TEMA 5.METODOLOGÍA DIAGNÓSTICO GENÉTICO - Versión 06

PREPARACIÓN OPOSICIONES
FACULTATIVO ESPECIALISTA METODOLOGÍA DIAGNÓSTICO GENÉTICO

ANÁLISIS CLÍNICOS/BIOQUÍMICA CLÍNICA
TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 1 de 57
TEMA 5 .Metodología del diagnóstico genético: Estudio citogenético, enzimático y

molecular.Análisis directo de enzimas. Determinación de proteínas alteradas. Detección de
mutaciones en el DNA.
1.-ESTUDIO CITOGENÉTICO
El análisis cromosómico ha proporcionado un conocimiento básico de los cambios genéticos

responsables de las cromosomopatías y, en el caso del cáncer, de los procesos que suceden durante la
transformación maligna de las células tumorales. En las cromosomopatías estos estudios han sido
esenciales en su correcto diagnóstico, y su detección precoz en el líquido amniótico forma parte de la
clínica habitual. Durante las últimas décadas se han descrito un elevado número de alteraciones
cromosómicas recurrentes frecuentemente asociadas con subtipos tumorales particulares. Además,
estas aberraciones citogenéticas han contribuido a establecer en muchos casos el pronóstico de la
enfermedad y en algunos incluso indicar tratamientos específicos. Por todo ello, muchas decisiones
terapéuticas están basadas en estos hallazgos genéticos.
A los estudios citogenéticos convencionales desarrollados en la década de los sesenta se han añadido
en los últimos años otras metodologías que han permitido mejorar la sensibilidad y la especificidad de los
hallazgos citogenéticos. Estas técnicas son derivadas de la hibridación in situ fluorescente (HISF). Las
más usadas han sido la hibridación genómica comparada (HGC), la HISF multicolor o SKY y la HISF de
bandeo multicolor (Rx FISH), que, junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han
permitido profundizar en el diagnóstico citogenético de las cromosomopatías y de los tumores en general
. En este capítulo se analizarán las principales características y las aplicaciones clínicas de las técnicas
de citogenética molecular, que han revolucionado la Genética moderna y, en consecuencia, la Medicina
actual.
1.1 CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
A pesar de que las técnicas de citogenética convencional cuentan con casi medio siglo de existencia, su
interés no es sólo histórico, sino que siguen proporcionando valiosa información clínica. En la actualidad
el análisis de los cromosomas es obligado en el estudio de las cromosomopatías, las hemopatías
malignas, y de los tumores en los procesos oncológicos. En algunas ocasiones se dispone de sondas
específicas que complementan los hallazgos obtenidos por citogenética. En otras ocasiones, el
diagnóstico se basa exclusivamente en el cariotipo de los enfermos, como en el caso de la determinación
de roturas cromosómicas, hallazgo característico de los enfermos con anemia de Fanconi (fig. 1).
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La muestra que se cultiva en los estudios citogenéticos puede proceder de cualquier tejido: sangre,
médula ósea, líquido amniótico, ganglio, bazo, masas tumorales o efusiones tumorales.
La citogenética convencional permite estudiar los cromosomas de las células obtenidas tras el cultivo in
vitro de las mismas. En el caso de un cultivo de sangre o médula ósea, el procedimiento que se sigue es
el siguiente: Unas gotas de la muestra son puestas en cultivo en un medio de crecimiento con nutrientes,
antibióticos y agentes inductores de la mitosis, y se mantiene a 37ºC durante 24/72h. Tras este periodo
de incubación, se añade al medio de cultivo un agente antimitótico denominado colchicina que permite
detener la división celular en metafase. El cultivo se somete a un choque hipotónico que rompe la
membrana celular y la suspensión de núcleos es fijada. El tratamiento con una enzima denominada
tripsina y la tinción con el colorante Giemsa permite generar en los cromosomas un patrón de bandas
claras y oscuras (bandas G) que permite identificar cada par cromosómico. El estudio de la morfología
cromosómica permite estudiar tanto alteraciones numéricas como estructurales.
Es imprescindible que la muestra no esté contaminada en el momento de su siembra y que el transporte

hasta el laboratorio de Citogenética sea lo más rápido posible. Las condiciones de cultivo varían en
relación con el tipo de tejido que se pretende analizar y con el diagnóstico de sospecha de la
enfermedad. Una vez cultivada, se procede a la recolección de los cromosomas y posteriormente éstos
se tiñen adoptando el patrón característico de bandeo cromosómico
La labor que realizan las consultas y laboratorios de Citogenética es fundamental en la estructura

sanitaria de cualquier hospital, de modo que, con los avances científicos y tecnológicos actuales, la
Genética ha llegado a tener un papel fundamental en todas las áreas médicas debido a que las pruebas
y diagnósticos que allí se manejan son fundamentales para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de
las enfermedades congénitas y hereditarias.
Es importante por lo tanto que conozcamos de qué medios disponemos en la actualidad en el
laboratorio de citogenética, qué utilidades tiene para la clínica y qué significado tienen estos estudios.
La Citogenética es el área de la genética que se dedica al estudio de los cromosomas, su estructura, su
herencia y las enfermedades relacionadas con ellos, causadas por un número y/o una estructura
anormales produciendo las llamadas anomalías cromosómicas.
La citogenética es una ciencia relativamente joven. A mediados del siglo XIX el hombre comenzó
a observar los cromosomas al microscopio, pero hasta final de los años 50 no fue posible individualizar
los cromosomas al microscopio, contarlos y conocer su estructura. Con los avances que se han
producido en las últimas décadas, no sólo hemos podido identificar los cromosomas, sino
que hemos llegado a identificar anomalías cromosómicas tan pequeñas que de cualquier otra
forma pasaban desapercibidas.
El Análisis cromosómico se ha convertido en un procedimiento diagnóstico muy importante en la
medicina clínica, debido a que las anomalías cromosómicas constituyen causas importantes de pérdidas
reproductivas y defectos congénitos y son frecuentes en muchas formas de cáncer.
La habilidad para interpretar un informe cromosómico y algunos conocimientos acerca de la
metodología, el alcance y las limitaciones de los estudios cromosómicos son aspectos esenciales para la
práctica clínica diaria de médicos y otros profesionales sanitarios que atienden a pacientes con defectos
congénitos, retraso mental, anomalías del desarrollo sexual y muchos tipos de cáncer o bien desarrollan
su ejercicio profesional en el ámbito del diagnóstico prenatal.
1.1.1 MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA HUMANO
El momento más apropiado para estudiar la morfología de los cromosomas es durante la división del
núcleo celular en metafase, ya que, cuando una célula se divide, su material nuclear, la cromatina, que
se compone de ácido desoxirribonucleico (ADN) y una compleja serie de proteínas cromosómicas, pierde
la apariencia relativamente homogénea característica de las células que no están en división y se
condensa hasta tomar la apariencia de orgánulos en forma de bastoncillo, los cromosomas. Estos
cromosomas que sólo son visibles en mitosis presentan un empaquetamiento de ADN de hasta 1000
veces más que en el núcleo en interfase.
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Cada especie tiene un cariotipo (también llamado complemento cromosómico) característico en cuanto
al número y la morfología de sus cromosomas. Los genes, unidades de información genética, se
codifican en el DNA cromosómico, y se encuentran en orden lineal a lo largo de los cromosomas donde
cada gen posee una posición precisa o locus.
El mapa génico es el mapa de la localización cromosómica de los genes, el cual, también es
característico de cada especie y resulta el mismo en todos los individuos de una misma especie.
Hay dos tipos de división celular: la meiosis y la mitosis.
La meiosis ocurre solo en células de la línea germinativa. Provoca la formación de células reproductivas
(gametos), cada una de las cuales tiene solo 23 cromosomas: uno de cada clase de autosoma y un X o
un Y por lo que los gametos poseen la dotación haploide o dotación n. La mitosis es la división habitual
de la célula somática. La división mitótica genera dos células hijas, cada una con cromosomas y genes
idénticos a los de la célula madre. Estas células somáticas tienen la dotación diploide o dotación
cromosómica 2n, esto es, 46 cromosomas, los cuales constituyen 23 pares. De estos, 22 son semejantes
en mujeres y en varones (del par 1 al 22), y se denominan autosomas. El par restante comprende los
cromosomas sexuales: XX en mujeres y XY en varones. Los miembros de un par, denominados
cromosomas homólogos, contienen información genética emparejada; esto es, tienen los mismos loci
genéticos en la misma secuencia, aunque en cualquier locus específico pueden poseer formas idénticas
o algo diferentes denominadas alelos. Aunque parezca obvio, es importante recordarque un miembro de
cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro, de la madre.
El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una especie; es por tanto, el patrón cromosómico
de una especie expresado a través de un código, establecido por convenio, que describe las
características de sus cromosomas. El cariotipo es característico de cada especie. Debido a que en el
ámbito de la clínica suelen ir ligados, el concepto de cariotipo se usa con frecuencia para referirse a un
cariograma (Fig. 1), el cual es una foto o dibujo de los cromosomas de una célula metafásica ordenados
de acuerdo a su tamaño y homología.

Bajo el microscopio, los cromosomas se ven como estructuras delgadas y alargadas compuesto
por dos cromátidas. Tienen un brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o constricción
primaria, llamada centrómero. El brazo corto se designa como p y el largo como q. El centrómero es la
zona por la que el cromosoma interacciona con las fibras del huso mitótico desdeprofase hasta anafase,
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tanto en mitosis como en meiosis y es parte integral del cromosoma. En laestructura del centrómero
intervienen tanto el ADN centromérico, que consta fundamentalmente de heterocromatina constitutiva,
como proteínas centroméricas. Es esencial para realizar y regular los movimientos y segregación
normales del cromosoma durante la división celular.
Los telómeros son los extremos de los cromosomas. Son regiones de ADN no codificante, altamente
repetitivas, cuya función principal es la estabilidad estructural de los cromosomas en las células
eucariotas (Fig. 2).
Además de las constricciones primarias, en algunos cromosomas se puede distinguir otro tipo de
"adelgazamiento" denominada constricción secundaria, las que se hallan relacionadas normalmente con
la presencia de las secuencias de ADN ribosómico. Tales regiones se denominan regiones
organizadoras del nucléolo (regiones "NORs"). Los cromosomas con NOR en muchos casos presentan
un segmento que une a esta región con el telómero, el cual se denomina satélite, esto ocurre en los
cromosomas acrocéntricos.
Los cromosomas metafásicos humanos presentan tres formas básicas y se pueden clasificar de
acuerdo a la posición que ocupa el centrómero con respecto al cuerpo del mismo, lo cual determina
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la longitud de los brazos corto y largo. (Fig. 3)

Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos corto y largo de aproximadamente la misma longitud,
con el centrómero en el punto medio
Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes desiguales, con
el centrómero más próximo a uno de los extremos.
Los cromosomas acrocéntricos tienen el centrómero muy cerca de un extremo, con un brazo corto muy
pequeño. Con frecuencia tienen constricciones secundarias en los brazos cortos, conectando trozos muy
pequeños del DNA, llamados tallos y satélites, al centrómero. Los tallos contienen genes que codifican
el RNA ribosómico.
Los brazos de los diferentes cromosomas se indican por el numero del cromosoma seguido de las letras
p o q; por ejemplo, 11p es el brazo corto del cromosoma 11, y Yq es el brazo largo del cromosoma Y.
Los diagramas, llamados idiogramas (Fig. 4) son básicamente un "mapa cromosómico" que muestra la
relación entre los brazos corto y largo, el centrómero (cen) y, en el caso de cromosomas acrocéntricos,
los tallos (st, de stalk) y satélites (s). En los ideogramas también se ilustran los patrones de bandas
específicos. Cada banda se numera para ayudar en la descripción de reorganizaciones.
1.1.2. PROTOCOLOS Y TÉCNICAS DE CULTIVO EN CITOGENÉTICA HUMANA CONVENCIONAL
Aunque a mitad del siglo XVIII ya era posible visualizar cromosomas al microscopio, no fue hasta 1950
cuando la aparición de nuevas técnicas de cultivo mejoró su visualización al conseguir una máxima
condensación y separación. La técnica de Moorhead & cols. para obtener preparados de cromosomas en
metafase a partir de muestras de sangre periférica significó un importante avance.
El arresto mitótico con colchicina y la posterior hipotonización celular, facilitaron enormemente el análisis
microscópico ya que permitían obtener preparados con mayor cantidad de células en metafase y con
cromosomas menos superpuestos entre sí. Todo ello permitió la elaboración de cariotipos y por tanto la
detección de alteraciones numéricas y estructurales. Desde entonces se sucedieron una serie de
descubrimientos de patologías humanas con aberraciones cromosómicas
en número y en morfología que dejaron en claro la importancia de la citogenética en la clínica médica.
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La Citogenética Convencional permite estudiar los cromosomas de las células obtenidas tras el cultivo in
vitro de las mismas. El estudio de cromosomas mediante las técnicas de citogenética convencional y
algunas técnicas de citogenética molecular (FISH), requiere la presencia de células en división.
Únicamente durante la división celular, especialmente en metafase, los cromosomas pueden ser
identificados individualmente al microscopio. En principio, cualquier tejido que contenga células en
división puede utilizarse para un estudio citogenético convencional.
Los cromosomas metafásicos se suelen obtener in vivo, a partir de muestras que tienen un alto índice
de división mitótica (vellosidades coriales, médula ósea, tumores sólidos, etc.), e in vitro induciendo
químicamente la división celular (linfocitos de sangre periférica, biopsias de tejido y células de líquido
amniótico) mediante la realización de cultivos celulares.
Aunque las técnicas específicas difieren según el tejido usado, el Protocolo básico para el cultivo, la
obtención de preparaciones cromosómicas y el estudio y la identificación de anomalías
cromosómicas es el siguiente:
- Obtención de la muestra y preparación inicial.
- Técnicas de siembra y cultivo celular.
- Técnicas de sacrificio. Adición de un inhibidor de la mitosis para detener las células en metafase
- Técnicas de recogida de las células. Este paso es muy importante para obtener preparaciones de alta
calidad. Implica exponer las células a una solución hipotónica, seguida de una serie de soluciones
fijadoras.
- Técnicas de extensión. Para que las células se expandan, de modo que los cromosomas se extiendan
y puedan examinarse individualmente.
A partir de aquí, una vez obtenido el material de estudio se recurre a técnicas para poder identificar y
estudiar el material cromosómico:
- Técnicas de bandeo y tinción de las preparaciones cromosómicas para detectar los posibles
cambios numéricos y/o estructurales.
- Estudio de los cromosomas al microscopio.
- Obtención del cariotipo y análisis citogenético del mismo.
- Emisión del informe citogenético.
Por supuesto que los protocolos de trabajo en el laboratorio de citogenética deben estar escritos y
expresados con claridad, actualizados y a disposición del personal del laboratorio
Recolección de la muestra
Se realiza exclusivamente de tejidos vivos que contengan células con núcleo.
- En Genética Clínica Postnatal:
Sangre Periférica: Principalmente se emplean los glóbulos blancos que se hallan en la sangre por su fácil
accesibilidad. Importante obtener una muestra fresca de sangre periférica (SP), para asegurarnos que
ésta contiene células vivas capaces de dividirse. 1-5 mL de SP en un tubo con heparina sódica al 1%.
Otros tejidos: Biopsia de piel, biopsia gonadal, etc.
- En Diagnóstico Prenatal:
Líquido amniótico: Se obtiene por amniocentesis, técnica de diagnóstico prenatal invasiva.
Obtención de Vellosidades Corionicas (OVC): Por vía transcervical o transabdominal.
Cordocentesis (MPSCU o Foniculocentesis): Se obtiene una muestra de sangre fetal directamente del
cordón umbilical.
- En Diagnóstico Oncológico: Se puede usar médula ósea, sangre periférica, ganglios linfáticos y
biopsias de tumor.
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Técnicas de sembrado y cultivo celular

La realización de cultivos celulares, se debe llevar a cabo en condiciones estériles y con material
previamente esterilizado, con el objetivo de prevenir posibles contaminaciones que pudiesen afectar a la
viabilidad celular. Además para todo tipo de muestras, se recomienda, siempre que sea
posible, hacer la siembra por duplicado y realizar los cultivos de forma independiente, incluso en
distinta estufa si se puede.
- Cultivo: Estufa 37 ºC
- Directo: Médula ósea.
- Semidirecto 24h: Médula ósea, vellosidades coriales.
- Corto plazo 48-72h: Sangre periférica, sangre de cordón umbilical y médula ósea.
- Largo plazo 2-3 semanas: Líquido amniótico, restos abortivos, vellosidad corial, fibroblastos de piel y
otros tejidos.
Técnica de cultivo de sangre periférica
La muestra de SP puede sembrarse al cabo de varios días de haber sido extraída; sin embargo, para la
obtención de un cultivo óptimo, la siembra debe realizarse dentro de las primeras 24 horas tras la
extracción. La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento, evitando en
cualquier caso temperaturas extremas pero sobre todo la congelación. Todas las operaciones se deben
realizar en la campana de flujo laminar.
Las células se hacen crecer en un medio de cultivo acuoso (Por ejemplo, PB-MAX, Karyotiping Medium o
medio de cultivo RPMI). Se siembra la muestra en un tubo de fondo redondo que contiene de medio de
cultivo a 37 ºC. El medio de cultivo contiene una solución salina consistente en un sistema tamponado
encargado de mantener el pH suplementado con Suero fetal bovino que contiene factores esenciales
para un buen crecimiento celular y L-glutamina, aminoácido esencial para el crecimiento celular.
Normalmente también lleva algún tipo de antibiótico que retrasa el crecimiento de microorganismos
evitando contaminaciones del cultivo. Los fungicidas sólo se usan en caso estrictamente necesario, ya
que tienen el inconveniente de que retrasan el crecimiento celular. Además también se suplementa con
Fitohematoglutinina (PHA) al 4%, que es una lecitina mitógena que se une a la membrana plasmática de
los linfocitos T estimulando su proliferación.
Tras la siembra, de aproximadamente 1 mL de sangre periférica, el cultivo se mantiene en una estufa a
37ºC. El cultivo se mantiene en la estufa con el tubo inclinado (en posición horizontal) y el tapón
herméticamente cerrado, hasta alcanzar el pico máximo de crecimiento exponencial celular, lo cual tiene
lugar aproximadamente a las 72 horas de cultivo.
Técnicas de sacrificio. Adición de Inhibidor de mitosis

En este momento, se inicia la extracción de las células en metafase del cultivo. A esta extracción se le
denomina sacrificio. Éste proceso se inicia añadiendo colchicina (p.e. Colcemid. KARIO-MAX Colcemid
Solution) utilizando una jeringuilla de insulina estéril y se incuba a 37ºC durante 30 min. en posición
horizontal. Este antimitótico colcemid, análogo de la colchicina, se une a una proteína conocida como
tubulina, impidiendo la despolimerización del huso mitótico. De este modo, al impedir la separación de
las cromátidas hermanas en anafase, las células quedan bloqueadas en estado de metafase. Una
exposición demasiado prolongada al antimitótico, si bien aumenta el número de células en metafase,
también aumenta la condensación cromosómica, lo cual dificultará posteriormente la detección de
anomalías cromosómicas.
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Técnicas de recogida de células y procesado

Terminada la incubación se trasvasa la suspensión de células a un tubo de fondo cónico y a
continuación, se centrifuga, se aspira el sobrenadante y se resuspende el sedimento golpeando el fondo
del tubo.
Se somete la suspensión celular a un choque hipotónico añadiendo una solución de Cloruro Potásico a
temperatura ambiente, se mezcla por inversión y se deja actuar durante 20 min. A temperatura ambiente.
Esta solución hipotónica, al contener una menor concentración de sales que el citoplasma de la célula,
provoca la entrada de agua en la célula por un fenómeno de ósmosis haciendo que ésta se hinche para
que aumente el volumen celular y los cromosomas se separen.
Se considera que el choque hipotónico es un paso crítico del cual dependerá más tarde la obtención de
buenas extensiones cromosómicas. Conviene controlar muy bien el tiempo, ya que si la exposición es
demasiado prolongada la célula podría lisarse, en cambio una exposición demasiado corta no hincharía
suficientemente las células, lo cual dificultaría la obtención de buenas extensiones.
Seguidamente se realiza una prefijación añadiendo solución fijadora Carnoy, recién preparado,
mezclando metanol y ácido acético en proporción 3:1. La solución se añade dentro de la suspensión
agitando por aspiración y expulsión utilizando una pipeta pasteur. Posteriormente se centrifuga a 1.500
rpm durante 5 min.
Se aspira el sobrenadante, se resuspende golpeando el fondo del tubo y se realiza una primera fijación
añadiendo 5 mL de Carnoy. Esta solución se añade en un principio gota a gota (el primer mL), por la
pared del tubo. De este modo se consigue detener la acción de la solución hipotónica y fijar las células.
El metanol precipita la cromatina y el ácido acético lisa las distintas estructuras
membranosas de la célula sin precipitarlas. Tras ello se incuba 10 min. a Tª ambiente y se centrifuga a
1500 rpm durante 5 min.
Posteriormente, se realizan lavados adicionales con Carnoy para eliminar los restos celulares, siendo
necesarios unos 2 o 3 lavados para obtener un material limpio. Así se realiza una segunda fijación del
mismo modo que la primera pero mezclando el Carnoy por inversión del tubo.
En la tercera y última fijación se aspira el sobrenadante obteniéndose un botón celular blanco el cual
se resuspende añadiendo 5 mL de Carnoy. De este modo, puede conservarse el material fijado a 4ºC
hasta el momento de realizar las extensiones.
Técnicas de Extensión
Finalmente, la suspensión celular fijada se extiende sobre un portaobjetos previamente desengrasado

con metanol absoluto a -20ºC durante 20 min. o a 4 ºC durante 24 h. y secado manualmente con papel
de celulosa que no deje restos, en el caso de la realización de extensiones deforma manual, o
desengrasados y lavados con jabón y prehumedecidos en agua destilada en el caso de realizar las
extensiones con un equipo automático que estandariza y reproduce las condiciones prefijadas.
Una buena preparación debe tener un número suficiente de metafases bien extendidas, con el menor
número de solapamientos posibles y libres de citoplasma. Existen numerosas variantes que afectan a la
obtención de buenas extensiones, entre ellas:
- temperatura ambiente
- humedad
- el propio tratamiento hipotónico
- altura desde la que se realiza la extensión
-el uso de portaobjetos humedecidos con metanol
La alta temperatura y la humedad favorecen la obtención de buenas preparaciones. El material
sobrante se puede conservar a –20º C, durante 5-6-años.
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1.1.3 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA. BANDEO CROMOSÓMICO
Hacia fines de los años 60' Torbjörn Caspersson y Lore Zech observaron que los cromosomas teñidos
con ciertos colorantes del ADN como la quinacrina presentaban un patrón de bandas específico.
A principios de los 70' dos trabajos independientes demostraron que las bandas producidas por la
quinacrina podían reproducirse en preparados teñidos con colorantes no fluorescentes como el colorante
de Giemsa. La técnica utilizada por la Dra. Marina Seabright en Inglaterra consistía en colorear los
preparados tras someterlos a una digestión con una enzima proteolítica: la tripsina, obteniéndose un
patrón de bandas, tras la tinción con colorante de Giemsa, que era enteramente equivalente al patrón de
bandas Q (de quinacrina) obtenido por Caspersson.
En este bandeo no fluorescente, las bandas que se teñían de oscuro (bandas G) eran las mismas que
se observaban brillantes en la tinción con quinacrina, mientras que las bandas claras correspondían a las
bandas apagadas u opacas con quinacrina. Este patrón de bandas no fluorescentes se denominó G (de
Giemsa).
A partir de este descubrimiento se han desarrollado un gran número de técnicas de bandeo para la
identificación individualizada de los cromosomas, dividiéndose en dos tipos:
Aquellas que producen un patrón alternativo de bandas a lo largo de todo el cromosoma, creando un
patrón único para cada par de cromosomas homólogos: Bandas G, Bandas R (Bandeo
Reverso) y bandas Q.
Aquellas que tiñen selectivamente una determinada región de algunos o de todos los cromosomas:
Bandas C y Bandas NOR, la técnica ―harlequín‖ de coloración diferencial de cromátides, técnica
Distamicina/DAPI, técnicas de ―patrones de replicación‖, el bandeo T (telomérico)...
Los bandeos cromosómicos más utilizados son:
- Bandas G
- Bandas C
- Bandas NOR.
Bandas G
Actualmente es el método de bandeo más usado. Previamente es necesario envejecer las preparaciones
con el objetivo de que pierdan humedad y se deshidrate la muestra. Esto se realiza en
estufa a 65ºC durante 14 h o durante 3 días a temperatura ambiente.
Este método es conocido como Bandeo GTG (Bandas G obtenidas con Tripsina y Giemsa). Los
cromosomas son tratados enzimáticamente con tripsina, que desnaturaliza su contenido proteico, y
posteriormente teñidos con colorante Giemsa. Los tiempos se establecen en función del tipo de muestra
y de las condiciones particulares de cada laboratorio. En algunos laboratorios realizan la tinción con dos
colorantes, Giemsa y Wrigth, ya que el empleo de los dos mejora la calidad del resultado, puesto que
facilita el análisis al microscopio para el citogenetista creando un contraste de color en las bandas que se
formaron al emplear la tripsina
Con este método, se obtiene un patrón de bandas claras y oscuras específico de cada cromosoma, de
400 bandas si se ha realizado un cultivo estándar y en torno a 850 bandas en el caso de un cultivo de
alta resolución. Cada una de estas bandas corresponde aproximadamente a 8.000 Kb de ADN.
- Las bandas oscuras son regiones ricas en A-T (adenina-timina) de replicación tardía (estas zonas se
condensan pronto en el ciclo celular pero se replican tarde). Poseen muy pocos genes activos.
Los genes que contienen suelen ser grandes porque los exones están separados por largos intrones.
- Las bandas claras son regiones ricas en C-G (citosina-guanina) de replicación temprana (estas zonas
se condensan tarde en el ciclo celular pero se replican pronto). Estas bandas tienen un mayor significado
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biológico ya que se consideran regiones genéticamente muy activas. Los genes que contienen suelen
ser más pequeños porque los exones están más juntos.
- El nivel de resolución mínimo exigible para un análisis citogenético constitucional común para la
detección de aneuploidias es de un patrón de bandeo de 400 bandas, mientras que para el estudio de
pacientes con retraso mental, defectos congénitos, niños con rasgos dismórficos o parejas con abortos
recurrentes, la resolución mínima debe ser de 550 bandas.
Con una resolución de 400-550 bandas, es posible detectar deleciones o duplicaciones de un tamaño
superior a 5-8 Mb, mientras que con una resolución de 800 bandas es posible detectar anomalías de 3-5
Mb. (Fig. 6 y 7)
Bandas C
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También denominadas como bandas CBG (bandas C obtenidas con hidróxido Bárico usando Giemsa).
El método consiste en introducir las preparaciones en una cubeta con HCl 0,02N (2 ml HCl+100 ml H2O
destilada) a temperatura ambiente durante 10 min. Se lava con agua y se dejan secar al aire. A
continuación, se introducen las preparaciones en una cubeta a 60ºC con Ba(OH)2 saturado (100 ml
H2O+304 g de Ba(OH)2) durante 1 min. El hidróxido de bario despuriniza y desnaturaliza el ADN. Se
realizan dos lavados con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario. Se dejan secar las
preparaciones y se incuban en el detergente 2xSSC a 65ºC durante 15 min. Se lavan las preparaciones y
se dejan secar. Se tiñen con colorante Giemsa durante 5-10 min. Hay que tener en cuenta, que ésta
técnica degrada un 50% del material cromosómico, lo cual dificulta la posterior aplicación de otras
técnicas.
La heterocromatina constitutiva resiste a la degradación y es por tanto el único material que queda
teñido, por este motivo, en el bandeo C se tiñe selectivamente la heterocromatina constitutiva.
Las bandas C positivas (Fig. 8) comprenden las regiones alrededor de los centrómeros, que contienen
secuencias altamente repetitivas ordenadas en tándem de ADN α-satélite de replicación tardía y las
áreas ampliamente polimórficas presentes en los cromosomas 1, 9, 16 y región distal del brazo largo del
cromosoma Y. Estas bandas son especialmente útiles para la caracterización de cromosomas
dicéntricos (o pseudodicéntricos) y también para la determinación de heterocromatina
en cromosomas marcadores, que son pequeños elementos supernumerarios detectados en el cariotipo
constitucional, formados por material cromosómico a priori no identificado, con o sin repercusión en el
fenotipo, dependiendo del tipo de material del que estén formados. Los cromosomas marcadores
pequeños con frecuencia consisten en poco más que heterocromatina céntrica.
Pero los más grandes con frecuencia contienen algún material de uno o ambos brazos cromosómicos, lo
que crea un desequilibrio para los genes presentes en ese material cromosómico.
Bandas NOR
Para la obtención de unas bandas NOR se requiere una solución de nitrato de plata al 50% (0,5 g
AgNO3+1 ml de agua destilada) que debe filtrarse. Se añaden 0,2 μL de esta solución sobre la
preparación y además 6-8 gotas de una solución de formaldehído al 0,3% (en agua destilada) que
acelera la tinción. Se incuba a 37ºC durante 24 h. protegido de la luz.
Las bandas NOR permiten identificar cromatina con secuencias medianamente repetidas de ADNr,
asociada a las regiones NOR del cromosoma ya que tiñen selectivamente las regiones organizadoras del
nucleolo (Nucleolar Organizer Regions) localizadas en las regiones tallo (stalks) y los satélites de los
cromosomas acrocéntricos (Fig. 9). Estas regiones contienen RNA de origen ribosomal y se tiñen con
nitrato de plata. Las bandas NOR son útiles en la identificación de cromosomas marcadores,
reorganizaciones cromosómicas y polimorfismos en los cuales estén involucrados los cromosomas
acrocéntricos.
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Todas las técnicas de bandeo cromosómico anteriormente descritas, requieren que las células estén en
división y detectan anomalías a nivel de una única célula, permitiendo identificar la existencia de
heterogeneidad celular (mosaicismos cromosómicos). Los métodos clásicos de bandeo cromosómico
han sido durante muchos años la única herramienta para la detección de anomalías cromosómicas tanto
numéricas como estructurales. Toda esta batería de técnicas ayudó a distinguir anomalías
cromosómicas imposibles de observar con técnicas de coloración homogénea,como por ejemplo
inversiones paracéntricas y translocaciones entre fragmentos cromosómicos de tamaño similar que no
modifican la morfología de los cromosomas participantes, de modo que gracias a ellas se han podido
identificar muchas anomalías cromosómicas asociadas a diferentes malformaciones congénitas,
síndromes o cánceres colaborando eficazmente en la comprensión de la etiología de dichas patologías.
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1.1.4 TÉCNICA DE ANÁLISIS CROMOSÓMICO

1. Captura de metafases: Se debe recorrer minuciosamente cada una de las extensiones realizadas y
teñidas para localizar metafases completas y con los cromosomas bien individualizados y
convenientemente bandeados. (Fig.10).
2. Cariotipado de las metafases: Se debe recortar y ordenar (cariotipar) por parejas de cromosomas
homólogos cada uno de los cromosomas que conformen la metafase,2. teniendo especial cuidado en el
estudio posterior de los cromosomas involucrados en una superposición con otro cromosoma.
3. Análisis de metafases: Se debe analizar la muestra para evidenciar posibles anomalías numéricas y/o
estructurales. En general, se deben analizar un mínimo de 5 metafases completas para un cariotipo
constitucional. Se le puede practicar el análisis a un número mayor de metafases en función de la política
del laboratorio. Todos los casos deben tener una imagen almacenada a ser posible de forma informática
para su posterior revisión.

4. Interpretación: Informe citogenético.
1.1.5 EL INFORME EN CITOGENÉTICA
Según las guías editadas por la ECA, es responsabilidad del citogenetista suministrar una descripción
clara y sin ambigüedades de los hallazgos citogenéticos, además de una explicación de las
implicaciones clínicas del resultado.
Los informes deben ser realizados de forma estandarizada, y de fácil lectura para el no especialista.
Los informes deben incluir la información siguiente:
• Fecha de recepción y fecha del informe.
• Servicio del cual procede y nombre del facultativo peticionario.
• Identificación del laboratorio.
• Identificación del paciente (nombre, Tarjeta Sanitaria, historia...).
• Motivo de consulta o de petición de análisis citogenético.
• Tipo de tejido examinado
• Nivel de resolución de las bandas obtenidas para el estudio. Si la calidad de bandeo de las metafases
estudiadas están por debajo del estándar mínimo hay que dar información acerca de las limitaciones del
13
resultado. Cuando ésto ocurre, pero no se detectan anomalías clínicamente significativas en el análisis
citogenético, ésto debe constar en el informe para evitar la repetición de procedimentos invasivos cuando
no están clínicamente justificados.
• Fórmula del cariotipo utilizando la nomenclatura correcta y estandarizada según el ISCN 2005 o 2009.
• Se informa, además, la conclusión diagnóstica de forma comprensiva acerca de la normalidad o posible
anormalidad de las líneas celulares observadas.
• Nombre y firma de la persona responsable del informe.
Si el informe es de un caso cromosómicamente anormal, además de lo anterior debe incluir:
• Descripción de la anomalía, independientemente de que ésta sea balanceada o desbalanceada.
• Interpretación escrita de todos los resultados cromosómicamente anormales (comprensible para los no
especialistas).
• El nombre de cualquier Síndrome conocido o enfermedad asociada.
• El número de células analizadas.
• Si el resultado citogenético es consistente con los rasgos clínicos y/o una descripción del fenotipo
esperado si se puede.
• Recomendaciones para el Consejo Genético cuando proceda, acerca de las recomendaciones
hacia futuros embarazos o posible descendencia.
RESUMEN
• El Análisis cromosómico se ha convertido en un procedimiento diagnóstico muy importante en la
medicina clínica, debido a que las anomalías cromosómicas constituyen causas importantes de pérdidas
reproductivas y defectos congénitos y son frecuentes en muchas formas de cáncer.
• El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una especie; es por tanto, el patrón cromosómico de una
especie expresado a través de un código, establecido por convenio, que describe las características de
sus cromosomas. El cariotipo es característico de cada especie.
• Las anomalías cromosómicas se pueden clasificar en anomalías cromosómicas numéricas o
anomalías cromosómicas estructurales las cuales pueden ocurrir tanto en los autosomas como en los
cromosomas sexuales (o afectar a ambos simultáneamente). La incidencia global de anomalías
cromosómicas en neonatos se estima alrededor de 1/175 nacimientos lo cual significa que afectan a un
0.5-0.6% de la población.
• Cada servicio o Unidad de Genética debe tener sus propios protocolos y algoritmos de actuación
dependiendo de su capacidad técnica o clínica, siguiendo para ello las normas y recomendaciones de la
Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance. Para representar y describir todas las anomalías
cromosómicas existe una nomenclatura de consenso recogida en el ISCN 2005 o ISCN 2009, referencia
indispensable para la correcta emisión e interpretación de informes.
• El Protocolo básico para el cultivo, la obtención de preparaciones cromosómicas y el estudio y la
identificación de anomalías cromosómicas es el siguiente:
- Obtención de la muestra y preparación inicial.
- Cultivo celular.
- Sacrificio y recogida de las células.
- Extensión, bandeo y tinción de las preparaciones cromosómicas
- Estudio de los cromosomas al microscopio, obtención del cariotipo y análisis citogenético del mismo.
- Emisión del Informe Citogenético
14
1.1.6 INDICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS CROMOSÓMICO
En general, las indicaciones clínicas que sugieren la necesidad de un Análisis citogenético

constitucional en clínica son: (Tabla 5).
- Presencia de fenotipo específico. Pacientes en los que debido a la presencia de un fenotipo
característico de algún síndrome cromosómico el Análisis cromosómico constituye una parte estándar de
la evaluación clínica.
- Problemas de crecimiento y desarrollo tempranos. Pacientes con fallo o retraso en el crecimiento,
facies dismórficas, malformaciones múltiples, estatura corta, genitales ambiguos y retraso mental son
hallazgos frecuentes en niños con anomalías cromosómicas.
- Mortinatos y muerte neonatal. Debido a que la incidencia de anomalías cromosómicas es
mucho mayor en mortinatos que en RNV también es elevada en niños que mueren en el periodo
neonatal. En estos casos, el cariotipo es esencial para el consejo genético preciso y puede proporcionar
información importante para el diagnostico prenatal en embarazos futuros.
- Problemas de fertilidad. Los estudios cromosómicos están indicados en pacientes que presentan
amenorrea y en parejas con antecedentes de infertilidad o abortos de repetición. En una proporción
importante (3-6%) con dos abortos sucesivos o mas o infertilidad se observa una anomalía cromosómica
(normalmente un reordenamiento estructural o un mosaicismo de cromosomas sexuales) en uno de los
padres.
15
- Antecedentes familiares. Una anomalía cromosómica conocida o sospechada en un pariente de

primer grado constituye una indicación para el Análisis Cromosómico en ciertas circunstancias.
1.1.7. PROTOCOLOS DIAGNÓSTICOS EN CITOGENÉTICA HUMANA

Un protocolo clínico podría definirse como el conjunto de recomendaciones sobre los procedimientos
diagnósticos y/o terapéuticos más adecuados a utilizar ante todo paciente con un determinado cuadro
clínico o problema de salud.
Estos protocolos surgen ante la necesidad de reducir la variabilidad injustificada en la práctica clínica y
mejorar la calidad del proceso asistencial.
Un Esquema básico de los procesos para los diagnósticos citogenéticos podría ser: (Fig. 5)
Conviene tener en cuenta que los protocolos de diagnóstico en citogenética se desarrollan de forma
paralela a la investigación básica y generalmente están poco estandarizados. Los laboratorios d
diagnóstico genético tienen por lo general un carácter híbrido al desarrollar actividades de investigación
básica conjuntamente con la aplicación de dicha investigación al ámbito clínico.
Frecuentemente el desarrollo de una estrategia diagnóstica es en sí misma una línea de investigación
básica en la cual está implicada la caracterización de una anomalía cromosómica y el espectro de
expresiones fenotípicas causadas por la patología en estudio.
Los protocolos y algoritmos de actuación en Citogenética se basan en:

- ISCN (2005-2009) (International System for Human Cytogenetics Nomenclature).
- Literatura Técnica y Clínica basada en la experiencia científica.
- Guías de Practica Clínica.
Las guías de práctica clínica (GPC) se utilizan para englobar los protocolos de actuación clínica y
algoritmos de decisión. Estas GPC son conjuntos de recomendaciones que ayudan a los profesionales a
tomar decisiones sobre cuál es la asistencia más apropiada en circunstancias clínicas
específicas.
Existen diversas GPC en el campo de la Citogenética (Professional Guidelines for Clinical Cytogenetics
de la Association for Clinical Cytogenetics, Guidelines for Molecular Karyotyping in constitucional Genetic
Diagnostics, Best practice guideline: General guideline for humans benetics
16
(2011), Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance.....) y todas ellas son guías cuyo propósito es
estandarizar una serie de pautas y criterios generales en el manejo de las muestras, en el desarrollo de
las técnicas y también en los planteamientos y ejecución de los diagnósticos, con el fin de que cada
laboratorio de citogenética siente unas bases que le ayuden a establecer sus propios controles de
calidad.
La E.C.A. (European Cytogenetics Association) tiene un Grupo Permanente de trabajo, los cuales han
elaborado y editado una Guía de Citogenética y Control de Calidad (Cytogenetic Guidelines and
Quality Assurance) con el objeto de establecer en todos los países europeos una guía común y unos
procedimientos estándares mínimos que puedan ser usados como manual en todos los países de UE.
Los laboratorios de Citogenética deberían estar sujetos a los Sistemas de Calidad y Control Internos y
Externos que rigen las normativas nacionales e internacionales estándar (ISO 15189).
La tendencia de todos estos grupos de trabajo es unificar y armonizar criterios de actuación tanto en la
calidad de los test genéticos y citogenéticos como de los procedimientos a seguir en los laboratorios.
Estas guías presentan normas que tienen en cuenta las ya existentes en cuanto a la evaluación de
calidad, las guías de buenas prácticas de laboratorio (GLP) y los procedimientos de acreditación y
protocolos de distintos países, así como los documentos de política internacional. Estos documentos
incluye los aspectos de control de calidad y de seguridad para la mayoría de los métodos de rutina con
los que se trabaja actualmente en la práctica clínica diaria de los laboratorios de citogenética, de modo
que estas normas deben ser consideradas como criterios mínimos aceptables. También debe
considerarse como una guía para la certificación y / o acreditación de los laboratorios de citogenética.
Hay que tener en cuenta que los Procesos de Asesoramiento utilizados son los Controles de Calidad y la
Comunicación entre los Profesionales integrantes en los diagnósticos. Cada servicio o Unidad de
Genética debe tener sus propios protocolos y algoritmos de actuación dependiendo de su capacidad
técnica o clínica, siguiendo para ello las normas y recomendaciones de la Cytogenetic Guidelines and
Quality Assurance.
El proyecto Europeo EUROGENTEST comenzó en enero de 2005 y tiene una duración de cinco años.
Pretende desarrollar la infraestructura, herramientas, recursos, guías y procedimientos que puedan
conducir a una armonización y mejora en la calidad de los servicios de Genética.
Los objetivos de este proyecto Europeo son:
- Armonizar y mejorar los Controles Externos de Evaluación.
- Facilitar el desarrollo de guías
- Ayudar y financiar los servicios de acreditación y certificación.
- Promover el desarrollo y colaboración entre los centros públicos y privados así como promover el
acercamiento entre los entre los centros académicos y el sector tecnológico.
- Fomentar y promocionar las mejores y más económicas técnicas de diagnóstico.
- Crear una red (Network of Excellence) basada en los cuatro principios de la ética médica: no
malevolencia, beneficencia, autonomía y justicia.
Estos objetivos serán alcanzados a través de los siguientes aspectos:
- Acreditación de los test diagnósticos genéticos o citogenéticos realizados en los laboratorios de
Genética.
- Valoración Externa de la Calidad.
- Control de la calidad Interna de la actividad del Laboratorio.
Para representar y describir todas las anomalías cromosómicas existe una nomenclatura de consenso
recogida en el ISCN 2005 y en su versión más actual el ISCN 2009 (Sistema Internacional de
Nomenclatura de Citogenética humana), los cuales recogen una serie de recomendaciones del Comité
Permanente Internacional de Nomenclatura en Citogenética Humana, por lo que se ha convertido en
referencia indispensable para citogenetistas, técnicos y estudiantes para la correcta emisión e
interpretación de informes.
1.2.- HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE
La HISF utiliza sondas específicas de centrómeros o de regiones específicas de cromosomas marcadas

con un fluorocromo. Tras la hibridación con núcleos en interfase o en metafase es posible observar la
presencia de ganancias, pérdidas o fusiones entre genes. Esta metodología se usa cada vez más en el
diagnóstico de las hemopatías que tienen una alteración característica, como la t(9;22) en la leucemia
17
mieloide crónica o la t(15;17) en la leucemia aguda promielocítica y también es de extraordinaria

importancia en el estudio de las alteraciones cromosómicas en el líquido amniótico y en la sangre de los
enfermos en los que se sospecha la existencia de una alteración cromosómica y en los que no se han
podido obtener metafases. De hecho, el estudio sistemático de las alteraciones numéricas de los
cromosomas X, Y, 18 y 21, junto con el bra zo corto del cromosoma 5, constituye una técnica obligada
en el cribado diagnóstico de las cromosomopatías. Además, su uso ha permitido descifrar el contenido
de material genético en cromosomas marcadores y contribuido a un mejor seguimiento de los enfermos
con alteraciones numéricas en el momento del diagnóstico.
La HISF consiste en la detección de secuencias de ADN previamente marcadas con fluorescencia sobre
cromosomas o núcleos celulares fijados sobre un portaobjetos, usando para ello un microscopio de
fluorescencia y un sistema de captura y procesamiento de imágenes. A diferencia de la citogenética
convencional, la mayoría de las técnicas de HISF no precisan de células tumorales en división, por lo
que es de gran ayuda en el estudio de muestras en las que no se han obtenido metafases. Además
puede aplicarse directamente sobre células extendidas de sangre periférica o médula ósea, improntas de
tejido en fresco o congelado, y tejido seccionado y parafinado (tabla 2)
Sondas para hibridación in situ fluorescente
En la actualidad se dispone de un gran número de sondas para el estudio de las alteraciones genéticas
frecuentes en las cromosomopatías, en enfermedades genéticas que se asocian con microdeleciones
(síndrome de Angelman, síndrome de Prader-Willi, etc.) y en las neoplasias. Estas sondas están
marcadas directamente con fluorocromos, lo que facilita su uso y permite una detección rápida y eficaz
de las alteraciones numéricas, de las pérdidas y de los reordenamientos tanto en metafase como en
interfase celular. Las sondas usadas en la HISF se pueden clasificar en:
Sondas locus-específicas (LSI).
Estas sondas hibridan con una secuencia única de ADN, es decir, son específicas para un locus
determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific identifier) o sondas de secuencia única.
Las sondas locus-específicas tienen su aplicación dirigida a la detección de aneuploidías, pero también
permiten detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e
identificar deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Megabases (Mb).
No obstante, su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.
En función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 Kb, como los plásmidos, o son vectores más largos de
80 Kb -1 Mb como los Bacterial artificial chromosomes (BACs) o Yeast artificial chromosomes (YACs). Es
el ejemplo de la sonda LSI para los cromosomas 13 y 21 utilizada comercialmente, la cual es un vector
de E.coli que contiene una mezcla de secuencias de DNA únicas que se hibridan en la región 13q14 del
cromosoma 13 y en las regiones 21q22.13 a 21q22.2 del brazo largo del cromosoma 21. (Fig. 24)ndas
que identifican una estructura específica y repetitiva del cromosoma
Estas sondas hibridan con las secuencias α y ß satélite adyacentes al centrómero, que son específicas
de cada centrómero, pero que varían de un cromosoma a otro. Las sondas centroméricas permiten
identificar alteraciones de tipo numérico, especialmente monosomías y trisomías y otras aneuploidías
tanto en las cromosomopatías (Síndrome de Turner, síndromede Down, síndrome de Klinefelter) como
en los tumores (trisomía 8 o monosomía 7 en leucemias agudas) (fig. 2).
18
Sondas que hibridan simultáneamente con múltiples secuencias del cromosoma
Se denominan sondas de pintado cromosómico a aquellos fragmentos de ADN que se obtienen

mediante separación cromosómica por citometría de flujo y se marcan directamente mediante DOP-PCR.
Sólo pueden utilizarse en metafase y sirven para detectar alteraciones estructurales (translocaciones,
cromosomas marcadores, derivativos, etc.) difíciles de identificar con la citogenética convencional, como
la t(12;21)(p12;q22) en la leucemia aguda linfoblástica B del niño.
19
Sondas que hibridan con una única secuencia de ADN
Estas sondas permiten sobre todo detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones
cromosómicas concretas. Para poder utilizarlas es necesario conocer a priori la región candidata a
estudio en cada patología. Sus aplicaciones son: a) la detección de translocaciones cromosómicas tales
como la t(9;22)(q34;q11), con fusión de los genes BCR y ABL, en la leucemia mieloide crónica o la
t(11;14)(q13;q32), donde BCL-1 se transloca a la región de la cadena pesada de las inmunoglobulinas,
en el linfoma del manto (fig. 3); b) el estudio de pérdidas de genes concretos, como el gen del síndrome
de Prader-Willi, o la pérdida de P53 en tumores, y c) el estudio de genes que se amplifican, es decir, se
multiplican de manera considerable en el núcleo de la célula tumoral, como N-MYC en el neuroblastoma.
Fig. 3. Hibridación in situ fluorescente en interfase y metafase de un enfermo con linfoma del manto y
t(11;14). La sonda específica del gen en la cadena pesada de las inmunoglobulinas se ha marcado en
verde y la del gen de la ciclina D1 (BCL-1) en rojo. Se observa la presencia de fusión de ambos genes en
los dos cromosomas derivativos y en el núcleo en interfase (flechas).
20
Sondas centroméricas (o alfoides)
El DNA satélite o repetitivo constituye aproximadamente del 10 al 20% de todo el DNA humano. En
particular, los cromosomas llevan de 105 a 106 pares de bases de secuencias DNA centroméricas o
pericentroméricas cortas repetidas en tándem. Las unidades monoméricas que forman estas secuencias
satélites alfa, a pesar de ser prácticamente idénticos para todos los cromosomas, varían de tal manera
(en 2-3% de su secuencia) que muchas son cromosoma-específico lo que permite que la mayor parte de
los centrómeros individuales puedan ser distinguidos, a excepción de las parejas de centrómeros de los
cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los cromosomas 14 y 22.
Se han aislado y clonado sondas para estas secuencias específicas para la mayoría de los cromosomas
humanos y están comercialmente disponibles, de forma que se pueden detectar e identificar alteraciones
de tipo numérico (monosomías, trisomías...). Se conocen como sondas CEP (chromosome enumeration
probe).
Es el ejemplo de la sonda CEP 18/X/Y, plásmido de E.coli utilizado para detectar secuencias satélite alfa
en las regiones centroméricas de los cromosomas 18, X e Y en el screening de aneuploidías en líquido
amniótico. (Fig. 25)
Sondas subteloméricas
Los telómeros son una zona del genoma humano con alta concentración de genes y, por tanto,
pequeñas alteraciones en esa zona podrían afectar a genes candidatos a producir síndromes que
conlleven retraso mental. La mayoría de estas anomalías teloméricas son indetectables para la
citogenética convencional, de ahí el nombre de ―crípticas‖ o ―sutiles‖. Esto es debido a que el tamaño y el
patrón de bandas de estas regiones cromosómicas son muy similares y no se pueden distinguir
convenientemente como ocurriría en el caso de una translocación, o bien, puede ser debido a que el
tamaño de la anomalía es tan pequeño que supera el límite de resolución de las actuales técnicas de
bandas.
Por ello se utilizan sondas subteloméricas, que contienen secuencias específicas de ADN que se
encuentran aproximadamente a 100-300 Kb del extremo del cromosoma y se usan en la identificación de
deleciones y rearreglos teloméricos submicroscópicos. Poseen una alta resolución que varía según la
medida de la sonda utilizada (30-100 Kb). (Fig. 26)
Sondas de pintado cromosómico.
Las sondas painting o de pintado cromosómico, también conocidas como sondas WCP (whole
chromosome painting) son sondas complejas que utilizan una mezcla de diferentes secuencias de DNA
21
que son homólogas a muchas zonas a lo largo de un cromosoma específico, y que son generadas a
partir de cromosomas microdiseccionados que se obtienen mediante separación cromosómica
por citometría de flujo y se marcan y amplifican directamente mediante DOP-PCR (Degenerate
Oligonucleotide Primer-Polimerase Chain Reaction). Esto permite que el cromosoma sea pintado o
decorado tanto en metafase como en el núcleo en interfase.
Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado cromosoma se
consiguen pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes (con excepción de las regiones
centroméricas y teloméricas), permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones numéricas y
estructurales intercromosómicas que afecten a ese cromosoma específico, como por ejemplo, detectar
translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética convencional, así como para
identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma derivado o en pequeños
marcadores supernumerarios. (Fig. 27).
Usos y limitaciones de la hibridación in situ fluorescente
En la actualidad la HISF es una metodología ampliamente utilizada en los laboratorios de Citogenética.

Son indudables los beneficios que puede aportar al conocimiento de las alteraciones genéticas
subyacentes en algunas enfermedades (tabla 2). Sin embargo, presenta una serie de inconvenientes que
están reflejados en la tabla 3.
22
1.3.-HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA
En la HGC se produce la hibridación de ADN tumoral y ADN normal frente a cromosomas normales. Esta
técnica presenta la ventaja de no necesitar material en fresco, ya que el ADN se puede obtener de tejido
en parafina. Con ella se pueden conocer alteraciones numéricas (pérdidas o ganancias de material
23
genómico), pero no la presencia de translocaciones recíprocas. Su aplicación al estudio de los tumores

ha puesto de manifiesto que en la mayoría de las neoplasias hay alteraciones genéticas.
Fundamento de la hibridación genómica comparada
La HGC consiste en la hibridación competitiva entre ADN tumoral (test) y ADN normal (referencia) sobre
8
metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano . Previamente, el ADN tumoral y
el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo, el ADN tumoral con un
fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo) lo que permitirá su posterior identificación mediante un
microscopio de fluorescencia. El análisis digital de las metafases capturadas cuantifica la proporción de
verde y de rojo en todos los cromosomas de manera que si existe una ganancia de material genético en
una determinada región cromosómica se producirá un aumento de la fluorescencia verde a ese nivel,
mientras que si hay una pérdida de material genético se producirá una disminución de la fluorescencia
verde y por tanto un aumento relativo de la fluorescencia roja. El cariotipaje posterior se realiza sobre la
base de la tinción con DAPI de los cromosomas.
La HGC ha sido la primera técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha
permitido realizar un análisis global del genoma. Puesto que las alteraciones en el número de copias de
ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la patogenia del cáncer, la HGC ha
despertado gran interés en el estudio de las neoplasias. La HGC ha sido utilizada de forma más amplia
en el estudio de los tumores sólidos que de las neoplasias hematológicas, entre otras razones por la
dificultad que entraña obtener mitosis en los tumores sólidos, y porque los reordenamientos no
recíprocos y las amplificaciones génicas se producen con más frecuencia en ellos que en las neoplasias
9
hematológicas (fig. 4) . No obstante, puesto que la HGC no requiere metafases de las células tumorales
y no está afectada por la selección clonal inherente a los cultivos celulares, se ha utilizado en
hemopatías malignas. Las neoplasias linfoides B representan el grupo más estudiado y más
concretamente los linfomas no Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones
constituyen una alteración más frecuente de lo que se suponía, y que se asocian generalmente a
linfomas agresivos. Otra aportación importante de la HGC al conocimiento de la patogenia de los
linfomas ha sido la demostración de que la amplificación es otro mecanismo que causa sobreexpresión
de la proteína bcl-2, añadido al ya conocido mecanismo de transloca
24
Fig. 4. Hibridación genómica comparada en un enfermo diagnosticado de astrocitoma agresivo. Tanto en

la metafase como en los ideogramas se observa la presencia de pérdidas en 1p y 19p acompañada de
trisomía de los cromosomas 3, 8 y 11 y de monosomía del 4, 9, 18 y X.
25
Aplicaciones de la hibridación genómica comparada
Las aplicaciones clínicas de la HGC dependen de sus potenciales implicaciones diagnósticas,

pronósticas y terapéuticas y de sus dos principales limitaciones, la no detección de alteraciones
cromosómicas recíprocas y la necesidad de una infiltración tumoral mínima del 50% (tabla 3). Desde el
punto de vista diagnóstico las aportaciones de la HGC son escasas puesto que las hemopatías malignas
constituyen un grupo de neoplasias bien caracterizadas mediante citogenética convencional e HISF.
Respecto a su papel en el pronóstico puede considerarse una técnica complementaria a los estudios de
citogenética clásica. Desde que las alteraciones citogenéticas se han erigido en un factor pronóstico de
primer orden, es necesario explorar la presencia de determinadas anomalías cromosómicas con interés
pronóstico en los caso s no informativos mediante técnicas de citogenética estándar, ya sea por no
obtener metafases o por crecimiento de las células normales. En este sentido la HGC es útil en las
hemopatías malignas en las que las ganancias y pérdidas de material genómico constituyen un factor
pronóstico, por ejemplo las leucemias agudas linfoblásticas o el mieloma múltiple. Por otro lado, aún no
hay suficiente número de trabajos que establezcan una superioridad de los cambios genómicos
detectados mediante HGC frente a las alteraciones cromosómicas observadas con otras técnicas de
citogenética, a la hora de predecir la supervivencia de los enfermos con hemopatías malignas.
1.4.- HIBRIDACIÓN IN SITU MULTICOLOR
Tipos de hibridación in situ multicolor
En la actualidad se dispone de tres técnicas de HIS de varios colores.
1. La M-FISH y el SKY pintan, mediante combinaciones de fluorocromos, los 24 cromosomas humanos

de diferentes colores. Estas técnicas han supuesto una verdadera revolución en el análisis de los
cariotipos complejos y de los enfermos que presentaban alteraciones que no podían ser descifradas por
métodos convencionales. Aunque se han aplicado a varios tumores, su uso en la rutina aún está por
establecerse. El elevado coste que suponen sus equipos y las sondas que utilizan restringen su
aplicación, por el momento, al ámbito de la investigación.
2. La Rx-FISH se basa en el principio de homogeneidad que existe entre nuestra especie (Homo
sapiens) y la de Gibon. Esta metodología pinta cada cromosoma del gibon en un color de manera que su
26
hibridación frente a cromosomas humanos produce un auténtico patrón de bandas de

colores que permite diferenciar las alteraciones estructurales que se producen en las hemopatías.
Cariotipo espectral en colores
La técnica de cariotipo espectral en colores (SKY) permite la detección e identificación simultánea de

todos los cromosomas humanos mediante la combinación de cinco fluorocromos. La sonda que se utiliza
para hibridar las células tumorales en metafase es una mezcla de sondas de pintado cromosómico de los
24 cromosomas, cada uno marcado con una combinación de fluorocromos diferente. Se necesita un
equipo y un software especial para detectar y discriminar las diferentes sondas de ADN que se hibridan
simultáneamente. Por lo tanto, esta técnica combina la sensibilidad del FISH con la gran ventaja del
análisis citogenético convencional: obtener una visión global de las todas las alteraciones cromosómicas
en un único experimento.
Este método ha permitido detectar translocaciones crípticas, en algunos casos recurrentes y, sobre todo,
analizar cariotipos complejos e investigar los orígenes genéticos del material implicado en cromosomas
marcadores . Así, se ha podido detectar el origen de las adiciones en el brazo largo del cromosoma 14,
tan frecuentes en neoplasias linfoides (fig. 5). El principal inconveniente del SKY es que no permite
detectar inversiones ni pequeñas deleciones .
27
Fig. 5. Hibridación in situ multicolor en una enferma diagnosticada de un lifoma difuso de células grandes
B. Se observa la presencia de pérdidas en 6p y 7q, así como de material del cromosoma 6 en el 8 y de
éste en el cromosoma 14 (flechas).
Los resultados de esta técnica pueden abrir campos a nuevas investigaciones, pero además puede tener
un significado pronóstico, ayudando a identificar alteraciones genéticas recurrentes que identifiquen
subtipos específicos de una enfermedad. En las leucemias agudas el SKY ha permitido la detección de
translocaciones crípticas en cromosomas que el análisis mediante bandas G detectaba como
delecionados, proporcionando una herramienta para que en el futuro se puedan definir mejor los grupos
de mal pronóstico .
Cuando se desarrolló la técnica, se pensó que el SKY podría detectar alteraciones en los pacientes con
neoplasias hematológicas pero que presentaban cariotipo normal. Algunos trabajos recientes muestran
que el SKY detecta alteraciones crípticas en un porcentaje muy bajo de estas muestras . Estos
resultados, junto con el hecho de que es una técnica laboriosa y cara, sugieren que probablemente el
SKY no es la técnica de elección para el estudio de casos con un resultado citogenético normal.
Las distintas técnicas genéticas no se excluyen, son complementarias unas de otras. Lo importante es
valorar qué tipo de estudio se debe utilizar en cada caso. Esto se aplica también al SKY, que siempre se
debe utilizar como un método complementario del análisis de bandas G. El cariotipo convencional
permite analizar un mayor número de metafases y proporciona una descripción más exacta de las
bandas implicadas en los reordenamientos.
En conclusión, el SKY puede representar un importante instrumento en el análisis citogenético,

especialmente en casos con cariotipos complejos. La capacidad de discernir diferencias genéticas entre
poblaciones de células leucémicas similares morfológica e inmunológicamente está ayudando a
establecer las bases para una revisión de la clasificación de neoplasias hematológicas. La utilización
conjunta de estas técnicas está aportando datos a una investigación dirigida a identificar factores
pronósticos en estos pacientes.
Hibridación in situ multicolor
Su uso ha sido más restringido que el del SKY por la poca disponibilidad de sondas. Sin embrago,
recientemente se ha aplicado con un interés cada vez más creciente en dos situaciones:
28
1. El uso de varias centroméricas de manera simultánea marcadas con diferentes colores ha permitido
discernir la coexistencia de alteraciones genéticas en la misma célula. Esta utilidad es especialmente
notable en el caso de los tumores en los que el estudio simultáneo de varias alteraciones permite
discernir la presencia de evolución clonal intratumoral.
2. El trabajo cooperativo de varios laboratorios en Europa y EEUU ha permitido diseñar una serie de
sondas específicas de las regiones subteloméricas de cada cromosoma. El telómero es una estructura
constante e idéntica en todos los cromosomas. Sin embargo, las regiones subteloméricas albergan
multitud de genes. El uso de estas sondas subteloméricas de manera simultánea ha permitido reconocer
regiones críticas asociadas con retraso mental, como la pérdida de la región subtelomérica de 1p .
Hibridación in situ fluorescente con bandeo en colores
Recientemente se ha descrito la técnica de multibanding-FISH o cross species color banding (Rx-FISH) ,

técnica similar a las de M-FISH o SKY, que permite la generación de un patrón de bandas de distintos
colores para cada cromosoma. Dicha metodología se basa en las homologías genómicas que existen
entre la especie humana y la del Gibon. Las ventajas que ofrece respecto a las de M-FISH o SKY
radican en que la de Rx-FISH permite la identificación de alteraciones estructurales dentro de un mismo
cromosoma (inversiones y translocaciones) y en que los puntos de rotura de los posibles
reordenamientos pueden ser localizados con mayor exactitud. Así mismo, permite determinar cariotipos
complejos y cromosomas no identificables con las técnicas de bandeo (cromosomas marcadores), pero
tiene la limitación, como M-FISH y SKY, de necesitar células en división. Esta técnica aún está en fase
de desarrollo y experimentación por lo cual no existen demasiadas referencias en la literatura.
1.5.-OTRAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
El creciente desarrollo de todas las metodologías de estudio del ADN y el desarrollo de fluorocromos ha
permitido combinar tecnologías para analizar el núcleo celular con otras estructuras. Así la combinación
del marcaje inmunofenotípico de la membrana con la HISF ha permitido analizar las alteraciones
genéticas en grupos celulares concretos, caracterizados por la expresión de un determinado antígeno de
superficie. Esta metodología se denomina FICTION, o MAC-HIS (morfología, antígeno, citogenética) o
SKY-FICTION si se aplica con el sistema de SKY. Otros grupos han analizado el ADN en la cromatina
descondensada, es decir, no en los cromosomas, sino en el núcleo en interfase. Tras una serie de
procesos químicos es posible elongar la cromatina en finas hebras y analizar la disposición de los genes,
identificados por sondas específicas, en el núcleo. Esta metodología se denomina técnicas de cromatina
extendida o de fibras de cromatina y ha permitido la cartografía de genes y ordenar secuencias de genes
en el núcleo, así como analizar los mecanismos de fusión de genes. Es evidente que en un futuro
próximo estas técnicas se verán superadas por otras más sofisticadas que permitirán un mayor
conocimiento morfológico del genoma.
De todo lo expuesto se puede concluir que las técnicas de estudio cromosómico son fundamentales en el
correcto estudio de las cromosomopatías y del cáncer. Las nuevas metodologías de HISF son el
complemento ideal de los clásicos estudios de citogenética convencional y, en conjunto, se denominan
citogenética molecular porque sirven para analizar los genes en su situación espacial, es decir, dentro
del núcleo, bien en interfase o en metafase. Estos estudios son indispensables en el momento del
diagnóstico, condicionan el pronóstico de las hemopatías y de algunos tumores sólidos y sirven en la
monitorización de la enfermedad residual tras el tratamiento. En algunos casos, como el SKY o la Rx-
HIS, es aún temprano para determinar con exactitud su posible aplicación en los análisis rutinarios. Por
el contrario, las técnicas de HISF, de uno o dos colores, con el número cada vez más creciente de
sondas disponibles, se han convertido en una estrategia que se aplica en el momento actual de manera
sistemática en el estudio de los enfermos con neoplasia
29
2..-DIAGNÓSTICO GENÉTICO MOLECULAR
Como en cualquier otro tipo de patologías, el diagnóstico de enfermedades genéticas se realiza

mediante la identificación clínica de los síntomas y signos que caracterizan cada síndrome concreto,
apoyado en datos de laboratorio. Con los avances del Proyecto Genoma Humano, hoy en día es posible,
en muchos casos, analizar directamente la alteración causal a nivel del ADN. De todas formas, en el
entorno clínico nos encontramos varios problemas que pueden dificultar el diagnóstico correcto. En
primer lugar, la posible presencia de heterogeneidad genética: varios genes pueden ser los
responsables de una única enfermedad. Esta circunstancia hace muy laborioso el estudio mutacional, ya
que multiplica el número de exones que hay que analizar. Incluso en aquellos casos en los que se sabe
con exactitud cuál gen está alterado, puede suceder que las mutaciones responsables del cuadro clínico
se distribuyan por todo el gen (fenómeno que algunos autores denominan heterogeneidad alélica), de
manera que sería necesario analizar toda la región codificante antes de poder descartar o confirmar que
el gen en cuestión está mutado. Lógicamente, si se trata de un gen de gran tamaño, el análisis se hace
extremadamente laborioso. La situación opuesta vendría dada por aquellas enfermedades genéticas que
están causadas, en la gran mayoría de familias, por una misma mutación, de manera que podemos
centrarnos en el estudio de esa mutación concreta para confirmar o descartar el defecto molecular que
provoca esa enfermedad.
Por tanto, hemos de sopesar todas las circunstancias mencionadas para decidir si nos inclinamos por
realizar lo que se denomina diagnóstico directo (análisis de un individuo para ver si es portador de la
mutación concreta que causa la enfermedad en esa familia), o si por el contrario aplicaremos el
denominado diagnóstico indirecto (análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el
consultando ha heredado el cromosoma que lleva la mutación). A continuación discutiremos las ventajas
30
e inconvenientes de cada una de estas aproximaciones diagnósticas, así como los métodos más
habitualmente empleados.
El mejor conocimiento de las bases genéticas de las enfermedades está poniendo de manifiesto que
algunas entidades que fenotípicamente parecían monogénicas pueden ser consecuencia de alteraciones
en genes diferentes; además, se ha comprobado que las mutaciones de un mismo gen pueden producir
fenotipos diferentes dependiendo de la localización y el tipo de mutación (aspectos revisados con más
detalle en otro trabajo de este número). Estos hallazgos están planteando la necesidad de realizar
diagnósticos no sólo basados en las características fenotípicas de los pacientes, sino en las alteraciones
genotípicas.El estudio genético de las enfermedades hereditarias tiene como objetivo definir el tipo y la
localización de la mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad. Los métodos de
detección de mutaciones han ido cambiando en el transcurso de las tres últimas décadas, pudiendo
diferenciar dos etapas separadas por la introducción de la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
El estudio de mutaciones en genes implicados en el desarrollo de enfermedades comienza en 1970,

cuando se generaliza la técnica de clonación de genes. En esta etapa desempeñaron un papel
fundamental el desarrollo de vectores, como los fagos y los plásmidos, que luego se multiplican en el
interior de bacterias; la caracterización de las endonucleasas de restricción, enzimas que reconocen una
secuencia determinada de ADN y la cortan como si fuesen unas tijeras (fig.1); y la capacidad de "coser"
fragmentos de ADN por acción de las ligasas de ADN
31
Fig. 1. Mecanismo de acción de las endonucleasas de restricción. B. La digestión con la misma

endonucleasa de restricción de ADN genómico y ADN plasmídico permite generar moléculas híbridas en
las que el plásmido contiene un fragmento de ADN humano. El cultivo de bacterias infectadas por el
plásmido nos permite obtener múltiples copias del fragmento de ADN humano.
Una vez clonado el gen responsable de una determinada enfermedad se procedía a cortarlo con
diferentes enzimas de restricción y a volver a clonar los fragmentos generados para proceder a su
secuenciación en los individuos portadores de la enfermedad. Esta aproximación suponía un enorme
trabajo, y los primeros genes estudiados fueron genes de pequeño tamaño como el de las cadenas alfa y
beta de la hemoglobina cuyas mutaciones son responsables de la aparición de talasemias.
Aparecen también nuevos métodos que permiten detectar mutaciones en ADN clonado y no clonado sin
necesidad de secuenciar. Así, la electroforesis en geles de agarosa y acrilamida permitía separar los
fragmentos de ADN generados tras la digestión con endonucleasas de restricción de acuerdo con su
tamaño y, tras transferirlos a una membrana de nylon o nitrocelulosa (método de Southern blot), se
podían hibridar con sondas específicas del gen que se deseaba estudiar (fig. 2). De esta manera se
podían caracterizar deleciones y reordenamientos génicos, así como mutaciones puntuales cuando
afectaba a la secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción. Estos métodos son muy
laboriosos y requieren el empleo de grandes cantidades de isótopos radiactivos, lo que dificulta su uso
rutinario en los estudios diagnósticos.
Fig. 2.
Representación esquemática del método de Southern.
En 1987 cambia radicalmente la metodología de diagnóstico de mutaciones con la introducción de la

PCR, que permite amplificar regiones del ADN eliminando la necesidad de clonar y reclonar genes. Una
vez que conocemos la secuencia de un gen, podemos diseñar oligonucleótidos que flanquean la región
del ADN que queremos amplificar, así como obtener millones de copias de esa región (fig. 3).
32
Fig. 3. Representación esquemática de los dos primeros ciclos de una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
La reacción en cadena de la polimerasa ha sido ampliamente estudiada en el Tema: Técnicas de

Biología molecular
La mayoría de las técnicas que se emplean actualmente para detectar mutaciones emplean la PCR y se
pueden agrupar en dos clases: a) las que permiten detectar nuevas mutaciones, que exigen el estudio de
todo el gen; lo que se aplica para estudiar genes recién caracterizados o aquéllos en los que las
mutaciones pueden localizarse en diferentes lugares del gen, y b) las que permiten detectar mutaciones
ya conocidas, que se emplean en el diagnóstico de familiares de pacientes en los que ya se conoce la
mutación o en el de aquellas enfermedades que tienen mutaciones con mucha penetrancia en la
población (como la mutación C282Y en el caso de la hemocromatosis).
La detección de mutaciones puede realizarse a partir del ADN de células nucleadas de sangre periférica,
lo que permite estudiar tanto los exones como los intrones, pero tiene el inconveniente de que hace muy
laborioso el estudio de nuevas mutaciones en genes de gran tamaño como el gen del factor VIII o el gen
de la distrofina. Este estudio puede realizarse también a partir del ARN, sintetizando inicialmente cADN,
que es un ADN artificial que se obtiene en el laboratorio mediante el empleo de la transcriptasa reversa y
contiene solamente las secuencias de los exones, y realizando posteriormente la PCR sobre este cADN.
La PCR que se realiza sobre cADN se denomina RT-PCR.
En el caso de la detección de mutaciones en las que conocemos la secuencia mutada, suele emplearse
el ADN genómico y se amplifica el fragmento de ADN que contiene la secuencia que puede estar
mutada.
Como hemos dicho, el diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen —cuya implicación en el
desarrollo de una enfermedad ya ha sido demostrada— para detectar la presencia de posibles
mutaciones en el mismo. En aquellos casos en que las mutaciones patogénicas pueden estar localizadas
a lo largo de toda la secuencia codificante del gen (heterogeneidad alélica fuerte), se deben utilizar
métodos "de barrido", que examinan cada exón por separado para detectar simplemente si existe una
33
mutación o no. Estos métodos no identifican el tipo de mutación, pero nos permiten descartar
rápidamente todos aquellos exones normales, para centrarnos en el estudio de los exones mutados. En
cambio, cuando queremos detectar una mutación concreta, porque ya sabemos que es ésta mutación la
que origina la enfermedad en esta familia, utilizaremos métodos dirigidos a identificar únicamente esa
mutación (métodos "de confirmación"). Éstos últimos son quizás los métodos más utilizados en el
contexto de un laboratorio diagnóstico, especialmente en aquellas enfermedades que tienen una
heterogeneidad alélica limitada, es decir, enfermedades en las que un pequeño número de mutaciones
causan la inmensa mayoría de los casos. Los ejemplos más notorios son la mutación C282Y (que causa
la mayoría de los casos de Hemocromatosis Hereditaria en europeos); la mutación F508del, responsable
de hasta el 80% de los casos de Fibrosis Quística en individuos nor-europeos; la inversión de los exones
1-22 del gen del Factor VIII de la coagulación (responsable de un 50% de los casos de hemofilia A); la
mutación G380R del gen FGFR3 (que causa la mayoría de los casos de Acondroplasia), las mutaciones
N370S y L444P (que detectan la mayoría de los casos de Enfermedad de Gaucher), o las enfermedades
por expansión de trinucleótidos (Enfermedad de Huntington, Síndrome del X Frágil, etc). A continuación
analizaremos algunos de los métodos más utilizados en el diagnóstico directo, tanto métodos de barrido
como de confirmación.
2.1 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MUTACIONES Y POLIMORFISMOS
En los últimos 40 años se han desarrollado numerosos métodos de detección de mutaciones y
polimorfismos sin necesidad de realizar la secuenciación del fragmento en donde se localiza el
cambio. Resulta difícil el comentarlos todos en detalle, por lo que realizaremos una breve
descripción de algunos de los utilizados para la detección de mutaciones no conocidas (técnicas
de rastreo del gen)
2.1. MÉTODOS DE BARRIDO
Análisis de polimorfismos de conformación del ADN monocatenario (SSCP: single stranded

conformational polymorphism)
Para la detección rápida de mutaciones (sin identificar el tipo concreto de mutación). Excepto en el
primero (SSCP) estos métodos se basan en la detección de heteroduplexes, que se forman por la
reasociación lenta de las cadenas tras la desnaturalización del fragmento de ADN. Cuando el fragmento
contiene una mutación y se mezcla con un ADN normal, la desnaturalización-reasociación da lugar a
moléculas heteroduplex portadoras de un desemparejamiento (mismatch) precisamente en el nucleótido
donde está la mutación.
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo de la Conformación de Cadenas

Sencillas). Un cambio en la secuencia provoca cambios conformacionales cuando el ADN se
desnaturaliza (se separan las dos cadenas) y se deja que cada cadena se repliegue por separado. Estos
cambios conformacionales se detectan porque alteran la migración electroforética en geles de
poliacrilamida no-desnaturalizantes. En el ejemplo típico, se amplifica un exón mediante PCR, se
desnaturaliza el producto de PCR por calor, se cargan los productos desnaturalizados en un gel de
acrilamida, se realiza la electroforesis y se tiñe el gel mediante una tinción específica para el ADN
(tinción de plata, por ejemplo). Si no hay mutaciones, se detectarán únicamente las bandas
correspondientes al homodúplex (resultado de la reasociación parcial de las dos cadenas
complementarias durante la electroforesis) y las bandas correspondientes a cada una de las cadenas
sencillas que se han replegado adoptando una conformación determinada. En cambio, la presencia de
una mutación dará lugar a nuevas bandas debidas al patrón de plegamiento de las cadenas sencillas
mutantes, que será diferente al de las cadenas nativas. Como hemos comentado, este análisis no nos
dice de qué tipo de mutación se trata: para eso es necesario secuenciar este producto de PCR y
compararlo con la secuencia normal. La ventaja es que nos permite descartar la presencia de
mutaciones rápidamente, lo que ahorra tiempo y recursos.
34
La desnaturalización, por calor o empleando agentes químicos, del ADN bicatenario da lugar a la
formación de dos hebras monocatenarias que tienen diferente contenido de nucleótidos y, por tanto,
diferente conformación, lo que se traduce en una diferente movilidad al separarlas por electroforesis. Es
más, la variación de cualquier base de una hebra monocatenaria modifica la conformación de la misma y
provoca un cambio en su movilidad electroforética. Aunque convencionalmente la electroforesis de ADN
monocatenario se realiza en geles desnaturalizantes que mantienen el ADN en cadena sencilla
(empleando urea en el caso de la acrilamida y formaldehído en el caso de la agarosa), en la SSCP el gel
no es desnaturalizante, permitiendo interacciones intramoleculares que hacen que el ADN
monocatenario emigre con diferente movilidad dependiendo de su estructura terciaria (fig. 4).
Fig. 4. Método de análisis de polimorfismos de conformación del ADN monocatenario (SSCP). Cada
hebra del ADN monocatenario tiene diferente configuración espacial y migra de manera diferente en los
geles de electroforesis.
Entre las ventajas de esta técnica está su sencillez y entre las desventajas que no permite detectar el
100% de las mutaciones y no se puede predecir qué mutaciones se pueden detectar y cuáles no.
La SSCP es una técnica que permite la detección con una gran sensibilidad, de muta-ciones puntuales y
pequeñas deleciones e inserciones en la secuencia de DNA. El fun-damento de esta técnica es la
variación en la movilidad electroforética de moléculas de DNA de cadena sencilla en geles de
poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes. La conformación de una molécula de DNA viene
determinada por la secuencia de bases y presenta una conformación preferente (mínima energía libre,
secuencias de las moléculas producen la aparición de nuevas conformaciones que modifican su

migración durante la electroforesis. El análisis por SSCP permite la detección de estas conformaciones
mediante la electroforesis de los fragmentos mo- nocatenarios de DNA obtenidos tras desnaturalización
por calentamiento a 96 °C y posterior enfriamiento rápido a 0 °C (Figura 6). Generalmente, se lleva a
cabo el análisis de fragmentos de DNA amplificados por PCR en los que se ha introducido algún tipo de
marcaje (isótopos radiactivos o compuestos fluorescentes) para facilitar su posterior detección, ya sea
por autoradiografía o por fluorescencia, respectivamente. Para aumentar la sensibilidad de la técnica, los
SSCP realizan la separación de fragmentos bajo dos condiciones (presencia o ausencia de glicerol a
diferentes temperaturas).
35
Figura 6. Técnica de: Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP).
Análisis de heterodúplex
En esta técnica se somete una mezcla de DNA control y de DNA a estudio a desnatu- ralización
(97-98ºC) por calor y al reacoplamiento (hibridación) lento posterior. Si no existe ninguna variación solo
se producen homodúplex (cadenas que emparejan todos sus nucleótidos) pero si existe una variación se
producen tanto homodúplex como heterodúplex (cadenas que no emparejan 100% puesto que algunos
de sus nucleótidos son distintos) (Figura 7). La separación por electroforesis en un gel no desnaturali-
zante produce bandas de diferente movilidad. En el caso de que el fragmento en cues- tión tenga una
variación, aparecerán dos bandas y de no existir solo una. Esta técnica pierde sensibilidad en función de
la longitud del fragmento a analizar y según la posi- ción en que se encuentre la mutación. Lo ideal para
la técnica es analizar fragmentos cortos (< 200pb) y con mutación centrada a mitad del fragmento.
Las moléculas de heterodúplex son moléculas de ADN bicatenario que contie nen alguna base no
apareada correctamente, diferenciándose en eso de las moléculas de ADN homodúplex, en las que
todas las bases se emparejan adecuadamente. En este método se mezcla un fragmento de ADN
bicatenario portador de una mutación con otro fragmento bicatenario en configuración germinal y se
desnaturalizan por calor, tras lo cual se enfrían para que vuelvan a formar fragmentos bicatenarios. En el
reagrupamiento de las hebras monocatenarias de ADN se pueden generar cuatro tipos de moléculas, la
36
mitad serán homodúplex, bien de los fragmentos germinales, bien de los mutados; mientras que la otra
mitad serán heteroduplex, mezcla de fragmentos germinales y mutados (fig. 5). Los homodúplex y
heterodúplex tienen una migración diferente, probablemente porque se modifica la estructura terciaria del
ADN bicatenario.
Fig. 5 La desnaturalización de dos cadenas de ADN que se diferencian en un nucleótido permite al

renaturalizar la generación de homoduplex cuando las dos cadenas son totalmente complementarias, o
heterodúplex, cuando las dos cadenas se diferencian en un nucleótido. Los heterodúplex tieneun patrón
de migración electroforética diferente que los homodúplex.
Figura 7. Análisis de heterodúplex.
La eficacia de la técnica se aleja del 100%, probablemente dependiendo de las secuencias que
flanquean la secuencia mutada, de manera que las mutaciones localizadas en la mitad de los fragmentos
37
se pueden visualizar más fácilmente que las localizadas en los extremos. La ventaja es que el método es
muy sencillo y barato.
Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE: denaturing gradient gel

electrophoresis)
Es un sistema de electroforesis que permite la separación de fragmentos que se diferencian en un único

nucleótido basándose en que los fragmentos de ADN de doble hélice presentan diferentes condiciones
óptimas de desnaturalización (disociación) dependiendo de los nucleótidos que los integran. A medida
que los fragmentos migran a través de un gel de gradiente, son expuestos a una mayor concentración de
agente desnaturalizante, como la formamida o la urea, de manera que cuando la molécula alcanza un
nivel crítico, el ADN se disocia, lo que conlleva una reducción de la movilidad del fragmento. El punto
crítico de disociación varía dependiendo de la secuencia nucleotídica de cada fragmento (fig. 11).
Fig.6. Representación esquemática de la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DDGE).

Las condiciones de desnaturalización de dos cadenas de ADN que se diferencian en un nucleótido son
diferentes, por lo que si realizamos una electroforesis de dos fragmentos de ADN que se diferencian en
un nucleótido en las mismas condiciones de desnaturalización la migración será diferente dependiendo
del momento en el que se produce la desnaturalización.
Aunque este procedimiento no requiere la utilización de isótopos o productos tóxicos, se necesita un

equipamiento especial para poder hacer la electroforesis en condiciones homogéneas. La ventaja es que
permite detectar prácticamente el 100% de las mutaciones. Además, permite modelar el comportamiento
de las moléculas mediante ordenador y predecir su migración.
Una variante de este método, denominada electroforesis en geles de gradiente de temperatura (TGGE ),
emplea la temperatura, en lugar de agentes químicos para desnaturalizar los fragmentos de ADN.
Esta técnica se basa en someter una muestra de ADN a una electroforesis en geles de acrilamida con un
gradiente desnaturalizante químico o térmico, de manera que la muestra se encuentra con condiciones
cada vez más desnaturalizantes a medida que avanza por el gel. Las muestras de ADN son productos
de PCR (exones, habitualmente) en cuyo extremo hay una región corta muy rica en citosinas y guaninas
(región llamada "clamp" o "pinza" GC), de forma que la temperatura de desnaturalización de esta
pequeña región es mayor que la del resto del fragmento. Por tanto, cuando el fragmento va avanzando
por el gel, llegará un momento en que se desnaturaliza todo excepto la región del clamp-GC. El resultado
es que el fragmento se frena y deja de avanzar por el gel. Cuando la muestra de ADN es un
heteroduplex que contiene un desemparejamiento, su punto de desnaturalización será distinto al del
38
fragmento nativo, y por tanto se parará en un punto distinto del gel. Esto se reflejará en la aparición de
una banda con distinta migración electroforética.
DHPLC (Denaturing HPLC)
Es una técnica en la que los heteroduplex y homoduplex son separados en un aparato de HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) utilizando un gradiente desnaturalizante de acetonitrilo y variando
la temperatura de la columna. La muestra se injecta en una columna de cromatografía y el ADN se une a
la matriz. El acetonitrilo deshace estas interacciones y el ADN eluido se detecta a la salida de la columna
midiendo la absorbancia a 260 nm, originando un pico a un tiempo de elución característico. En
temperaturas bajas, no desnaturalizantes, la concentración de acetonitrilo necesaria para eluir un
fragmento depende del tamaño y la secuencia del mismo, por lo que cada fragmento da lugar a un pico
de elución característico. Al aumentar la temperatura de la columna, la elución tiene lugar a
concentraciones menores de acetonitrilo, a medida que el fragmento comienza a desnaturalizarse. Como
los heteroduplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homoduplex, generan picos a tiempos
de elución diferentes. De este modo es posible detectar mutaciones puntuales. La gran ventaja del
DHPLC es su rapidez, ya que los tiempos de elución típicos están en torno a los 5 minutos y una
muestra se puede analizar en 10 minutos. Por tanto, conserva la gran sensibilidad de los métodos de
detección de heteroduplex que utilizan un gradiente desnaturalizante (temperatura, en este caso), pero
tiene una procesividad mucho mayor y es fácilmente automatizable.
La figura 7 presenta ejemplos del análisis mediante DHPLC. En la imagen se puede ver el análisis de
dos muestras (una muestra normal y una muestra con una mutación) del exón 12 del gen JAK2,
analizadas a dos temperaturas distintas. Tanto a 56ºC como a 56,4ºC se puede distinguir la muestra
normal de la muestra que lleva la mutación, que presenta dos pequeños picos antes del pico principal.
Los picos pequeños corresponden a los heterodúplex, y sólo aparecen si en el ADN original hay una
mutación.
Rotura de Desemparejamientos (Mismatch Cleavage).
Es un método basado en el hecho de que determinados tratamientos químicos o enzimáticos son

capaces de romper un fragmento de ADN específicamente en el punto donde existe un
39
desemparejamiento. Como hemos dicho, los heteroduplexes son portadores de un desemparejamiento

(mismatch) precisamente en el nucleótido donde está la mutación. Por tanto, el tratamiento con
determinadas sustancias romperá el fragmento sólo en el caso de que existan desemparejamientos, de
forma que una electroforesis en gel será suficiente para comprobar la presencia de una mutación.
PTT (Protein Truncation Test, Prueba de truncamiento de proteínas).
Es un método especialmente dirigido a la detección de mutaciones que crean un codón de parada

prematuro y provocan el truncamiento de la proteína. Para llevar a cabo esta prueba, se prepara ADNc
mediante RT-PCR (PCR tras transcripción reversa del ARN del paciente) utilizando un cebador que
contiene la secuencia del promotor del fago T7 y la secuencia consenso de inicio de la traducción
(secuencia de Kozak). Esta construcción permite realizar la transcripción y traducción in vitro, a partir del
producto de la RT-PCR. El análisis en un gel de acrilamida de los fragmentos proteicos que resultan de
la transcripción/traducción revelará la presencia de una banda correspondiente al tamaño esperado para
la secuencia nativa, o bien otras bandas de menor tamaño correspondientes a todas las posibles
mutaciones que provoquen un truncamiento del producto proteico (mutaciones sin sentido, los cambios
del marco de lectura y las mutaciones que afectan a las secuencias de ayuste).
Secuenciación del ADN
Una alternativa a los procedimientos anteriores es secuenciar directamente el producto amplificado por
PCR mediante método de Sanger de manera manual o automática.
Hoy en día, con la aparición de equipos fluorescentes automatizados y con bajo coste por reacción, la
secuenciación directa de productos de PCR (exones, o incluso la secuenciación directa de un ADNc
obtenido por RT-PCR) es un método cada vez más popular de detección de mutaciones. Tiene la ventaja
de que identifica el tipo de mutación, y de hecho es un paso obligado para identificar las mutaciones
detectadas por los métodos de barrido que acabamos de explicar. Sin embargo, sólo es realmente fiable
cuando el ADN mutado está en una proporción superior al 15-20% del total de ADN presente en la
muestra. Aunque esto se cumple en las enfermedades hereditarias, no es así cuando se trabaja con
muestras procedentes de tumores, en las que con frecuencia la cantidad de células tumorales es baja y
no todas son portadoras de una mutación concreta (por lo que el número de moléculas mutadas puede
ser inferior al 15% del total).
40
La figura 8 muestra una mutación detectada mediante secuenciación en el nucleótido 97 de este

fragmento, cuya secuencia normal se representa en el electroferograma superior. Debajo de él vemos la
secuenciación de una muestra de un paciente, con dos picos (correspondientes a timina y citosina) en
esa posición. La herramienta informática detecta automáticamente este tipo de alteraciones y nos alerta
sobre la presencia de una posible mutación (figura inferior).
Cada uno de los métodos de barrido que hemos visto tiene sus ventajas e inconvenientes, sobre todo en
lo referente a la sensibilidad (porcentaje de mutaciones que son capaces de detectar), coste,
complejidad técnica, capacidad de especificar la posición de la mutación, etc. Aunque las características
de cada método se presentan resumidas en la siguiente tabla, la elección de un método u otro
dependerá de las peculiaridades de cada laboratorio, del gen que se quiera estudiar, los medios
disponibles y la experiencia previa con cada uno de los métodos.
41
Pirosecuenciación
Es un método de análisis genético que se basa en el principio de secuenciación por sín- tesis. Es el
único método de análisis genético actual que permite obtener secuencias ex- plícitas en pocos minutos y
la información que aporta es cualitativa y cuantitativa. La pirosecuenciación se basa en el hecho de que
cuando una DNA polimerasa cataliza la incorporación de un dNTP se libera una molécula de pirofosfato
(PPi) en cantidad equi- molecular al nucleótido incorporado, a continuación la ATP sulfurilasa convierte
cuanti- tativamente el PPi en ATP en presencia de adenosina fosfosulfato (APS). Este ATP formado
provoca la conversión de luciferina en oxiluciferina mediante la acción de la enzima luciferasa, lo que
genera luz visible en cantidades proporcionales al ATP utilizado. La luz producida en la reacción de la
luciferasa es detectada por una cámara que puede visualizarse en un pirograma. La intensidad de cada
pico (señal luminosa) es proporcional al número de nucleótidos incorporados (Figura 8). En el caso que
no se incorpore el nucleótido añadido no se produce señal luminosa, de esta forma se puede conocer, en
base al orden de adición de los dNTP, la secuencia del molde utilizado.
La reacción de pirosecuenciación requiere de los siguientes pasos: Paso 1: Hibri- dación del
oligonucleótido de secuenciación al molde de DNA de cadena sencilla, se incuba con la mezcla de
enzimas (DNA polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa) y con los sustratos (APS y luciferina).
Paso 2: Adición de uno de los cuatro dNTP a la reacción. La DNA polimerasa cataliza la incorporación de
este nucleótido en el caso de que sea complementario a la hebra de DNA. Cada incorporación libera PPi
en cantidades equimolares a la cantidad de nucleótido incorporado. Paso 3: La ATP sulfurilasa convierte
el PPi en ATP en presencia de APS de manera cuantitativa. El ATP media en la transformación de la
luciferina a oxiluciferina por la luciferasa que genera luz en cantidad proporcional al ATP. La luz la
detecta una cámara que transforma la señal en un pirograma. Paso 4: La apirasa, enzima que degrada
nucleótidos, degrada ATP y los dNTP no incorporados, eliminando la emisión de luz y regenerando el
42
medio de reac- ción. Paso 5: Se continúa con la adición de dNTP (uno por vez). En lugar de dATP se
añade el análogo deoxiadenosin alfatio trifosfato (dATPαS) que es incorporado por la DNA polimerasa
pero no es reconocido por la luciferasa. Continuando el proceso, las señales del pirograma indican la
secuencia.
Entre las aplicaciones de la pirosecuenciación se encuentran: a) Análisis basados en el análisis de la

secuencia: Detección de mutaciones, detección de polimorfismos, secuenciación, etc. b) Análisis
basados en la cuantificación de la señal: Frecuencias alélicas SNP e ―indel‖ (DNA pooling), frecuencias
alélicas para más de dos alelos, estado de metilación CpG, número de copias de genes, pérdida de
heterozigosidad, análisis de genomas poliploides, etc.
Figura 8. Bases de la pirosecuenciación.
2.2 MÉTODOS DE COMPROBACIÓN PARA DETECTAR DE LA EXISTENCIA DE UNA MUTACIÓN

ESPECÍFICA:
PCR-Digestión.
El fundamento de esta técnica reside en el hecho de que la mutación crea o destruye una diana de
restricción, de modo que la simple digestión del producto de PCR con el enzima de restricción permite
determinar, en un gel de agarosa, el patrón de digestión indicativo de la presencia o ausencia de la
mutación. Es un método que, por su sencillez y rapidez, es uno de los más utilizados en laboratorios
clínicos. La principal limitación, lógicamente, es que no todas las mutaciones alteran una diana de
restricción.
ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucleótido Especifico de Alelo).
Una técnica bastante utilizada en los primeros años del diagnóstico molecular, aunque hoy en día ha
caído en cierto desuso. Se basa en el diseño de sondas específicas para el alelo mutado y para el alelo
nativo, utilizando oligonucleótidos. El tamaño de las sondas hace que su Tm (temperatura de
desnaturalización) sea lo suficientemente distinta para que —en determinadas condiciones de
hibridación— la sonda específica del alelo normal hibride solamente con ADN normal, y la sonda
específica del alelo mutado hibride específicamente con ADN genómico que contiene la mutación. El
43
ADN de los pacientes (puede ser tanto ADN genómico como un exón amplificado mediante PCR) se
deposita en membranas de nylon haciendo un "dot-blot", y esas membranas se hibridan con cada una de
las sondas (oligonucleótidos marcados con radioactividad o con fluorescencia). El análisis de la
hibridación de cada sonda permite identificar si la muestra contiene un solo alelo mutado (heterocigoto),
dos alelos mutados (homocigoto para la mutación), o ninguno (homocigoto sano).
En este caso, la mutación se detecta durante la reacción de amplificación por PCR. Para ello, seamplifica
un fragmento de ADN que contiene la secuencia que puede estar mutada en uno de los extremos. La
amplificación se realiza empleando tres oligonucleótidos, dos de ellos complementarios con la secuencia
que puede contener la mutación y otro complementario con el extremo opuesto del fragmento de ADN.
Los dos oligonucle ótidos complementarios con la secuencia que puede contener la secuencia mutada
difieren en el extremo 3' y, mientras uno contiene la secuencia sin la mutación, el otro contiene la
secuencia mutada (fig. ).
Fig. 9. Reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo. El cebador 3 contiene la secuencia

portadora de la mutación y sólo amplifica el alelo portador de la mutación.
Cuando el paciente es portador de una mutación, amplificará la PCR en la que hemos empleado el
oligonucleótido cuya secuencia es complementaria con la mutación, pero no la realizada con el
oligonucleótido que contiene la secuencia germinal. En los individuos heterocigotos amplificarán las dos
reacciones (fig. 13).
Este método se denomina también amplification refractory mutation system (ARMS) y presenta la ventaja
de que no es necesario marcar el ADN y es barato; mientras que su mayor inconveniente es la
necesidad de realizar una electroforesis para poder detectar la mutación.
Existen variantes del método que permiten amplificar varias mutaciones simultáneamente, aunque
resulta difícil equilibrar las condiciones de anillamiento para todas las amplificaciones. Por otra parte,
este método es susceptible de simplificación en un solo tubo y de automatización si se marcan los
extremos 5' de los oligonucleótidos que reconocen la secuencia germinal y la mutada con dos
fluorocromos diferentes, de manera que un lector permite diferenciar si se ha amplificado el alelo
germinal, el mutado o los dos.
ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

44
Sistema de Mutación Resistente a la Amplificación) está basada en el mismo principio que ASO, es
decir, la utilización de oligonucleótidos específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada.
La diferencia estriba en que, en el caso del ARMS, estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se
diseñan, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian
en los cebadores específicos para cada alelo: un cebador amplificará sólo el alelo normal, el otro
cebador amplificará sólo el alelo mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está
desplazando cada vez más a la técnica de ASO.
OLA (Oligonucleotide Ligation Assay, Ensayo de Ligación de Oligonucleótidos).
Se trata de un método algo más laborioso, pero que —una vez optimizado— permite analizar gran
número de muestras con rapidez y fiabilidad. Se basa en la ligación de dos oligonucleótidos, uno de los
cuales está marcado con biotina y el otro con una molécula radioactiva o fluorescente. El punto crucial es
el diseño de ambos oligonucleótidos a ambos lados de la base mutada. Por ejemplo, un diseño habitual
es que ambos oligos hibriden sobre la secuencia normal, de modo que la mutación impida la hibridación
de uno de ellos. Como consecuencia, la reacción de ligación sólo será efectiva en presencia de una
secuencia normal. Cuando se separan las sondas y se unen por los residuos de biotina a un soporte que
contiene estreptavidinas, sólo las moléculas completas (fruto de la ligación de los dos oligos) emitirán la
señal correspondiente al marcador (radioactividad o fluorescencia). Por el contrario, el ADN de un sujeto
homocigoto para la mutación no dará ninguna señal. En principio, este método también permite detectar
los individuos heterocigotos para la mutación, ya que la intensidad de la señal emitida será la mitad de la
de un individuo homocigoto normal. El método de OLA permite la automatización y la cuantificación de la
señal cuando se utilizan marcadores fluorescentes, lo que le convierte en un buen método para el
análisis de gran cantidad de muestras.
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
es una modificación del OLA que permite determinar el número de copias de hasta 45 genes en un solo
ensayo, pudiendo discriminar secuencias que difieren en un solo nucleótido. MLPA utiliza, para cada
gen, dos sondas: una de ellas es complementaria a la secuencia que se quiere estudiar (21-30
nucleótidos), a la que se añade la secuencia de un cebador universal en el extremo 5'; la otra sonda de
la pareja tiene otra secuencia complementaria a la diana, un ADN de relleno ?que puede ser de distintos
tamaños? y la secuencia de otro cebador universal en el extremo 3'. Ambas sondas hibridan a ambos
lados de la secuencia diana, y son ligadas por una ligasa termoestable. Con un solo cebador se pueden
amplificar las sondas que se han ligado correctamente. Utilizando secuencias de relleno de distintos
tamaños para cada gen, podemos amplificar en una misma reacción muchos fragmentos distintos, lo que
ahorra mucho tiempo y reactivos. Además, como las condiciones de reacción son las mismas, la
cantidad final de producto es proporcional a la cantidad inicial de ADN, por lo que los resultados de
MLPA pueden ser cuantificados. Por tanto, MLPA permite detectar deleciones y amplificaciones, además
de detectar mutaciones.
Un comentario final a todas estas técnicas de análisis directo es que pueden aplicarse a ADN procedente
de distintos tipos de muestra, ya que trabajan con secuencias amplificadas mediante PCR. Por tanto, es
posible detectar la presencia de mutaciones no sólo en ADN de sangre periférica, sino también en
raspados bucales, vellosidades coriales, cabello, biopsias, material incluido en bloques de parafina o
incluso de tarjetas impregnadas con manchas de sangre (tarjetas de Guthrie, por ejemplo).
Estos métodos se emplean cuando no se sabe si el gen está mutado o no, ni en qué región del gen se
localiza la mutación. Son métodos muy utilizados en el estudio de mutaciones en genes implicados en
tumorigénesis y menos en el estudio de enfermedades hereditarias.
Hibridación con oligonucleótidos específicos (dot-blot)
Este método se basa en que, en condiciones extremas, un oligonucleótido (secuencia corta de ADN)
sólo hibrida con un fragmento de ADN si sus secuencias son totalmente homólogas. En estas
condiciones, cualquier variación en la secuencia de nucleótidos impedirá la hibridación. En este tipo de
45
estudios se emplean dos oligonucleótidos, uno que contiene la se cuencia normal, y otro que contiene la
secuencia mutada que se quiere estudiar. Ambos oligonucleótidos se incuban con fragmentos de ADN,
amplificados por PCR, que contienen la secuencia susceptible de estar mutada, obtenidos tanto de un
individuo sano (que se emplea como control), como de los posibles pacientes y que se han fijado a una
membrana de nylon (fig. 9).
Fig. 10. Representación esquemática de un dot-blot. Los productos de la amplificación por reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN de un individuo homocigoto para el alelo A, un
heterocigoto AB y un homocigoto para el alelo B se depositan en una membrana de nylon y se hibridan
con dos oligonucleótidos que contienen las secuencias de los alelos A y B respectivamente. La
hibridación del heterocigoto tiene menor intensidad que en los casos homocigotos.
La ventaja de este método es que es barato y no necesita geles ni electroforesis; su mayor limitación es
la dificultad para establecer las condiciones adecuadas de hibridación y que sólo permite analizar una
mutación en c ada par de hibridaciones.
Cuando se quieren descartar varias mutaciones simultáneamente, se emplea el método denominado

reverse dot-blot o blot-dot, en el que se fijan múltiples oligonucleótidos, germinales y mutados a la
membrana de nylon, y se híbrida con los fragmento de ADNA o cADN amplificados por PCR. El
problema que plantea este procedimiento es que es difícil encontrar condiciones de hibridación
homogéneas para las diferentes mutaciones.
Análisis de patrones de restricción: RFLP
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición

diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es
polimórfica para estos fragmentos de restricción.
La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a
contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros
campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.
46
Metodología
El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la
técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction),
luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes
longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de acrilamida.
Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular.
Diagnóstico de una enfermedad mediante screening de un marcador RFLP
Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen genético, la presencia o
ausencia de éste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la
enfermedad.
La suposición es que el gen en el que los investigadores están realmente interesados está localizado tan
cerca del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteración en el gen. A veces, un
RFLP en particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es esencial examinar no sólo al
paciente, sino a todos los miembros de la familia que sea posible.
Las pruebas más útiles para tales análisis son las asociadas a una única secuencia del DNA; esto es,
una secuencia que está presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA presenta una
función que es desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente sin dañar al individuo. La
muestra del sujeto sometido al diagnóstico hibridará con distintas longitudes de DNA digerido de
diferentes personas dependiendo de los sitios de corte de la enzima que haya heredado. Una gran
variedad de polimorfismos puede presentarse en la población, obteniendo una gran colección de alelos.
Algunas personas serán homocigotos y presentarán una única banda, otros ( ej, todos los miembros de
la familia mostrados abajo) serán heterocigotos y presentarán una banda distinta por cada alelo.
El pedigree muestra la herencia del marcador RFLP a través de tres generaciones en una sola familia.
Un total de 8 alelos (numerados a la izquierda del gel) están presentes en la familia. Los RFLPs de cada
miembro de la familia están enumerados justo debajo de ellos.
Si, por ejemplo, cada persona que heredó el alelo RFLP 2 tuviera también cierto desorden heredado, y
ninguno de los que carecieran del alelo tuviera la afección, deduciríamos que el gen de la enfermedad
está ligado de manera muy próxima al RFLP. Si los padres decidieran tener otro hijo, un test prenatal
podría revelar si el niño presentaría la enfermedad. Pero destacar que el cruzamiento durante la
formación de los gametos podrían mover el marcador RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia
entre el RFLP y el locus del gen, disminuye la probabilidad de un diagnóstico preciso.
Un RFLP (denominado RFLP por el inglés restriction fragment length polimorphism, es decir,
polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción) o polimorfismo en la longitud de un fragmento
de restricción representa un polimorfismo asociado generalmente a una mutación puntual en un punto
determinado de un genoma. Se detecta mediante la digestión mediante enzimas de restricción de ADN
genómico o bien de un amplicón producido mediante PCR previamente (en este último caso, se habla de
6
CAPS o Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, o polimorfismo de fragmento amplificado y digerido).
47
Cartografía mediante RFLP. Se muestra un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B), así como
sus respectivos Southern blots.
Una forma de detectar dicho polimorfismo es mediante Southern blot. Para ello se digiere el ADN
genómico de dos individuos con una enzima y luego se hibrida la mezcla de fragmentos resultante con
una sonda marcada que hibrida en la zona de la diana que muestra polimorfismo. De este modo, puede
detectarse luego el tamaño de los fragmentos generados. En el gráfico se observa: un individuo A que es
homocigótico para la ausencia de diana, luego muestra en el southern una única banda de 5 KB (el
tamaño acotado por dos dianas de restricción para la enzima empleada); y un heterocigoto, que muestra
la misma banda de 5 KB (procedente de su cromosoma homólogo "sin diana") más dos bandas (de 3 y 2
KB, pues la sonda complementa con una secuencia en ambos fragmentos, pues éstos colindaban en
7
origen con la diana de restricción).
Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern,
es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una
mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa
con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos de ADN y, después, una transferencia a una
1
membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su
2
inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A) y uno heterocigoto (B) para un
marcador; tras hibridarse con una sonda específica (rosa) se observa el resultado del Southern a la
derecha.
48
Detección de mutaciones empleando enzimas de restricción
En algunos casos, las mutaciones modifican secuencias que son dianas de enzimas de restricción, de
manera que impiden que la secuencia sea reconocida por la enzima. También puede ocurrir que la
mutación genere una secuencia nueva que es reconocida por una enzima de restricción donde antes no
era reconocida . El constante descubrimiento de nuevas enzimas de restricción hace cada vez más
probable que una mutación modifique la secuencia del genoma de manera que se generen o
desaparezcan secuencias reconocidas por enzimas de restricción.
Fig. 11.. La presencia de una mutación en la secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción
EcoRI hace que la secuencia no sea reconocida por la enzima y no se pueda digerir. B. La mutación
genera una secuencia reconocida por la endonucleasa EcoRI, y el fragmento de reacción en cadena de
la polimerasa se digiere al incubarlo con la enzima.
No obstante, en los casos en los que no se modifican secuencias dianas reconocidas por enzimas de
restricción, se pueden diseñar oligonucleótidos que, al ser empleados en la PCR, generen una secuencia
reconocida por una enzima de restricción. Para ello, es necesario diseñar un oligonucleótido homólogo
con la secuencia que se quiere amplificar, en el que se cambia una única base, de manera que no se
impide el anillamiento del oligonucleótido y se permite amplificar una secuencia en la que se ha
generado una nueva secuencia reconocida por una enzima de restricción .
Las ventajas de este método son su sencillez, el que no es necesario emplear marcaje isotópico y que es
relativamente barata. En contra está el hecho de que debemos realizar una electroforesis.
Ensayo de la 5' nucleasa
El ensayo de la 5' nucleasa es una técnica que permite monitorizar el número de veces que un fragmento
es amplificado en una reacción de PCR basándonos en la fluorescencia que se libera durante la misma.
El método se basa en la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq ADN polimerasa, que rompe los
nucleótidos del extremo 5' del ADN de doble cadena, de manera que degrada la cadena de ADN que
tiene el extremo 5' más próximo. En la reacción, además de los dos oligonucleótidos que flanquean el
fragmento que se quiere amplificar, se emplea un tercer oligonucleótido, diseñado para que anille en la
región central del fragmento amplificado, y que está fosforilado en el extremo 3', de manera que no
49
puede actuar como cebador en la reacción de extensión del ADN. Cuando una molécula de Taq ADN
polimerasa alcanza el oligonucleótido central, lo desplaza y lo degrada totalmente, continuando con la
amplificación del fragmento.
El oligonucleótido central, también denominado "sonda", está marcado con dos fluorocromos diferentes
en cada extremo, de manera que uno de ellos (denominado quencher) anula la señal del otro, efecto que
es mediado por la transmisión de energía entre ellos y que requiere que los dos fluorocromos estén
próximos uno al otro. La degradación de la sonda por la ADN-polimerasa durante el proceso de
amplificación del ADN da lugar a la separación de los dos fluorocromos, el cese de la acitividad
silenciadora del quencher, y al aumento de la fluorescencia de manera proporcional a la cantidad de
fragmento amplificado. Este sistema está patentado por Perkin Elmer™ bajo la marca TaqMan y las
sondas contienen TAMRA (6-carboxytetrametilrodamina) como silenciador 3', y FAM (6-carboxy
fluoresceína), TET (tetracloro-6-carboxy fluoresceína) o HEX (hexacloro 6 carboxy fluoresceína) como
fluorocromos. La utilización de diferentes fluorocromos permite realizar PCR multiplex.
Esta técnica, que se utilizó inicialmente sólo para cuantificar el número de fragmentos amplificados
durante la PCR, se ha adaptado para detectar mutaciones empleando algunos de los métodos ya
descritos en los apartados anteriores, pero en lugar de analizar los fragmentos mediante su migración en
electroforesis, se detectan por la fluorescencia liberada durante la reacción de amplificación.
Básicamente, el procedimiento se basa en que el silenciador (quencher) se sitúa, en lugar de en el
extremo 3' de la sonda, en el nucleótido inmediatamente 3' del nucleótido que puede estar mutado, lo
que hace que, al no aparearse el nucleótido mutado y el germinal, la ADN polimerasa no degrade la
región de la sonda complementaria a la mutación y se liberen juntos el fluorocromo y el silenciador. El
empleo de dos sondas, una que contiene la secuencia germinal y otra portadora de la mutación,
marcadas con dos fluorocromos diferentes, permite discriminar en la misma reacción si el paciente es
homocigoto o heterocigoto para una determinada mutación .
La ventaja de este método es su sencillez y la minimización del riesgo de contaminación, mientras que el
mayor problema es que no permite detectar todas las mutaciones
Estos métodos se emplean cuando se conoce la mutación responsable de la enfermedad en uno de los
integrantes de una familia y se quieren detectar nuevos portadores de la mutación. También se utiliza
cuando una mutación responsable de una enfermedad aparece en un elevado porcentaje de la población
afecta; cuando es necesario discriminar si una nueva mutación está implicada en el desarrollo de la
enfermedad o es un polimorfismo neutro y, finalmente, cuando se realizan estudios para determinar la
distribución de un determinado polimorfismo en la población.
2.3.-ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Una vez concluida la secuenciación del genoma humano, los esfuerzos técnicos se están centrando en
el estudio del transcriptoma, es decir, el estudio del conjunto de genes que se transcriben de manera
específica en una célula.
Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia
dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una
extracción de ARN total).Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a
fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya
resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda
1
molecular marcada radiactiva o químicamente.
El nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN),

denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la técnica
equivalente para ARN se empleo el punto cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al
meridional «southern»).
50
3. MÉTODOS DE ANÁLISIS GENÉTICOS EN PARALELO A GRAN ESCALA MICROARRAYS Y

BIOCHIPS
Los equipos analíticos y las tecnologías basados en la miniaturización y ultraminiaturización se basan en

los conocimientos previos de la microelectrónica e informática para el diseño de macromatrices y ―chips‖
de material biológico o ―biochips‖. La potencia de estos sistemas hace que se pueda obtener un gran
volumen de información en tiempos breves: análisis de mutaciones, polimorfismos o niveles de expresión
génica. Esta tecnología se ha desarrollado gracias a que es posible sintetizar químicamente moléculas
de ácidos nucleicos, la capacidad que tienen las moléculas de DNA de unirse a determinados soportes,
los métodos de marcaje de DNA a soportes sólidos, la propiedad que poseen los ácidos nucleicos de
unirse a cadenas complementarias (hibridación) y el avance en la dispensación de reactivos en
microespacios.
Los microarrays o micromatrices son soportes sólidos, generalmente, de cristal o de plástico sobre los
que se disponen, de manera ordenada, una serie de sondas específicas de DNA (ácido
desoxirribonucleico) que representan a una serie de genes. La técnica de microarrays está basada en la
propiedad física de los ácidos nucleicos para hibridar con secuencias complementarias, a temperaturas y
pH adecuados. De manera que las bases complementarias entre una muestra biológica y el microarray
se reconocen y esta hibridación se puede visualizar, mediante el uso de un trazador, que habitualmente
se trata de una molécula fluorescente. De este modo, la muestra biológica se marca con el trazador y
tras la hibridación y una serie de lavados, el microarray se escanea y se visualiza una imagen.
Posteriormente, mediante el uso de un software especializado, se cuantifica la señal de las imágenes.
Finalmente, se realiza un tratamiento informático de los datos que persigue minimizar las variaciones
inherentes a la técnica, optimizar la extracción fiable de los datos y correlacionar dichos datos con el
proceso biológico.
TIPOS DE MICROARRAYS
Existen varios tipos de microarrays, específicos para el tipo de estudio que se quiera realizar. Los
microarrays de expresión (gene expression microarrays), fabricados con sondas de cDNA o de
oligonucleótidos de zonas codificantes, están diseñados para el estudio del transcriptoma celular,
51
es decir, para el estudio de la expresión del RNA. Los SNP-arrays (Single nucleotide polymorphism
array), están diseñados para detectar cambios en la secuencia del DNA. Estos microarrays se están
aplicando en múltiples campos, ya que permiten estudiar de forma rápida y simultánea múltiples cambios
conocidos, en distintos genes, asociados a distintas patologías, respuesta a tratamiento o susceptibilidad
a enfermedades. En investigación los SNP-arrays se emplean para escanear todo el genoma con el fin
de identificar variaciones genotípicas entre distintos individuos o poblaciones que se asocien a una
condición determinada (Genome Wide Association Studies). Los arrays- CGH (Comparative Genome
Hibridization arrays), determinan alteraciones en el número de copias de regiones de DNA y se emplean
frecuentemente en el diagnóstico de patologías asociadas a ganancias o pérdidas de material genético.
También, hay microarrays para el estudio de miRNAS (micro ARN (miARN o miRNA)).
Otras aplicaciones que se han ido sumando a este amplio catálogo de estudios son el estudio masivo de
la metilación, en las regiones promotoras de los genes, o el estudio simultaneo de varias proteínas en un
tejido parafinado (Tissue microarray). También, mencionar los microarrays de proteínas en los que las
sondas son sustituidas por anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio.
Una variante de esta técnica es la vertiente aplicada al diagnóstico de la alergia. En este caso, las
proteínas alergénicas, en su forma biológica activa, están sólidamente ancladas a la superficie del
microarray y se enfrentan a suero problema del cual se quieren detectar anticuerpos específicos.
Por tanto, estos arrays no están basados en la complementariedad de las bases de DNA sino una
reacción antígeno-anticuerpo sobre una matriz.
Chips de ADN de oligonucleótidos
En los chips de ADN de oligonuleótidos o micromarreglos de canal único, las pruebas son designadas a
partes de una secuencia conocida o un ARNm predicho. Estos chips de ADNs dan estimaciones del nivel
de expresión, pero distintas condiciones no pueden ser observadas en una misma matriz, por lo que por
cada condición se ha de utilizar un chip.
Chips de ADN para Genotipado
Los chips de ADN pueden ser utilizadas para "leer" las secuencias de un genoma particular en
determinadas posiciones.
Los SNP arrays son un tipo particular de matrices que son usadas para identificar variaciones
individuales y a través de poblaciones. Los oligonucleotidos pequeños son capaces de identificar
polimorfismos de un sólo nucleótido (en inglés SNPs, single nucleotide polymorphisms) que podrían ser
los responsables de variaciones genéticas dentro de una población, la fuente de susceptibilidad a
distintas enfermedades genéticas e incluso a ciertos tipos de cáncer. En general, la aplicación de estas
técnicas de genotipado es forense, ya que son rápidas en descubrir o medir la predisposición de
enfermedades o incluso permitir el uso de ciertos medicamentos para tratar ciertas enfermedades según
sea el ADN del enfermo o donante. Los chips de ADN de SNPs son también utilizadas para identificación
de mutaciones somáticas en cáncer, sobre todo la pérdida de heterocigosis, la amplificación o la deleción
de regiones de ADN en el genoma individual de pacientes afectados, es decir la detección de
aberraciones cromosómicas..
Un chip de ADN (del inglés DNA microarrays) es una superficie sólida a la cual se unen una serie de
fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser vidrio,
plástico e incluso chips de silicio. Los arreglos de ADN son utilizadas para averiguar la expresión de
genes, monitorizándose los niveles de miles de ellos de forma simultanea.
La tecnología del chip de ADN es un desarrollo de una técnica muy usada en biología molecular, el
Southern blot. Con esta tecnología podemos observar de forma casi instantánea la expresión de todos
los genes del genoma de un organismo. De tal forma que suelen ser utilizados para identificar genes que
52
producen ciertas enfermedades mediante la comparación de los niveles de expresión entre células sanas
y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades.
La tecnología básica sobre la cual se sustentan estos dispositivos es común y consiste en que el material
biológico complementario a los genes que se desea analizar se deposita en cantidades microscópicas
sobre superficies sólidas en unas posiciones definidas, anclando las sondas al soporte y generando
matrices (Figura 9).
A continuación se deposita la muestra marcada que se hibrida con su DNA complementario. El análisis
para identificar el material que ha hibridado, intensidad de hibridación y localización se realizará
detectando radioactividad, color o fluorescencia en dependencia del método de marcaje utilizado (Figura
10). Cada microcasilla de los ―mi croarrays o biochips‖ actúa como un tubo de ensayo en el que se
produce una reacción. Los ―biochips‖ se fabrican con miles de secuencias de DNA conocidas, unidas a
una matriz en posiciones fijas. Cuando la muestra previamente modificada y tratada se deposita sobre
el ―chip‖, las secuencias marcadas se unen a sus complementarias y emiten fluorescencia cuando se
excitan con un láser a la longitud de onda adecuada. Para el análisis de mutaciones son necesarios dos
oligonucleótidos que contienen entre 15-20 bases, estos nucleótidos se sintetizan de tal forma que se
sitúe la mutación que se desea ana-lizar en la parte central. El DNA problema que contiene la mutación
se hibrida con la oligo-sonda que es complementaria a la misma y con menor eficacia a la oligo-sonda
normal, tras un lavado en condiciones adecuadas, únicamente permanecerá fijado el DNA que está
unido a la -sonda a la cual es totalmente complementaria En el caso de un sujeto heterocigoto se
obtendrá una señal positiva con las dos sondas.
Figura 9. “Microarrays”.
Se utilizan distintos tipos de materiales para fijar la ―sonda‖ y una amplia variedad de sistemas
miniaturizados: ―macroarrays‖, micromatrices ―microarrays‖ y oligochips ―biochips‖. Los oligochips
―biochips‖ de DNA, presentan la peculiaridad de contener una gran cantidad de oligonucleótidos de
tamaño entre 10 y 25 nucleótidos, a menudo sintetizados in situ, alcanzando densidades de integración
de hasta 100.000 oligonu- cleótidos/cm2. Los ácidos nucleicos problema, generalmente se marcan con
fluorófo- ros lo que facilita su localización. Los soportes utilizados suelen ser de vidrio sometido
previamente a un tratamiento especial. El tipo y las técnicas de fabricación de los bio-chips dependen de
las casas comerciales variando en cuanto a la dispensación de reactivos sobre el chip, síntesis de
oligonucleótidos, tipo de hibridación (química o electrónica), marcaje y detección.
53
Figura 10. Revelado de un “array”.
Los ―Genechips‖ desarrollados por la compañía Affymetrix consisten en pequeñas láminas de vidrio que
poseen grupos reactivos sobre los cuales se une un nucleótido y posteriormente a partir de este
nucleótido unido al soporte se sintetiza la cadena del oligonucleótido correspondiente in situ. Esta
síntesis en fase sólida in situ de oligonucleótidos se realiza gracias a la protección de los grupos
reactivos de los nucleótidos mediante una película de un agente químico fotodegradable. Sobre el chip
se sitúa una máscara y se enfoca un haz de luz hacia microposiciones determinadas del chip
degradando el agente fotoprotector en estas regiones. A continuación se añade un medio que contiene
uno de los 4 nucleótidos que se une al nucleótido que ha sido desprotegido. Como los nucleótidos
añadidos llevan moléculas protectoras de los restantes grupos fotodegradables, la cadena que se va
sintetizando del oligonucleótido queda protegida a no ser que incida un rayo de luz sobre ella
54
La operación se va repitiendo de forma automatizada con los distintos nucleótidos hasta conseguir
generar los oligonucleótidos de la secuencia deseada. Sin embargo, para la fabricación de un ―biochip‖
es necesario disponer de la información previa del número y características de las mutaciones y/o
polimorfismos que se quiere determinar.
Se han diseñado y desarrollado micromatrices capaces de genotipar múltiples genes. Las muestras de
DNA se amplifican en las zonas de los genes a analizar mediante la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) multiplex y las variantes alélicas son analizadas simultáneamente utilizando una
matriz en la que se encuentran inmovilizadas las sondas específicas. El desarrollo de los biochips
permite hacer un diagnóstico genético preciso, sin embargo el abaratamiento de los costes de
secuenciación mediante los secuenciadores de nueva generación ha desplazado en parte el uso de esta
tecnología.
Micro-RNA
Los microRNA (miRNA) son RNA de pequeño tamaño (entre 19 y 25 nucleótidos) que no codifican
proteínas. Son producidos a partir de estructuras de RNA de entre 60 y 110 nucleótidos conocidos como
pre-miRNA, que son transcritos producidos a partir de transcritos primarios de mayor tamaño conocidos
como pri-microRNA (Figura 11). Los miRNA regulan de forma negativa sus genes dianas mediante dos
mecanismos:
A) Reducción de los mRNA de los genes diana: Los miRNA se unen por complementariedad perfecta (o
prácticamente perfecta) a secuencias de mRNA codificantes induciendo la ruta de RNA de
interferencia. Los transcritos de mRNA son fragmentados por ribonucleasas en el complejo miRISC, lo
que lleva a la degradación de los mRNA de los genes diana. B) Reducción de los niveles de la proteína
codificada por los genes diana: Los miRNA se unen por complementariedad imperfecta a las regiones
3´UTR de los mRNA de los genes diana, lo que lleva a una represión de la expresión del gen inhibiendo
su traducción.
1. Análisis de perfiles de expresión de los miRNA
Con el avance en las técnicas de biología molecular actualmente es posible determinar simultáneamente
los niveles de expresión de la totalidad de los miRNA descritos. Entre las técnicas disponibles para el
análisis de miRNA conocidos se encuentra la PCR cuantitativa en tiempo real, que permite la
cuantificación desde un solo miRNA hasta el análisis en tarjetas de 384. Es factible también determinar
los perfiles de expresión empleando técnicas de alto rendimiento como los microarrays de expresión, de
los cuales la empresa Affymetrix™ ofrece la capacidad de analizar en un solo chip miRNA de hasta 71
especies de interés en investigación (6.703 miRNA en total). La plataforma de Illumina™ analiza de
expresión de 1.146 miRNA humanos y un formato de análisis de nivel intermedio (Veracode™), es capaz
de determinar simultáneamente los niveles de expresión de hasta 96 miRNA. Para la identificación de
miRNA desconocidos se encuentra la técnica de expresión génica serial de miRNA (miRAGE).
55
Figura 11. Ruta de biogénesis y mecanismos de inactivación de los miRNA en mamíferos.
Los niveles de sensibilidad para analizar los miRNA constituyen un problema, sin embargo actualmente
existen estrategias de amplificación de transcritos que permiten trabajar con nanogramos de RNA total.
También cabe la posibilidad de utilizar otras estrategias en las que no se amplifica el material genético,
sino que únicamente se intensifica la señal obtenida de los perfiles de expresión de miRNA tal es el caso
del método RAKE (RNA primed Array based Klenow Enzyme assay). Finalmente, el desarrollo de
métodos de análisis de miRNA que combinan la biotecnología con la nanotecnología permite detectar y
cuantificar miRNA en el rango de fentomolar.
Se han desarrollado varios métodos computacionales de la predicción de genes diana de los miRNA. En
el caso de los mRNA diana de los miRNA, el hecho de que sean muy cortos y de que los dúplex
miRNA-RNAm no son plenamente complementarios, convierten en todo un reto conseguir los patrones
de hibridación. Se encuentran disponibles numerosas herramientas bioinformáticas que predicen genes
blanco de miRNA: miRanda http://www.microrna.org/microrna/home.do; miRBase http://mi-
crorna.sanger.ac.uk; TargetScan http://www.targetscan.org; PicTar http://pictar.mdc- berlin.de;
RNAHybrid ; http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid.
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Bibliografía
(1) LOZANO JA, GALINDO JD, GARCÍA-BORRÓN JC, MARTÍNEZ-LIARTE JH, PEÑAFIEL R, SOLANO
F: Bioquímica y biología molecular en ciencias de la salud. 3ª edición. Editorial MacGraw-
Hill/Interamericana; 2005.
(2) RODRIGUEZ-SANCHEZ IP, BARRERA HA: Ciencia UANL, 2004 ;7: 323-335.
(3) TAGU D, MOUSSARD C: Fundamentos de las Técnicas de Biología Molecular. Editorial Acribia;
2006.
(4) WATSON JD: Biología Molecular del Gen. 5ª Edición. Editorial Panamericana; 2006.
(5) LUGOTRAMPE A, TRUJILLOMURILLO K: ―MicroRNAs: reguladores clave de la expresión génica‖.

Medicina Universitaria 2009;11:187-192.
(6) GREEN MR, SAMBROOK J: Molecular Cloning: A laboratory manual. 4ª Edición. Cold Spring Harbor
Press; 2012.
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PREPARACIÓN OPOSICIONES

FACULTATIVO ESPECIALISTA METODOLOGÍA DIAGNÓSTICO GENÉTICO

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 1 de 57

TEMA 5 .Metodología del diagnóstico genético: Estudio citogenético, enzimático y

El análisis cromosómico ha proporcionado un conocimiento básico de los cambios genéticos

1.1 CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 2 de 57

Es imprescindible que la muestra no esté contaminada en el momento de su siembra y que el transporte

La labor que realizan las consultas y laboratorios de Citogenética es fundamental en la estructura

1.1.1 MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA HUMANO

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de acuerdo a su tamaño y homología.

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TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 5 de 57

la longitud de los brazos corto y largo. (Fig. 3)

1.1.2. PROTOCOLOS Y TÉCNICAS DE CULTIVO EN CITOGENÉTICA HUMANA CONVENCIONAL

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TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 7 de 57

Técnicas de sembrado y cultivo celular

Técnica de cultivo de sangre periférica

Técnicas de sacrificio. Adición de Inhibidor de mitosis

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 8 de 57

Técnicas de recogida de células y procesado

Finalmente, la suspensión celular fijada se extiende sobre un portaobjetos previamente desengrasado

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 9 de 57

1.1.3 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA. BANDEO CROMOSÓMICO

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TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 13 de 57

1.1.4 TÉCNICA DE ANÁLISIS CROMOSÓMICO

para su posterior revisión.

1.1.5 EL INFORME EN CITOGENÉTICA

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 14 de 57

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 15 de 57

1.1.6 INDICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS CROMOSÓMICO

En general, las indicaciones clínicas que sugieren la necesidad de un Análisis citogenético

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 16 de 57

- Antecedentes familiares. Una anomalía cromosómica conocida o sospechada en un pariente de

1.1.7. PROTOCOLOS DIAGNÓSTICOS EN CITOGENÉTICA HUMANA

Los protocolos y algoritmos de actuación en Citogenética se basan en:

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1.2.- HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE

La HISF utiliza sondas específicas de centrómeros o de regiones específicas de cromosomas marcadas

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mieloide crónica o la t(15;17) en la leucemia aguda promielocítica y también es de extraordinaria

Sondas para hibridación in situ fluorescente

Sondas locus-específicas (LSI).

No obstante, su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 19 de 57

Sondas que hibridan simultáneamente con múltiples secuencias del cromosoma

Se denominan sondas de pintado cromosómico a aquellos fragmentos de ADN que se obtienen

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 20 de 57

Sondas que hibridan con una única secuencia de ADN

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 21 de 57

Sondas centroméricas (o alfoides)

Sondas de pintado cromosómico.

TEMARIO ANÁLISIS/CLÍNICOS SAS TEMA 5 V06 Página 22 de 57

Usos y limitaciones de la hibridación in situ fluorescente