DOC-20190822 - Guia de Laboratorio Microbiologia

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
https://www.google.com.co/search?q=imagenes+de+microbiologi
MANUAL
PRACTICO DE
LABORATOTRIO
CLARET CARREÑO SOLANO
MICROBIOLOGA Esp.
UNIDAD DE CIENCIAS BASICAS
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERIA
MANUAL PRACTICO DE MICROBIOLOGIA

AMBIENTAL
Yopal julio de 2018

INTRODUCCION
La historia de la microbiología tiene sus inicios hace 250 años con un hombre humilde llamado
Anthony Leeuwenhoek el cual entró por primera vez a un mundo nuevo y misterioso poblado de
millares y diminutos seres mortíferos y otros útiles. Como ciencia, la Microbiología, data desde la
segunda mitad del siglo XIX. Son grandes los aportes dados en esta rama de la biología,
contribuyendo en la solución Ambiental, medica, agroindustrial, y biotecnológica, gracias a científicos
como Alexander Fleming, Robert Koch, Louis Pasteur, Carl Wosee, Robert Faulkner Copel, entre
otros.
La investigación en la Microbiología Ambiental nos permite conocer la interacción existente entre los
diferentes tipos de microorganismos, conocer la aplicación de los mismos en ecosistema como el
agua, el aire entre otros, la interacción de los diferentes grupos, y como funciona su metabolismo en
la trasformación de materia orgánica a reciclar. Por otra parte, nos permite entender la importancia
de los microorganismos benéficos o perjudiciales. ( Microbiología aspectos fundamentales
recuperado de http://www.javeriana.edu.co/documents ).
Este manual de laboratorio es una guía indispensable que facilita el aprendizaje a los estudiantes de
Microbiología ambiental del programa de Ingeniera ambiental de la Fundación Universitaria de San
gil UNISANGIL. El Manual ha sido diseñado para dar a conocer con un enfoque investigativo y un
método científico los cuales facilitaran el aprendizaje no solo de las practicas relacionadas, sino con
unos fundamentos que le permiten iniciarse en el estudio de la microbiología Ambiental, los cuales le
permitirán complementar su aprendizaje frente a una de las ramas de estudio más importante en la
aplicación de microorganismos para posible solución a problemas ambientales generados por el
hombre dentro de un ecosistema.
Este manual incluye procesos y técnicas implementadas para la identificación y caracterización

microscópica de bacterias y hongos en diferentes ecosistemas como suelo, agua y aire entre otros,
sujetos a unos parámetros en cada uno de estos ecosistemas.
OBJETIVO
Permitir la comprensión a través de vocabulario, procedimientos de técnicas de cultivo, conceptos

teóricos y experimentales, la diversidad y el lugar que los microorganismos ocupan dentro de un
ecosistema.
Con estas variables el estudiante estará en la capacidad de reconocer características morfológicas,

nutricionales, medidas de bioseguridad, habilidades para la manipulación de los mismos en el
laboratorio detectando la importancia de su interacción con los organismos y el medio ambiente.
1. Normas básicas de Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología ambiental
1.1 Pictograma de Bioseguridad

Los pictogramas de bioseguridad son ilustraciones que nos permiten identificar cada una de las
acciones a desarrollar dentro del laboratorio con el fin de proteger la integridad del personal.
Imagen 1. Bioseguridad en Microbiología. Barreras de protección.
Fuente:.ttps://www.google.com.co/search?biw=1366&bih=662&tbm=isch&sa=1&ei=MutVW-
DwEZGW5wK9w7aADA&q=pictograma+dde+biosegurid#imgrc=5nr7YHURYW8IZM:
1.2 Reglas basicas del laboratorio de microbioplogia.
El manejo de microorganismos representa por si mismo un riesgo potencialmente patogeno, por este
motivo, se deben seguir estrictamente las indicaciones que mostraremos a continuacion.
NO hay que ingorar el riesgo que representa la manipulacion de los microorganismos, de sustancias,
de los materiales de vidrio, mecheros de gas, de los cuales se debe dar aviso al monitor o coordinador
del laboratrorio en caso de cualquier derrame, fugas de gas detectadas o material de vidrio quebrado.
1. Se tendrà como maximo de 15 minutos para la entrada al laboratorio, luego de este tiempo
no se permitirà la entrada bajo ninguna circunstancia.
2. Es obligatorio el uso de la bata blanca, la cual se deberà colocar y abotonar antes de ingresar
al laboratorio y se podra quitar cuando termine su practica.
3. No se permitirà la entreda a personas ajenas a los grupos establecidos.
4. Se deben recoger el cabello antes de entrr al laboratorio.
5. NO deberan usar objetos como: audifonos, manos libres, celulares, aretes, anillos, reloj,
pulceras ni elementos que puedan causar heridas por contacto de algunos rectivos.
6. No se permite el uso de sandalias o zapatos abiertos, ni tacon alto.
7. La puerta del laboratorio se mantendra cerrada.
8. Las esas de trabajo se deberan limpiar con productos antimicrobianos antes y despues de
terminar su practica.
9. Los objetos personales se deberan colocar en los lyugares destinas por el coordinar
dellaboratorio o al monitor encargado.
10. Està prohibido comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje,
11. El estudiante debe ser responsable de revisar con antisipacion las fechas asignadas para
cada una de las practicas, con el fin de estar al tanto de cada una de las sesiones y de los
respectivos materiales adicionales que deban tarer para su actividad.
12. Deben conservar el orden en el laboratorio, y tener una conducta adecuada.
13. Deben seguir con atencion las indicacines del profesor o monitor encargado y seguir las
indicaciones del manual practico. Si no entiende debe hacer la pregunta con respeto.
14. Deben cuidar los equipos y materiales dados en cada sesion. Deberan dejar todo limpio.
encaso de un incidente con los equipos o materiales, deberan resppnder por el mismo y
deberan informar inmediatamente al coordiandor del laboratorio o al monitor encargado.
15. Depositar e las canecas de basura el material no conataminado.
16. El material contaminado deberà ser desinfectado según protoclo de desinfeccion estipulado
por el coordioandor del laboratorio.
17. El material que se incube deberà estar bien rotulado con el nombre del grupo, alumno, fecha,
meduio de cultivo etc.
18. Se deberan lavar las manos antes y despues de terminar la practica.
La inasistencia debe justificarse por escrito dentro de los plazos establecidos por la universid,
docente encargado o coordinador del laboratorio. Cada trabajo practico se evaluarà a traves
del desarrollo de cada guìa y la elaboracion del informe respectivo.
Cada estudiante debe disponer de su propio Manual de laboratorio de Microbiologia

ambiental, el cual consta de cada una de las practicas propuestas.
Las guias deberan ser previamentes estudiadas y analizadas por cada estudiante para
elaboran con antelacion los prespectivos pre informes.
Una vez iniciado el laboratorio, el estudiante debe mantenerse atento a los procedimientos y
seguir las instrucciones dadas por el docente, monitor y/o coordinador de laboratorio.
1.3 Elaboración de informes y pre informes
1.3.1 Pre informe
Cada grupo de laboratorio debe realizar los pre informes de laboratorio formato IEEE
presentación de laboratorios. Este pre informe se debe realizar en un cuaderno antes de llevar
a cabo la práctica, con el fin de garantizar que cada uno de los estudiantes adquieran el
conocimiento necesario para poder realizar la práctica de laboratorio con mayor facilidad y
objetividad.
El pre informe está constituido por:
1. Título de la practica
2. Nombre del autor (primer autor, segundo autor…)
3. Institución
4. Correo del autor
5. Resumen
6. Marco teórico
7. Montaje experimental
8. Resultados
9. Análisis de resultados
10. Conclusiones
11. Referencias bibliográficas.
LIBROS. - Autor/a (apellido -sólo la primera letra en mayúscula-, coma, inicial de nombre y punto;
en caso de varios autores/as, se separan con coma y antes del último con una "y"), año (entre
paréntesis) y punto, título completo (en letra cursiva) y punto; ciudad y dos puntos, editorial.
Ejemplos: Apellido, I., Apellido, I. y Apellido, I. (1995). Título del Libro. Ciudad: Editorial. Tyrer, P.
(1989). Clasificación of Neurosis. London: Wiley.
ARTÍCULOS DE REVISTA. - Autores/as y año (como en todos los casos); título del artículo,
punto; nombre de la revista completo y en cursiva, coma; volumen en cursiva; número entre
paréntesis y pegado al volumen (no hay espacio entre volumen y número); coma, página inicial,
guion, página final, punto. Ejemplos: Autores/as (año). Título del Artículo. Nombre de la Revista,
8(3), 215-232. Gutiérrez Calvo, M. y Eysenck, M.W. (1995). Sesgo interpretativo en la ansiedad
de evaluación. Ansiedad y Estrés, 1(1), 5-20.
MATERIAL CONSULTADO EN INTERNET. El World Wide Web nos provee una variedad de
recursos que incluyen artículos de libros, revistas, periódicos, documentos de agencias privadas
y gubernamentales, etc. Estas referencias deben proveer al menos, el título del recurso, fecha
de publicación o fecha de acceso, y la dirección (URL) del recurso en el Web.
Formato básico Autor/a de la página. (Fecha de publicación o revisión de la página, si está

disponible). Título de la página o lugar. Recuperado (Fecha de acceso), de (URLdirección)
Ejemplo: Suñol. J. (2001). Rejuvenecimiento facial. Recuperado el 12 de junio de 2001, de
http://drsunol.com.
1.3.2 Informe
El informe de laboratorio se debe entregar ocho días después de llevar a cabo la práctica.
Será realizado en formato IEEE o tipo artículo científico, impreso. Debe consignarse lo siguiente:
1. Título de la práctica
2. Nombre de autor.
3. Institución
4. correo del autor.
5. Resumen
6. Marco teórico
7. Montaje experimental
8. Resultados
9. Análisis de resultados. (Esta es la sección más importante de un informe o de un artículo
científico. Aquí los resultados pueden interpretarse apoyándose en literatura científica
como libros revistas, y se redactan en tercera persona).
10. Conclusiones. (Se presentan consecutivamente o puede retomarse el tema de la practica
mencionando los datos más relevantes y verificando los objetivos planteados.
11. Referencias bibliográficas.
2. Guías de laboratorio
F. GUÍA DE LABORATORIO LCB Y FÍSICA

LABORATORIO DE: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
ASIGNATURA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PROGRAMA INGENIERIA AMBIENTAL
PRÁCTICA NO. 1 TÍTULO: BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACION Y MEDIOS DE

CULTIVO
1. INTRODUCCIÓN
En laboratorios destinados a trabajos microbiológicos deben seguirse normas de higiene y seguridad
en el trabajo. El laboratorio de microbiología constituye un ambiente de trabajo muy delicado, ya que
pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que laboren allí. Cada
practica desarrollada en el laboratorio se realiza en grupos, las cuales requieren de una técnica
específicas para el manejo de materiales contaminados y en la elaboración de los medios de cultivo
determinando su propia seguridad, así como la del compañero de trabajo.
En el laboratorio de microbiología se trabaja por definición con microrganismos infecciosos o con

materiales que los contienen, algunos de estos son patógenos o con potencial de convertirse en ello,
razón por la cual es indispensable, que el personal que labora en las instalaciones conozca y aplique
todos los conceptos de BIOSEGURIDAD, el objetivo es garantizar la protección contra infecciones
del personal que trabaja en ellos, así como su extensión a la comunidad y al medio ambiente;
además que asegure la calidad de las técnicas usadas en cada practica y la confiablidad de los
resultados.
Antes de iniciar con las actividades prácticas, estudiantes, monitores, y docentes, debemos tener
claro conocimiento de las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de microbiología de tal
manera que el trabajo a realizar sea del más mínimo riesgo para los estudiante o personas que
laboran y el medio ambiente que os rodea. Con estas herramientas de seguridad los estudiantes
podrán lograr un ambiente de trabajo adecuado y seguro durante el desarrollo de las prácticas en el
laboratorio de microbiología.
2. COMPETENCIAS
Conocer el concepto de Bioseguridad y las normas básicas de trabajo seguro en el laboratorio.

Capacidad de abstracción análisis y síntesis.
Capacidad de relacionar los conceptos de bioseguridad, y trabajo seguro en laboratorios de
Microbiología
Reconocer la utilidad, tipos, composición, métodos de preparación, esterilización, y manejo de medios
de cultivo en los laboratorios de microbiología.
3. MARCO TEÓRICO
La BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO se refiere al conjunto de medidas preventivas,
destinadas a proteger la salud de las personas que allí laboran. El propósito básico es obtener un
ambiente de trabajo seguro y ordenado (Rojas 2011). Por otra parte, en los laboratorios de
microbiología se realizan técnicas de esterilización para que el desarrollo de sus técnicas arroje
resultados confiables una deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo
conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se
requieren buenas prácticas de laboratorio para su manejo (BPL).
Como principios de bioseguridad podemos decir que la seguridad biológica o bioseguridad, es la

aplicación del conocimiento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición
del personal del laboratorio y medio ambiente a agentes potencialmente biopeligrosos. Los agentes
Biopeligrosos son aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos
para el hombre, animales y plantas; entre ellos podemos citar, bacterias, virus, parásitos, hongos,
productos recombinantes, alérgenos, priones entre otros.
Según (Escobar, 2002), el objetivo de la bioseguridad es garantizar la protección contra infecciones

del personal que trabaja en ellos, así como su extensión, a la comunidad y al medio ambiente.
Normas generales para el trabajo en el laboratorio de microbiología
1. Ingrese al laboratorio con bata blanca, manga larga, abotonada y limpia.

2. Está prohibido introducir, consumir alimentos, y bebidas dentro del laboratorio.
3. Está prohibido fumar.
4. No colocar sus pertenencias (libros, celulares, maletas, computadores, cascos etc.) sobre
las sillas o mesones de trabajo. Las personas con cabello largo lo deben recoger al inicio de
las actividades.
5. Utilice zapatos cerrados, las uñas de las manos cortas y sin esmaltes.
6. Evite el contacto con el material infeccioso o de potencial de serlo con la piel.
7. Los derrames y acciones deber ser inmediatamente informados al auxiliar de laboratorio, no
intente limpiar usted.
Procedimientos de laboratorio
1. Lave correctamente las manos al iniciar y al terminar cada sesión práctica.

2. Cuando utilice el mechero asegúrese de que la llama siempre sea azul, manténgalo alejado
al microscopio y otros equipos, al apagarlo asegúrese de cerrar perfectamente la llave de
paso del gas.
3. Siempre deje limpio todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas, autoclaves etc.),
y reporte al auxiliar de laboratorio toda irregularidad en el funcionamiento de los equipos.
4. Al terminar la práctica, deje todo el material de vidrio y otros, perfectamente limpio y
ordenado sobre el mesón, en las mismas condiciones en el que lo encontró.
El principal objetivo de la Bioseguridad es la contención, teniendo en cuenta los niveles de

patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras procesadas en el
laboratorio; el centro de control de enfermedades (CDC) y el Instituto Nacional de Salud,
(INS), han establecido cuatro niveles de seguridad biológica, y han determinado las normas
específicas para trabajo en cada uno de ellos, teniendo en cuenta cuatro aspectos
importantes: técnica microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de las instalaciones
(Rojas, 2011).
Tabla 1. Niveles de Seguridad Biológico.
Nivel de Nivel de Nivel de Nivel de
Seguridad seguridad seguridad seguridad
Biológica I Biológica II Biológica III Biológica IV
Seguridad Seguridad Con De elevado
requerida para los requerida para microorganismos y riesgo individual
agentes no manipulación de muestras de alto y comunitario.
patógenos bien microorganismos y riesgo, que pueden Es el nivel
conocidos o muestras con un causar la muerte. requerido
patógenos potencial de riesgo Requiere el uso cuando se
oportunistas; es el moderado a alto, obligatorio de sospecha de un
nivel utilizado es el caso de cabinas de agente patógeno
comúnmente en laboratorios de seguridad. Solo infeccioso, que
los laboratorios de diagnóstico puede realizar produce alta
prácticas en microbiológico. procedimiento mortalidad y
universidades o Los agentes personal calificado. para el que no
industrias patógenos pueden existe
alimentarias. Los provocar tratamiento.
microorganismos enfermedades a
tienen poca seres humanos o
probabilidad de animales pero que
provocar tienen pocas
enfermedades en probabilidades de
el ser humano o entrañar un riesgo
los animales. grave para el
personal de
laboratorio. La
exposición en el
laboratorio puede
provocar una
infección grave,
pero existen
medidas
preventivas y
terapéuticas
eficaces y el riesgo
de propagación es
limitado.
Fuente: Escobar, 2002.
Para brindar mayor protección a las personas que realizan investigación, microbiológica, los
laboratorios deben estar dotados de cabinas de seguridad dotados con filtros HEPA (, del inglés
"High Efficiency Particle Arresting", o "recogedor de partículas de alta eficiencia") a partir de segundo
nivel de aseguramiento de calidad (nivel de contingencia II), con el fin de reducir la cantidad de
alérgenos presentes en el aire.
Aun riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad practica
en el laboratorio, donde se requiere de la manipulación de cultivos de microorganismos pudiendo
alcanzar concentraciones elevadas causando infecciones si no son manipuladas correctamente.
Para la bioseguridad en el laboratorio de microbiología es fundamental disponer de concomimientos

básicos de Esterilización y desinfección. Teniendo en cuenta que los objetos muy sucios no
pueden desinfectarse o esterilizarse rápidamente, es igualmente importante comprender los
conceptos básicos de limpieza previa. A este respecto, los siguientes principios generales se aplican
a todas las clases conocidas de microbios patógenos.
Los requisitos particulares de la descontaminación dependerán del tipo de trabajo experimental y de
la naturaleza de los agentes infecciosos que se estén manipulando. Los tiempos de contacto con
los desinfectantes son distintos para cada material y cada fabricante, por lo tanto, en este caso se
deben seguir las instrucciones del fabricante.
El termino ESTERILIZACIÓN lo podemos definir como un método de eliminación total de todo tipo
de organismos que asegura la USENCIA ABSOLUTA de cualquier forma de vida.
Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo, conlleva a

contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello se requieren buenas
prácticas de laboratorio para el adecuado manejo.
Definiciones
A continuación, identificaremos los términos más comunes en el campo de la bioseguridad.
Antimicrobiano: Agente que mata a los microorganismos o suprime su crecimiento o proliferación.

Antiséptico: Sustancia que inhiben el crecimiento o desarrollo de microrganismos, pero no
necesariamente los mata. Los antisépticos suelen usarse a las superficies corporales.
Biocida: Termino general para cualquier agente que mate microrganismos.
Descontaminación: Cualquier proceso utilizado para eliminar o matar microrganismos. También se
utiliza para referirse a la eliminación o neutralización de sustancias químicas peligrosas y materiales
radioactivos.
Desinfección: Medio físico o químico para matar microrganismos, pero no necesariamente esporas.
Desinfectante: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizadas para matar microrganismos,
pero no necesariamente esporas. los desinfectantes suelen aplicarse a superficies u objetos
inanimados.
Esporicida: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizadas para matar microorganismos y
esporas.
Esterilización: Proceso que mata o elimina toda clase de microrganismos y esporas.
La esterilización por calor seco o húmedo, son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el
laboratorio de microbiología.
El calor seco destruye a los microrganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a
la flama de u mechero o en un horno a 150ºC-180ºC durante dos horas. Estos métodos se aplican en
la esterilización de asa de inoculación y para todo tipo de materiales de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplica
para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos
que se desechan.
El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 libras); con esta
presión el material alcanza una temperatura de 120 ºC y se mantiene durante 15 minutos, variables
que asegurarán la inactivación de endosporas que son las estructuras bacterianas más resistentes al
calor.
Como en los estudios de la microbiología se requiere de la esterilización de espacios, superficies y

materiales de naturaleza diversa (plásticos, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para
desechar etc..), existen diferentes métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de materiales
requeridos.
Tabla 2. Métodos de esterilización
Métodos físicos Calor Húmedo Vapor a presión
(autoclave)
Aire caliente (horno)
Seco Flameado
Incineración.
Filtración Membranas o filtros absolutos
Flujo laminar
No Rayos ultravioloeta
ionizantes
Rayos infrarrojos
Radicaciones
Ionizantes Rayos X
Rayos (cobalto-60)
Radiación electrónica de alta energía.
Métodos Químicos Gases Óxido de etileno
Líquidos Formaldehido
Fuente: (Aquiahuatl, y otros, 2012
Tratamiento en autoclave
La aplicación de vapor de agua saturado a presión (tratamiento en autoclave), es el medio más

eficaz y fiable de esterilizar material del laboratorio. Para la mayoría de los propósitos, se describe a
continuación el equipo de la autoclave:
La autoclave consta de dos recipientes metálicos, adaptado uno dentro del otro, siga las siguientes
indicaciones para su uso:
1. Coloque agua en la olla hasta cubrir la resistencia (no colocar agua en el recipiente interno
también llamado camisa), el nivel del agua debe mantenerse también en cada ciclo de la
esterilización.
2. Coloque el material a esterilizar dentro de la camisa, colocando previamente la rejilla en el
fondo, en forma ordenada y sin recargarla para permitir el flujo adecuado de vapor.
3. Introduzca la camisa.
4. Tape la autoclave haciendo coincidir las flechas impresas en la tapa y la autoclave, insertando
el flujo flexible en el canal dispuesto en la pared interior de la camisa.
5. Aprete los tronillos haciendo cierre lateral, simultaneo y uniforme. No use llaves para apretar
y mantenga las superficies de contacto de la tapa y el borde interno de la autoclave, limpio.
6. Abra la válvula de seguridad colocándole en posición vertical. El vapor generado en la base
del esterilizador, pasa hacia arriba y por fuera del recipiente y luego hacia abajo a través del
material a esterilizar, hasta la base del recipiente, empujando hacia a fuera desde la base a
través del tubo flexible de escape y la válvula de seguridad; es muy importante que la corriente
de vapor elimine por completo al aire de la cámara de lo contrario la temperatura alcanzada
es mucho menor.
7. cuando el vapor escape vigorosamente debe colocar la válvula en posición horizontal.
8. A partir de entonces la presión y la temperatura empezaran a aumentar, lo cual se verá
indicado en la aguja del manómetro.
9. Permitir que la aguja llegue a 121ºC y 15 libras de presión, es a partir de este momento que
se empieza a contabilizar el tiempo de esterilización.
10. Tenga en cuenta los siguientes tiempos de esterilización: 10-15 minutos para material limpio;
30-40 minutos para material contaminado.
11. Al terminar el periodo de esterilización, apague la autoclave y permita que el manómetro baje
a cero, luego, levante la válvula para que escape el vapor restante y proceda a destapar la
olla desenroscando los tornillos opuestos en forma simultánea.
Precauciones en el uso de las autoclaves.
Las siguientes instrucciones pueden reducir al mínimo los riesgos derivados del manejo de cualquier
recipiente a presión.
1. El manejo del equipo debe ser responsabilidad de personas adiestradas.

2. Se debe realizar un programa de mantenimiento preventivo que comprenderá la inspección
de la cámara, el sellado de las puertas y todos los calibradores y controles por parte del
personal calificado.
3. El vapor de agua estará saturado y exento de sustancias químicas (sustancias que causen
corrosión), que podrían contaminar los objetos que se están esterilizando.
4. Todo el material debe colocarse en recipientes que permitan una fácil evacuación del aire y
una buena penetración del calor; la cámara no estará sobrecargada, de modo que el vapor
alcance por igual a toda la carga.
5. En las autoclaves que no dispongan de un dispositivo de seguridad que impida que la puerta
se abra cuando la cámara está sometida a presión, es indispensable que la válvula central del
vapor esté cerrada y que se deje descender la temperatura por debajo de 80ºC antes de abrir
la puerta.
6. Cuando se introduzcan líquidos en la autoclave, la evacuación debe ser lenta, pues al sacarlos
pueden hervir debido al sobrecalentamiento.
7. El operador de la autoclave, debe llevar guantes y viseras de protección adecuada al abrir la
autoclave, incluso luego de bajar la temperatura a 80ºC.
8. Se debe verificar el funcionamiento colocando indicadores biológicos.
Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores
físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo
y es necesario saberlas para poder cultivarlos en el laboratorio. (Rojas 2011).
Los Medios de cultivo: Son ambientes artificiales, semejantes a su medio natural, elaborados con los
nutrientes apropiados para cada microorganismo y las condiciones ambientales favorables de pH,
presión osmótica, gases, humedad, etc., con el propósito que puedan vivir o desarrollarse. (Escobar,
2002).
El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un microorganismo en particular,

debe satisfacer las necesidades nutricionales, con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer
adecuadamente en el laboratorio. De manera general, estos medios pueden ser medios artificiales o
medios químicamente definidos.
Para los medios químicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos
puros que lo conforman, ya sean de tipo orgánico como los de tipo inorgánico. Los medios artificiales
están compuestos de un número limitado de sustancias complejas, como extractos de plantas o de
animales cuya composición química exacta o se conoce. De acuerdo a lo anterior. De acuerdo a lo
anterior, los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales en los medios
de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse. (Rojas, 2011).
Los medios de cultivo aportan a los microorganismos:
1. Una fuente de carbono: El carbono es el componente esencial y central para conformar la

estructura celular y permitir a la célula realizar todas las funciones. Según la fuente de
carbono, los microorganismos se encuentran divididos en dos grupos: loa autótrofos, y los
heterótrofos. Los autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan como fuente de
carbono únicamente compuestos inorgánicos (utilizan principalmente el dióxido de carbono –
CO2 como carbono inorgánico. Los heterótrofos en su lugar necesitan suministro de carbono
orgánico (glucosa u otro carbohidrato).
2. Una fuente de nitrógeno: Elemento esencial para que la célula construya macromoléculas
como: proteínas y ácidos nucleicos. Algunos microorganismos usan nitrógeno atmosférico,
otros emplean sales de nitrato o de amonio como compuesto inorgánico, así como otros
requieren compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como los aminoácidos.
3. Elementos no metálicos: iones no metálicos como el azufre y el fosforo. El azufre puede
encontrarse con proteínas, sulfatos o como azufre elemental; mientras que el fosforo puede
encontrarse formando sales.
4. Elementos metálicos: (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2, Fe+3). llamados también
micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales inorgánicas
adicionadas a los medios y los cuales son tomados en bajas concentraciones por los
microorganismos.
5. Vitaminas: Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos
de síntesis de las mismas. Algunos microrganismos poseen una variedad de vías para
sintetizar vitaminas; mientras otros, sintetizan un número muy limitado de ellas a partir de
componentes del medio. Otros las requieren como suministro.
6. Agua: Los microorganismos necesitan grandes cantidades de agua. Algunas excepciones
se pueden considerar como organismos acuáticos, requieren cierto grado de humedad para
crecer. Definiendo el concepto de agua, podemos decir que: Es el principal constituyente de
protoplasto bacteriano, es el medio universal donde ocurren las reacciones bilógicas, es un
reactante en exceso, es decir, un producto resultante de algunas reacciones químicas.
Conocer sobre la nutrición microbiana permite el cultivo de los microrganismos en el

laboratorio. Todos los microrganismos tienen parecidos requerimientos de macro y micro
nutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado varía
mucho entre unas bacterias y otras, como la cantidad relativa de cada nutriente. Los
microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de recetas o
formulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo.
Un medio de cultivo es una solución acuosa incorporada a un coloide en estado de gel en

las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de unos
determinados microorganismos.
La presentación comercial de los medios de cultivo sintéticos y deshidratados puede ser en

polvo o granulados. en el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios
servidos en placas de Petri o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son elaborados a partir de materias prima sometidas a
molienda, mezclado, pulverizado y granulación (aglutinación de la mezcla pulverulenta).
Propiedades de os medios de cultivo.
1. Humedad: Indispensable para el crecimiento de los microorganismos, su carencia

(desecación) puede llevar a la muerte de los microorganismos.
2. Fertilidad: Se refiere a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento
bacteriano.
3. pH: Se refiere a los pH óptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable para su
aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento.
4. Transparencia: Permite la observación microbiológica, evidenciar morfologías y
físicamente su crecimiento en medios de cultivos adecuados.
Tabla 3. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico, composición
y propósito.
Clasificación Estado/composición/objetivo Descripción
Según su Solidos 1.5-2.0% de agar-agar
estado físico Semisólidos 0.5% de agar-agar
Líquidos No contiene agar-agar
Bifásicos Contiene fase sólida y liquida.
Naturales Utilizados para cultivar
microorganismos tal y como se
encuentran en la naturaleza. Se usan
con base en la experiencia y no a su
composición.
Ej.: sangre diluida, leche, jugos
vegetales.
Según su Sintéticos De composición exactamente
naturaleza o conocida, los más utilizados son los
composición. medios comerciales deshidratados.
Vivos Contienen células vivas u organismos

vivos.
Medios Con adición de
enriquecidos sangre, suero o
extractos de
tejidos de
ani8males o
plantas al caldo o
agar,
proporcionando
sustancias
nutritivas,
completamente
Según su Aislamiento de para el
propósito microrganismos crecimiento de
los
microorganismos
existentes.
Medios Con adición de

selectivos algunas
sustancias que
NO permiten el
desarrollo de un
grupo de micro-
organismos y sin
afectar el
desarrollo de los
grupos de interés.
En principio se
pueden se-
leccionar los
microrganismos
que se desarro-
llan en medios
orgánicos poco
comunes, caso en
el cual se omiten
otros compuestos
de car-
bono
Medios Contienen reactivos
diferenciales químicos que traen
como resultado,
determinado tipo de
crecimiento
bacteriano,
después de la
incubación
(observa- ción de
hemólisis,
coloraciones de las
colonias
de las colonias y
otras reacciones
indicadoras)
Fuente: Rojas, 2011.
4. EQUIPOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

CANTIDAD DESCRIPCIÓN
1 Balanza de precisión.
1 Estufa eléctrica
1 Autoclave
5. MATERIALES A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

2 Cajas de Petri estériles
2 Tubos de ensayo estériles tapa rosca.
2 Pipetas de 10 ml estériles.
1 Erlenmeyer de 250ml
2 Probetas de 50ml
1 Mechero Bunsen.
1 Espátula.
6. REACTIVOS REQUERIDOS
1 Medios de cultivos deshidratados (simple, selectivos o diferencial).
150 Ml de agua destilada.
1 Alcohol al 70%
1 Toallas desechables
1 Cintas de enmascarar.
7. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Lea las indicaciones de preparación del medio de cultivo comercial asignado a su grupo (gramos
de medio deshidratado a pesar por cada litro de agua destilada).
2. Realice los cálculos matemáticos para 100mL de medio de cultivo
3. Desinfecte el área de trabajo con alcohol al 70% y una toalla desechable
4. Pese la cantidad de medio de cultivo calculada
5. Mida el volumen del agua destilada con la probeta
6. Mezcle el medio de cultivo con la mitad del agua, agite suficiente y agregue el agua restante.
7. Agite hasta obtener una solución homogénea y caliente la solución hasta hervir (preferi-
blemente). Este procedimiento se realiza en un agitador magnético con plancha de ca-
lentamiento.
8. Lleve el Erlenmeyer previamente cubierto y marcado a la autoclave, deje que la autoclave se
caliente hasta alcanzar 121°C o 15lb/in2 de presión y mantener estas condiciones durante 15
minutos. Revisar continuamente el manómetro.
9. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje a cero, por seguridad abra la válvula
10. Con la ayuda de guantes de asbesto, abra cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para
evitar que el vapor caliente cause quemaduras
Nota: Para la manipulación de la autoclave siga detalladamente las siguientes instrucciones

dadas.
PROCEDIMIENTO 2:
VERTIDO DE LOS MEDIOS EN CAJAS DE PETRI Y SOLIDIFIACION
1. Enfrié los medios de cultivo de los Erlenmeyer hasta una temperatura de aproximada mente 45-
50°C, temperatura que puede resistir en sus manos sin quemarse.
2. Limpie el área de trabajo con alcohol al 70%, encienda el mechero y ubíquelo a una distancia
de 50cm.
3. Vierta entre 20-25mL directamente del Erlenmeyer a en cada caja Petri siempre en el área
aséptica.
4. Para el caso de los tubos, con ayuda de una pipeta estéril sirva entre 5 a 6ml de medio de
cultivo, tápelos y ubíquelos en una superficie inclinada.
5. Para el caso de los tubos, con ayuda de una pipeta estéril sirva entre 5 a 6ml de medio de
cultivo, tápelos y ubíquelos en una superficie inclinada.
PROCEDIMIENTO 3:
PRUEBA DE ESTERILIDAD
1. Lleve los tubos y cajas de Petri a la incubadora durante 24 horas a 37 °C

2. Transcurrido el tiempo de incubación, observe posible crecimiento microbiano en el medio.
3. Tome nota de los resultados y fotografías
PROCEDIMIENTO 4:
PRUEBA DE EFECTIVIDAD
Para comprobar que el medio preparado es adecuado para ser utilizado en el crecimiento de
microorganismos.
1. Abra las cajas de Petri con medio de cultivo estéril sobre una superficie del laboratorio durante
10 minutos.
2. Coloque las cajas de Petri en la incubadora a 37°C durante 24horas, colocando la tapa hacia
abajo.
3. Transcurrido el tiempo de incubación, revise las cajas de medio y determine el crecimiento
microbiano, formación de colonias microbianas en la superficie de los medios sólidos.
8. PREGUNTAS
1. Complete la tabla con resultados obtenidos en la prueba de esterilidad y efectividad.

2. Discuta los resultados obtenidos con base en la efectividad de la esterilización y el manejo del
material.
3. Consulte qué métodos de esterilización serían los más adecuados para las siguientes muestras
ambientales:
a. Un medio solido o liquido contaminado con Escherichia coli, Salmonella sp.
b. Una muestra de agua residual doméstica.
c. Tejidos de procedencia animal.
d. Un suelo inoculado con patógenos de plantas.
4. ¿Cuáles son los requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano?
5. ¿En qué nivel de enseñanza se ubica un laboratorio básico de enseñanza y qué equipos de
seguridad necesita? (Revisar Manual de Bioseguridad OMS)
6. ¿Cuál es el símbolo de peligro biológico?
7. ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización? (ejemplo de c/u).
Tabla. 1. (Titulo).
Nombre del Esterilidad Aspectos de Efectividad Aspectos de Registro
medio de (UFC) las colonias (UFC) las colonias fotográfico
cultivo
Fuente:
9. BIBLIOGRAFÍA
Manual de Bioseguridad en el laboratorio, tercera edición. OMS, Ginebra 2005.
Organización Mundial de la Salud 2005, Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. [En línea]. Ginebra- Suiza. Ediciones de la
OMS. [Consultado Agosto, 2012]. Disponible en internet<
http://whqlibdoc.who.int/publications/200 5/9243546503_spa.pdf>
Tortora, Funke, Case, 2007, Introducción a la microbiología, Buenos aires: Medica, Panamericana.
Elaborado CLARET CARREÑO SOLANO 23 07 2018

Revisado Unidad de Ciencias Básicas 23 07 2018
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRÁCTICA NO. 2 TÍTULO: FROTIS BACTERIANO, COLORACION DE GRAM Y USO DE

MICROSCOPIO
10. INTRODUCCIÓN
En esta práctica observaremos a través del microscopio óptico estándar células bacterianas; pero para poder
realizar esta actividad debemos tener en cuenta, que casi todos los microorganismos son casi incoloros cuando
se observan a través de este instrumento ocular, por esta razón debemos someter las células a tinción
(coloración).
La palabra microscopia deriva del vocablo latino micro, que significa pequeño y del vocablo griego skopos,
que significa mirar. Los microbiólogos modernos utilizan microscopios que producen aumentos de diez a miles
de veces que los lentes simples.
Algunos microrganismos se visualizan con mayor rapidez por su tamaño o por que presentan características
más fáciles de detectar. Sin embrago, muchos otros organismos como las bacterias son sometidos a diversos
procedimientos de tinción para que sus paredes celulares, sus capsulas y otras estructuras pierden su estado
natural incoloro. En esta práctica, se explicarán algunos métodos utilizados con mayor frecuencia para la
preparación de las muestras que se van a examinar con el microscopio. Los microorganismos y sus
componentes estructurales se miden en unidades aún más pequeñas, como los micrómetros y los nanómetros.
Un micrómetro (um) es igual a 0,000001m (10-6m), (Tortora, 2007), por tal fundamento es muy indispensable
el uso del microscopio para el estudio de estas células microbianas.
Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por los
que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste entre
las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.
11. COMPETENCIAS
1. El estudiante estará en capacidad de realizar un frotis bacteriano a partir de un medio de cultivo solido
o líquido.
2. El estudiante aplicar la técnica de tinción de Gram para la identificación celular microbiana.
3. El estudiante obtendrá la habilidad del manejo del microscopio.
12. MARCO TEÓRICO
La mayoría de las observaciones iniciales de todo microrganismo se realizan con preparados teñidos. El
termino tinción, significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas
estructuras. Sin embargo, antes de teñir los microorganismos se les debe fijar o adherir al portaobjeto. El
proceso de fijación produce la muerte simultanea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos.
Cuando se fija una muestra microbiana se extiende una película delgada del material que contiene los
microrganismos sobre la porta objetos, a esta película, la denominamos extendido, el cual se deja secar al
aire.
FROTIS BACTERIANO:
Otro término utilizado para designar la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de un cultivo para lograr
los resultados esperados en cada una de las tinciones (simples o compuestas bacteriano, con el objetivo de
separar por extensión los microorganismos presentes).
Como ya lo habíamos mencionado, un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los
microorganismos sobre una superficie transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor a
través del mechero Bunsen con el lado del extendido hacia arriba o cubriéndolo con alcohol metílico durante
un minuto. Se aplica el colorante, se lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se realiza la
fijación, el colorante podría arrastrar los microorganismos de la porta objetos. Luego de realizar este
procedimiento, los microrganismos están listos para la observación al microscopio.
Químicamente un colorante se describe como un compuesto orgánico que contienen un grupo benceno y un
grupo cromófobo, así como un auxócromo. Un cromóforo es un grupo químico que imparte color al benceno
(solvente orgánico); mientras que un auxócromo, es un grupo químico que le confiere la propiedad de
ionización al cromógeno capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos.
La habilidad de un colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos

nucleicos, etc.), radica en la carga eléctrica tanto en la porción cromogénica como del componente celular a
teñir.
Los colorantes son sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo, uno de los cuales esta coloreado
y se conoce como cromoforo. El color de los denominados colorantes básicos está en el ion positivo; Los
colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción cromogénica exhibe una carga
negativa que tendrá afinidad por las constituyentes de la célula cargados positivamente. Las proteínas,
componentes celulares cargados positivamente, se unirán y aceptarán el color de un cromógeno anicónico
cargado negativamente de una tinción ácida.
En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el ion positivo coloreado
en un colorante básico es atraído hacia la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos, entre
los que se encuentran el violeta de genciana, el azul de metileno, el verde de malaquita, y la safranina, se
utilizan con más frecuencia que los colorantes ácidos. Estos últimos no son atraídos por la mayor parte de
los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del
colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la estructura bacteriana.
Los preparados bacterianos incoloros contra un fondo coloreado se denomina tinción negativa, una técnica
valiosa para la observación de las formas generales, los tamaños y las capsulas celulares porque las células
resultan muy visibles contra un fondo oscuro que contrasta. Las distorsiones del tamaño
Figura 1. Fijación de frotis Bacteriano
Fuente: (Aquiahuatl, y otros, 2012.
TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS
Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por los que
no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste entre las
células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.
Químicamente un colorante se describe como un compuesto orgánico que contiene un grupo benceno un
grupo cromóforo, así como un auxócromo. Un cromóforo es un grupo químico que imparte color al benceno
(solvente orgánico); mientras que un auxócromo, es un grupo químico que le confiere la propiedad de
ionización al cromógeno capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos.
La habilidad de un colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos

nucleicos, etc), radica en la carga eléctrica tanto en la porción cromogénica como del componente celular a
teñir.
Los colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción cromogénica exhibe una carga
negativa que tendrá afinidad por las constituyentes de la célula cargados positivamente. Las proteínas,
componentes celulares cargados positivamente, se unirán y aceptarán el color de un cromógeno aniónico car-
gado negativamente de una tinción ácida.
Los colorantes básicos son catiónicos, es decir, la ionización de la porción cromogénica exhibe una carga
positiva, lo cual permite una fuerte afinidad por los constituyentes de la célula cargados negativamente. Los
ácidos nucleicos componentes celulares cargados negativamente, se unirán y aceptarán cromógenos
catiónicos cargados positivamente; por ejemplo, el azul de metileno.
Los colorantes básicos son los más comúnmente empleados para tinciones bacterianas, la presencia de
carga negativa en el exterior celular repele los colorantes ácidos y evita su penetración en la célula.
Cuadro 1. Característica de los Colorantes

Benceno Solvente orgánico
(sin color)
Cromoforo Grupo químico que proporciona Cromógeno Colorante
el color al solvente.
Auxòcromo Grupo químico que permite a la
formación de sales y la unión de
los tejidos (intensifica el color).
Fuente: El autor.
USO DEL MICROSCOPIO
Figura 2. Partes de microscopio
Fuente: (Aquiahuatl, y otros, 2012)

PASOS PARA LA OBSERVACIÓN DE MUESTRAS BAJO EL MICROSCOPIO
COMPUESTO
1. Coloque la preparación a observar (porta objeto) sobre la platina y sujétela con las pinzas del carro.
Compruebe previamente que el objeto de menor enfoque se encuentre en posición de enfoque.
2. Realice el enfoque de la muestra, iniciando siempre por el objetivo de menor aumento (4X) así:
a. Gire el tornillo micrométrico para realizar el enfoque grueso de la preparación (observación de la

imagen).
b. Cuando observe la imagen, realice el enfoque girando el tornillo micrométrico, hasta lograr total
claridad de la imagen.
c. Si es necesario, mejore la iluminación de la preparación girando la perilla reguladora del voltaje.
d. Mueva los oculares lateralmente, para ajustar la visión a su distancia interpupilar.
3. coloque el objetivo 10X en posición de enfoque, girando el revolver suavemente. No girando los
mismos oculares, en este caso solo haga uso del tornillo micrométrico para aclarar la imagen. NO
USE EL TORNUILLO MACROMETRICO.
4. Continúe con el objetivo 40X colocándolo en posición de enfoque y suba ligeramente el
condensador. La imagen debe estar casi enfocada (afine la nitidez con el tornillo micrométrico): si la
imagen no está enfocada, devuélvase al objetivo de menor aumento y repita la operación completa.
5. Empleo del objetivo de inmersión (100X).
a. Gire el revolver hacia el objetivo de inmersión o 100X, dejándola medio camino entre éste y el de
40X.
b. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de cuerde que el condensador debe estar
en la parte alta.
c. Termine de girar suavemente el revolver hasta que el objetivo de inmersión que dé en posición de
enfoque.
d. Enfoque cuidadosamente la preparación con el tornillo micrométrico, esta debe estar casi enfocada si
usted ha realizado un enfoque cuidadoso con el objetivo 40X. De no ser así, INICIE EL ENFOQUE DE
LA PREPARACIION DESDE EL OBJETIVO DE MENOR AUMENTO, pero una vez haya aplicado el
aceite de inmersión NO PUEDE VOLVER A ENFO- CAR CON EL OBJETIVO 40X PORQUE LO
MANCHARIA DE ACEITE.
e. Finalmente retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con papel arroz o
papel especial para óptica. Compruebe que el objetivo 40X este también limpio.

1 Microscopio compuesto.

2 Porta objetos por cada integrante del grupo.
1 Asa curva
1 Mechero
1 Set de colorantes de tinción de Gram
Medio de cultivo de crecimiento de colonias bacterianas.
Toallas desechables.
1 Marcador
Alcohol antiséptico 70%
16. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
PREPARACION DEL FROTIS BACTERIANO.
1. Limpie un portaobjetos con alcohol, papel de filtro y flamearlo.

2. Coloque un agua el centro del portaobjetos y con el asa de siembra esterilizada, a la llama del
mechero, tome una pequeña cantidad de colonia bacteriana, colóquela sobre la gota de agua, forme
una emulsión y espárzala sobre el portaobjetos generando un extendido muy delgado.
3. Fije la muestra con calor pasando rápidamente el portaobjetos por la llama del mechero dos veces.
4. Deje secar la preparación a temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO 2:
COLORACION DEL FROTIS-TINCION DE GRAM
1. Coloque el portaobjetos en el lugar dispuesto para realizar la coloración que le indique el auxiliar de
laboratorio.
2. Aplique el colorante Cristal violeta sobre el frotis y deje actuar por 1 minutos (controle el tiempo).
3. Lave con agua de llave y escurra el exceso.
4. Cubra ahora el frotis con lugol y deje actuar por un minuto.
5. Lave con agua de la llave u escurra el exceso.
6. Cubra con solución decolorante (alcohol-acetona) por 30 segundos.
7. Lave con agua de la llave y escurra el exceso.
8. Cubra ahora con colorante de contraste (safranina o Fuschina), deje actuar por 45 segundos.
9. Lave con agua de la llave y escurra el exceso.
10. Permita que la preparación teñida se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada.
PROCEDIMIENTO 3
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.
1. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión, la porta objetos teñido siguiendo siguiendo las
instrucciones dadas en el presente manual.
17. PREGUNTAS
1. Cuál es la utilidad del aceite de inmersión.?

2. ¿Cuáles son los reactivos y tiempos empleados para la coloración Gram?
3. ¿Por qué cree usted, que Escherichia Coli puede adquirir el color de la safranina? ¿De qué está
compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. Que tinciones se usan para la observación de cada una de las siguientes estructuras microbianas:
capsula, flagelos, esporas y gránulos.
5. Diga qué errores evidenciaron durante la practica en el momento de realizar el frotis bacteriano, la
coloración y el manejo del microscopio.
18. BIBLIOGRAFÍA
Tortora, Funke, Case, 2007, Introducción a la Microbiología, Buenos aires: Medica, Panamericana.
Madigan, Michael, 2003, Biología de los Microrganismos, Parson Prentice Hall.
Adsa=Micro, 1991, Medios de cultivo para Microbiología, Barcelona, España, ADSA-MICROBIOLOGIA
Elaborado Claret Carreño solano, Microbiología Esp. 29 07 2018
Revisado Unidad de Ciencias Básicas

PROGRAMA INGENIERIA AMBIEBTAL
METODO PARA LA DETERMINACION DE BACTERIAS

PRÁCTICA NO. 3 TÍTULO: COLIFORMES TOTALES, FECALES POR LA TECNICA DE
DILUCIONES EN TUBOS MULTIPLES (NUMERO MAS PROBABLE
NMP). DE AGUA CRUDA.
19. INTRODUCCIÓN
La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública, ya que ésta puede servir como
vehículo de microorganismos patógenos, es decir, productores de enfermedades llamadas comúnmente "de
origen hídrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos
microorganismos son todos de origen entérico. Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los
depósitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas especies
de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes,
Estreptococos fecales (como Streptococcus faecalis) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del
intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales.
Así pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de contaminación fecal y el
camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las materias fecales .
La OMS incluye dentro del grupo coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram
negativos, no esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la lactosa, a 35 – 37 °C. Las especies
clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes
Escherichia coli, es un microorganismo entero patógeno, que forma la mayor parte de la flora intestinal aerobia
y anaerobia, la cual es eliminada por las heces al exterior, por lo tanto, es muy frecuente que se encuentre en
el medio ambiente, sobreviviendo un tiempo prudente en el agua y en otros medios propicios para su
desarrollo; Debido a estas condiciones, su aislamiento constituye un indicador de contaminación fecal reciente,
influyendo en procesos patológicos como enfermedades diarreicas e infecciones extra intestinales diversas.
Los coliformes totales se encuentran frecuentemente en el medio ambiente, pueden estar en el suelo y en
superficies de agua dulce, por este motivo no se identifican como intestinales, su identificación está dada por
fallas en los tratamientos del sistema de distribución. (IDEAM)
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a
35°C ± 1ºC.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la
lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie
determinada, sin embargo, la más prominente es Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de

cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.
El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra sin diluir que pueden ser volúmenes de 50, 10
y 1 mL, ó de 10, 1 y 0.1 mL, o diluida en caso necesario, en una serie de tubos por triplicado o quintuplicado
con un medio que contiene lactosa (caldo lactosado o caldo lauril triptosa).
La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del NMP supone la utilización
de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua y las cantidades de tubos sembrados en
una ó más series. Realmente consiste en tratar estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada
que resulten positivos después de su incubación.
20. COMPETENCIAS
El estudiante estará en la capacidad de evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la
identificación de microorganismos coliformes totales, fecales y Escherichia coli.
El estudiante estará en la capacidad de interpretar los resultados.
21. MARCO TEÓRICO
Los coliformes pertenecen a la familia de las entero bacterias, están formados por los géneros: Escherichia,
Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter.
La determinación de los microorganismos coliformes totales por el método del número más probable (NMP),
se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y
gas al incubarlos a 36 más o menos 1ºC durante 48 horas, utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares.
Los coliformes son bacilos Gram Negativos, no esporulados, oxidasa negativos, son aerobios y anaerobios
facultativo.
Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.
Para la fase presuntiva se utiliza el medio de cultivo Caldo Lauril sulfato de sodio, el cual permite la
recuperación de los microrganismos dañados presentes en la muestra que son capaces de utilizar la lactosa
como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado
bilis verde brillante, selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microrganismos capaces de tolerar
tanto sales biliares como el verde brillante.
Para la determinación del NMP (número más probable), de microorganismos coliflores fecales, se realiza a
partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias capaces
de fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 más o menos 0.1ºC
por un periodo de 24 a 48 horas.

1 Balanza
1 L Lámpara UV (ultravioleta).
1 Incubadora. 35ºc.
1 Autoclave.
1 Estufa

Materiales N.M.P de coliformes totales.
9 Tubos de ensayo ( por grupo.) de 150 x 15mm (contenido de 10ml de caldo bilis verde brillante
con tubo de fermentación de 70x10mm.
Pipetas de 1ml, estériles.
1 Mechero bunsen
1 Asa redonda.
Campanas Durham.
1 Agitador
Materiales N.M.P coliformes fecales
1 Asa redonda
Baño maría
10 Tubos con 10ml de caldo Bilis Verde Brillante con tubos de fermentación
1 Gradilla (por grupo.).
Tubos con agua de triptona

Caldo Lactosado.
caldo Bilis Verde Brillante con tubos de fermentación
25. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
ANÁLISIS DE AGUA CRUDA
PRUEBA PRESUNTIVA PARA DE COLIFORMES TOTALES
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.

1. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo lactosado, una de doble concentración y las otras dos
de concentración sencilla.
2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 mL.
3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se va a inocular, a
efecto de homogeneizar.
4. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá ser flameada con
objeto de evitar contaminación.
5. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo de doble
concentración, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra en la segunda serie de tubos con concentración
sencilla.
6. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 mL de muestra.
Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga elevada carga bacteriana, solo se inoculan
estas tres primeras series de tubos. En caso contrario, será necesario inocular otras series y por lo tanto,
realizar diluciones de la muestra original.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es
decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de gas en la
campana Durham. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado
de la fermentación de la lactosa en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo y no confundir con
burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes
de proceder a la inoculación y desechar aquellos que contengan burbujas de aire ó de alguna manera eliminar
éstas y así poder utilizarlos.
9. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para
coliformes totales y coliformes fecales.
10.En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos, continuarán
en incubación 24 horas más.
11.Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
12.Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se toman como
negativos.
Para la interpretación de los resultados tenemos en cuenta:
Si el total de tubos son negativos, El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. ·
Los tubos que den positivos para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se procederá a realizar
la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
PROCEDIMIENTO 2:
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos
previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde
Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C. 3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de
gas.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas
Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera positiva, debiendo anotar el número de
tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. · Si en ninguno de los tubos se observa
producción de gas, aun cuando se observe turbidez, se considera negativo.
PROCEDIMIENTO 3
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para
homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de turbidez y gas. (Para confirmar E.coli, se
hacen pasar los tubos por una lampara UV.
Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera positiva, debiendo anotar el número de
tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. · Si no se observa producción de gas, aun
cuando se observe turbidez: Se reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES
Presentación de resultados:
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales:
Deberán establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en la tabla estadística
correspondiente (el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua.). Consultar tabla del NMP.
CONFIABILIDAD
El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por su facilidad y economía. El
resultado de esta prueba se expresa por “el número más probable” (NMP), pero debe entenderse que este
método no es exacto ya que sólo nos da la probable densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una
muestra determinada. La confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza
al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 mL, no obstante, es una indicación importante para
evaluar la calidad sanitaria del agua.
26. PREGUNTAS
1. Consultar los cálculos realizados para obtener el NMP de Coliformes Totales y Fecales en el agua
analizada.
2. ¿Qué características que debe reunir un Microorganismo Indicador de contaminación fecal?
3. ¿El número de Coliformes Totales es siempre mayor que el de Coliformes Fecales; explique esta
afirmación?
4. ¿De acuerdo a la norma colombiana, Cuáles son los límites permisibles en cuanto a Coliformes Totales
y Coliformes Fecales en el agua para consumo humano? (indique la resolucion).
27. BIBLIOGRAFÍA
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas probable,
detección de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia coli por el número mas probable
https://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p17.pdf
Elaborado Claret Carreño Solano DD MM AAAA


ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA: FILTRACION POR
PRÁCTICA NO. 4 TÍTULO: MEMBRANA
28. INTRODUCCIÓN
La presencia de E. coli, es un índice de contaminación fecal en agua, debido a que éste microorganismo es
habitante del tracto digestivo de los animales de sangre caliente.
Escherichia coli genera un peligro a cualquier sistema de suministro de agua ya que su presencia por si sola
puede generar gastroenteritis. La cepa E. coli 0157H7 ha generado una serie de enfermedades
gastrointestinales, así como Shigella, Klebsiella, Salmonella, entre otras.
La identificación de coliformes totales es más difícil, debido a que éstos pueden venir de suelo, y de superficies
de agua dulce por lo que no siempre son intestinales.
La presencia de coliformes indican fallas en la eficacia del tratamiento y en el sistema de distribución.
La filtración por membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan en la superficie de la membrana,

microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del poro 0.45 um, este gracias a que una bomba
eléctrica ejerce una presión diferencial sobre la muestra de agua haciendo que filtre. los contaminantes que
poseen un tamaño menor, que el especifico del poro atraviesan la membrana o se quedan retenidos en su
interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego este es llevado a un medio de cultivo
selectivo (IDEAM)
El cromocult, contiene sustrato el sustrato Salmon GAL-6 cloro-3 indol y BetaDgalactopiranosido es un sustrato
cromo génico que es usado para la detección de la enzima galactosidasa de colonias bacterianas en un ensayo
colorimétrico; que da como resultado el cambio de la colonia a un color rojo salmón esta reacción se observa
cuando hay coliformes totales.
Para diferenciar E. coli de los coliformes totales, se hace por medio del sustrato cromo génico X-Glucorosido,
Que reacciona con la enzima glucoronidasa, pero estas también reaccionan con el sustrato Salmon-GAL
produciendo un color azul violeta en la colonia.
29. COMPETENCIAS
1. El estudiante comprenderá el fundamento de la técnica de filtración a través de membrana para la detección
de coliformes totales y E. Coli en muestras de agua.
2. Determinará la cantidad de coliformes totales y E. Coli de una muestra de agua mediante el método de
filtración a través de membrana.
3. interpretará los resultados con base en una legislación nacional.
30. MARCO TEÓRICO

TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y sabores indeseables y sin embargo estar
contaminada. Esta contaminación puede ser por microorganismos patógenos o dañinos que llegan al agua y
que en un momento dado la hacen peligrosa para consumo humano o animal. La potabilidad de un agua se
puede determinar por pruebas de laboratorio tanto fisicoquímicas como bacteriológicas.
Podría pensarse que la manera más adecuada de determinar si un agua está contaminada por
microorganismos patógenos sería el aislamiento de dichas bacterias, sin embargo, esto no es lo recomendado
debido a varias causas:
Se necesitan varios días para obtener los resultados de los exámenes de laboratorio que determinen con
exactitud la presencia de un microorganismo patógeno específico. Muchas personas podrían haber tomado
agua antes de conocerse los resultados y así haberse expuesto a la infección.
Los organismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por tanto,
pueden no estar o no detectarse en una muestra que se envíe al laboratorio.
Por el contrario, es más sencillo y rápido determinar la presencia o no, de otros microorganismos no patógenos
que comparten algunas veces el mismo hábitat con los patógenos. Por consiguiente, el hallazgo de los
saprófitos indicaría la posible presencia de un patógeno.
Se sabe que los microorganismos patógenos llegan al agua procedentes de las descargas intestinales de los
humanos y los animales. Ciertos tipos de bacterias tales como Escherichia coli y varios microorganismos
afines, denominados Coliformes (además de los estreptococos fecales etc) son habitantes normales del
intestino y en consecuencia siempre están en las materias fecales: de tal manera que la presencia de estos
Coli-formes indica que el agua está contaminada con materia fecal, existiendo por tanto la probabilidad que
cualquier patógeno haya llegado a ella.
Se ha usado por mucho tiempo el grupo de bacterias Coliformes como indicadores de la contaminación del
agua con excretas, éstos gozan de algunas ventajas al compararlos con otros indicadores:
1. Los microorganismos Coliformes, particularmente la Escherichia coli, se encuentra en número muy

grande en el intestino y generalmente sobreviven en el agua durante más tiempo que otros patógenos.
2. Por lo regular una persona sana no elimina microorganismos patógenos, pero puede desarrollar una
infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en materia fecal. Así, la presencia de
Coliformes en el agua, se toma como señal de alarma, pues, ha sido contaminada peligrosamente.
El grupo de Coliformes comprende todas las bacterias en forma de bacilos GRAM NEGATIVOS, que son
aeróbicos o anaeróbicos facultativos, no formadoras de esporas y fermentadores de la lactosa en un tiempo
de 24 a 48 horas a temperatura de 35ºC. Para microbiología de aguas y en relación con la familia
ENTEROBACTERIACEAE este grupo comprende los siguientes géneros: Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter y Klebsiella.
Varias investigaciones hechas en el campo de la microbiología acuática han demostrado que los organismos
Coliformes presentes en el tracto intestinal y por tanto en las heces de animales de sangre caliente,
generalmente incluyen organismos capaces de producir gas a partir de lactosa en un medio de cultivo
apropiado a temperatura de 44.5ºC + 0.2ºC. Organismos Coliformes procedentes de otras fuentes (suelo,
vegetación) no puede producir gas bajo las anteriores condiciones.
La presencia de bacterias patógenas en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente,
que se incrementa en las áreas de mayor densidad poblacional. La técnica de filtración por membrana (MF)
se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de membrana microporosa, en cuya
superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamaño de poro de
0.45 micras ya que la mayoría de los microorganismos tienen un tamaño superior (diámetro). Las membranas
son luego incubadas en un medio especifico, que se selecciona según el tipo de microorganismo que se quiera
detectar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales entre otros) a unas condiciones y tiempo
determinados para el posterior recuento y observación de las colonias.
La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo público establece como
análisis microbiológicos a realizar las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, gérmenes
totales, estreptococos fecales y clostridios sulfito-reductores. El número de determinaciones se establece
para cada tipo de análisis, si este es mínimo, normal o completo.

1 Sistema de filtración y fuente de vacío
Membranas de filtración de 0.45 micras de diámetro de poro.
1 Mechero

REACTIVOS REQUERIDOS
Muestras de agua potable: muestra de agua de la llave (Indicar localización).
33. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
FASE A: MUESTREO Colectar las muestras de agua de la llave de la siguiente manera:
1. Escoger la llave o grifo que estén en buenas condiciones de funcionamiento.

2. Lavarse las manos con agua y jabón.
3. Abrir completamente la llave o grifo y dejar correr el agua por lo menos 3 minutos.
4. Reducir el flujo de agua para permitir la toma de la muestra. - Abrir el frasco y obtener la muestra sin
enjuagar llenando el envase hasta ¾ partes de su capacidad para permitir la agitación de la muestra.
5. Tapar inmediatamente el frasco cuidando cerrar bien para evitar filtraciones.
6. Completar los datos de etiqueta adherida al frasco de muestra.
PROCEDIMIENTO 2:
FASE B. MONTATE DEL SISTAMA DE FILTRACION (VER FIGURA 1)
PROCEDIMIENTO 3:
FASE C. FILTRACION DE LA MUESTRA
1. Limpiar con alcohol la superficie del porta filtros del embudo.

2. Colocar un filtro de membrana al interior del embudo con la ayuda de unas pinzas de acero previamente
flameadas con alcohol.
3. Situar el embudo sobre el soporte hasta que esté fijo.
4. Verter la muestra de agua problema en el embudo (100ml) y aplicar el vacío hasta que el líquido se haya
filtrado.
5. Detener el vacío y extraer el embudo. Con las pinzas flameadas se extrae el filtro del soporte.
6. Se coloca el filtro dentro de una placa Petri sobre el medio de cultivo, con la cuadricula hacia arriba,
procurando que no se formen burbujas entre la membrana y el medio de cultivo.
7. Las placas se llevan a incubar en posición invertida en la estufa: Coliformes totales y E. Coli: 24 horas a 37ºC.
8. Realizar el conteo de las colonias que se desarrollaron sobre la superficie del filtro. El número de colonias
que se desarrollan es el número de microorganismos viables en el volumen de líquido (agua) que se filtró. Los
resultados se expresan en número de microorganismos/100 ml de agua.
Figura.1 Esquema Filtración por Membrana.

Fuente: https://www.google.com.co/searchq=ESQUEMA+DE+FILTRACION+POR+MEMBRANA& rlz
34. PREGUNTAS
Tabla1. (Titulo)
ORIGEN DE (UFC) ASPECTOS UFC) UFC) REGISTRO

LA MUESTRA COLIFORMES DE LAS E. COLI E. COLI FOTOGRAFICOS
(PROMEDIO) COLONIAS (PROMEDIO) (PROMEDIO
CAJA 1
CAJA 2
Fuente:
Preguntas complementarias
1. De qué forma funciona el agar Chromocult, es decir porqué unas bacterias se observan de color
rosadas y otras moradas.
2. ¿En qué consiste la prueba del número más probable (NMP) para el análisis microbiológico del agua?
3. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el método de filtración por membrana respecto al número mas
probable?
4. ¿Cuál es la diferencia entre coliformes totales y coliformes fecales, que tipo de medios de cultivo se
emplean para su identificación y crecimiento, en qué consisten esas medidas?
5. Consultar la normatividad ambiental vigente que establece las características permisibles para agua
de consumo humano en Colombia.
6. De acuerdo a sus resultados y a la pregunta anterior, discuta la calidad microbiológica del agua
procesas.
35. BIBLIOGRAFÍA
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable,
detección de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia coli por el número más probable.
Elaborado CLARET CARREÑO SOLANO DD MM AAAA

PRÁCTICA NO. 5 TÍTULO: ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS
36. INTRODUCCIÓN
Microbiología de suelos
La utilización de microorganismos ha sido considerada como elemento importante en la agricultura, mediante

el entendimiento de su actividad en las propiedades del suelo y en la planta misma. En el sistema suelo ocurren
diversas relaciones entre grupos microbianos que estimulan o inhiben la proliferación de un grupo. La
diversidad microbiana propicia la búsqueda de microorganismos con actividad fisiológica específica. Así
encontramos bacterias y hongos benéficos que mediante su uso es factible la obtención de incrementos
significativos en el crecimiento vegetal y otros beneficios paralelos.
Estos beneficios son mayores cuando la microflora benéfica nativa se encuentra reducida por efecto de
prácticas culturales y de manejo en los cultivos, cuando se introduce en sistemas de producción de plantas que
involucren la esterilización o fumigación del sustrato. De este modo, se asegura que el beneficio que los
microorganismos pueden proveer a sus hospedantes sea rápidamente visible, ya que se favorece su contacto
con las plantas.
37. COMPETENCIAS
El estudiante estar en la capacidad de Realizar la cuantificación de microorganismos del suelo (hongos y

bacterias) mediante la técnica de diluciones y siembra en placa.
38. MARCO TEÓRICO
El suelo es considerado por muchos expertos como el mayor sustrato utilizado para la producción agrícola y,
si bien esta definición es acertada, este sustrato presenta características especiales, por lo que además es
posible definirlo como el sustrato vivo y dinámico más abundante en términos de diversidad biológica, donde
se desarrollan muchas formas de vida, entre ellas las plantas. Aunque no es evidente a simple vista, el suelo
constituye uno de los ecosistemas más variados pues contiene una gran diversidad de organismos vivos.
Si se toma un gramo de suelo es posible encontrar entre 1.000 y 10.000 millones de células, siendo los
microorganismos, los que más abundan tanto en número como en diversidad de especies. Cuando se hace
referencia a bacterias, hongos y virus asociados a la agricultura convencional, generalmente estos organismos
se relacionan con las enfermedades de los cultivos. Sin embargo, en la agricultura ecológica se hace mención
a una trilogía donde coexisten plantas, suelo y organismos en conjunción con factores bióticos y abióticos que
modulan el sistema productivo y en donde con certeza son más las bacterias, hongos y virus benéficos que
los patógenos.
En el suelo conviven seres vivos de diferente tamaño y naturaleza, modificando el ambiente para sostener el
sistema productivo. A diferencia del hombre, que lleva los microrganismos consigo donde quiera que vaya, las
plantas modifican su relación con los microorganismos a lo largo del tiempo debido a los cambios fisiológicos
y por ende a las modificaciones en los metabolitos o productos exudados a traves de la raíz. En presencia de
la semilla y posteriormente de la planta, el ambiente del suelo cambia y se hace favorable para ciertos grupos
de microorganismos, en especial muy cerca de la raíz. Este ambiente se conoce como la rizósfera y provee
condiciones químicas y físicas especiales que favorecen la actividad y multiplicación de ciertos grupos de
microorganismos, mientras la raíz se encuentre activa. A medida que la raíz entra en senescencia, los
exudados cambian y con ellos las especies y actividad de los microorganismos de la rizósfera. (María
Mercedes Martínez, Ph.D, Rodrigo Ortega Blu PhD).
Llamamos suelo a la parte más externa de la corteza terrestre, resultante de la meteorización de las rocas
subyacentes y con unas características claramente diferenciadas de las mismas. Podemos considerar el suelo
como un sistema de interacción entre tres fases bien definidas: una fase sólida, constituida por materia mineral
y orgánica, una fase líquida, y una fase gaseosa o atmósfera del suelo.
El tipo y composición de la materia mineral viene dado por las características de las rocas del subsuelo, así
como de los procesos edáficos que hayan tenido lugar en su formación. La porción inorgánica es muy
importante por su influencia en la disponibilidad de nutrientes, aireación, retención de agua, etc.
La materia orgánica procede de la actividad de los distintos organismos vivos del suelo y su composición y
cantidad es variable, principalmente en función del tipo de cubierta vegetal. El resto del volumen del suelo está
prácticamente constituido por espacios porosos, que a su vez están ocupados por agua y los gases que
constituyen la atmósfera edáfica. La porosidad (cantidad y tamaño de los poros) depende de la textura,
determinada por la cantidad de arena, limo y arcilla, la estructura y el contenido en materia orgánica. Todos
estos factores determinan a su vez el movimiento y capacidad de retención de agua del suelo y la composición
gaseosa de su atmósfera. De forma característica la atmósfera del suelo se encuentra enriquecida en dióxido
de carbono y empobrecida en oxígeno, como resultado de la respiración aeróbica de raíces de plantas,
animales y microorganismos. Sin embargo, cuando se producen condiciones de anaerobiosis (p.e. por
acumulación de agua en los poros del suelo) aparecen en la atmósfera del suelo otros gases como óxido
nitroso, nitrógeno gaseoso y metano, resultantes de actividad respiratoria anaeróbica bacteriana.
Los organismos del suelo no se distribuyen al azar sino que siguen patrones espaciales de agregación, a
escalas diferentes (desde nm a km) que se superponen. Esta estructuración obedece al efecto causado por
diferentes factores de control y es totalmente dinámica (Ettema, et al., 2002). Utilizando técnicas de
observación de secciones ultrafinas de suelo mediante microscopía electrónica, tomografía, análisis
geoestadístico y la elaboración de modelos, especialmente basados en fractales, se ha demostrado que la
distribución de las bacterias edáficas está altamente estructurada, y que esta estructuración es importante
para la funcionalidad del suelo. Las bacterias se organizan en microcolonias compuestas de pocas células que
pueden pertenecer a diferentes morfotipos (Nunan, et al., 2003). Factores como la presencia de raíces,
pequeños agregados, nutrientes y poros parecen gobernar la distribución de bacterias en microhábitats.
La complejidad del suelo como ecosistema (nivel microscópico incluido) junto con las especiales
particularidades de los microorganismos, tales como su tamaño microscópico y las dificultades para una
diferenciación basada en su morfología, habían proporcionado una visión del mundo microbiano edáfico como
una “caja negra” de la cual se sabía que cumplía una función aunque no se conociese su contenido (Insam,
2001)

1 Incubadora
1 Microscopio

1 Matraz de Erlenmeyer.
pipetas
Tubos de ensayo
Cajas de Petri
1 Mechero
1 Varilla de vidrio

Muestra de suelo
Solución salina isotónica
Alcohol
42. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
1. En condiciones estériles, adicionar 11 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca
con 99 ml de solución salina isotónica estéril. Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación vigorosa.
2. Agitar y tomar 1 ml de la solución de suelo preparada anteriormente y transferirlo a un tubo con 9 ml de
solución salina estéril o medio líquido (dilución 1:10). Agitar y tomar 1 ml de la solución 1:10 y transferirlo
a un tubo con 9 ml de solución salina estéril o medio líquido (dilución 1:100). Realizar diluciones sucesivas
utilizando el mismo procedimiento hasta obtener la dilución 1:100.000 aproximadamente. Se puede utilizar
la misma punta o pipeta estéril en cada paso cuidando de no tocar con ella otras superficies para no
contaminarla.
3. Seleccionar tres diluciones próximas, Agitar y tomar 0.1 ml de cada dilución seleccionada y colocarla en
el centro de la superficie del medio de cultivo.
4. Extender homogéneamente la alícuota en la superficie del medio con una varilla de vidrio previamente
esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su enfriamiento).
5. Incubar las placas de forma invertida a 30 ˚C en ausencia de luz.
6. Después de un periodo de incubación de 24 a 48 horas, contar el número de colonias y reportar como
unidades formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.
Cálculos
1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH). Donde: UFC/
g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco. NC= número de colonias en una caja. FD = factor
de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la que se inocula la caja.
Ejemplo:
Una dilución 1:10 se puede representar como 1/10

Una dilución 1:100 se puede representar como 1/100 etc.
El factor de dilución indica el numero de veces que se ha diluido la muestra, y se calcula como el
inverso de la dilución:
El factor de dilución para una dilución 1/10 = 10 El factor de dilución para una dilución 1/100 = 100 V= volumen
inoculado en la caja = 0.1 ml. P = peso de la muestra húmeda = 11 g. FH = factor de corrección de humedad
(1-(%humedad/100)). En nuestro caso emplearemos un FH de 1. Manual de Prácticas de
PROCEDIMIENTO 2:
Para hongos se realiza el mismo procedimiento, empleando el agar Saborout, la variante empleada es la
siguiente:
Técnica de placa profunda:
1. Se realizan los mismos pasos descritos a partir del numeral 3, pero se inocula 1 ml de muestra antes
de verter el agar, utilizando las mismas diluciones de suelo preparadas en el paso 2 del procedimiento .
2. Una vez servida la muestra se sirve el agar fundido a una Temperatura promedio de 35°C y se procede
a agitar cuidadosamente la placa y dejar gelificar. Posteriormente se incuba a 30°C de 3 a 5 días.
Reportar los resultados teniendo en cuenta la ecuación indicada.
43. PREGUNTAS
1. Por que se debe hacer diluciones seriadas a partir de la solución de suelo? (ver paso 2 del procedimiento)
2. Explique cual es el propósito de cultivar muestra de diluciones de suelo próximas en los medios de cultivo?
(ver paso 3 del procedimiento)
3. Explique las razones por las cuales los hongos y no las bacterias del suelo son cultivados mediante la
técnica de placa profunda.
4. En qué consiste la técnica del Número Mas Probable para la cuantificación de microorganismos del suelo?
44. BIBLIOGRAFÍA
Michael, Madigan,Martinco, 2003, Biología de los Microrganismos, Pearson Educación.
Ecosistema, Revista Científica y medio ambiente, http://www.redalyc.org/pdf/540/54014206.pdf
Elaborado CLARET CARREÑO SOLANO DD MM AAAA


PROGRAMA INGENIERIA ABIENTAL
ANALISIS MICROBIOLÓGICO DEL AIRE TECNICA DE
PRÁCTICA NO. 6 TÍTULO: SEDIMENTACION
45. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos presentes en el aire del interior de los edificios (casas, escuelas, empresas, hospitales
etc.) pueden proceder del hombre, del aire exterior, polvo, madera, pintura, papel, humidificadores y otros, y
han sido estudiados desde hace tiempo.
El grado de contaminación microbiana en estos ambientes está influenciado por factores tales como la
frecuencia de ventilación, el número de personas presentes en la sala y la naturaleza y grado de las actividades
que realizan los individuos dentro de los locales. En las industrias también han sido estudiados los
microorganismos del aire por su interés sanitario o por la alteración que pueden causar en los productos que
en ellas se fabrican.
Para el Recuento de microorganismos Se utilizará el método de sedimentación en cajas de agar que consiste
en exponer cajas con un medio nutritivo solido al ambiente en un periodo determinado incubar las cajas,
hacer el recuento de las colonias obtenidas.
Con este método se detectan los microorganismos que caen sobre la superficie de la placa, lo cual simula lo
que ocurre normalmente cuando estamos trabajando en el laboratorio. Como las condiciones ambientales
influyen en la sedimentación de los microorganismos es necesario que, cuando se realiza este método, las
placas se expongan siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para poder comparar los
resultados obtenidos.
46. COMPETENCIAS
El estudiante estará en la capacidad de Realizar análisis microbiológico del aire empleando la técnica de
sedimentación y proponer posibles soluciones.
47. MARCO TEÓRICO
Análisis microbiológico del Aire
Lucretius en el año 55 a.C. observó las partículas de polvo brillando en un rayo de sol en una habitación oscura
y concluyó que debían ser corpúsculos flotando en el aire; aunque fue necesario esperar hasta el
descubrimiento del microscopio para ver que en el aire había microorganismos vivos. Las esporas de los
hongos fueron vistas por Valerius Cordus en el siglo XVI, pero fue Micheli quién primero las dibujó observando
las esporas de los mohos que se transmitían por el aire. Leeuwenhoek observa y describe por primera vez las
bacterias en distintos ambientes y supone que “Estos animálculos pueden ser transportados por el viento
mediante el polvo que flota en el aire”.
En 1855 Gaultier de Claubry inauguró una investigación científica en la que estudió los microorganismos
reteniéndolos al hacer borbotear el aire en agua destilada. Pero fue Pasteur el que perfeccionó estos
procedimientos realizando los primeros estudios precisos de las bacterias en el aire, demostrando así la no
existencia de la generación espontánea.
En aquella época uno de los motivos que incentivaron el estudio de los microorganismos del aire fue descubrir
la causa de algunas enfermedades; como la epidemia del cólera que apareció en Europa en 1847. Varias
investigaciones se realizaron para descubrir en el aire de los hospitales los gérmenes causantes de esta
enfermedad.
Pierre Miquel fue sin duda el investigador que más estudió los microorganismos en el aire, realizando
numerosos ensayos y creando una gran variedad de métodos de análisis, además de determinar la influencia
de los diversos factores (temperatura, lluvia, corrientes de aire, altitud, número de personas etc.). En 1882
demostró que a medida que aumenta la altitud, disminuye el número de microorganismos. Para la época lo
más difícil fue determinar el tipo de bacterias presentes en el aire, fueron Miquel y Cambert en 1901 quienes
afirman que la mayoría de bacterias son saprófitas y proceden del suelo, encontrando una gran variedad,
siendo las más frecuentes las bacterias cromógenas, los bacilos esporulados y los cocos.
La hipótesis de la existencia de bacterias en el aire llevó a Lister en 1867 a la utilización de pulverizaciones

del aire con ácido carbólico para evitar la infección de las heridas quirúrgicas, comenzando así la época de la
antisepsia en la cirugía. Posteriormente se demostró la presencia de varias bacterias patógenas, como
Staphylococcus aureus, Streptcoccus pyogenes, Mycobacterium tuberculosis, etc. Y que, por lo tanto, a través
de el podían transmitirse enfermedades infecciosas.
La década de los años cincuenta se caracterizó por la aparición de una ciencia multidisciplinar, la Aerobiología,
en la que se estudian los microorganismos del aire desde todos sus aspectos. Varios autores estudian la
supervivencia de los microorganismos en los aerosoles tales como: Bacillus, Echerichia coli, Pseudomonas,
Corynebacterium, Micrococcus, Serratia, Micobacteryum, Staphylococcus etc; algunos hongos como:
Aspergillus y Pestalotia.
Un avance importante para el control de los microorganismos en ambientes cerrados, fue la utilización de los
filtros para el aire de fibra de vidrio o de alta eficacia (HEPA), ampliamente utilizados en hospitales e industria
farmacéutica para conseguir salas o zonas asépticas.
En la década de los setenta surge una mayor preocupación por el control del aire en los ambientes cerrados
principalmente en los hospitales, industrias farmacéuticas y alimentarias. Así por ejemplo en 1969 la OMS
dicta las primeras normas recomendadas para la fabricación y la inspección de la calidad de los medicamentos
en los que se incluye el control microbiano del aire de los locales. Desde entonces el estudio microbiológico
de estos ambientes ha ido en aumento, siendo actualmente práctica habitual e incluso obligatoria, el efectuar
recuentos y controles periódicos del aire en las zonas estériles y limpias de hospitales, industrias de alimentos
y farmacéuticas.
También suelen controlarse otros ambientes cerrados como fábricas de aparatos electrónicos, escuelas y
edificios de oficinas. Este último caso, se debe a que, en los últimos años, se ha descrito una nueva
enfermedad “El síndrome del edificio enfermo” que se produce en los ocupantes de determinados edificios. El
origen de los síntomas, irritación de las membranas mucosas, dolor de cabeza, erupciones y dificultad
respiratoria, no está aún muy claro, pero entre las posibles causas se citan factores ambientales, químicos y
microorganismos.

Incubadora

Cajas de Petri.

Agar Yeast extract o extracto de levadura
Agar Mc Conkey
Agar Plate Count
Coloración de Gram.
51. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO 1:
A. Preparación de los medios de cultivo. Siguiendo las instrucciones del fabricante, prepare una (1) caja de
medio de cultivo estéril; por grupo de trabajo, de cada uno de los siguientes medios de cultivo
a. Agar Yeast extract o extracto de levadura

b. Agar Mc Conkey
c. Agar Plate Count
B. Método de sedimentación
1. Elija un área dentro del laboratorio cuya calidad de aire considere influye directamente en los resultados
obtenidos en las prácticas de laboratorio de microbiología realizadas anteriormente
2. Ubique las tres cajas con los medio de cultivo estériles sobre una superficie del área seleccionada, y en
condiciones de asepsia retire la tapa a las tres cajas de Petri y deje expuestas al medio ambiente por un tiempo
de 15 minutos.
Teniendo precaución de ubicar las tapas boca abajo sobre el mesón de trabajo previamente desinfectado.
3. Transcurrido el tiempo señalado, en condiciones de asepsia tape las cajas y lleve a incubar a 35ºC por 24
horas.
4. Realice el recuento de UFC/15 minutos de exposición
5. Seleccione una colonia por cada medio de cultivo y realice coloración de Gram y lectura respectiva
6. Descarte los medios de cultivo siguiendo las indicaciones del auxiliar de laboratorio
52. PREGUNTAS
1. Que otros métodos pueden ser empleados para el análisis microbiológico de aire y en qué consisten
2. Qué factores determinan la carga microbiana presente en un área determinad.
3. En que consiste el Síndrome del Edificio Enfermo
RESULTADOS
1. Complete la siguiente tabla con la información requerida para sus resultados.
Tabla.1 XXXXXXXX
Medio de cultivo UFC/15min de Observación Observación Lectura

exposición macroscópica Microscópica Coloración de
Gram
Fuente: El autor
2. Discuta sobre los resultados obtenidos, teniendo en cuenta los siguientes aspectos: Recuento
microbiano, calidad microbiológica del aire del área muestreada, tiempo de exposición, tipos de
microorganismos aislados y observados en coloración de Gram vs medios de cultivo empleados.
INFORME DE RESULTADOS: • Para ambientes se hace el recuento y se informa el número. En
caso que no se evidencie crecimiento se informará < 1UFC /placa/minuto.
53. BIBLIOGRAFÍA
Michael, Madigan,Martinco, 2003, Biología de los Microrganismos, Pearson Educación.
Elaborado Claret Carreño Solano DD MM AAAA

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MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

CLARET CARREÑO SOLANO

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERIA

MANUAL PRACTICO DE MICROBIOLOGIA

Yopal julio de 2018

Este manual incluye procesos y técnicas implementadas para la identificación y caracterización

Permitir la comprensión a través de vocabulario, procedimientos de técnicas de cultivo, conceptos

Con estas variables el estudiante estará en la capacidad de reconocer características morfológicas,

1.1 Pictograma de Bioseguridad

Imagen 1. Bioseguridad en Microbiología. Barreras de protección.

1.2 Reglas basicas del laboratorio de microbioplogia.

Cada estudiante debe disponer de su propio Manual de laboratorio de Microbiologia

1.3 Elaboración de informes y pre informes

1.3.1 Pre informe

El pre informe está constituido por:

Formato básico Autor/a de la página. (Fecha de publicación o revisión de la página, si está

F. GUÍA DE LABORATORIO LCB Y FÍSICA

ASIGNATURA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRÁCTICA NO. 1 TÍTULO: BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACION Y MEDIOS DE

En el laboratorio de microbiología se trabaja por definición con microrganismos infecciosos o con

Conocer el concepto de Bioseguridad y las normas básicas de trabajo seguro en el laboratorio.

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Según (Escobar, 2002), el objetivo de la bioseguridad es garantizar la protección contra infecciones

Normas generales para el trabajo en el laboratorio de microbiología

1. Ingrese al laboratorio con bata blanca, manga larga, abotonada y limpia.

1. Lave correctamente las manos al iniciar y al terminar cada sesión práctica.

El principal objetivo de la Bioseguridad es la contención, teniendo en cuenta los niveles de

Para la bioseguridad en el laboratorio de microbiología es fundamental disponer de concomimientos

Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo, conlleva a

A continuación, identificaremos los términos más comunes en el campo de la bioseguridad.

Antimicrobiano: Agente que mata a los microorganismos o suprime su crecimiento o proliferación.

Como en los estudios de la microbiología se requiere de la esterilización de espacios, superficies y

La aplicación de vapor de agua saturado a presión (tratamiento en autoclave), es el medio más

1. El manejo del equipo debe ser responsabilidad de personas adiestradas.

El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un microorganismo en particular,

Los medios de cultivo aportan a los microorganismos:

1. Una fuente de carbono: El carbono es el componente esencial y central para conformar la

Conocer sobre la nutrición microbiana permite el cultivo de los microrganismos en el

Un medio de cultivo es una solución acuosa incorporada a un coloide en estado de gel en

La presentación comercial de los medios de cultivo sintéticos y deshidratados puede ser en

Propiedades de os medios de cultivo.

1. Humedad: Indispensable para el crecimiento de los microorganismos, su carencia

Vivos Contienen células vivas u organismos

Medios Con adición de

4. EQUIPOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

5. MATERIALES A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Nota: Para la manipulación de la autoclave siga detalladamente las siguientes instrucciones

VERTIDO DE LOS MEDIOS EN CAJAS DE PETRI Y SOLIDIFIACION

1. Lleve los tubos y cajas de Petri a la incubadora durante 24 horas a 37 °C

1. Complete la tabla con resultados obtenidos en la prueba de esterilidad y efectividad.

Elaborado CLARET CARREÑO SOLANO 23 07 2018

ASIGNATURA MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRÁCTICA NO. 2 TÍTULO: FROTIS BACTERIANO, COLORACION DE GRAM Y USO DE

12. MARCO TEÓRICO

La habilidad de un colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos

Figura 1. Fijación de frotis Bacteriano

Fuente: (Aquiahuatl, y otros, 2012.