EXTRACCION DE PROTEINAS

26-12-2019

EXTRACCION
DE PROTEINAS

Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión

 EXTRACCION DE PROTEINAS

INDICE
INTRODUCCION............................................................................................................................. 2
TIPOS DE PROTEINAS .............................................................................................................. 3
EXTRACCIÓN DE PROTEINAS ................................................................................................... 4
Desnaturalización .......................................................................................................................... 5
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN TEJIDO ANIMAL ........................................................... 6
Procedimiento ................................................................................................................................ 6
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN HONGOS .......................................................................... 7
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS .................................................................... 8
Extracción de proteínas de la membrana externa ...................................................................... 8
EXTRACCION DE PROTEINAS EN PLANTAS......................................................................... 9
Métodos de extracción .................................................................................................................. 9
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 10
BIBLIOGRAFIA Y REFERENCIAS WEB ................................................................................. 11

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INTRODUCCION
Las proteínas son las más variadas de todas las macromoléculas, y cada célula contiene varios miles
de proteínas diferentes. Las funciones de las proteínas incluyen servir como componentes
estructurales de células y tejidos (p.ej., colágeno) , actuar en el transporte y almacenamiento de
pequeñas moléculas (p.ej., en el transporte de oxigeno por la hemoglobina), transmitir información
entre células ( p.ej., hormonas proteicas), proporcionar una defensa frente a la infección (p.ej.,
anticuerpos), actuar como elementos esenciales en sistemas motiles y contráctiles (p.ej., actina),
almacenar aminoácidos como elemento nutritivo (p.ej., caseína). Sin embargo, su principal función
es la de actuar como catalizadores biológicos, denominados enzimas, las cuales participan en la
mayoría de las reacciones químicas en los sistemas biológicos.
Las proteínas están constituidas por la concatenación de unas sustancias químicas denominadas
aminoácidos (unidades monoméricas). Por hidrolisis de proteínas se han identificado 20 aminoácidos
distintos. Cada aminoácido consiste en un átomo de carbono (llamado carbono α) ligado a un grupo
carboxilo (COO-), un grupo amino (NH+ 3), un átomo de hidrogeno y una cadena lateral
característica cuya propiedades físicas y químicas determinan los papeles de cada aminoácido en la
estructura y función proteica. Los aminoácidos se clasifican basándose en la polaridad de su cadena
lateral. Dentro del conjunto de todos los aminoácidos naturales existen unos que pueden ser
sintetizados por las células del organismo humano a partir de materiales sencillos que contengan C,
O, H y N, pero otros tienen adquirirse necesariamente con la dieta. Estos últimos se denominan
aminoácidos esenciales para la especie humana y son: valina, leucina, isoleucina, treonina, metionina,
fenilalanina, triptófano, lisina e histidina (solo para lactantes). Todos los aminoácidos a excepción de
la glicina, poseen átomos de carbono asimétricos y en consecuencia presentan actividad óptica, es
decir, presentan estero isomería (enantiomeros D y L). En las proteínas solo se encuentran
aminoácidos de la seria L. El valor de pH al cual el aminoácido no tiene carga neta se llama punto
isoeléctrico (pI), a valores de pH < pI la molécula tendrá carga positiva mientras que la carga será
negativa si pH > pI. La forma neutra se debe a la formación de una sal interna llamada Zwitterion,
esto ocurre porque el protón del grupo carboxilo es abstraído por el grupo amino NH2 que está en
posición alfa y quedando este como grupo amonio NH3+. El punto isoeléctrico de las proteínas está
influenciado por las cadenas laterales, ya que los grupos aminos y ácidos principales participan en el
enlace peptídico. Los aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos entre el grupo α amino de un
aminoácido y el grupo α carboxilo del siguiente. La propiedad fundamental del Enlace peptídico es
que todos los átomos que lo forman han de estar en un mismo plano, por lo que la cadena proteica
solo puede girar por sus Cα pero nunca por el enlace peptídico. Las uniones de miles de aminoácidos
forman lo que se conoce como cadena poli peptídica, la cual contiene dos extremos distintivos, uno
llamado N terminal y otro C terminal. Los polipéptidos se sintetizan desde el extremo amino al
carboxilo terminal, y la secuencia de aminoácidos en un poli péptido se escribe (por convención) en
el mismo orden. Cada proteína consiste en una secuencia específica de aminoácidos, determinada por
el orden de los nucleótidos en un gen. Esta secuencia permite interacciones entre aminoácidos
constituyentes que darán origen a configuraciones tridimensionales características, cruciales para la
función proteica.

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TIPOS DE PROTEINAS
Cada tipo de proteína puede tener diferentes estructuras de organización:
 Estructura primaria: Composición cuantitativa y secuencia lineal de aminoácidos.
 Estructura secundaria: estructura local de la cadena polipeptídica. Se determina por las interacciones
mediante puentes de hidrogeno entre el oxígeno del grupo carbonilo de una cadena peptídica y el
hidrogeno de amida de otro puente peptídico cercano. Existen dos tipos de estructuras secundarias:
Hélice α posee una cadena peptídica fuertemente enrollada y con las cadenas laterales de los residuos
aminoácidos extendiéndose hacia fuera del eje de la espiral; Hoja plegada β es una estructura extendida
que se forma cuando dos partes de una cadena poli peptídica se encuentran una junto a otra con enlaces
puente hidrogeno entre ellas, estas a su vez, pueden estar orientadas bien paralela o anti paralelamente
entre sí.
 Estructura terciaria: conformación tridimensional, plegada y biológicamente activa. La estructura
está estabilizada por interacciones entre grupos funcionales de las cadenas laterales: puentes di sulfuros
covalentes, puentes de hidrógeno, puentes salinos e interacciones hidrofobicas.  Estructura
cuaternaria: complejo ensamblaje de dos o más cadenas peptídicas que se mantienen unidas por
interacciones no covalentes, en algunos casos, covalentes. La mayoría de las proteínas mayores de 50
da constan de más de una cadena y se conocen como proteínas diméricas, trimétricas o multimérica.
Según su conformación nativa las proteínas pueden clasificarse en Fibrosas o Globulares:
 Fibrosas: típicas estructuras secundarias, formadas por fibras ordenadas a lo largo de un eje. Insolubles
en agua y en soluciones acuosas, gran resistencia física: acción mecánica (esqueletos, transmisión de
esfuerzos) o de protección. Ej.: colágeno, elastina, queratina.
 Globulares: cadenas plegadas de tal modo que toman formas esféricas o globulares compactas
(estructura terciaria). Solubles en agua o soluciones acuosas. Papeles muy dinámicos en el organismo.
Pertenecen a esta categoría, las enzimas, los anticuerpos, algunas hormonas, las proteínas con función
de transporte, etc. Algunas proteínas no se encuentran claramente en ninguno de estos grupos de
clasificación: por ejemplo, pueden presentar estructura de tipo fibroso, pero ser solubles en soluciones
salinas, como las globulares, que es el caso de la miosina del músculo y el fibrinógeno del plasma
sanguíneo.
Según su composición química, las proteínas pueden ser:
 Simples: su hidrólisis produce sólo aminoácidos, como la insulina o el colágeno.
 Conjugadas: su hidrólisis produce, además de aminoácidos, otros compuestos inorgánicos u
orgánicos, clasificándose entonces en:
 Nucleoproteínas.
 Fosfoproteínas.
 Glicoproteínas.
 Metal proteínas.
 Lipoproteínas.
La solubilidad de las proteínas es variable y depende de la distribución y de la proporción de grupos
polares y no polares de la molécula. La proteína es soluble cuando ocurre interacción proteína-agua y
tiende a ser insoluble cuando ocurre interacción proteina-proteina. Cualquier condición que altere esas
interacciones alterará la solubilidad. Por lo tanto, la solubilidad de una proteína es función de la
composición iónica del medio, de la fuera iónica y del pH. La adición de un disolvente orgánico, como
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acetona o alcohol, a una solución de proteína en agua, disminuye la constante dieléctrica del disolvente,
desplaza también algunas de las moléculas de agua asociadas con la proteína, y reduce la concentración
del agua presente en la solución. Estos efectos tienden a disminuir la solubilidad de la proteína y causar
su precipitación en solución. En presencia de pequeñas concentraciones de sal, la proteína en solución
de agua pura disminuye su coeficiente de actividad y aumenta su solubilidad (disolución salina o
“salting in”) debido a las fuerzas de atracción entre los iones de la proteína y los iones de la sal.
Ahora bien en concentración elevadas de sales muy solubles como sulfato de amonio, se observa
precipitación salina o “salting out” de las proteínas, la cual depende de la disminución de la actividad
del agua, lo que a su vez disminuye las interacciones solubilizantes entre el agua y los grupos de la
proteína. Es decir, que cuando aumenta mucho la cantidad de iones extraños, la interacción proteína-
proteína se hace mayor que la interacción proteína-agua, baja la movilidad de las cargas proteicas y las
proteínas precipitan.

EXTRACCIÓN DE PROTEINAS
La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos
más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los
límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se
denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las
proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones secundarias por oxidación,
proteólisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de técnicas de disrupción celular, que se usan a
escala de laboratorio que se pueden clasificar como:
a) métodos físicos mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta presión o extrusión por
presión.
b) métodos físicos no mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación descongelación, sonicación o
secado.
c) métodos químicos: tratamiento con álcali, solventes, detergentes, ácidos o sustancias caotrópicas.
Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separación y purificación de los componentes
celulares. Como primera medida, puede realizarse una centrifugación diferencial para obtener
fracciones subcelulares o para aislar organelas específicas. En este caso, las proteínas asociadas a
membrana quedarán en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una
centrifugación) y las solubles en el sobrenadante.
En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan las proteínas en diferentes
fracciones basados en algunas propiedades tales como tamaño o carga, proceso denominado
fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias en la solubilidad de las
proteínas. Existen diversos factores que afectan esta solubilidad; en particular, la composición en
aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es en general más soluble que una rica en
aminoácidos hidrofóbicos); la estructura tridimensional (las proteínas fibrosas son en general menos
solubles que las globulares) y el entorno de la propia proteína. Respecto a las condiciones del entorno
de las proteínas, los principales factores que pueden afectar su solubilidad son la temperatura; la
constante dieléctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza iónica. La precipitación salina de las
proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una fracción de proteínas mediante el
aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de
proteínas, disminuye la interacción proteína-H2O porque quita la capa de solvatación, predominando
la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas. La concentración salina a
la que se produce la precipitación no es igual para todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad
para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente
se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de
amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C) y porque el ión sulfato divalente permite alcanzar
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altas fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.

Desnaturalización
Es la modificación que ocurre en la estructura nativa de una proteína, alterando así sus propiedades.
Envuelve alteraciones de la estructura 2°,3° y 4° de las proteínas. La estructura 1° se mantiene. Las
alteraciones que se observan son disminución de la solubilidad y/o pérdida de la actividad biológica.
La disminución de la solubilidad puede ser explicada por la exposición de radicales hidrofóbicos que
perjudican la interacción proteína-agua y favorecen la interacción proteína-proteína. La floculación y
la coagulación son manifestaciones visibles de la alteración estructural causada por agentes
desnaturalizantes.
Agentes desnaturalizantes:
 Calor: la agitación térmica afecta las interacciones que estabilizan la estructura tridimensional de
las proteínas (puentes H, interacción hidrofóbica)
 Ácidos: se combinan con proteínas con carga + formando complejos insolubles.
 Sales de metales pesados: se combinan con proteínas de carga formando proteinatos insolubles.
 Solventes orgánicos: presentan corriente dieléctrica inferior al agua entonces la atracción entre
cargas opuestas es alta. (precipitación)
Caracterización de aminoácidos
Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas reaccionan con
una variedad de compuestos formando productos coloreados. Existen reacciones de coloración que son
específicas para aminoácidos y son importantes, tanto para la detección como para el dosaje de
aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos
comunes a todas las proteínas como grupos amino o uniones peptídicas (ninhidrina y biuret)
 Reacción Xantoproteica: Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color
amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado
positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, tirosina,
fenilalanina, triptófano. Una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali y vira a un color
anaranjado.
 Reacción de aminoácidos azufrados: Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado
negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre
de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro
de plomo.
 Determinación cuantitativa de proteínas mediante el método de Biuret: Se basa en la
formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en
medio básico. 1 Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente
proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica,
de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se
recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados. Este método es
sencillo y su sensibilidad está dentro de un rango de concentración del orden de miligramos.

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EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN TEJIDO ANIMAL

En el caso de órganos u otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis
celular, ya que las células se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En general estas técnicas
involucran la utilización de enzimas (como por ejemplo colagenasa) y/o una ruptura mecánica
grosera. Para esto pueden utilizarse morteros, homogeneizadores eléctricos, tijeras o tamices metálicos
(mesh), entre otros. Cuando el material es un cultivo celular, la extracción puede realizarse adicionando
un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación. esto determinará el buffer de extracción
que se utilizará dependiendo se desea o no que las proteínas conserven su actividad biológica, su
conformación nativa, su interacción con otras proteínas u otras moléculas.
La cantidad de proteínas puede estimarse por diversos métodos. La mayoría de las proteínas absorben
a 280 nm, y a bajas concentraciones, lo hacen de manera proporcional con su concentración. Este es
un método rápido y sencillo pero tiene la desventaja es que la muestra debe estar pura, ya que otras
moléculas no-proteicas como el DNA, también absorben a esa longitud de onda. Por otro lado, los
ensayos colorimétricos involucran la adición de una sustancia química que es capaz de reaccionar con
determinados residuos aminoacídicos. El resultado de estas reacciones es el cambio de color en la
solución, que es cuantificado mediante una medida de absorbancia. En general, estos métodos son más
sensibles que la cuantificación por absorbancia directa a 280 nm. Posteriormente, para determinar la
concentración de proteínas totales de la muestra a analizar los resultados de absorbancia se interpola a
una curva de calibración construida utilizando una proteína estándar, por lo general albúmina sérica
bovina (BSA bovine seric albumin), cuya concentración es conocida.
Los ensayos colorimétricos más utilizados son:
Ensayo de Bradford (595nm): es uno de los más sensibles. Es rápido y muy sencillo y además no
presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el β-mercaptoetanol, que sí interfieren
con Los ensayos de Lowry y BCA. La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lípidos.
Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reacción de redox con los enlaces peptídicos y con los
aminoácidos Tyr, Trp y Cys. Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Como desventaja, es afectado
por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritón X-100. Sin
embargo existen variables que pueden realizarse para evitar estas interferencias, que están disponibles
comercialmente.
Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es más sensible que Lowry y puede realizarse en
un amplio rango de temperaturas. También es sencillo, pero requiere de tiempos de incubación un poco
más largos. Los complejos coloreados son muy estables. Aunque es altamente susceptible a
interferencias, no interfiere con detergentes y lípidos. En este trabajo práctico se obtendrán los extractos
proteicos crudos de distintos órganos de ratón. Se realizará una centrifugación diferencial y la
precipitación salina con distintas concentraciones de sulfato de amonio de la fracción soluble
Procedimiento
1) Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo.
2) Agregar 1500 µl PBS.
3) Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
4) De ser necesario agregar más PBS para seguir disgregando (¡anotar el volumen extra agregado)
5) Tomar el extracto líquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los trozos menos
disgregados de tejido.
6) Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4°C
7) Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo.
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PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4

Precipitación con Sulfato de amonio:

1) Realizar las diluciones de la solución saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuación:
% Solución saturada de sulfato de amonio 0 30 70 100
Volumen de Agua (µl) 500 150 350 –
Volumen de SO4(NH4)2 saturado (µl) - 350 150 500
2) Rotular en la tapa, 4 tubos con el % de sulfato de amonio agregado y el Número de grupo de trabajo
(ejemplo para el grupo 4: 30% G4). Agregar en cada uno 100 µl del extracto crudo de proteínas
3) Agregar 100 µl de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente.
4) Agitar vigorosamente durante unos segundos
5) Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
6) Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rótulo, y descartar el
tubo con el pellet
7) Conservar en hielo
RECOMENDACIÓN: trabajar siempre con las muestras en hielo para evitar la degradación por acción
de las proteasas
Cuantificación de proteínas: Se utilizará el reactivo de Bradford de Bio-rad®
http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/bioradbradford.pdf
1) Para realizar la curva del estándar preparar por duplicado 5 diluciones en PBS de la proteína estandar
(BSA) entre 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. También incorporar a la curva el valor "blanco" (PBS solo).
2) Realizar 2 diluciones seriadas 1/10 de las muestras
3) Colocar 200 µl del reactivo de Bradford a cada pocillo que se va a utilizar, de una placa de 96
pocillos (microplaca).
4) Agregar 10 µl de cada dilución del estándar (y del blanco) en los pocillos, cuidando de cambiar el
tip entre muestras, (o utilizando el mismo tip, pero tomando siempre desde la muestra más diluida a
la más concentrada) También colocar en otros posillos 10 µl de las muestras (las dos diluciones).
CAMBIAR EL TIP AL AGREGAR CADA MUESTRA.
5) Incubar a temperatura ambiente por un mínimo de 5 minutos (y un máximo de 1 hora).
6) Medir la absorbancia a 595 nm en un lector de microplacas.

*Con los valores obtenidos, construir la curva de calibración y calcular la concentración de los extractos.

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN HONGOS

Entre los métodos tenemos:
 Extracción en agua-ácido fórmico (E. agua): se realiza una suspensión acuosa del hongo (1-4 Mc
Farland) con agua calidad espectrometría (Sigma-Aldrich, Francia), se agita durante 15 min,
posteriormente se colocan 2ul de la suspensión en un pocillo con 1ul de ácido fórmico (AF) 70%
(Sigma-Aldrich, Francia) y 1ul de matriz alfaciano-4 hidroxi-ácido cinámico (HCCA) (Bruker
Daltonics, Alemania).
 E. zirconio: se disgrega el hongo en 250ul de etanol absoluto (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) con 50ul
de perlas de zirconio de 0,1 mm de diámetro (Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, EE. UU.), se
agita durante 15 min, se centrifuga a 13.000 rpm (2 min) y se descarta el sobrenadante. Se adiciona al
pellet 50ul de AF al 70%, se agita durante 5 min, luego se añaden 50ul de acetonitrilo al 100% (Sigma-
Aldrich, Lyon, Francia). Agitando nuevamente durante 5 min y se centrifugando a 13.000 rpm (2 min);
finalmente, se coloca en el pocillo 1ul del sobrenadante y 2ul de matriz HCCA

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 Extracción en tubo con caldo Sabouraud-etanol-acetonitrilo-ácido fórmico: se inocula una porción

del cultivo en caldo Sabouraud glucosado (Biokar Diagnostics, Francia) y se incuba durante 48 h en
agitación con rotor. Se deja reposar el caldo durante 10 min y se centrifuga un volumen de 1,5 ml del
sedimento a 13.000 rpm (2 min). Se realizó un lavado con agua agitando durante 5 min, se centrifuga
y el pellet se resuspende en 300 ul de agua. La suspensión se agita durante 5 min y se agrega 900ul de
etanol absoluto, luego se agita otros 5 min y se centrifuga a 13.000 rpm (2 min); se descarta todo el
etanol y se deja secar el pellet hasta evaporación total. El pellet se resuspende en 50ul de AF al 70% y
se agita durante 10 min; posteriormente, se adiciona 50ul de acetonitrilo al 100% y se agita 10 min
más, luego se centrifuga a 13.000 rpm (2 min). Finalmente, se coloca en el pocillo 1ul del sobrenadante
y 1ul de matriz HCCA (Guide Fungi Library MALDI Biotyper. Bruker Daltonics, 2012, EE. UU.).

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS

Extracción de proteínas de la membrana externa

Las proteínas de la membrana externa son extraídas aplicando el método de Boissinot, se emplea el
buffer Hepes 10 mM (pH 7,4) con EDTA 10 mM y PMSF 0,1 mM. Se sónica en un desintegrador
ultrasónico SONIPRPEP 150 (MSE Scientific Instruments) en cuatro ciclos de 30s a una amplitud
máxima a 0°C y posteriormente se centrifuga 5 000 g durante 30 min para eliminar células completas
y otros detritos. El sobrenadante se ultracentrífuga 1 h a 100 000g y el precipitado obtenido se
resuspende en buffer Tris 1M (pH 6,8) con 1 % de sarkosil. Esta mezcla se incuba 20 min a 20°C,
Finalmente se ultracentrifuga a 100 000g durante 1h para resuspender el pellet en agua destilada estéril.
Se toman fracciones del preparado antigénico presente en el sobrenadante de la centrifugación posterior
a la sonicación, así como, del sobrenadante de la ultracentrifugación y del precipitado obtenido,
posterior al tratamiento con sarkosil. En este precipitado es donde se deben concentrar las proteínas de
la membrana externa. Las fracciones se someten a un análisis cualitativo mediante electroforesis en gel
de poliacrilamida.

Extracción de proteinas de membrana externa (OMPs) de A. actinomycetemcomitans, F.

nucleatum y P. gingivalis
Se procede a la ruptura de la célula en un tampón adecuado para evitar la lisis de las proteínas, la
agregación proteica y favorecer la resuspensión de éstas. Las células de ambas cepas bacterianas se
resuspenden en 3.5 ml de HEPES 10mM (pH 7.4) conteniendo 17.5 µL de fluoruro de metil fenil
sulfonato (PMSF, inhibidor de proteasas) (0.5 mM) + 350 µL cocktail inhibidor de proteasas.
Posteriormente la suspensión es sonicada, dicho método consigue la ruptura de las membranas
bacterianas utilizando ondas de ultrasonido mediante un sonicador ultrasónico de punta Branson (10
pulsos discontinuos de 20 milisegundos durante 3 segundos). Posteriormente, se centrifuga para
descartar el “debris” celular durante 10 min a 2000g a 4ºC. El sobrenadante se ultracentrifuga a
10 5000g a 4ºC durante 1 h y el pellet que se obtiene, corresponde a la fracción de membrana total.
Este pellet se resuspende en 1% de lauroylsarcosina sódica (Sarkosil) en 10 mM HEPES (pH 7.4) (100
µL) y se agita suavemente (en vortex) durante 1h a temperatura ambiente, para conseguir la separación
de ambas membranas. A continuación, la suspensión se ultracentrifuga a 10 5000g durante 1 h a 4ºC y
se obtiene, por un lado, la fracción enriquecida en membrana interna (Sarkosyl-soluble) que es el
sobrenadante y la fracción enriquecida en membrana externa (Sarkosyl-insoluble) que es el pellet.

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EXTRACCION DE PROTEINAS EN PLANTAS

Métodos de extracción:
El material vegetal se macera en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Con el fin de evaluar
el mejor buffer de extracción, se toman las hojas maceradas en nitrógeno líquido, a 0,1 g de material
vegetal agregándole 1 ml por cada buffer de extracción, se evalúan las siguientes soluciones buffer:
Tris-HCl, HEPES y fosfato, cada buffer conteniendo 0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2 mM y
Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% se ajusta a pH 7.5, se extrae por 4 horas a 4°C ; pasado este
tiempo se centrifuga a 10.000 gravedades por 5 minutos, la fase acuosa resultante se precipita toda la
noche a 4 °C con sulfato de amonio al 70%. Después se centrifuga a 10.000 gravedades por 10 minutos
a 4°C y el pellet se resuspende en cada uno de los buffers evaluados, posteriormente se dializa en
membrana de diálisis (Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) por 4 horas a 4°C, luego se cuantifica con el
método de ácido bicinconinico (BCA) y se realiza electroforesis.

Sulfato de amonio: Se toman las hojas y las semillas de la especie seleccionada y se macera en
nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino, se hacen 3 lavados con acetona en 0,1 g de material
vegetal, se agrega 1 ml de acetona por cada lavado, se homogeniza y centrifuga a 10.000 gravedades
por 3 minutos, este pre tratamiento permite extraer del material vegetal clorofilas y carotenoides y otros
compuestos, a continuación se deja secar el material vegetal toda la noche para que se evapore la
acetona en su totalidad. De este material vegetal se toma 1g para realizar la extracción con buffer fosfato
0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2 mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% y a un pH 7.5 (27), se dejó
en extracción a 4°C por 4 horas, después se centrifuga a 10.000 gravedades por 5 min a 4 °C, el extracto
acuoso obtenido se precipita toda la noche a 4°C con sulfato de amonio al 70% agregándolo en polvo
y disolviéndolo. Pasado este tiempo se centrifuga a 10.000 gravedades por 10 minutos a 4°C y el pellet
se resuspende en buffer fosfato, posteriormente se dializa en una membrana de diálisis (Spectra/Por®
6 MWCO 1KDa) con buffer fosfato a 4°C por 4 horas, finalmente el extracto dializado se pasa por un
filtro de 0,22 µm. Este procedimiento de precipitación de la proteína con sulfato de amonio se utiliza
para realizar los ensayos de actividad antimicrobiana y para la cromatografía.

3.2 TCA-Acetona: Las semillas y hojas de la especie seleccionada se maceran en nitrógeno líquido,
luego se les agrega 0,0025g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) por cada 1g de material vegetal,
posteriormente a este material vegetal se le realizan 3 lavados con acetona fría, centrifugando a 10.000
gravedades por 3 min a 4°C entre cada lavado. Por cada 0,1g de material vegetal se adiciona 1 ml de
buffer fosfato con 1,5% PVPP, 10mM KCl y 2 mM EDTA, pH 7.5, se deja en extracción por 2 horas
a 4°C, después se centrifuga a 12 000 gravedades por 20 minutos a 4°C al sobrenadante se adiciona la
solución de precipitación que contiene 10% de ácido tricloroacetico (TCA) y 0,07% de
betamercaptoetanol en 2 ml de acetona fría, luego se sonica la muestra por 30 min y se deja precipitar
toda la noche a -20°C. Después se centrifuga a 12 000 gravedades por 20 minutos a 4°C, se descarta el
sobrenadante y al pellet se le realiza tres lavados con 400 µL de acetona fría centrifugando a 10.000
gravedades por 5 minutos a 4°C entre cada lavado, finalmente el remanente de acetona presente en el
pellet se deja secar y este se resuspende en buffer fosfato (29). 3.3 Fenol-Tris: A partir de 0,1 g de
material vegetal macerado en nitrógeno líquido y con 2,5% de Polivinilpolipirrolidona (PVPP), se le
agrega 0,2 ml de buffer que contiene: Tris-HCl 500 mM, EDTA 50 mM, Sucrosa 700 mM, KCl 100
mM, 2% de betamercaptoetanol y Pefabloc 4 mM a un pH 8, se agita en hielo por 5 min y se agrega
0,2 ml de buffer Tris saturado con fenol y se deja 10 min a temperatura ambiente, posteriormente se
centrifuga a 10 000 gravedades por 10 minutos. Se recupera la fase superior (fenólica) y se adiciona
0,2 ml de buffer de extracción, se agita y se centrifuga 10 000 gravedades por 10 min después se
recupera la fase fenólica; a esta fase se le adiciona 4 volúmenes de solución de precipitación (Acetato
de amonio 0,1 M en metanol) y se deja toda la noche a -20°C, después se centrifuga a 10 000 gravedades
por 10 min, se realizan 3 lavados con solución de precipitación fría y un lavado con acetona fría, se
deja secar el pellet y resuspende

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 EXTRACCION DE PROTEINAS

Cromatografía: Se realiza cromatografía en columna de intercambio iónico Q- Sepharose, con flujo

de 4,5 ml/ min, volumen de 5 ml; La columna previamente se equilibra con buffer fosfato 500 mM pH
7.5, se añade 1 ml del extracto proteico acuoso de las hojas de la planta que se obtuvo por el método
de sulfato previamente descrito. Las proteínas se eluyen de la columna con buffer fosfato 500 mM con
NaCl pH 7.5, con 2 gradientes 50% y 100% del buffer eluyente, se monitorea la absorbancia de las
proteínas eluidas a 280 nm.
Electroforesis: Se realiza electroforesis de una dimensión SDS-PAGE con el sistema de Laemmli en
cámara de electroforesis Mini-PROTEAN® Tetra cell, a partir de los extractos proteicos acuosos de
semillas y hojas obtenidos por los métodos de: TCA-Acetona, fenol-Tris y sulfato de amonio, también
de las tres soluciones buffer: Tris-HCl, HEPES y fosfato; se llevan a cabo en geles del 12% de
acrilamida, se corrieron a 120 V constantes por aproximadamente 1 hora y fueron teñidos con azul de
Comassie y con plata. El peso molecular de las proteínas se determina por la comparación de la
movilidad electroforética de la muestra con el patrón.

CONCLUSIONES
Existen diferentes tipos de extracción de proteinas. algunas más específicas para el material biológico
seleccionado, pero en todas ellas se llega al objetivo teniendo en cuenta los protocolos y los equipos a
utilizar para cada procedimiento experimental para la investigación en la cual se analiza la muestra ya
sea vegetal, animal o bacteriana.

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos
nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras
similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato
este trabajo) al final del procedimiento.

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 EXTRACCION DE PROTEINAS

BIBLIOGRAFIA Y REFERENCIAS WEB

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raíz de Bupleurum perenne para 2-DE. Electroforesis 2007; 28, 871–875
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5. K. Aunstrup, en 'Bioquímica Aplicada y Bioingeniería', ed. L. B. Wingard,
6. Mass Spectrometry for Biotechnology: Gary Siuzdak
7. Osborn R, Samblan G, Thevissen K, Goderis I. Aislamiento y caracterización de plantas. 1995; 368, 257-
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