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    Separación de Proteínas

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    Tatiana Sampedro
    La separación de proteínas por electroforesis permite separar las fracciones proteicas de una muestra depositada sobre un gel de poliacrilamida aplicando un campo eléctrico. Las moléculas se desplazan a velocidades que dependen de su carga y peso molecular. La determinación de la composición en aminoácidos totales implica la hidrólisis ácida para romper enlaces peptídicos, seguida de cromatografía de intercambio iónico y detección espectrofotométrica para cuantificar los aminoá

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    Separación de Proteínas

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    La separación de proteínas por electroforesis permite separar las fracciones proteicas de una muestra depositada sobre un gel de poliacrilamida aplicando un campo eléctrico. Las moléculas se desplazan a velocidades que dependen de su carga y peso molecular. La determinación de la composición en aminoácidos totales implica la hidrólisis ácida para romper enlaces peptídicos, seguida de cromatografía de intercambio iónico y detección espectrofotométrica para cuantificar los aminoá

    Descripción original:

    proteinas

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    La separación de proteínas por electroforesis permite separar las fracciones proteicas de una muestra depositada sobre un gel de poliacrilamida aplicando un campo eléctrico. Las moléculas se desplazan a velocidades que dependen de su carga y peso molecular. La determinación de la composición en aminoácidos totales implica la hidrólisis ácida para romper enlaces peptídicos, seguida de cromatografía de intercambio iónico y detección espectrofotométrica para cuantificar los aminoá

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    Separación de Proteínas

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    La separación de proteínas por electroforesis permite separar las fracciones proteicas de una muestra depositada sobre un gel de poliacrilamida aplicando un campo eléctrico. Las moléculas se desplazan a velocidades que dependen de su carga y peso molecular. La determinación de la composición en aminoácidos totales implica la hidrólisis ácida para romper enlaces peptídicos, seguida de cromatografía de intercambio iónico y detección espectrofotométrica para cuantificar los aminoá

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    Separación de proteínas

    Separación de proteínas por electroforesis


    • La técnica descrita por Grassmann y Hanning (1950) permite separar
    las diferentes fracciones proteicas de una muestra depositada sobre
    una tira de papel empapada con un electrolito de pH 8,6, cuyos
    extremos están conectados a los bordes de un generador de corriente
    continua.
    • Las moléculas de péptidos o de proteínas, bajo la acción de un campo
    eléctrico, se desplazan a una velocidad que depende, a la vez, de su
    carga y de su peso molecular.
    • Después de la migración, se procede a la coloración de las diferentes
    fracciones con ayuda de un colorante específico para las proteínas.
    • En la actualidad, la migración se realiza más frecuentemente sobre un
    gel de poliacrilamida (PAGE), apareciendo numerosas variantes que
    permiten separar fracciones proteicas según su pH isoeléctrico
    (electroenfoque), su peso molecular (electroforesis sobre gel de
    poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico: SDS PAGE) o sus
    propiedades antigénicas (inmunoelectroforesis)
    • En el campo agroalimentario, las principales aplicaciones de la
    electroforesis de las proteínas son: la identificación de las variantes
    de trigo o de cebada por electroforesis de las prolaminas sobre gel de
    poliacrilamida (Wrigley y col. 1982), la investigación de adulteraciones
    como la detección de proteínas vegetales en productos de origen
    animal (Jansseny col. 1987) y la detección de proteínas alteradas
    durante los tratamientos tecnológicos (leche en polvo obtenida por
    pulverización).
    Determinación de la composición en
    aminoácidos totales
    • Tras la ruptura de los enlaces peptídicos por hidrólisis ácida, el análisis
    más frecuente es la cuantificación de los AA que componen la
    proteína.
    • La cromatografía de intercambio iónico es la más utilizada con una
    elución selectiva y detección espectrofotométrica, tras derivación
    post-columna.
    • El método corriente se aplica al conjunto de los aminoácidos a
    excepción del triptófano (destruido durante la hidrólisis ácida), los
    aminoácidos azufrados (que son oxidados parcialmente y que
    aparecen como diversos picos, cuyas áreas se han de sumar) y la
    asparagina y la glutamina, que son desaminadas respectivamente a
    ácido aspártico y glutámico.
    Muestra sometida a HCL 6N
    hidrólisis ácida

    105 – 115 °C por 24 h.

    Hidrolizado
    Neutralizado y secado

    Alícuota en columna de resina Dowex 50,


    Amberlita IR-20 en forma ácida
    Tampones de pH crecientes: y a temperaturas
    que aumentan progresivamente (pH 2,2 a 30
    °C (tampón citrato), pH 3,1 (tampón citrato),
    pH 5,1 (tampón citrato/acetato) a 50 °C y
    después a 75°C.

    Elución
    • Los aminoácidos son eluidos progresivamente en función de su punto
    isoeléctrico y de sus propiedades fisicoquímicas .
    • El eluato, en continuo, se hace reaccionar con ninhidrina, como
    reactivo colorimétrico, a una temperatura de 95-98 °C. La intensidad
    del color (absorbancia) se registra de forma continua y, finalmente, se
    calcula el área de los picos correspondientes a los AA (Mossé y col.
    1985, 1987).
    • En cuanto a la reacción colorimétrica requiere la participación de dos
    moléculas de AA con dos moléculas de ninhidrina, de las cuales una
    se reduce previamente a hidrindantina.
    • La lectura se realiza a 570 nm, salvo para la prolina y la hidroxiprolina
    que desarrollan un color más acusado a 440 nm. La composición en
    AA del hidrolizado se calcula considerando la intensidad de la
    coloración obtenida para cada uno de ellos después del análisis de
    una muestra patrón de los mismos.
    Intensidad de la coloración desarrollada en la reacción de los AA con la
    ninhidrina (lecturas a 570 nm, sobre una base molar y un valor de 1,00
    para la leucina) (Moore y Stein, 1952).

    Alanina 0,97 Treonina 0,94


    Arginina 1,01 Triptófano 0,94
    Ácido aspártico 0,94 Tirosina 1,00
    Cisteína 0,55 Valina 0,97
    Ácido cisteico 0,99 Asparagina 0,95
    Ácido glutámico 0,99 Creatina 0,03
    Glicina 0,95 Glutamina 0,99
    Histidina 1,02 Taurina 0,88
    Hidroxilisina 1,12 Urea 0,03
    Isoleucina 1,00
    Leucina 1,00
    Lisina 1,10
    Metionina 1,02
    Fenilalanina 1,00
    Serina 0,95
    • Se recurre también al HPLC para establecer un aminograma completo
    a pesar de algunas dificultades que subsisten todavía en la separación
    del conjunto de picos de los diferentes aminoácidos. El tiempo entre
    dos análisis es, sin duda alguna, el principal inconveniente para la
    implantación de esta técnica.
    • La composición en aminoácidos, en el campo agroalimentario y
    nutricional, no se expresa como cantidad por 100 g de producto, sino
    en porcentaje sobre proteína bruta, cuya tasa es el resultado de
    multiplicar el nitrógeno total por el factor de conversión apropiada.
    • Los hidrolizados alcalinos son indispensables para la determinación
    del triptófano, cuantitativamente destruido en medio ácido; se realiza
    en medio sódico o bárico de 3M a 5M durante 24 h a 110 °C. La
    cuantificación del triptófano puede efectuarse recurriendo a una
    reacción coloreada particular (Slump y Schreuder, 1969; Adrian,
    1969).
    • Los AA azufrados (metionina y cisteina) son oxidados parcialmente
    durante la hidrólisis ácida convertidos en metionina sulfona y
    sulfóxido, el uno, y ácido cisteico, el otro. Por ello existen métodos
    que oxidan totalmente estos dos AA en una primera fase para
    dosificarlos, a continuación, en su forma oxidada (Moore, 1963).
    • La determinación de un AA en particular puede realizarse a partir de
    un hidrolizado proteico o proceder directamente a la cuantificación
    de aquel, aprovechando técnicas basadas en la propiedad del AA. Por
    ejemplo la reflectancia infrarroja de la metionina (Williams y col.,
    1985) o el uso de un electrodo específico en el caso de la lisina (Tran y
    col., 1983). Este último método puede utilizarse tanto para la
    cuantificación de la lisina total como para la lisina disponible.

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