UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRACTICA N°7

DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DE UNA SUSTANCIA

BIOLÓGICA
DETERMINACIÓN DE CREATININA

Profesor:​ Guillermo José Gallardo Vásquez

Integrantes:

1. Amando Morales, Alexandra 20180350

2. Dipas Guillén, Ariana Alejandra 20160098
3. Romero Jara, Melanie Nicole 20171373
4. Vera Rodriguez, Tyfani Carla 20171124

Grupo (día/hora) : Jueves de 8:00 am a 10:00 am

Fecha de la práctica : 16/05/19

Fecha de entrega de informe ​: 23/05/19

LIMA- 2019
I. INTRODUCCIÓN
En el presente informe trabajaremos por reacciones colorimétricas en las cuales
los enlaces peptídicos de ciertos aminoácidos reaccionan y los productos
coloridos son los que se cuantifican. la concentración de proteínas en una
muestra biológica que se aborda un esquema de purificación de una proteína
concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos
propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos

métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz
en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las
proteínas de unir ciertos colorantes.
.Para los métodos colorimétricos se necesita un: factor de calibración
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una
sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la
cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita.
En determinaciones colorimétricas, se cumple una relación proporcional entre la
magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que
la provoca.
La intensidad de color se mide con un espectrofotómetro o colorímetro en función
de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta, y para
esto necesitaremos de la aplicación directa y útil de la Ley de Lambert y Beer ;que
explica esencialmente que a mayor cantidad de proteína, mayor cantidad de
producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color.
La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya
concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema
(solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Se debe
descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer
siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos
aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste
debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se
calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia. ( P.,
2003, Bioquímica​: Técnicas y métodos​).

II. OBJETIVOS
● Observar directa y útil la ley de Lambert y Beer en los métodos
espectrofotométricos con uso de único estándar , particularmente
para la cuantificación de la creatinina.

● Ejercitarse en el concepto de factor de calibración para cálculos de

concentraciones en espectrofotometría.
III. MARCO TEÓRICO

La determinación de creatinina se fundamenta en formación de un

compuesto coloreado (rojo, naranja-rojizo) de ácido picrámico (longitud de
onda óptima= 520nm) el cual se forma por reducción, al ponerse en contacto
la creatinina con el ácido pícrico en medio alcalino (reacción de Jaffé). La
intensidad de la coloración es directamente proporcional al contenido de
creatinina cumpliendo con la ley de Lambert y Beer hasta 40 mg/L. Con
ayuda deuna solución estándar de concentración conocida se podrá
determinar el contenido de creatinina en la sangre.
La creatinina es el anhídrido de la creatinina, formada por la deshidratación
irreversible (no enzimática) de la fosfocreatinina:

La creatinina está presente en músculo, cerebro y sangre, se sintetiza a partir

de los aminoácidos glicina, arginina y metionina, y Mg+2 y aporte de energía.
Se elimina diariamente como un constituyente de la orina en cantidad
constante para cada sujeto. Debido a su constante concentración en la
sangre es de interés diagnóstico y pronóstico en las nefropatías e
insuficiencias renales. La determinación de creatinina en sangre es de las
principales pruebas que nos habla de la buena operatividad del riñon que es
encargado de su depuración. Los valores normales de creainina en suero son
de 0.8 - 1.4 mg/dL. El nivel sanguineo de creatinina se incrementa cuando se
presenta fallas en la filtración glomerular e insuficiencia renal, y disminuye
durante el embarazo por aumento de la función renal.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales
·​ ​Espectrofotómetro rango visible
·​ ​Tubos de prueba 50 ml
·​ ​Tubos de prueba 20 ml
·​ ​Pipetas graduadas y volumétricas
·​ ​Oxalato de sodio cristales
·​ ​Papel de filtro
Reactivos
1.​ ​H​2​SO​4​ 2/3N
2.​ ​Tungstato de sodio 10%
3.​ ​Ácido pícrico 1,5%(p/v)
4.​ ​Solución de picrato alcalino
Se debe de preparar en el momento de la determinación usando solución
saturada de ácido pícrico y NaOH 10%(proporción 1:1)
5.​ ​NaOH 10%
6.​ ​HCL 0,1 N
7.​ ​Solución stock de creatinina :disolver 100 mg de creatinina pura en 100
ml de HCL 0,1N
8.​ ​Solución estándar de trabajo: En fiola de 100 ml colocar 0,6 ml de sol.
Stock ,2 ml de HCL 50% y agua destilada cantidad suficiente para (c.s.p) 100
ml.

Fig.1​. A)Tungstato de sodio 10%. B)​ ​H2​​ SO​4​ 2/3N C) NaOH 10%

Metodología
A)​ ​Precipitación de proteínas
Para la determinación de creatinina y de otros compuestos en la sangre total,
la presencia de proteínas perturba las reacciones necesarias para su
cuantificación por ello es que debe de realizarse un proceso previo
(desproteinización):
En un tubo de prueba de 50 ml de capacidad colocar 7 ml de agua destilada,
adicionar 1ml de sangre oxalacetada (con anticoagulante), 1ml de tungstato
10% y un ml de H​2​SO​4 ​2/3N. Agitar el tubo después de cada adición.
Fig2.​ A) Tubo de prueba de 50 ml de capacidad con 7 ml de agua destilada, 1ml de sangre
oxalacetada (con anticoagulante), 1ml de tungstato 10% y un ml de H​2​SO​4 2/3N.
​ B) El
mismo tubo pero agitado después de la adición de los componentes anteriormente
mencionados.

Observar después de cada adición. Observar la precipitación de proteínas de

la sangre por formación de un precipitado marrón chocolate por formación de
metahemoglobina oxidada. Filtrar lentamente a través de papel filtro rápido.

Desechar el precipitado y reservar el líquido filtrado como muestra

clarificada.

​ Fig 3​. Filtración de las proteínas de la sangre

B)​ R
​ eacción de color:(reacción de JAFFE)
 Rotular tres tubos de prueba como “blanco”, “estándar”, “muestra “ y
preparar la siguiente batería de tubos:

TUBO BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA

REACTIVO

Sol.estándar - 3,0 ml -
de creatinina

Muestra - 3,0 ml
clarificada
(filtrado)

H​2​O destilada 3,0 ml - -

Sol.de picrato
alcalino 1:1 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml
(preparado en
el momento)
Mezclar y agitar por inversión: dejar reposar por 10 minutos y leer a 520 nm
Calcular la concentración de creatinina en la muestra de sangre, expresarla en mg/dl

Fig4​. Reacción de Jaffe

 V. RESULTADOS

Tabla 1. Reacción de Jaffé

TUBO BLANCO TUBO TUBO
ESTÁNDAR MUESTRA

Agua Destilada 3.0 mL - -

Sol. Estándar de creatinina - 3.0 mL -

Muestra clarificada - - 3.0 mL

(filtrado)

Sol. picrato de sodio 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL

Absorbancia λóp = 520 nm 0.010 0.192 0.060

Absorbancia corregida - 0.182 0.050

Concentración (mg/mL) - 1.092x 10−3 3x 10−3

Cálculos:

C M P = ( C ST x AM P )/ AST

C M P = F C x AM P

(100 mg) (0.6mL) = X (100mL)

0.6 mg=X

0.6mg -------------------->100 mL
X ----------------------->1mL

X=0.006mg

C
F C = A ST = 0.006 mg/mL
ST

Una vez tenemos el factor de calibración, pasamos a hallar las

concentraciones:

Para el TUBO ESTÁNDAR

C M P = F C x AM P
C = 0.006 mg/mL x 0.182
 C = 1.092x 10−3 mg/mL

Para el TUBO MUESTRA

C M P = F C x AM P
C = 0.006 mg/mL x 0.050
C = 3x 10−3 mg/mL

VI. DISCUSIONES

La excreción urinaria de creatinina se ha utilizado históricamente para

conocer el estado nutricional de un paciente, la conservación de la masa
magra muscular, y la realización de estudios de composición corporal. La
excreción urinaria de Creatinina es constante en un individuo sano, y
proporcional a la masa magra muscular. Se puede predecir la excreción
urinaria de creatinina de un sujeto si se conocen el sexo, la edad, la talla y el
peso corporal. Se ha definido un índice de excreción de creatinina (también
conocido como índice creatinina-talla) para comparar la excreción urinaria
actual de creatinina de un sujeto cualquiera, con los estándares provistos por
sujetos de una población de referencia.
El mejor parámetro bioquímico sanguíneo de la función renal es la creatinina.
En principio , cuanto mayor es el descenso de la función renal, tanto más
elevado es el valor de la creatinina sérica. (​Barreto J.,Santana S.,
Consuegra D., ​2003)

Los valores normales de creatinina en los hombres adultos se encuentra

entre 0,7 y 1,3 mg/dl. En las mujeres adultas, se encuentra entre 0,5 y 1,2
mg/dl. Mientras que en los niños, se suele situar de 0,2 y 1 mg/dl.
Por tanto, unos niveles de creatinina por encima de lo normal puede ser una
señal de un problema, puede ser que los riñones no están funcionando
correctamente. (Sanitas, S.A.)

Pero como se utilizó sangre de vaca, en la concentración de creatinina en la

muestra en ml de sangre del vacuno, encontraremos 25.05 mg de Creatinina.
Debido a que el nivel de creatinina está relacionado con la masa muscular el
valor de la creatinina en vacunos será mayor que en humanos, alcanzando
1.5 mg/dl. En la práctica de laboratorio tras la evaluación de la sangre se
obtuvo como 25.05 mg/ml de concentración de creatinina.
Para realizar las mediciones primero se realizó la desproteinización (se pudo
observar un cambio de color, de rojo vivo a un rosa pálido y turbio) porque las
proteínas interfieren en la acción de la creatinina.Cuando el reactivo tiene
color, se tiene que usar un blanco de reactivo. Normalmente se usa para
todas las reacciones.
De acuerdo a la tabla 1, podemos observar que la concentración del tubo
muestra es de 0.001092mg/mL y la concentración del tubo muestra es de
0.003mg/mL, existiendo una diferencia de concentración de 0.001908mg/mL
VII. CONCLUSIONES
Para la cuantificación de la creatinina se hizo uso de la Ley de Lambert y
beer, pudiendo hallar de esta manera el factor de calibración, que será
utilizado para encontrar las concentraciones para el tubo estándar y tubo
muestra, y las cuales van a variar según sus absorbancias corregidas.

Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se

puede mantener constante siendo solo necesario ensayar las muestras
problema, multiplicando la absorbancia resultante por el factor, para conocer
la concentración. Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos,
ajustes del aparato, etc.) requiere el cálculo de un nuevo factor de
calibración. (S.A. 2015)

VIII. BIBLIOGRAFÍA
Díaz, J. Fernández, M. Paredes F. (1997). Aspectos basicos de Bioquimica
Clinica. Primera Edición. Madrid, España. Ediciones Díaz de Santos,S.A.

Sanitas. (S.A.) La prueba de función renal. España. Consulta: 18 de marzo

del 2019.
<​https://www.sanitas.es/sanitas/seguros/es/particulares/biblioteca-de-salud/gi
necologia/controles-analiticas/sin012110wr.html​>

Barreto J.,Santana S., Consuegra D. (​2003) Intervalos de referencia

locales para la excreción urinaria de creatinina en una población
adulta.​Madrid, 2003, Vol.18, N°2, pp. 1

S.A. (2015) “Fotometría. Espectrofotometría. Tipos de medida y

procedimientos más frecuentes”. Técnicos Especialistas de Laboratorio del
servicio vasco de salud-Osakidetza. Vasco. Editorial Mad. Pp. 237

ROCA. P; OLIVER.J;RODRÍGUEZ;A.2003. Bioquímica Técnicas y

métodos.​ Madrid: Editorial Hélice.

IX. ANEXOS
CUESTIONARIO
1. Una disolución aislada de E. Coli da una absorbancia de 0.7930 a 260
nm en una celda de 1 cm, a pH 4.5. Si el es 197. Calcular la
concentración en mg/mL:

A= 0,793
E1 cm1%= 197 = Absorbancia específica de 1%(p/v) en una celda de 1cm.
E1 cm 1%= A%C*b

197= 0,793%C x1 → % C=0,00403

2.Calcular el coeficiente de extinción molar a 361 nm para la

acuocobalamina en tampón fosfato 0.1 M a pH 7.0 a partir de los
siguientes datos obtenidos en una celda de 1 cm. (hallar el coeficiente
de extinción molar para cada solución y luego el promedio de estos
valores

SOLUCIÓN CONC. x 10 -5 M Io I

A 2.23 93.1 27.4

B 1.90 94.2 32.8

3.En una determinación de glucosa se obtuvieron los siguientes

resultados:

Glucosa (mg%) 50 75 100 125 150 175 200 250

 Transmitancia 92.9 89.9 86.3 84.3 81.3 78.7 73.8 70.5

Hallar el factor de calibración promedio, y la concentración de 2

muestras de suero que resultaron con una transmitancia de 88.3
y 85.11.

Fc 1 = 0.50 mg/ 0.032 = 15.625 mg

Fc 2 = 0.70 mg/ 0.046 = 15.217 mg
Fc 3 = 1.00 mg/ 0.064 = 15.625 mg
Fc 4 = 1.25 mg/ 0.074 = 16.892 mg
Fc 5 = 1.50 mg/ 0.090 = 16.667 mg
Fc 6 = 1.75 mg/ 0.104 = 16.827 mg
Fc 7 = 2.00 mg/ 0.132 = 15.152 mg
Fc 8 = 2.50 mg/ 0.152 = 16.447 mg

4.​Para evaluar un metabolito “x”, una muestra fue sometida a

dilución tomando una parte de ella con 4 partes de agua y luego
fue comparada espectrofotométricamente con un estándar de
10mg/ml obteniéndose las siguientes lecturas de absorbancia:
Blanco=0.0023, Estándar=0.357, Muestra=0.677. calcule la
concentración de la muestra en mg%.

Concentración ​ST​/Absorbancia ​ST​ = Concentración ​Muestra​/Absorbancia ​Muestra

10/0.357= X/0.677
 X = 18.96mg/ml
94.8mg/ml de metabolito “x”
9480mg%

5.¿Qué es el factor de dilución? Explique mediante un ejemplo.

El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un
volumen dado de muestra original, o parte alícuota. En otros términos, el
factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la
muestra original sobre la concentración de la muestra diluida.
Ejemplo: Cuando un volumen de una solución A de concentración 0,1 M se
diluye con un volumen de agua destilada, haciendo un total de 2 volúmenes
de solución diluida, se habla de una dilución 1:2 (también expresada como
½), y la concentración B teórica así lograda es 0.05 M.

Si la dilución buscada es 1:10, se tomaría un volumen de la solución 0,1M y

se añadirían 9 volúmenes de disolvente, con lo que la concentración teórica
lograda sería 0,01 M.

6.​ ¿Qué es el factor de calibración? Explique mediante un

ejemplo.
El Factor de Calibración de una técnica fotométrica es absolutamente
necesario para determinar la concentración desconocida de la
molécula en estudio, mediante la ecuación de Lambert-Beer.

7. ​Explique la preparación de la muestra problema (sangre) para la

determinación de creatinina.

Para la determinación de creatinina y de otros compuestos en la sangre total,

la presencia de proteínas perturba las reacciones necesarias para su
cuantificación por ello es que debe de realizarse un proceso previo
(desproteinización):
En un tubo de prueba de 50 ml de capacidad colocar 7 ml de agua destilada,
adicionar 1ml de sangre oxalacetada (con anticoagulante), 1ml de tungstato
10% y un ml de H​2​SO​4 2/3N.
​ Agitar el tubo después de cada adición.
Observar después de cada adición. Observar la precipitación de proteínas de
la sangre por formación de un precipitado marrón chocolate por formación de
metahemoglobina oxidada. Filtrar lentamente a través de papel filtro rápido.
Desechar el precipitado y reservar el líquido filtrado como muestra
clarificada.
 8.​Diferencias entre una solución stock, solución estándar y
solución trabajo

Solución stock Solución estándar Solución trabajo

●​ ​Se denomina solución ●​ ​Son soluciones de ●​ ​Solución de

madre o stock a concentración concentración
composiciones conocidas. no conocida.
concentradas de nutrientes ●​ ​Suficientemente ●​ ​Realización
las cuales están estable en el tiempo de
formuladas por sales para determinar su operaciones
minerales que se emplean concentración una matemáticas
en un medio particular. vez (no se necesita en función de
●​ ​Debido al elevado número determinar la
de compuestos que incluye nuevamente su concentración
y a que algunos de ellos se concentración cada conocida de
emplean a muy baja vez que se utilice) otra solución
concentración, resulta más ●​ ​Reacción rápida con para la
práctico preparar el analito determinación
soluciones madre o ●​ ​Reacción más o de la
"stocks" concentrados. menos completa para concentración
●​ ​Hace más rápida la futura alcanzar el punto desconocida.
preparación de medios y final.
minimiza los errores, ya ●​ ​Reacción con el
que La composición de analito por medio de
una solución se debe una reacción
medir en términos de selectiva que pueda
volumen y masa. ser descrita por una
ecuación química
balanceada.

9.​¿Qué función bioquímica cumple la creatinina? Escriba su

fórmula.

El mejor parámetro bioquímico sanguíneo de la función renal es la creatinina.

En principio, cuanto mayor es el descenso de la función renal, tanto más
elevado es el valor de la creatinina sérica.
Los aminoácidos glicina, arginina y metionina forman en el hígado creatina,
que por fosforilación de la fosfocreatina, que circula por la sangre hacia el
músculo y cerebro, y solamente en cantidades traza se elimina por la orina.
La fosfocreatina acumulada en el músculo es un depósito de energía y con la
pérdida del fósforo se convierte en creatina, la cual por deshidratación pasa a
creatinina. La creatinina es, por tanto, el anhídrido de la creatina, la cual una
vez que pasa a sangre no vuelve a ser utilizada y se excreta de forma
constante por la orina.
10. ¿Qué papel cumplen los siguientes reactivos en la cuantificación de
creatinina?

● ​tungstato de sodio y Ácido sulfúrico:​ juntos forman el ácido túngstico

que es el encargado de desnaturalizar las proteínas contenidas en la sangre
y lograr que se precipitan en un concentrado de color marrón.

● ​Ácido pícrico: ​Este compuesto al reaccionar con el Hidróxido de sodio

(reacción ácido-base) produce picrato de sodio y este último al reaccionar
con la creatinina produce ácido picrámico que es un complejo coloreado que
se mide su absorbancia.

11. El coeficiente de extinción molar de un complejo yodo-glucógeno a

450 nm es 0.20. Calcule la concentración del glucógeno en una solución
de complejo en yodo que tiene una absorbancia de 0.36, medida en una
cubeta de 3 cm.

A= 𝛆.ℓ.c​ → 0.36 = 0.20 x 3 x c → c = 0.6