999)1
[270] K. Salchet, T. Pompe, C. Sperling, C. Werner, Journal of
Chromatography A 1005(2003)113
[271] E.H. Soufleros, E. Bouloumpasi, C. Tsarchopoulos, C.G. Biliaderis,
Food Chemistry 80(2003)261
[272] Y.V. Tcherkas, A.D. Denisenko, Journal of Chromatography A
913(2001)309
[273] K.S. Lee, D.G. Drescher, Journal of Biological Chemistry
254(1979)6248
[274] K. Petritis, P. Chaimbault, C. Elfakir, M. Dreux, Journal of
Chromatography A 896(2000)253
[275] P. Chaimbault, K. Petritis, C. Elfakir, M. Dreux, Journal of
Chromatography A 855(1999)191
[276] J. Qu, Y. Wang, G. Luo, Z. Wu, C. Yang, Analytical Chemistry
74(2002)2034
[277] B. Casetta, D. Tagliacozzi, B. Shushan, G. Federici, Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine 38(2000)391
[278] J.L. Gómez-Ariza, M.J. Villegas-Portero, V. Bernal-Daza,
Analytica Chimica Acta 540(2005)221-230
[279] J.J. Dalluge, S. Smith, F. Sánchez-Riera, C. McGuire, R. Hobson,
Journal of Chromatography A 1043(2004)3
[280] Z. Liu, P.E. Minkler, D. Lin, L.M. Sayre, Rapid Communications in
Mass Spectrometry 18(2004)1059
[281] Y.V. Tcherkas, L.A. Kartsova, I.N. Kartsova, Journal of
Chromatography A 913(2001)303
[282] Y. Qu, Y.M. Li, E. Vandenbussche, S. Geeraerts, F. Vandesande,
Journal of Chromatography A 798(1998)19
[283] V. Rizzo, A. Anessi, L. Montalbeti, G. Bellantoni, R. Trotti,
C.V. Melzi d’Eril, Journal of Chromatography A 729(1996)181
_____________________________________________________________
285
 X. BIBLIOGRAFÍA/REFERENCES

[284] L. Canevari, R. Vie ira, M. Aldegunde, F. Dagani, Analytical

Biochemistry 205(1992)137
[285] G.C. Li, I.S. Krull, S.A. Cohen, Journal of Chromatography A
724(1996)147
[286] T. Mahachi, J. Tendai, R.M. Carlson, D.P. Poe, Journal of
Chromatography 298(1984)279
[287] S. Cui, Ziran Kexueban 19(1993)37-41
[288] J. Pei, X.Y. Li, Fresenius Journal of Analytical Chemistry
367(2000)707
[289] M. Odhyla, N.S. Cohen, G.M. Foster, Thermochimica Acta
365(2000)34
[290] M.J. Lerma-García, J.M. Herrero-Martínez, G. Ramis-Ramos,
E.F. Simó-Alfonso, Analytica Chimica Acta, 2006, in referees.
[291] J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analyitcal
Chemistry, 4th Ed., Prentice-Hall, Harlow, England, 2000
[292] J. Dugot, Les Luths (Occident)-Catalogue des Collections du
Musée de la Musique, vol. 1, Cité de la Musique, Paris, 2006
[293] S.H. Chen, K.C. Chen, H.M. Lien, Journal of Chromatography A
849(1999)357
[294] J.S. Mills, Studies in Conservation 11(1966)92
[295] S. Basar, Phytochemical Investigations on Boswellia Species,
Thesis,
University of Hamburg, 2005
[296] H. Chisholm In (Ed.), Encyclopædia Britannica, vol. 9, 11th ed.,
Horace Everett Hooper, 1911, p. 259
[297] R. White, J. Kirby, Technical Bulletin, vol. 22, National Gallery,
London, 2001, p. 64

_____________________________________________________________
286