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Resumen
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1. ¿Por qué la espectroscopia Raman?

Como lo describió el Dr. C. V. Raman en 1928, la señal de Raman suele ser débil (uno en
cien millones de fotones incidentes) y "requiere una iluminación muy potente para su
observación".1 Hoy en día, los avances en las fuentes láser y en los detectores sensibles
permiten la aplicación de este evento de dispersión en muestras que son más complejas que
los "líquidos o gases libres de polvo" originales. Los picos de Raman son típicamente
espectralmente estrechos (unos pocos números de onda) y en muchos casos pueden estar
asociados con la vibración de un enlace químico particular (o modo normal dominado por
la vibración de un solo grupo funcional) dentro de una molécula. 2 La Fig. 1 muestra un
ejemplo del espectro Raman, el de la fosfatidilcolina, una molécula fosfolípida, donde cada
banda puede correlacionarse con modos específicos de vibración de estiramiento y flexión
en la molécula, proporcionando así una huella molecular. Consecuentemente, en el tejido,
que está compuesto de una mezcla compleja de moléculas, la presencia de las bandas
únicas de fosfatidilcolina puede ser rastreada, resultando en la evaluación cuantitativa de la
composición química de la muestra. Esta evaluación cuantitativa o cualitativa a su vez
puede utilizarse para inferir cambios bioquímicos específicos asociados con la patología o
fisiología de los tejidos para el diagnóstico o la monitorización.

Fig. 1
Raman espectro de fosfatidilcolina, un fosfolípido conocido por estar presente en las células y
tejidos, medido utilizando una sonda de fibra óptica basada en el sistema Raman a 785 nm de
excitación. Los picos espectrales característicos corresponden a las vibraciones moleculares de la
molécula de interés.

Por lo tanto, la espectroscopia Raman es una técnica molecular específica que puede
utilizarse para desarrollar una comprensión bioquímica fundamental de la fisiología y la
patología de los tejidos y ampliar estos conocimientos para el diagnóstico y la
monitorización de los tejidos. La naturaleza óptica de la técnica permite extraer esta
información de forma no invasiva, o al menos no intrusiva, facilitando la utilidad de esta
técnica en un entorno clínico. Debido a que la dispersión Raman es un fenómeno sensible y
débil, las consideraciones sobre los instrumentos para adaptar esta técnica a las
aplicaciones clínicas pueden ser un desafío. Desde los informes iniciales de los espectros
de tejidos vivohumanos en 1993,3 el desarrollo tecnológico y el refinamiento de las técnicas
han permitido realizar mediciones Raman en humanos con tiempos de integración de 0,5-5
segundos, lo que permite una evaluación en tiempo real del estado de los tejidos. 4-6 Los
espectros ahora pueden ser recolectados, corregidos por componentes de señal indeseables,
procesados y analizados rápidamente para proporcionar retroalimentación automatizada en
el momento de la medición. 7-9 Con estos avances, las técnicas Raman satisfacen muchos de
los criterios requeridos para la adopción de una nueva técnica de diagnóstico biomédico en
la práctica clínica: sensibilidad a los cambios en el tejido, aplicación in vivo e información
única obtenida de forma no invasiva, en tiempo real. 10 Esta revisión se centrará en las
consideraciones vitales para la implementación eficiente de la espectroscopia Raman para
aplicaciones clínicas in vivo en el diagnóstico y la detección y en algunas de las principales
investigaciones clínicas que se encuentran bajo investigación continua.
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2. Instrumentación clínica
Un sistema Raman dispersivo es similar a la mayoría de los sistemas espectroscópicos
ópticos y consta de tres componentes primarios: fuente de luz, entrega y recolección de luz
de muestra y elemento dispersivo con detector (Fig. 2). Las especificidades de estos
componentes se ven desafiadas por las necesidades del entorno clínico y de la aplicación.
Al igual que los instrumentos médicos estándar, un sistema clínico Raman debe ser
pequeño y fácilmente transportable, la alineación óptica y la calibración deben ser robustas,
la entrega y recolección de la luz de la muestra debe ser esterilizable y resistente, y el
sistema de detección debe ser sensible a las señales biológicas débiles.
12 La
Fig. 2
Esquema básico de un sistema espectroscópico óptico (incluyendo Raman).

Los componentes que conforman un sistema clínico Raman pueden ser clasificados
ampliamente en ramas de excitación y detección. La excitación se logra mediante la
entrega de la luz de una fuente láser dada al sitio del tejido de interés, en general por medio
de una sonda de fibra óptica o un brazo articulado de entrega de luz. La luz difusa de
Raman es entonces recogida, a menudo a través del mismo sistema de entrega, y dirigida a
un espectrógrafo y un detector. A medida que se ha desarrollado la tecnología utilizada in
vivo para las mediciones clínicas, también se ha desarrollado la amplitud de los
componentes individuales que han sido investigados y aceptados dentro de estos sistemas.
Las siguientes secciones discutirán muchos de los requisitos para los componentes
individuales con el fin de realizar la espectroscopia clínica Raman.

a. Láseres
Debido a la débil naturaleza de la dispersión Raman, es imperativo suministrar suficiente
potencia a la muestra para generar fotones dispersos Raman para su detección en un tiempo
razonable de integración relevante para el entorno clínico en cuestión. Sin embargo, la
dispersión Raman está mediada por otros fenómenos ópticos competidores dentro de la
muestra. Además, es importante tener en cuenta cuestiones como la exposición máxima
permitida (determinada por ANSI u organizaciones similares) 11 y el aumento de la temperatura
(relevante para la comodidad del paciente y la minimización del daño tisular).
potencia del láser se convierte entonces en una función de identificar un compromiso entre la señal y el ruido, la seguridad y comodidad del paciente y las consideraciones de instrumentación. La elección del láser también se rige por otros factores, como la
estabilidad del láser, especialmente cuando se utiliza un láser multimodo. Las líneas Raman son estrechas y altamente específicas para un determinado modo vibracional. Esto implica que la posición precisa y el ancho de la línea Raman requiere que la fuente de excitación
sea estable en posición de longitud de onda, ancho de banda y modo espacial para obtener resultados consistentes. Habiendo considerado estos factores, las propiedades del tejido o
 13Las muestras

muestra objetivo son uno de los principales criterios para la elección de la fuente de excitación láser para un instrumento clínico Raman. Debido a que los cambios de Raman son relativos a la línea de Rayleigh (excitación), teóricamente se pueden obtener resultados similares de muchas configuraciones de
instrumentos diferentes. Sin embargo, las propiedades ópticas de las muestras, incluidos los coeficientes de dispersión y atenuación total, así como las propiedades de excitación, emisión y rendimiento de cualquier fluoróforo endógeno presente en la muestra, son factores críticos a tener en cuenta. El impacto de
cada uno de estos parámetros es una función de la longitud de onda.

con altos coeficientes de atenuación limitarán la capacidad de entregar y recoger la luz más
allá de las capas muy superficiales. Además, las moléculas de fuerte absorción en una
muestra también pueden llevar a la generación de un exceso de deposición de calor en el
tejido, lo que puede causar daños con una alta irradiancia. Asimismo, la presencia de
fluoróforos fuertes puede generar señales que superan los modestos picos Raman que se
detectan simultáneamente. Debido a la disminución asociada en el coeficiente de
atenuación total de las principales moléculas absorbentes en muchos tejidos biológicos
(agua, melanina, oxihemoglobina y desoxihemoglobina), las fuentes de excitación NIR se
eligen comúnmente para los instrumentos clínicos. 14 Además, dado que pocos fluoróforos
biológicos conocidos tienen su emisión máxima en esta región del espectro, con una
notable excepción de la melanina, el desplazamiento a las longitudes de onda NIR para
excitación da como resultado un fondo de fluorescencia más bajo en el tejido a estas
longitudes de onda y simplifica el procesamiento de la señal necesario para extraer las
bandas Raman en comparación con la excitación visible o UV. 15 Como se muestra en la
Fig. 3, los tejidos como el seno (A) que no tienen señales de autofluorescencia fuertes
relativas a las características de Raman pueden ser recolectados con varias longitudes de
onda diferentes; sin embargo, los tejidos altamente autofluorescentes como el riñón (B)
requieren el uso de longitudes de onda de excitación más largas para obtener espectros
Raman útiles. Por lo tanto, las propiedades de los tejidos son consideraciones vitales a la
hora de elegir la fuente láser para la aplicación clínica de la espectroscopia Raman.
Fig. 3
Las señales de ajuste del polinomio de dispersión y autofluorescencia Raman para (A) seno y (B)
riñón midieron ex vivo a 785 nm (azul) y 1064 nm (verde) de longitudes de onda de excitación.
Las características fuertes de Raman del tejido mamario son evidentes a pesar del fondo del tejido,
mientras que las intensidades bajas de Raman del riñón están completamente abrumadas por
la fuerte señal intrínseca a 785 nm pero más fácilmente visible a 1064 nm.

20 diodos

Los primeros sistemas Raman se basaban en el láser de iones de argón para excitación
visible,16,17 láser Nd:YAG (granate de aluminio y itrio-aluminio dopado con neodimio) para
aplicaciones FT-Raman,18 y láser de titanio:zafiro (Ti:Sapph) para excitación NIR. Las altas
potencias de salida, los modos de funcionamiento espaciales y longitudinales únicos y los
perfiles de haz gaussiano permiten un rendimiento óptico casi limitado por la diferenciación
para todas estas fuentes. 19 Sin embargo, el tamaño de estos láseres y sus requerimientos
electrónicos y de enfriamiento limitan su practicidad en un sistema clínico portátil Raman.
Algunos instrumentos Raman actuales, especialmente aquellos con capacidades confocales,
todavía utilizan el láser Ti:Sapph. El desarrollo y el avance continuo de la tecnología láser de
diodos ha cambiado completamente la huella de un sistema Raman típico. Los láseres de diodos
utilizan componentes electro-ópticos (diodos), que emiten luz en función de la
corriente aplicada y de la temperatura de funcionamiento. Los son pequeños (<1

mm3) y requieren una electrónica de control de alta precisión para obtener la salida estable
necesaria para la excitación Raman. Sin un control térmico y de corriente altamente
estabilizado, los diodos láser son propensos a los efectos termoelásticos en la longitud de la
cavidad del láser (y por lo tanto en la frecuencia de salida) y en las fluctuaciones de la
potencia de salida, respectivamente. Los diodos láser también se caracterizan por su salida
de haz elíptico (forma rectangular de la faceta de salida) y astigmatismo (divergencia
desigual del haz de cada dimensión de la faceta rectangular). Estos factores complican el
acoplamiento de haz libre de los láseres de diodos, que normalmente requieren ópticas de
conformación de haz para su implementación exitosa. La mayoría de los láseres de diodos
comerciales están disponibles con una opción de espiral para acoplar directamente una
fibra al diodo láser para minimizar las pérdidas debidas al astigmatismo y a la naturaleza
elíptica del haz.
Más recientemente, los láseres de diodo de cavidad externa (ECDL) han surgido como
fuentes de luz robustas y rentables para aplicaciones Raman. La longitud extendida de la
cavidad resonante del diodo láser minimiza el efecto de pequeños cambios termoelásticos
en la frecuencia de salida al extender la distancia entre los modos longitudinales del diodo.
Comparado con un diodo láser estándar, el ECDL disminuye los saltos de modo, minimiza
el ancho de banda espectral de la luz de salida, permite la sintonización de longitud de
onda y disminuye la respuesta de frecuencia dependiente de la temperatura. 21 El ancho de
línea del láser de <0,001 nm (a 785 nm) con bloqueo de modo proporcionado por un ECDL
es vital para aplicaciones médicas donde la repetibilidad de la medición y la resolución
espectral son parámetros de rendimiento importantes. Los ECDL están disponibles
comercialmente en configuraciones sintonizables Littman-Metcalf o Littrow, y se pueden
fabricar en longitudes de onda específicas utilizando configuraciones de reflectores Bragg
distribuidos. Se comercializan láseres de diodos estabilizados de 22,23 Mode con potencias
del orden de 300 mW, ya sea en configuraciones monomodo o multimodo, diseñados
específicamente para la espectroscopia Raman, lo que aligera la carga para aquellos que
desarrollan sistemas clínicos Raman.

b. Sondas de fibra óptica

La aplicación clínica de la espectroscopia Raman requiere la entrega y recolección de luz
hacia y desde la muestra (tejido). Esto es típicamente mediado a través del uso de fibras
ópticas configuradas para maximizar la recolección de la señal mientras que minimiza las
24 Como las

26 La

señales de interferencia generadas en las fibras y en la óptica relacionada. sondas de

fibra óptica serán discutidas en un manuscrito relacionado en este número especial, aquí
sólo presentamos consideraciones relevantes para la traducción clínica. Dependiendo de las
limitaciones del objetivo clínico, los diseños de las sondas pueden adaptarse a la mejor
interfaz con la muestra y acceder a la región de interés. Las consideraciones de diseño
dependen de la configuración de Raman en estudio (discutida más adelante), la ubicación
del órgano en estudio, la microanatomía del tejido y la fisiopatología de la enfermedad.
Un aspecto crítico a considerar en la traducción de la espectroscopia Raman del laboratorio a
la clínica es la naturaleza inherente de la dispersión Raman. La dispersión Raman es un
fenómeno débil pero la mayoría de los materiales son Raman activos, y por lo tanto los
materiales utilizados en el sistema Raman generan señales Raman que interfieren con la
detección de la señal de muestra. 25 La mayoría de las sondas de fibra óptica utilizan fibras
ópticas hechas de sílice de bajo contenido de OH, que han sido ampliamente utilizadas en
muchas aplicaciones de luz en un entorno clínico. sílice es inherentemente inerte,

susceptible a la esterilización y relativamente barata, lo que la convierte en el material de

primera elección cuando se diseñan sondas de fibra. Desafortunadamente, la sílice tiene
una señal Raman fuerte, con varias bandas que pueden abrumar la señal de la muestra. 25
Esta señal de fibra puede tener magnitudes iguales y a veces superiores a las de la muestra
en estudio, por lo que cualquier diseño de sonda debe tener en cuenta este comportamiento.
27 La señal de fibra puede ser generada en el núcleo de la fibra de entrega y en el

revestimiento por la luz de excitación. Además, la señal de fondo también puede ser
generada en las fibras de recolección por cualquier luz de longitud de onda de excitación
que regrese a la(s) fibra(s) de recolección. 27,28 Las técnicas matemáticas típicamente no logran
desconcentrar esta señal de fibra no deseada de la señal de la muestra, ya que la intensidad
de la señal de sílice depende de la naturaleza reflexiva y de dispersión de la muestra y de la
pérdida de fotones debida a la flexión de la fibra. Un diseño de sonda factible que utilice
fibras de sílice debe, por lo tanto, evitar que la señal de sílice generada en la fibra de
entrega ilumine la muestra, así como evitar que la luz de excitación dispersada
elásticamente entre en las fibras de recolección y genere esta señal.
Se han propuesto varios diseños diferentes para la posible adquisición clínica de espectros
Raman utilizando sondas de fibra óptica basadas en sílice. 25,29 Desde los primeros informes
de diseño, la mayoría de los diseños de fibra se han basado en conceptos similares con
modificaciones. En general, los diseños de las sondas Raman utilizan un filtro pasabanda
colocado después de la lente de fibra de excitación, lo que permite solamente la transmisión
de la luz de excitación. Para conseguirlo, se han utilizado filtros de paso de banda
dieléctricos para desplazar en azul el límite de longitud de onda con un ángulo de
incidencia cada vez mayor y, por lo tanto, se ha demostrado que actúan como un espejo
unidireccional para la luz difusa elástica. 30 Este fenómeno aumenta la eficiencia general de
la sonda al evitar que múltiples fotones incidentes dispersos salgan del tejido y regresen a
la fibra fuente. Los filtros de paso largo o de hendidura se colocan delante de las fibras de
recolección para bloquear la transmisión de la luz de excitación reflejada por Fresnel, así
como para evitar que la luz dispersada elásticamente entre en las fibras de recolección.
Estos filtros pueden colocarse en la punta de la sonda, en las conexiones de fibra dentro de
la sonda, o depositados directamente en el extremo de las fibras mismas para maximizar la
eficacia, requiriendo generalmente tamaños del orden de unos pocos milímetros o más
pequeños para el filtrado de la punta distal. Por lo tanto, existe una demanda de
recubrimientos ópticos de alta calidad y componentes microópticos que simplificarán el
diseño de las tan necesarias sondas compactas de fibra óptica para la espectroscopia Raman
en biomedicina. Alternativamente, los materiales no basados en sílice, como las fibras
cristalinas y las guías de ondas huecas, han sido evaluados para las aplicaciones Raman; 31,32
sin embargo, estos materiales no han sido probados para uso clínico y, como tales, no se
incluyen aquí.
Los diferentes diseños de sondas de fibra de sílice disponibles en el mercado producen
diferentes geometrías de muestra y diámetros de sonda, lo que a su vez afecta a la
aplicación en cuestión. Por lo tanto, es fundamental considerar la anatomía de la muestra
que se va a estudiar junto con la fisiopatología de la enfermedad que se va a medir, de
modo que se pueda obtener un muestreo adecuado. 33 Por ejemplo, cuando se estudia el
revestimiento interno del colon, donde el revestimiento epitelial tiene un grosor de capa
variable basado en el estado de la enfermedad, es importante que la sonda esté diseñada
para muestrear sólo las capas superficiales del tejido y no en el tejido más profundo. 34 Se
han desarrollado una serie de sondas de muestreo diferentes para cumplir con criterios de
diseño específicos, como el tiempo de adquisición rápido, la selectividad de profundidad o
la recopilación de conjuntos de datos de modalidades complementarias. 35-39Algunos de los
diseños de sondas más comunes y proveedores asociados se enumeran en la Tabla 1.
Cuadro 1
Resumen de los componentes típicos utilizados para construir un sistema Raman dispersivo
portátil clínicamente utilizable

Sonda de
Láser fibra Espectrógrafo DIRCE

B&N Tek Visionexa Kaiser f/1.8i, f/2, 2i Princeton Instruments

BRDDb

Sacher Lasertechnik InPhotonics Andor Technology Shamrock Andor Technology

SR-303i BRDDb
 Sonda de
Láser fibra Espectrógrafo DIRCE

Instrumentos de proceso Emvision Princeton Instruments LS 785 Sinopsis de Horiba

SDL En casa Horiba Labram, HE-785 Kodak KAF 1001E

Soluciones innovadoras Óptica Oceánica QE65000 Óptica Oceánica

en fotónica QE65000

Estas empresas ya no existen.

Tecnología de chip CCD de agotamiento profundo reflejado por retroceso (BRDD).

c. Espectrógrafos y detectores
Un sistema típico de detección dispersiva Raman usado para aplicaciones clínicas potenciales
consiste en un espectrógrafo de imagenología de corta longitud focal conectado a una cámara
de dispositivo de acoplamiento de carga enfriada (CCD). La implementación clínica de la
espectroscopia Raman requiere una adquisición espectral de no más de unos pocos segundos.
Esta adquisición rápida necesita a su vez un espectrógrafo rápido y un detector altamente
sensible, especialmente dada la naturaleza débil de la señal Raman. Una cámara CCD típica
utilizada en espectroscopia consiste en un chip rectangular en el que el eje horizontal
corresponde al eje de longitud de onda/número de onda y el eje vertical se utiliza para apilar
múltiples fibras con el fin de aumentar el rendimiento, que posteriormente se puede encapsular
para mejorar la relación señal/ruido (SNR). Los avances tecnológicos han dado lugar a chips
CCD con eficiencias cuánticas del orden del 90% en el NIR (esta información puede
encontrarse en cualquiera de los sitios web de los proveedores de CCD (Tabla 1)). Mientras
que diferentes tipos de chips están disponibles comercialmente para diferentes aplicaciones, un
CCD de retroiluminación y agotamiento profundo es altamente recomendado para la
espectroscopia NIR Raman. Estos chips son, sin embargo, conocidos por ser susceptibles al
llamado efecto etalonaje,40-42 en el que el delgado chip de silicio actúa como un etalón, lo que
resulta en la introducción de picos agudos en la señal de muestra que son difíciles de resolver a
partir de la señal Raman de banda estrecha. Sin embargo, las cámaras CCD están ahora
disponibles en el mercado, lo que elimina efectivamente este efecto. 40-42 La mayoría de los
CCDs de Raman utilizan un sistema Peltier multietapa termoeléctrico (TE) para enfriar
activamente la cámara a al menos -70 °C con el fin de obtener un excelente rendimiento de
ruido oscuro. De hecho, los
sistemas Raman actuales para la mayoría de las aplicaciones biomédicas sólo
están limitados por el ruido de los disparos.

47,48

La señal de fondo de tejido es la plaga de la espectroscopia Raman dispersiva, que inunda el

detector y dificulta la evaluación de los espectros Raman de la muestra. Este fondo,
especialmente en muestras de tejido complejas, puede surgir tanto de la emisión de banda
ancha de autofluorescencia como de la dispersión elástica tanto de la luz de excitación dispersa
como de las bandas Raman mismas. El rendimiento de la luz no colimada y de los filtros
angulares dependientes puede añadir un fondo sustancial al espectro, al igual que la dispersión
y el ensanchamiento espectral de los propios picos de Raman; estos fenómenos son
continuamente variables con la longitud de onda. 43 La presencia de fluoróforos en las muestras
también contribuye con una amplia señal de fondo al espectro Raman recolectado y está
mediada por la excitación dependiente de la longitud de onda para los cromóforos que lo
componen. Sin embargo, la mayoría de los fluoróforos tisulares, con la excepción de las
porfirinas y la melanina44, tienen sus máximos de excitación y emisión en longitudes de onda UV y
visible (UV/VIS). 45 Por lo tanto, se prefieren fuentes visibles y NIR más largas a longitudes de
onda tales como 633, 785, y 830 nm sobre aquellas en el UV/VIS para reducir la cantidad de
ambas fluorescencias que interfieren con la señal Raman detectable. La selección de las
longitudes de onda NIR apropiadas para la excitación a menudo se rige por factores que
compiten entre sí. Cuanto mayor es la longitud de onda, menor es la fluorescencia y el fondo de
dispersión que debe rechazarse; sin embargo, la dispersión Raman también disminuye.
Nuevamente como se muestra en la Fig. 3, donde la excitación de 785 nm fue plagada por
autofluorescencia y dispersión en el tejido renal (B) que fue mitigada por la excitación de 1064
nm. Además, mientras que los detectores CCD de silicio son capaces de ofrecer un excelente
rendimiento en la mayoría de los NIR, la eficiencia cuántica disminuye rápidamente con la
longitud de onda, cayendo por debajo del 15% a 1000 nm. Por lo tanto, es necesario evaluar los
parámetros de la intensidad de dispersión de Raman, el fondo de tejido y la eficiencia del
detector en relación con el tejido bajo estudio para determinar el rango de longitud de onda que
se utilizará. En general, los investigadores en este campo tienden a preferir la excitación de 785
nm como un compromiso razonable para la mayoría de los tejidos (según las publicaciones
revisadas en la Tabla 2). Cabe señalar que al adquirir espectros Raman en la región de onda alta
(2400-3800 cm-1 en los tejidos), que es de aproximadamente 967-1118 nm para una excitación
de 785 nm, la obtención de señales Raman de SNR alto puede ser difícil utilizando detectores
basados en silicio debido a la disminución de las eficiencias cuánticas. Para la detección de
longitudes de onda superiores a 950 nm, es necesario utilizar otros tipos de detectores como el
arseniuro de galio indio (InGaAs), el germanio y el fosfuro de indio (InP). Sin embargo, estos
detectores sufren de una menor eficiencia cuántica y un aumento de ruido en comparación con
los detectores de silicio. 46 Sin embargo, las configuraciones de instrumentos que utilizan
fuentes Nd:YAG y detectores multicanal InP/InGaAsP han reportado recientemente la
factibilidad de la espectroscopia Raman en tejidos como el pulmón y el tejido gástrico a 1064
nm de excitación con tiempos de adquisición del orden

de cientos de segundos. Los informes ex vivo de los autores también han demostrado

recientemente el potencial para aplicaciones clínicamente relevantes de los instrumentos

Raman dispersos de 1064 nm, particularmente para el tipo de tejido con un fondo de
alta fluorescencia a 785 nm (Fig. 3). 12,49
Cuadro 2
Resumen de los grandes estudios clínicos (n > 50) realizados con espectroscopia Raman in
vivo en humanos

Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

Esófago de Sonda Wilson et 2005 65 86(displásico), 88 (no 82

Barrett Raman al. 88(alto grado) plástico), 89
(no de alta
calidad)

Esófago de Confocal Huang et2014 373 87 (alto grado) 84.7 101

Barrett Raman al.

Cáncer de Sonda Murali 2014 63 100 96.7 162

cuello uterino Raman Krishna et
al.

Cáncer de Sonda Murali 2014 93 100 93 161

cuello uterino Raman Krishna et
al.
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

Precáncer Sonda Mahadeva 2009 145 96,2 (displasia 90,7 157

cervical Raman n-Jansen premenopáusic (premenopáusi

et al. a) ca)

Precáncer Sonda Mahadeva 2011 172 96,5 (displasia) 97.8 93

cervical Raman n-Jansen

et al.

Precáncer Confocal Huang et2013 84 81 (displasia) 87.1 163

cervical Raman al.

Precáncer Sonda Mahadeva 2007 79 89 (alto grado) 81 (benigno) 160

cervical Raman n-Jansen

et al.

Cáncer de Sonda Huang et2015 50 90,9 (adenoma) 83,3 (pólipos 128

colon Raman al. hiperplásticos)
(HF)
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

cáncer Sonda Huang et 2011 107 92.6 (gástrico) 88.6 (gástrico) 99

al. y 90.9 y 93.9
gastrointestina Raman l
(esófago) (esófago)

cáncer Sonda Huang et 2011 81 97.9 (gástrico) 91.5 189

gastrointestina Raman l al.

cáncer Sonda Huang et 2015 164 92.5 (sonda 93.1 (sonda 184
al. biselada) biselada)
gastrointestina Raman
85.8 (sonda 88.6 (sonda
l (HF)
volumétrica) volumétrica)

Huang et 2013 83 83,3 (displasia) 95.895 188

cáncer Sonda
al. 84,9 .6
gastrointestina Raman l
(adenocarcino
ma)

cáncer Sonda Huang et 2010 67 94 (gástrico) 93.4 185

al.
gastrointestina Raman l
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

cáncer Sonda Huang et 2011 67 94,6 (gástrico) 94.697 182

al. 89,3 .8
gastrointestina Raman l
(validación
independiente)

cáncer Sonda Huang et2010 62 76,7 (en 91,4 (en 183

al. general) general)
gastrointestina Raman l

Huang et2014 450 81,3 88.3 186

cáncer Sonda
al. (prospectivo)
gastrointestina Raman l

Huang et 2010 71 82,1 (úlceras 90.8 187

Úlceras Sonda
al. malignas)
gastrointestina Raman
84,7 (úlceras
les
benignas)

Cáncer oral Sonda Murali 2012 104 86 (tumores) 74 176

Raman Krishna et 72

al. (premalignos)
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

Cáncer oral Sonda Gupta et 2014 199 96 (maligno) 99 (normal) 180

Raman al. 88 77 (multiclase)

(premaligno),
84 (maligno)
(multiclase)

Cáncer oral Sonda Murali 2013 84 92.7 (tumor) 98,7 (control 177
Raman Krishna et saludable)

al. 84
(contralateral
normal)

Cáncer de piel Sonda Tunnell et 2014 76 100 (melanoma 100 (lesión 154
Raman + al. maligno) pigmentada)
fluorescenc 90 (cáncer 85 (normal)
ia no melanoma)

Cáncer de piel Sonda Moryatov 2014 50 89 (melanoma 87 173

Raman + et al. maligno)
fluorescenc
ia
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

Cáncer de piel Sonda Meinke et 2015 104 74 (basal + 82 172

Raman al. célula
escamosa)

Cáncer de piel Sonda Zeng et 2012 453 90 (cáncer vs.64 6

Raman al. benigno)

Cáncer de piel Sonda Zeng et 2008 289 91(cáncer) 75 (benigno) 174

Raman al. 97(melanoma 78 (lesión
maligno) pigmentada)

Dermatitis Microscopí Irvine et 2010 132 98.7 86.9 175

a Raman al.

Carotenoides Resonancia Mayne et2012 381 115

cutáneos Raman al.

Pigmento Resonancia Stevenson 2006 97 114

macular Raman et al.
 Númer
Año de o de
Tipo de Método publicaci pacien Sensibilidad Especificidad Ref
enfermedad Raman Grupo ón te (%) (%) .

Degeneración Resonancia Stevenson 2013 433 112

macular Raman et al.

Degeneración Resonancia Gellerman 2002 201 113

macular Raman et al.

Abrir en una ventana separada

Un sistema de detección Raman-sensible capaz de realizar mediciones clínicas requiere un
espectrógrafo de imágenes apropiado que se acople a la interfaz de la muestra (como una
sonda de fibra) en un extremo y el CCD de su elección en el otro extremo. Los
espectrógrafos compactos, robustos y optimizados para el uso de Raman están ahora
disponibles comercialmente con un número f que coincide con la apertura numérica (NA)
de las fibras ópticas y un alto rendimiento para una rápida adquisición (ver Tabla 1). Para
resolver los detalles de las bandas Raman biológicas, el sistema de detección Raman debe
tener una resolución espectral de 8 cm-1 como máximo. Dado que la resolución espectral
depende de la óptica de acoplamiento, el tamaño de la ranura (o el tamaño de la fibra si no
se utiliza ninguna ranura) y el tamaño del píxel CCD, cada uno de ellos desempeña un
papel crucial en el diseño y la selección del sistema de detección. 50 Es común utilizar fibras
de 200-400 micrones de diámetro de núcleo en la sonda de fibra óptica para obtener la
máxima recolección de señales en la muestra. Sin embargo, esta pila de fibras colocadas en
el puerto de entrada del espectrógrafo reducirá significativamente la resolución espectral
del sistema. Si se asume 1 : 1 coincidencia de fibra óptica, 200 fibras de colección de
núcleo de μm apiladas en el puerto de entrada del espectrógrafo, sin ranura (o una ranura de
200 μm) y un tamaño de píxel de CCD de 25 × 25 μm, la resolución espectral resultante es
de 15,14 cm-1 para una rejilla de dispersión de 6,13 nm mm-1 (típica para rejillas
holográficas). 51 Se puede reducir la abertura de entrada a 100 μm y/o reducir el diámetro
del núcleo de la colección a 100 μm y lograr una resolución espectral de 7,6 cm-1 que se
aproxima a lo que se necesita para resolver los picos de tejido Raman. Dado que los haces
de las fibras son gaussianos, se puede especular que cuando se utiliza un tamaño de
hendidura más pequeño con fibras más grandes, la pérdida de fotones de Raman no es tan
significativa ya que sólo se está cortando la cola del haz. Además, las fibras más grandes
son más fáciles de trabajar cuando se construye una sonda filtrada que las fibras de
diámetro más pequeño. Por lo tanto, la realización de estos cálculos espectrales al diseñar
el sistema Raman, particularmente con respecto a la dispersión y, por lo tanto, a la
resolución espectral, necesita ser seguida durante la selección de cada uno de los
componentes necesarios para el sistema de detección Raman.

56 Se

Otros componentes adicionales del sistema de detección incluyen filtros de rechazo que
eliminan cualquier luz láser, así como la luz difusa elástica de la señal detectada. Los filtros
holográficos de hendidura pueden bloquear la longitud de onda del láser con una densidad
óptica de seis con bordes empinados y proporcionar una transmisión del 90% en otras partes
con una curva relativamente plana. 52 Para la dispersión, las rejillas transmisivas holográficas
generalmente tienen el rendimiento de rendimiento más alto, 53 sin embargo, la mayoría de ellas
se implementan en posiciones fijas, permitiendo la medición de sólo una parte del espectro
Raman a la vez. Además, el rendimiento de estos componentes puede derivar durante largos
períodos de tiempo (años), potencialmente debido a la degradación ambiental (humedad,
temperatura). Recientemente se ha renovado el interés por los enfoques reflexivos y basados en
prismas de la dispersión. 54,55 Las rejillas reflectantes pueden normalmente cubrir una gama más
amplia del espectro con una alta resolución espectral, pero a menudo resultan en un tiempo de
integración más largo debido a la menor eficiencia y movimiento de la posición de la rejilla.
Algunos dispositivos eluden este problema incluyendo opciones versátiles para mediciones
espectrales estáticas o de rango completo, o incluyen rejillas con diferentes elementos de
dispersión para lograr una alta resolución. En general, los instrumentos con rejillas múltiples
también tienen una huella más grande que aquellos con rejillas fijas. El tamaño es una
consideración importante al diseñar un dispositivo clínico, ya que el espacio disponible en la
mayoría de las salas de procedimientos clínicos es muy limitado. La pequeña huella necesaria
también está directamente en contradicción con los diseños de los espectrógrafos que reducen
las aberraciones que limitan el rendimiento basadas en largas distancias focales. Algunos
grupos han intentado tomar en cuenta las distorsiones de curvatura de campo en sistemas
transmisivos diseñando cuidadosamente el extremo del detector de la sonda de fibra para que
tenga una forma parabólica que se mapee apropiadamente a una línea vertical en el

detector, limitando la superposición de la señal y mejorando la resolución espectral. han

implementado diseños de instrumentos más nuevos usando óptica correctiva o técnicas de

conformación del haz para reducir el impacto de las aberraciones; sin embargo, estos
instrumentos aún no han sido reportados para la investigación clínica. Otra técnica
disponible para su uso en el entorno de sobremesa es la imagen hiperespectral Raman, que
recoge la cartografía global de alta resolución a través de imágenes monocromáticas. 57 Esta
técnica de instantánea proporciona información espacial para las muestras rápidamente; sin
embargo, hasta ahora no se ha implementado en la investigación clínica. El aumento de la
investigación que estudia la banda de ondas altas también ha dado lugar a la disponibilidad
comercial de espectrómetros con una cobertura espectral ampliada a expensas de la
resolución, el tiempo de integración o el tamaño total. Sin embargo, debe tenerse en cuenta
que existen varios espectrógrafos que satisfacen las necesidades de un sistema Raman
portátil; estos espectrógrafos son de diseño compacto y robustos para uso portátil (ver
Tabla 1).
La mayoría de las mediciones Raman en aplicaciones médicas de hoy en día se basan en
sistemas Raman de última generación, de alto costo y alto rendimiento, que son compactos
y altamente sensibles a las débiles señales Raman biológicas. 58,59 Aunque cada investigador
tiene sus preferencias en cuanto a los detalles específicos de los diferentes componentes del
sistema, el diseño depende en última instancia del tejido/organo en estudio y de la
fisiopatología del proceso que se va a monitorear. La Tabla 1 presenta los láseres, sondas
de fibra, espectrógrafos y cámaras CCD más comunes utilizados para construir sistemas
Raman clínicos, tal como se describe en los documentos enumerados en la Tabla 2.

60 La

Al describir y guiar la selección de cada uno de los componentes descritos anteriormente,

se presume que la espectroscopia Raman es la única modalidad que se está considerando, y
la configuración Raman que se utilizará es la espectroscopia Raman dispersiva, para
evaluar las firmas bioquímicas asociadas con el problema biomédico que se está estudiando
en la región de la huella dactilar o del número elevado de onda. Estos componentes pueden
ser obtenidos de cualquier número de proveedores o desarrollados dentro de un laboratorio
para ensamblar un sistema adecuado para el estudio específico en cuestión. Es vital para
cualquier aplicación clínica que los componentes individuales se integren en la
configuración de instrumentos más eficiente posible y que todas las fuentes espurias de
señales de confusión se minimicen a través del diseño.

d. Procesamiento y análisis de datos

i. Calibración de instrumentos
Basado en la sección anterior, se hace evidente que para comparar los espectros Raman
adquiridos de diferentes tejidos se requieren algunos métodos estandarizados de calibración y
procesamiento que permitan la transferibilidad de estos espectros. La Fig. 4 presenta un
diagrama de flujo de los principales pasos de procedimiento y su orden para convertir los datos
de medición brutos del detector en señales listas para su comparación y análisis. La
compensación de la fuente es un proceso estándar que puede aplicarse para controlar la
variabilidad de la fuente desde la medición hasta la medición. Este paso es crítico sólo cuando
se necesitan intensidades absolutas para el análisis. Las variaciones en la respuesta del
instrumento requieren dos tipos de calibración: calibración espectral y calibración de
intensidad. La calibración espectral se utiliza para convertir el eje horizontal del número de
píxeles CCD al número de onda relativo. El espectro de emisión de una fuente de luz calibrada
conocida, como una lámpara de neón con numerosas y estrechas bandas en el NIR, se utiliza
normalmente para calibrar el eje horizontal en números de onda absolutos (cm-1). La
calibración relativa del número de onda se realiza utilizando la posición espectral de la línea
láser y luego se valida utilizando estándares con características Raman bien caracterizadas y
una fuerte dispersión Raman, como naftalina y acetaminofeno. Los estándares espectrales
como el fluoróforo rodamina 6G y un dispersor Raman débil como el
azul de metileno o la vitamina E pueden utilizarse como estándares de intensidad
adicionales para tener en cuenta las variaciones diarias en la intensidad espectral.
calibración del eje de intensidad (corrección de la respuesta espectral) es necesaria para tener
en cuenta la respuesta dependiente de la longitud de onda de los distintos componentes del
tramo de detección del sistema, incluida la rejilla, los filtros, la óptica y la eficiencia cuántica
del chip CCD. Esto se realiza típicamente usando una fuente calibrada como una lámpara de
tungsteno certificada por el Instituto Nacional de Estándares y Pruebas (NIST) para generar
factores de corrección de intensidad para variaciones en el
rendimiento del instrumento. 61 Este proceso de calibración es esencial para la comparación
de espectros medidos a través de diferentes instrumentos Raman para la misma o similar
muestra. Esta calibración se realiza típicamente al principio de un estudio y luego de forma
regular para validar la precisión de los factores de corrección a lo largo del tiempo. Sin
embargo, la perturbación de cualquiera de los componentes ópticos, incluidos los inducidos
por el traslado del sistema del laboratorio a la clínica, puede afectar a la calibración, por lo
que también debe desarrollarse un método adicional que tenga en cuenta la calibración
diaria del rendimiento del sistema. La recolección de un espectro de intensidad de lámpara
NIST es a menudo poco práctica en una situación clínica debido a los controles
experimentales necesarios para asegurar que la emisión brillante y difusa de la lámpara
atraviese sólo su trayectoria prevista a través del instrumento Raman hasta el detector,
junto con las preocupaciones de seguridad que corresponden a la intensidad espectral en la
porción UV del espectro. Más recientemente, los estándares de intensidad espectral
consistentes en vidrio Schott de color verde han sido explorados por NIST62 y otros
grupos63 como alternativas más prácticas para la calibración diaria, pero aún no se ha
llegado a un consenso sobre su aplicabilidad como un estándar Raman.
 Abrir en una ventana separada
Fig. 4
Diagrama de flujo para los procedimientos típicos de calibración de sistemas y procesamiento de
señales para sistemas de espectroscopia clínica Raman. Las casillas sombreadas más oscuras
indican los pasos que requieren la recolección de espectros de referencia antes de la adquisición de
datos, mientras que los otros pasos pueden implementarse en línea por espectro para la
automatización del sistema.

Como se indica en la Tabla 1, es posible configurar un sistema Raman utilizando diferentes

combinaciones de láser, espectrógrafo, sonda y detector. En un estudio paramétrico de
combinaciones de láser, sonda y detector CCD para un único espectrógrafo, se investigó la
influencia de cada componente en la configuración de un instrumento sobre la fiabilidad y
reproducibilidad de los espectros Raman (no publicado). Las diferentes combinaciones de
estos componentes se pueden ver en la Fig. 5. Al aislar el impacto de cada instrumento, este
trabajo identificó que el impacto más significativo sobre la señal obtenida fue impulsado
por la sonda de fibra óptica. Cuando se mantuvo una sola sonda en diferentes láseres,
espectrógrafos y CCD, la varianza total de las señales detectadas disminuyó
significativamente en relación con las señales obtenidas cuando se combinaron espectros
entre sondas. Estos datos resaltan la importancia de usar un diseño de sonda única para la
recolección de datos para una aplicación clínica determinada.

Abrir en una ventana separada

Fig. 5
Diagrama para un estudio comparativo de los componentes del sistema de espectroscopia clínica
Raman. Mediante diversas combinaciones de instrumentos, los estudios de variabilidad han
investigado el impacto de los componentes únicos en las firmas espectrales adquiridas. Los
resultados muestran que la parte de recolección del sistema y el diseño de la sonda de fibra tienen la
contribución más significativa a la varianza del instrumento observada en los espectros.

Incluso cuando se selecciona un diseño de sonda única para un instrumento clínico Raman
determinado, es importante tener en cuenta con precisión la variabilidad inducida por el
instrumento. El estudio de variabilidad antes mencionado indica la importancia de utilizar
un diseño de sonda única para la recolección de datos clínicos (Fig. 6A). Sin embargo, no es
factible realizar un estudio clínico de gran tamaño ni fabricar un posible dispositivo médico
que dependa de una sola sonda durante toda la vida útil del instrumento. Como se utilizan
múltiples sondas construidas a partir de un solo diseño, debe tenerse en cuenta que cada
componente óptico puede tener una respuesta similar, pero en última instancia única,
dependiente de la longitud de onda. Como se muestra en la Fig. 6 para diferentes mediciones
de tejido in vivo con sondas únicas del mismo diseño, las diferencias en el filtrado y el
rendimiento pueden afectar no sólo a las señales en bruto (Fig. 6B) sino también a los
espectros procesados resultantes (Fig. 6B, recuadro). Sin embargo, los métodos de calibración
actuales no proporcionan una calibración adecuada para minimizar la respuesta de la sonda, lo
que a su vez afecta al análisis de datos cuando se combinan espectros a través de múltiples
sondas. 60 En la práctica, estos datos indican la necesidad de calibrar adecuadamente las
señales específicas de la sonda para la implementación exitosa de las técnicas Raman y la
comunidad necesita trabajar en conjunto para desarrollar tales métodos. Mientras tanto, se
recomienda que los investigadores adquieran múltiples sondas basadas en un solo diseño y
construidas al mismo tiempo, para minimizar esta variabilidad.

Fig. 6
Diferencias espectrales Raman representativas que pueden obtenerse de una sola muestra adquirida
utilizando dos sondas diferentes. (A) Una sonda Raman convencional filtrada (verde) y una sonda
Raman dirigida por haz (azul) sobre la piel in vivo demuestran formas de línea únicas. (B) Dos
iteraciones del mismo diseño de sonda utilizadas para medir una muestra de albúmina demuestran el
efecto de filtros en línea ligeramente diferentes sobre el espectro Raman en bruto y el espectro
Raman procesado resultante (insertado).

ii. Procesamiento de datos

1. Eliminación de fluorescencia y de fondo

El aumento de la investigación de la espectroscopia Raman con fines biológicos y

clínicos se debe en gran medida a su alta sensibilidad a cambios bioquímicos sutiles y a
su capacidad de aplicación no intrusiva. Uno de los retos a los que se enfrentan estas
investigaciones es que las aplicaciones biológicas involucran objetivos turbios,
químicamente complejos y muy variados. Por lo tanto, existen retos significativos tanto
para adquirir firmas Raman viables como para suprimir las fuentes de ruido inherentes al
medio de destino. El mayor desafío para obtener espectros Raman a partir de materiales
biológicos es la fluorescencia intrínseca y la dispersión elástica de muchas moléculas
orgánicas. A menudo varios órdenes de magnitud más intensos que las modestas señales de
Raman, este fondo, si no se trata, probablemente dominará el espectro de Raman y
dificultará el análisis y la interpretación de la bioquímica tisular. Para extraer la señal
Raman de los espectros brutos adquiridos, es necesario eliminar la señal de fluorescencia.
Mientras que la mayor parte de la fluorescencia biológica se produce en el UV/VIS y la
intensidad disminuye en función de la longitud de onda, la fluorescencia y el fondo de
dispersión observados para NIR todavía interfieren con el espectro Raman medido (Fig.

64 Aunque

74 Las

3B). La intensidad de este fondo depende generalmente del tejido, pero está presente en
casi todos los tejidos estudiados, lo que merece atención antes del análisis espectral.
Se han propuesto técnicas de hardware y software para la sustracción de fondo de las
señales Raman en bruto. El cambio de longitud de onda y la compuerta de tiempo son
técnicas basadas en hardware que han demostrado minimizar eficazmente la interferencia
de fluorescencia en los espectros de Raman, pero que requieren consideraciones de diseño
específicas para que el sistema espectroscópico logre sus resultados. 64,65 Varios métodos
matemáticos basados en software pueden ser implementados sin modificación del sistema
y generalmente son preferidos para la eliminación de fluorescencia. Tales técnicas han
incluido diferenciación de primer y segundo orden, 66,67 filtrado de dominio de frecuencia,
transformación de 64 wavelet, 68,69 suavizado multietapa,70 y ajuste polinomial. 7,71,72 Cada uno de
estos métodos ha demostrado ser útil en ciertas situaciones, sin embargo, todos tienen sus
ventajas y limitaciones que deben ser evaluadas antes de seleccionar un método para su
aplicación con un sistema dado.

La diferenciación de primer y segundo orden se basa en la emisión de fluorescencia dependiente de la longitud de onda invariable en comparación con los desplazamientos relativos medidos en el espectro Raman. Una manera de lograr esta diferenciación es midiendo el espectro a dos (o más) longitudes de onda de excitación ligeramente desplazadas (dentro de unos
pocos nanómetros) y tomando su diferencia. 73 La integración del espectro de diferencia da como resultado la señal Raman original. Se pueden lograr resultados similares con una sola longitud de onda de excitación tomando la primera derivada del espectro e integrando el espectro derivado suavizado por el ruido después de la corrección de la línea de base. 64,67El
método derivado para la sustracción de fluorescencia es eficiente e imparcial, pero distorsiona las formas de línea de Raman y se basa en complejos algoritmos matemáticos de ajuste para reproducir una forma espectral tradicional.

muchos de estos métodos fueron desarrollados y probados a principios de la década de 1990,

los métodos de excitación por desplazamiento para eliminar esta señal fluorescente
indeseable, acuñados como espectroscopia Raman de longitud de onda modulada, están
volviendo a ponerse de moda, utilizando múltiples fuentes de excitación estrechamente
espaciadas y algoritmos de procesamiento de señales para eliminar la señal de
fluorescencia. fuentes más nuevas permiten el uso de longitudes de onda de excitación

múltiples para mejorar la precisión del método; sin embargo, la eliminación

del desplazamiento de CC sigue siendo un problema.
El filtrado de frecuencia y el ajuste polinómico son otros métodos comunes para la
eliminación de la fluorescencia. El filtrado de frecuencia puede lograrse con la
transformada rápida de Fourier (FFT), transformando el espectro en el dominio de la
frecuencia tomando la FFT que luego se multiplica con un filtro digital lineal para
eliminar la fluorescencia. El FFT inverso produce el espectro Raman libre de
fluorescencia. 64 Si los elementos de frecuencia de las características Raman y ruido no
están bien separados, este método puede generar artefactos en los espectros procesados.
Un método más directo para restar la fluorescencia que es simple y preciso es ajustar el
espectro medido que contiene tanto la información de Raman como la de fluorescencia a
un polinomio suficiente para describir la forma lineal de fluorescencia sin capitular la
forma lineal de Raman de frecuencia más alta. 7El ajuste de curvas polinomiales tiene una ventaja
sobre otras técnicas de reducción de fluorescencia debido a su capacidad inherente para
retener los contornos espectrales y las intensidades de los espectros Raman de entrada y
puede implementarse fácilmente en MATLAB® u otras plataformas informáticas para un
rendimiento automatizado.
Las técnicas individuales tienen ventajas y desventajas; el método utilizado debe
seleccionarse en base a la aplicación específica y mejor adaptado a la técnica de medición.
Mosier-Boss et al. probaron el uso de las técnicas de excitación desplazada, primera
derivada y FFT para la sustracción por fluorescencia e indicaron una preferencia por el uso
del FFT basado en su capacidad para filtrar el ruido aleatorio del espectro. 64 En un análisis
de las diferentes técnicas del autor para aplicaciones de tejido in vivo, se encontró que el
uso de un ajuste polinomial era la técnica óptima tanto para consideraciones experimentales
como computacionales. Más recientemente, se ha propuesto un algoritmo de ajuste
polinómico modificado que tiene en cuenta los niveles de ruido72,75 que ha demostrado que
minimiza la presencia de picos artificiales en espectros de baja SNR que son comunes en
las mediciones de tejidos con alta autofluorescencia. Debe tenerse en cuenta que el orden
del polinomio utilizado es específico para la forma de la línea de fluorescencia de la
muestra y, como tal, debe determinarse antes de utilizar esta técnica (Fig. 7).
 Abrir en una ventana separada
Fig. 7
El impacto de la eliminación de fondo varía en función de la muestra o tejido medido. La
sustracción por fluorescencia usando (A) polinomio de 5to orden en la piel y el cuello uterino
produce formas únicas debido a las diferencias de composición. (B) El uso de un polinomio de 5º
versus 7º orden en el colon (inserto de espectros procesados) demuestra que un solo orden de ajuste
polinomial puede no ser apropiado para todas las muestras; se utilizan polinomios de orden superior
para simular la fluorescencia de fondo y se restan para mejorar la señal Raman subyacente de la
muestra.

82,83

Otros métodos han utilizado técnicas avanzadas de procesamiento de señales para separar la
autofluorescencia subyacente de las señales Raman deseadas. Se han descrito la
descomposición de ondículas, las técnicas de ajuste de mínimos cuadrados penalizados76 y
el análisis de componentes principales (PCA) para la supresión de los componentes de
señal confusos. 77 La transformación de ondículas depende del método de descomposición
utilizado y de la forma del fondo de fluorescencia, mientras que la PCA asume que la
mayor variación de la señal se debe al fondo de fluorescencia, que puede no ser válido para
algunas aplicaciones. Por lo tanto, hay compensaciones para cada método y la elección
puede estar regida tanto por la aplicación en cuestión como por la preferencia del
investigador.

2. Alisamiento de ruido y binning

Dado que la dispersión Raman es un fenómeno tan débil, el SNR de la mayoría de los
espectros Raman medidos requiere un alisamiento de ruido significativo para poder extraer las
bandas Raman subyacentes. Se han utilizado eficazmente varios tipos de filtros suavizadores
de ruido. Estos incluyen el filtro de mediana, el filtro de ventana de promedio móvil, el filtro
Gaussiano cuyo ancho completo a la mitad del máximo es típicamente igual a la mitad de la
resolución espectral del sistema, y el filtro Savitzky-Golay de varios órdenes. 59,78-81Otros métodos
incluyen el uso de PCA, algoritmos genéticos y otros enfoques estadísticos multivariados para
eliminar los componentes de orden superior y eliminar
eficazmente el ruido. Al utilizar cualquiera de estos u otros métodos de alisamiento de

ruido, se debe tener cuidado de mantener la integridad de la forma espectral,

especialmente cuando se trata de muestras con múltiples picos que están cerca uno del
otro. La validación del método utilizando espectros de muestras Raman débiles (con baja
SNR) debería ser un paso esencial en el proceso de desarrollo.
Otros métodos de preprocesamiento típicamente aplicados incluyen el binning del conjunto
de datos espectrales debido al gran número de variables (que depende del tamaño del chip
CCD) para facilitar el cálculo. Dependiendo de la variabilidad de los datos adquiridos y de
las necesidades de los métodos de análisis utilizados, también se pueden aplicar varios
métodos de normalización para permitir la comparación de los espectros. Los métodos de
normalización incluyen la normalización a estándares de intensidad, la normalización a la
intensidad máxima o al área bajo la curva de un espectro propio, y la escala media al
espectro promedio adquirido de un paciente dado. Algunos investigadores prefieren usar
espectros de diferencia para lograr el mismo efecto de normalización para tener en cuenta la
variabilidad intra e interpaciente observada.

iii. Análisis de datos

Una de las ventajas del diagnóstico espectroscópico es la automatización, que permite un
diagnóstico objetivo y en tiempo real de las patologías. Las diferencias espectrales
observadas en función de la fisiología o patología de los tejidos pueden incorporarse a
algoritmos de diagnóstico que, a su vez, pueden aplicarse en tiempo real para obtener una
clasificación mediante métodos estadísticos univariantes y multivariantes; se han
identificado y aplicado varios enfoques estadísticos para la extracción de características y
la clasificación de tejidos con vistas a un diagnóstico clínico automatizado. Dado que la
espectroscopia Raman es una técnica bioquímicamente específica, las contribuciones del
cromóforo y de las moléculas de dispersión pueden extraerse de los espectros medidos.
Estos pueden ser utilizados en algoritmos de diagnóstico, así como en la comprensión de la
firma espectral en lo que se refiere al proceso de la enfermedad. Por ejemplo, las
contribuciones extraídas pueden utilizarse para cuantificar analitos sanguíneos para
aplicaciones como la detección de glucosa. 84
Los análisis originales de las señales Raman se basaron en las diferencias de intensidad,
forma y ubicación de las diversas bandas Raman entre células y tejidos normales y
anormales. Las diferencias observadas entre los diferentes tipos de tejido bajo estudio se
seleccionaron para los algoritmos de clasificación basados en métodos empíricos que
utilizan cambios en la intensidad o en las proporciones de las intensidades o en el número y
la ubicación de los picos. Por ejemplo, se ha observado que la relación de intensidad del
modo vibratorio de flexión del CH2 a 1440 cm-1 y del modo vibratorio de la Amida I a
1655 cm-1 varía con la enfermedad en varias aplicaciones, incluyendo cánceres de mama,
cánceres ginecológicos y precanceras. 85,86 Sin embargo, la limitación de este enfoque es que
la información útil para el diagnóstico puede estar contenida en algo más que en los picos o
valles observados en el tejido; un método de análisis y clasificación que incluya toda la
información espectral disponible puede ser importante para la exactitud de la detección.
Además, los métodos empíricos tienden a estar sesgados a favor de las diferencias
espectrales específicas del conjunto de datos utilizados para el análisis y estos métodos no
se mantienen bajo validación. Para obtener una estimación imparcial del rendimiento de los
algoritmos para los datos Raman, las técnicas estadísticas multivariadas se han convertido
en la práctica aceptada para el desarrollo de algoritmos de discriminación y clasificación
para aplicaciones de diagnóstico.
En los últimos años se han dado grandes pasos en la aplicación de técnicas multivariantes para
el análisis espectroscópico de datos en la detección de enfermedades. Se han empleado técnicas
de discriminación como la regresión lineal y no lineal, así como técnicas de clasificación como
las redes neuronales. 61,87 Las herramientas de compresión de datos, como el PCA, se siguen
utilizando habitualmente para reducir la dimensionalidad de la matriz de datos y se han
utilizado para tener en cuenta la variabilidad de los datos. 88 También se han utilizado métodos
lineales y no lineales para la extracción de características. Posteriormente, se han utilizado
métodos como el análisis jerárquico de conglomerados (HCA) 89 y el análisis discriminante
lineal (LDA)87 para obtener algoritmos de clasificación para la diferenciación de enfermedades.
Los mínimos cuadrados parciales, una técnica basada en la regresión, así como el análisis
lineal híbrido, se han utilizado para modelar tejidos basados en espectros de componentes,
encontrando contribuciones de componentes para la detección de enfermedades y extrayendo
concentraciones precisas de analitos como la glucosa utilizando espectros NIR Raman para el
análisis sanguíneo transcutáneo. 90,91
También se han utilizado métodos de aprendizaje multivariados y automáticos más
complejos, incluyendo máquinas vectoriales de apoyo,92 modelos de regresión logística,49,93
algoritmos genéticos,82 redes neuronales,94 árboles de decisión,95 técnicas de optimización,91
y modelos lineales generalizados. Estos métodos permiten la integración de restricciones
no gaussianas y pesos variables para optimizar el rendimiento de la clasificación. Sin
embargo, debe tenerse en cuenta que estos métodos complejos no necesariamente
proporcionan una mejora significativa en el rendimiento diagnóstico de la espectroscopia
Raman y, como tal, la mayoría de los estudios tienden a basarse en métodos de
discriminación más simples (y a menudo lineales), aunque multivariados.
En conjuntos de muestras pequeños, a menudo se confía en los métodos de validación
cruzada"leave-one-out" o"K-fold", así como en los métodos anidados para múltiples pasos
de optimización. Se pueden obtener estimaciones rigurosas e imparciales desarrollando
algoritmos de discriminación robustos utilizando un conjunto de pruebas y cuantificando su
rendimiento en un conjunto de validación. Idealmente, estos dos conjuntos están formados
por la distribución aleatoria de la población de sujetos en dos conjuntos de datos iguales.
La verdadera medida del éxito de la espectroscopia Raman para el diagnóstico de tejidos
requiere la validación del algoritmo probado en un amplio conjunto de validación imparcial
(e independiente). 96
El análisis de las señales Raman para detectar diferencias espectrales y el desarrollo de
algoritmos de diagnóstico para la clasificación de enfermedades son una faceta de la
aplicación clínica de la espectroscopia Raman para el diagnóstico de tejidos. Sin embargo,
la riqueza de la información proporcionada en los espectros Raman, especialmente con
respecto a la composición molecular, permite identificar la naturaleza y los procesos
bioquímicos responsables de estos cambios. Esta información se puede utilizar para mejorar
la comprensión fundamental de los diversos procesos biológicos, así como para informar la
mejora del rendimiento de los diagnósticos.
Varios investigadores han aprovechado el beneficio de extraer marcadores fisiológicamente
relevantes del espectro Raman de los tejidos. Puppels et al. obtuvieron información
cuantitativa sobre la hidratación de la piel basada en los espectros de Raman. 97 Feld et al.
desarrollaron modelos completos para la extracción de componentes bioquímicos que se
utilizaron para la clasificación de enfermedades. 98 Más recientemente, Huang et al. realizaron
un modelado biomolecular semicuantitativo de mínimos cuadrados basado en espectros de base
representativa con el fin de distinguir las fuentes espectrales de lesiones neoplásicas en
múltiples pacientes. 99 Cada uno de estos métodos se basa en la adquisición de espectros Raman
a partir de cromóforos identificados individualmente, ya sea como componentes morfológicos
del tejido, como componentes bioquímicos extraídos o como productos químicos puros
disponibles en el mercado. Se ha utilizado la microspectroscopia Raman pixelada (con o sin
confocalidad) para medir los espectros Raman a partir de componentes de tejido morfológico
individuales utilizando secciones de tejido. Un espectrómetro Raman se acopla a un
microscopio y se escanea a través de la sección de tejido para obtener imágenes Raman que
luego se pueden correlacionar con secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) para
identificar los componentes morfológicos relevantes y su firma Raman. Alternativamente, los
dispersores de tejido pueden extraerse de ensayos bioquímicos y se pueden adquirir espectros
Raman de cada uno de estos cromóforos extraídos utilizando el mismo instrumento que se
utiliza para medir el
espécimen biológico. Utilizando modelos matemáticos como los desarrollados por el
grupo Feld, se pueden calcular las contribuciones de cada uno de los componentes
extraídos o morfológicos para el tejido intacto.
Así, un instrumento portátil y clínicamente viable con una sonda de fibra óptica puede ser
utilizado para adquirir espectros Raman in vivo. La capacidad de la espectroscopia Raman
en un tejido particular puede probarse en animales in vivo o in vitro y posteriormente
aplicarse para la detección humana in vivo. Los espectros adquiridos pueden ser procesados
y analizados y se puede extraer información sobre el rendimiento de la técnica, así como
sobre los componentes bioquímicos que contribuyen a las señales obtenidas por el método.

iv. Interfaz tecnológica, control y automatización

Una característica importante que es fundamental para la traducción de la espectroscopia
Raman o de cualquier otra tecnología de laboratorio a una clínica médica es la limitación de
una interfaz intuitiva y automatizada. Dada la debilidad inherente de la dispersión Raman y
la complejidad de las señales generadas, se debe dedicar mucho cuidado y esfuerzo al
desarrollo de la interfaz del instrumento antes de su despliegue para una aplicación médica.
Afortunadamente, los componentes del instrumento discutidos anteriormente pueden
combinarse de una manera apropiada para un objetivo de detección de modo que las señales
puedan ser detectadas rápidamente. Una vez detectada, la velocidad de la tecnología
informática moderna puede utilizarse para el procesamiento en tiempo real para la
eliminación en segundo plano, la extracción de componentes y la predicción de clases. La
optimización de los algoritmos para cada paso es vital para una interfaz intuitiva, junto con
consideraciones prácticas que incluyen la mejor manera de mostrar la retroalimentación al
usuario final. El primer paso hacia una integración exitosa es implementar un control de
usuario clínicamente relevante. La recolección de datos habilitada para manos libres con
pedales o botones en la interfaz de la sonda son características que permitirán el uso clínico,
junto con instrumentos que operan en tiempo real y proporcionan retroalimentación
continua. Zeng et al. y Huang et al. han reportado sistemas que integran la recolección,
procesamiento y análisis de datos en tiempos tan bajos como 100 ms. 6,56,100,101 Incluso con la
integración del procesamiento rápido, la información proporcionada por una herramienta
complicada basada en los espectros de Raman podría ser abrumadora. La combinación de
esta información en una pantalla de fácil interpretación o en una retroalimentación audible
son pasos vitales para la integración clínica, de modo que con un entrenamiento mínimo,
estos dispositivos pueden ser desplegados para beneficiar a la medicina clínica.
Ir a:

3. Configuraciones Raman
Se han utilizado varias modalidades diferentes de dispersión Raman para analizar la
estructura de varias moléculas biológicas. 102,103 Algunas de estas técnicas incluyen la
espectroscopia ultravioleta (UV), Raman visible o dispersiva NIR, Raman de Fourier (FT-
Raman), Raman de superficie mejorada (SERS) y Raman de resonancia ultravioleta
(UVRR). 2,104 Las técnicas desarrolladas más recientemente incluyen la estimulación Raman
(SRS), Raman con punta mejorada (TERS), y la dispersión Raman coherente anti-Stokes
(CARS). 105-107 La adopción temprana de la espectroscopia Raman para aplicaciones biológicas
con interferencia mínima de fluorescencia se basó en la espectroscopia FT-Raman, en la
que se detecta la transformación de Fourier de la señal dispersa, y posteriormente se
transforma en inversa para dar la firma real de Raman. Esta técnica produce una mejor
relación señal/ruido de eventos difíciles de detectar, pero requiere largos tiempos de
recolección97 que no son prácticos para su implementación clínica e in vivo. Con los
recientes desarrollos en la tecnología de láser y detector, los métodos de FT-Raman se han
vuelto más o menos obsoletos, al menos en lo que se refiere al diagnóstico clínico y como
tales no se discuten aquí. La dispersión NIR Raman dispersiva, que se persigue
ampliamente como una técnica viable para aplicaciones humanas in vivo, se excita
típicamente en el rango de 780-1100 nm, donde se produce una fluorescencia mínima que
facilita la detección de la señal Raman débil, especialmente en materiales biológicos. Sin
embargo, varias otras configuraciones de la espectroscopia Raman han sido
implementadas in vivo y a continuación se describe un resumen de algunas de ellas en lo
que respecta a su posible aplicación clínica.

118,119

a. UV/VIS
Mientras que la mayoría de las implementaciones para la espectroscopia clínica Raman
dependen de la excitación NIR (785 u 830 nm), algunos investigadores continúan usando
longitudes de onda visibles para aplicaciones biomédicas. La compensación entre las
secciones transversales de alta dispersión Raman a longitudes de onda de excitación más
bajas y la disminución de la profundidad de penetración, la absorción más alta, la
autofluorescencia y la generación de calor suele limitar el potencial de la aplicación clínica
in vivo con técnicas visibles. Sin embargo, algunos estudios continúan aplicando estas
fuentes de excitación más fácilmente disponibles para varios estudios, particularmente
cuando no se requiere una interacción directa con el paciente. 108-110 Especialmente en las
aplicaciones de la espectroscopia Raman para el análisis patológico, para las que los
protocolos clínicos de citología e histología ex vivo suelen emplear diapositivas de vidrio
convencionales como sustrato, las fuentes visibles, como las de 532 nm, demuestran
mejoras significativas en la señal de fondo en relación con la excitación NIR. 111 Otros
trabajos ex vivo continúan para varias neoplasias malignas, incluyendo la piel y la
neoplasia oral, con longitudes de onda visibles que muestran resultados prometedores. 112–115
La activación del Raman de resonancia puede lograrse cuando la longitud de onda de
excitación se aproxima a la absorción electrónica de una molécula. 116 La excitación de la
resonancia Raman aumenta la intensidad de la señal de dispersión en varios órdenes de
magnitud. Sin embargo, las frecuencias de absorción típicas de las moléculas biológicas
como las proteínas y los ácidos nucleicos se producen en las longitudes de onda ultravioleta,
donde estas longitudes de onda pueden causar la fotólisis de la muestra y destruirla con el
tiempo. 117 Además, la mutagenicidad de la radiación UV hace que esta
técnica sea inviable para el uso clínico in vivo. Como tal, pocos investigadores han

seguido este enfoque para aplicaciones clínicas potenciales en años recientes.

b. Imágenes Raman
La naturaleza débil de la dispersión de Raman dificulta la obtención de imágenes de las
características de Raman en materiales biológicos como células y tejidos con
espectroscopia Raman dispersiva en tiempos de integración clínicamente factibles. La
imagenología Raman intrínseca se ha realizado usando la intensidad de una banda Raman
específica o proporción de bandas para construir una imagen de células y tejidos. 120 Como
se mencionó anteriormente, un método adquiere una pila hiperespectral de imágenes
monocromáticas sobre áreas espaciales relativamente grandes. Otro enfoque consiste en
compilar un cubo de datos tridimensional midiendo los espectros Raman a través del
barrido de puntos o líneas de los haces de excitación y recolección. 121 El tamaño del vóxel
puede ser gobernado por la resolución espacial necesaria para el estudio y puede ser tan
pequeño como el estenopo confocal de hasta ~100 s de micrómetros. Ambos métodos de
imagenología se realizan en un microscopio Raman y pueden requerir de varios minutos a
horas para adquirir una imagen dependiendo de la resolución espacial, haciéndola inviable
para aplicaciones clínicas en tiempo real. La mayoría de los estudios con imágenes Raman
escaneadas en puntos o líneas se han utilizado para mejorar nuestra comprensión de los
procesos biológicos en células y tejidos in vitro, así como en modelos animales. 19,122,123
Otros métodos de imagenología Raman incluyen técnicas Raman no lineales como la
espectroscopia Raman coherente anti-Stokes (CARS) y la dispersión Raman estimulada que
aprovecha los procesos no lineales para señales aumentadas y selectivas. Ambos métodos
no lineales se han aplicado para estudiar las interacciones bioquímicas en células y tejidos,
y las aplicaciones in vitro e in vivo se han limitado a modelos de ratón. 107,124-127 Sin embargo,
todas estas técnicas de imagenología están restringidas por el número limitado de fotones
Raman disponibles y por lo tanto los largos tiempos de integración necesarios para adquirir
una imagen Raman exitosamente. Como tal, ninguno de estos enfoques se ha aplicado con
éxito in vivo en humanos y no son directamente prácticos para el uso clínico.

c. Huella dactilar versus número de onda alto

Mientras que la mayoría de los investigadores que aplican la espectroscopia Raman para
aplicaciones clínicas se han centrado principalmente en las diferencias espectrales en el
rango de las huellas dactilares (hasta unos 1.800 cm-1), algunos estudios han investigado la
utilidad diagnóstica de las características espectrales en el número de onda alta,
generalmente de 2.200 a 4.500 cm-1, en las que pueden observarse características
distintivas y fuertes de los lípidos, las proteínas y el agua (Fig. 8). La menor cantidad de
características pero más amplias que ocurren en la región del número de onda alto pueden
ser mucho más altas en intensidad en relación con las señales ópticas de la competencia.
Varios estudios han demostrado el potencial de la espectroscopia Raman de alto número de
onda sola o en combinación con métodos Raman de huellas dactilares para discriminar y
clasificar enfermedades in vivo. 128 La detección de características Raman de número de
onda alto plantea diferentes requisitos en el diseño del sistema Raman. Debido a que la
señal de número de onda alto está inherentemente a una longitud de onda más alta que la
huella dactilar, pueden ser necesarios diferentes rejillas, filtros y, lo que es más importante,
detectores para recolectar señales de manera eficiente, especialmente cuando se utilizan
fuentes de excitación NIR Raman comunes (descritas en la sección de detectores anterior).
Alternativamente, debido a que la separación entre la línea de Rayleigh y las bandas Raman
detectadas es tan grande, el filtrado en línea puede ser mitigado, lo que tiene el potencial de
simplificar el diseño de las sondas y reducir el costo, aumentando así el potencial de
traducción clínica.
Fig. 8
La huella dactilar y el espectro Raman de alto número de onda del tejido mamario ex vivo
representan los rasgos amplios y fuertes característicos de los componentes lipídicos del tejido.
Ambos segmentos del espectro Raman pueden proporcionar información valiosa para la evaluación
de la composición compleja de la muestra.

d. SORS
Quizás la configuración más impactante de la espectroscopia Raman en los últimos años ha
sido el descubrimiento de la espectroscopia Raman espacialmente compensada (SORS). La
teoría de la migración de fotones dicta que los fotones que inciden en la superficie de los
tejidos y que resurgen después de sólo unos pocos eventos de dispersión probablemente
sufrirán un desplazamiento transversal mínimo y viajarán a través de las profundidades
más superficiales. Los fotones que sufren muchos eventos de dispersión tienen más
probabilidades de sufrir un desplazamiento transversal mayor y de viajar más
profundamente dentro del tejido, debido al hecho de que la función de la fase de dispersión
del tejido está principalmente en la dirección hacia adelante. La combinación del
desplazamiento espacial con el efecto Raman introduce la selectividad de profundidad en
las mediciones espectrales, ampliando la capacidad de la espectroscopia Raman para
fenómenos subterráneos en aplicaciones biomédicas. 129 La intensidad de la luz dispersa de
Raman en el offset espacial cero incluye contribuciones tanto de las capas superficiales
como de las subyacentes. Sin embargo, a medida que aumenta el desplazamiento espacial,
la intensidad de la señal de las capas superficiales disminuye más rápidamente que la
intensidad de la señal de las capas subyacentes, lo que aumenta la proporción relativa de la
señal de las capas más profundas. La señal SORS se puede recoger a través de una serie de
desplazamientos espaciales, y se pueden aplicar técnicas computacionales como la
regresión de los mínimos cuadrados para separar las firmas espectrales de las capas
individuales. 130,131 Es importante notar que mientras que SORS puede producir espectros
Raman desde lo profundo del tejido, lo hace de una manera probabilística que depende de
la arquitectura de capas de los tejidos en la cual las firmas espectrales de las capas son
distintas. Esto contrasta con la espectroscopia Raman confocal, que rechaza explícitamente
la luz desenfocada y recoge espectros desde una profundidad bien definida. Esto hace que
SORS sea más adecuado para la medición de características dependientes de la profundidad
de baja resolución y a profundidades mayores (~centímetros) que la espectroscopia Raman
confocal (~100 s μm). Varios investigadores han aplicado el SORS en aplicaciones clínicas
en el hueso y el seno. 130.132.133 Este enfoque se ha extendido a otras configuraciones, tales
como SORS inverso, en el que se cambian la fuente y las fibras de detección134, y
tomografía Raman123, en el que SORS se combina con la tomografía computarizada y el
modelado de las propiedades ópticas para obtener mapas Raman tridimensionales.

e. SERS
La espectroscopia Raman mejorada de superficie (SERS) se utiliza para investigar las
propiedades vibratorias de moléculas de adsorción simple. 2,104,135 Se descubrió que el efecto
Raman, bastante débil, puede reforzarse enormemente (por un factor de hasta 14 órdenes de
magnitud) si se unen moléculas individuales a nanopartículas metálicas de un material y
rugosidad adecuados para capitalizar tanto la resonancia electromagnética (resonancia
plasmónica de superficie) como la mejora química. 136-138 Muchos grupos han utilizado el
SERS para detectar moléculas individuales adheridas a partículas de plata coloidal que
están adheridas a un portaobjetos de vidrio o en una solución acuosa. La detección de una
sola molécula es de gran interés práctico en la química, la biología, la medicina y la
vigilancia de la contaminación; por ejemplo, la secuenciación del ADN y el rastreo de
moléculas interesantes como las utilizadas en el bioterrorismo. En medicina, la viabilidad
de SERS para rastrear moléculas específicas in vivo en un modelo de ratón fue demostrada
con éxito por Gambhir et al. 139 Desde ese informe, numerosos grupos han aplicado
nanopartículas activadas por SERS para rastrear varios biomarcadores de cáncer in vivo en
modelos animales. 140-144 Sin embargo, la mayor limitación del SERS es la necesidad de introducir
una etiqueta con problemas de toxicidad relacionados, lo que hace que este enfoque sea
inviable para las aplicaciones clínicas humanas en este momento. Vo-Dinh et al.
desarrollaron un sensor SERS de fibra única que tiene el potencial de extender el SERS
para uso humano in vivo sin necesidad de una partícula específica. 145 Sin embargo, no se
encontraron reportes de pruebas in vivo de este sensor. Otra configuración es una
combinación de la mejora de la superficie con la espectroscopia Raman profunda, conocida
como SESORS. Esta técnica ha demostrado el potencial para detectar partículas SERS
específicas de moléculas enterradas profundamente en capas de tejidos. 146,147 Aunque esta
tecnología aún no ha sido implementada clínicamente, la investigación para el
confinamiento de nanopartículas en sustratos puede reducir el potencial de problemas de
toxicidad.
 ,155

A pesar de las diversas configuraciones descritas anteriormente, la configuración más común utilizada en la aplicación de la espectroscopia Raman en un entorno clínico se basa en la espectroscopia Raman dispersiva en la región del espectro de huellas dactilares y/o de número de onda alto. El offset espacial y el confocal son modificaciones a este enfoque que también han sido implementadas y probadas en un entorno clínico. Todos los
demás enfoques se han aplicado principalmente para desarrollar una mejor comprensión de los procesos biológicos y bioquímicos en lugar de un diagnóstico clínico. Se ha investigado la combinación de la espectroscopia Raman dispersiva con otros métodos ópticos (y no ópticos) en un esfuerzo por mejorar el rendimiento sobre la espectroscopia Raman sola para resolver un problema clínico. La espectroscopia Raman se ha combinado
con la tomografía de coherencia óptica, tomografía , microscopia de reflectancia confocal,
148-150 la óptica 151 la espectroscopia de fluorescencia y la espectroscopia de reflectancia difusa154 para
152,153 la

proporcionar información complementaria que se puede utilizar para mejorar aún más la
capacidad diagnóstica de cualquiera de estos métodos por sí solos. Las consideraciones de
instrumentación para hacer factibles estos enfoques multimodales suelen verse desafiadas
por la necesidad de combinar un láser de banda estrecha y un detector sensible, esenciales
para las señales Raman muy débiles, con las consideraciones de fuente y detector de una
señal mucho más brillante adquirida utilizando estas otras modalidades. Las combinaciones
resultantes dan como resultado un diseño de instrumento mucho más complicado
acompañado de un dispositivo de mayor costo. Sin embargo, varios investigadores han
demostrado con éxito la ventaja diagnóstica de estos enfoques multimodales.
Ir a:

4. Aplicaciones clínicas de la espectroscopia Raman

Numerosos grupos de investigación han investigado el potencial de la espectroscopia
Raman para uso clínico durante las últimas décadas y continúan encontrando problemas
médicos interesantes para los cuales la notoria sensibilidad de la dispersión Raman es muy
prometedora. Varias implementaciones de los instrumentos descritos anteriormente han
sido utilizadas en estudios clínicos que demuestran el potencial de la espectroscopia Raman
para impactar la atención médica. En esta sección, presentamos una revisión de grandes (n
> 50) estudios clínicos in vivo que se centran en la aplicación de la espectroscopia Raman
para la detección y detección de enfermedades. Estos estudios proporcionan una instantánea
del estado actual del campo en la implementación clínica de esta técnica (Tabla 2). Con
mucho, el objetivo clínico más común bajo investigación con la espectroscopia Raman es el
cáncer. Los estudios clínicos a gran escala han visto el trabajo en curso en varios sistemas
de órganos, todos los cuales tienen rasgos en común: la necesidad de una mejor detección
temprana con alta sensibilidad y especificidad, procesos de la enfermedad bien
caracterizados y una relativa facilidad de acceso al órgano bajo estudio. Los instrumentos
específicos utilizados en estos estudios difieren ligeramente, pero todos los diseños están
impulsados por el objetivo anatómico de interés. También es de interés notar que todos los
estudios publicados de grandes estudios clínicos han sido realizados por los mismos pocos
grupos de investigación que señalan la necesidad de más investigación para traducir el
alcance de la espectroscopia Raman a estudios humanos in vivo (Tabla 2).

a. Cuello uterino
 156 La

157 Al

158 El

El cáncer de cuello uterino es una enfermedad altamente prevenible, ya que la progresión del cáncer (o displasia) al cáncer toma muchos años, proporcionando una amplia ventana de detección y tratamiento. Los países desarrollados han implementado vigorosos programas de detección que han reducido
drásticamente las tasas de cáncer de cuello uterino. Lamentablemente, en los países en desarrollo donde los recursos limitados impiden la detección a gran escala, el cáncer de cuello uterino es una de las causas más comunes de muerte relacionada con el cáncer entre las mujeres, que representan aproximadamente el
90% de las 265.000 muertes por cáncer de cuello uterino en todo el mundo.

espectroscopia Raman ha sido evaluada como una herramienta de diagnóstico precoz para el
cáncer de cuello uterino y precancerosos durante las últimas dos décadas. Nuestro grupo
demostró que la dispersión Raman era sensible a los tejidos displásicos normales, benignos,
de bajo grado y de alto grado in vivo. integrar algoritmos analíticos con la recolección

de datos, se lograron precisiones de diagnóstico de hasta el 88%. Investigaciones posteriores

encontraron que al incorporar el estado hormonal/menopáusico, el desempeño
predictivo mejoró a 94%. trabajo continuo ha identificado la inflamación cervical, el

estado de paridad y el índice de masa corporal como variables adicionales a considerar,

pero ha identificado la influencia limitada de otras variables de pacientes, incluyendo la
raza/etnia y el estado socioeconómico en la discriminación por enfermedad basada en
la dispersión de Raman. 93,159
La naturaleza bien definida de la enfermedad y la fácil accesibilidad del cuello uterino han
permitido a muchos investigadores realizar investigaciones de diagnóstico en este órgano in
vivo. Varios grupos diferentes han utilizado sistemas Raman basados en fibra para el
diagnóstico y han correlacionado sus hallazgos con la colposcopia. En otros estudios sobre
cáncer de cuello uterino, Huang et al. desarrollaron un sistema Raman confocal simultáneo
de huellas dactilares y de onda alta para la detección precancerosa cervical y demostraron el
rendimiento de este enfoque combinado en 84 pacientes con una sensibilidad del 81% y una
especificidad del 87%. 163 Zeng et al. comprobaron la viabilidad de un análisis de sangre sin
etiqueta basado en el SERS de plasma sanguíneo en muestras de 60 pacientes con cáncer de
cuello uterino y obtuvieron una sensibilidad y especificidad del 96% y el 92%,
respectivamente, al utilizar algoritmos de diagnóstico multivariante. 164 Otros resultados han
demostrado el potencial de la espectroscopia Raman para diferenciar entre los que
responden y los que no responden a la radioterapia en biopsias de pacientes con cáncer
cervical165 y para detectar cepas de alto riesgo del virus del papiloma humano en células
cervicales. 166 Sin embargo, estos resultados necesitan ser validados independientemente en
una cohorte grande de estudio. Un reciente artículo de revisión sobre la aplicación de la
espectroscopia Raman para el cáncer de cuello uterino presenta un excelente resumen de
todos los estudios relevantes en una tabla. 167 Más allá del ámbito de la detección del cáncer,
nuestro grupo ha demostrado el potencial de la espectroscopia Raman para rastrear los
cambios bioquímicos en el cuello uterino durante el embarazo y desarrollar una
comprensión de la remodelación cervical que ocurre durante el embarazo y el parto. 168,169

b. Piel
Como el órgano principal en el sistema integumentario, la piel es tanto la barrera exterior del
cuerpo al mundo exterior como el tejido que es más fácil de interrogar con la luz. Los
cánceres melanocíticos y no melanocíticos tienen diferentes orígenes celulares, pero en
conjunto comprenden los cánceres más comunes en el mundo. 170 Como malignidad de
órganos de superficie, los cánceres de piel se encuentran entre los más fáciles de estudiar
con técnicas ópticas; sin embargo, la naturaleza compleja y turbia de la piel la convierte en
uno de los objetivos clínicos más desafiantes para el diagnóstico y la monitorización óptica.
Los primeros estudios utilizaron la espectroscopia Raman para extraer perfiles de
concentración de agua en la piel humana y demostrar la viabilidad de la espectroscopia
Raman in vivo para la monitorización clínica. 171 Desde entonces, gran parte de la
investigación de la piel de Raman se ha centrado en la investigación de diagnósticos
basados en Raman. Estos estudios también dieron como resultado el desarrollo de sistemas
portátiles que eran directamente aplicables al flujo de trabajo clínico, con instrumentos que
pueden realizar mediciones con tiempos de integración inferiores a 1 segundo. 6,8,56 Varios
grupos han invertido un esfuerzo significativo en el estudio de los cánceres de piel con el
fin de mejorar el cuidado de los pacientes y, como resultado, los estudios de cáncer de piel
tienen una de las tasas de reclutamiento más altas de todos los estudios Raman publicados,
según se relaciona en la Tabla 2.6,154,172-174 Zeng et al. utilizó un instrumento Raman para
estudiar lesiones melanocíticas y no melanocíticas, así como lesiones melanocíticas
malignas y premalignas de 453 pacientes: la discriminación del cáncer y las lesiones
precancerosas frente a las benignas demostró una sensibilidad del 90-99%, con una
especificidad relacionada del 15-54%. 6 Este trabajo sugiere que las técnicas Raman pueden
ser usadas para reducir la necesidad de biopsias innecesarias en un grado significativo,
potencialmente en un 50-100%. Otros grupos han utilizado enfoques multimodales,
aprovechando las fortalezas de la espectroscopia Raman con una combinación de técnicas
de fluorescencia y reflectancia difusa para mejorar los resultados diagnósticos. En uno de
estos informes de 76 pacientes, la espectroscopia Raman sola demostró alcanzar un 100%
de sensibilidad y especificidad para discriminar el melanoma de las lesiones pigmentadas
benignas, pero sólo un 72% de sensibilidad y un 64% de especificidad para separar los
cánceres de piel no melanoma de los precanceres, y un 68% de sensibilidad y un 55% de
especificidad para distinguir los cánceres y precanceres no melanoma de los tejidos
normales. Sin embargo, cuando se combinan con características de fluorescencia y
reflectancia difusa, esas mismas comparaciones logran sensibilidades/especificidades del
100/100%, 95/71% y 90/85%, respectivamente. 154 En otras investigaciones de la piel de
Raman no relacionadas con el cáncer, Irvine et al. estudiaron la dermatitis atópica en 132
niños, correlacionando las señales de los factores naturales de hidratación obtenidos por
dispersión de Raman con la detección genética de mutaciones de filagranina comunes en la
dermatitis atópica. 175 Los resultados de este estudio encontraron que las señales de Raman
alcanzaron una sensibilidad del 98.7% y una especificidad del 86.8% en la identificación de
la dermatitis atópica asociada con estas mutaciones. Las firmas espectrales Raman de
carotenoides de la piel también han sido investigadas usando un enfoque de resonancia
basado en 488 nm para perfilar el consumo de frutas y verduras en niños de edad
preescolar. 115 Este estudio demostró una correlación de las firmas de Raman con la
participación de las familias reportadas por los padres en un programa de educación y
calidad nutricional, demostrando además la exquisita sensibilidad de la dispersión de
Raman a los componentes bioquímicos.

c. Tracto gastrointestinal
El tracto gastrointestinal abarca el sistema digestivo desde la boca, pasando por el esófago,
el estómago, los intestinos y el colon hasta el recto. Todo el sistema de órganos, con
excepción de las partes del intestino delgado, es accesible directamente (hasta la boca) o a
través de un endoscopio. En el desarrollo de la espectroscopia Raman como herramienta
diagnóstica para el tracto gastrointestinal, el reto está en el desarrollo de una sonda de fibra
que puede ser insertada a través del endoscopio y puesta en contacto con el tejido de interés
de manera estable durante la adquisición de datos. Numerosos grupos han centrado su
atención en varias partes de este sistema de detección basado en Raman.

177 La

i. Boca
El tejido oral es particularmente fácil de acceder ya que no se requiere endoscopia, lo que
mitiga las limitaciones de tamaño de la sonda para las mediciones in vivo de Raman. La
incidencia del cáncer oral ha aumentado en los últimos 40 años en los Estados Unidos y es un
problema mayor a nivel mundial. Por ejemplo, representa el 10% de todos los cánceres de la
India. 156 Este cáncer se puede diseminar rápidamente, lo que enfatiza la necesidad de una
detección y monitoreo tempranos. Murali Krishna et al. reportan la discriminación de sitios de
control normal, premalignos y cancerosos de 104 pacientes con precisiones de predicción que
van desde 72-96%. 176 En un estudio más reciente, el mismo grupo investigó el potencial de la
espectroscopia Raman para detectar cambios asociados con la malignidad/efectos en el campo
del cáncer en una cohorte de 84 pacientes con cáncer oral y
pacientes de control de edad compatible. comparación de los lugares no cancerosos en

una población de fumadores y no fumadores demostró una precisión de predicción del 75-
98% con la mayoría de las clasificaciones erróneas que ocurren entre los lugares de control
en pacientes con cáncer y los lugares en los controles saludables de tabaquismo. Este
trabajo demuestra aún más la sensibilidad de la dispersión de Raman a los cambios
bioquímicos sutiles que pueden preceder a la enfermedad macroscópica. 178,179 Otro grupo
reportó la discriminación del tejido oral normal de tres categorías separadas de lesiones
con precisiones por clase que oscilaron entre 82-89% en 199 pacientes y 96% de
sensibilidad y 99% de especificidades para el tejido oral normal versus maligno y 99% y
98% respectivamente, para el tejido oral normal versus potencialmente maligno. 180 Un
estudio de variabilidad de la edad y el cambio patológico relacionado con el tabaco para el
cáncer oral y precanceroso demostró sensibilidad a los cambios relacionados con la edad
en el espectro Raman; sin embargo, la inclusión de esta diversa población de control no
tuvo impacto en la clasificación de las condiciones normales y anormales. 181 Dada la
necesidad crítica de la detección del cáncer oral, particularmente en entornos de bajos
recursos, y el excelente desempeño que se puede lograr en su detección con la
espectroscopia Raman, esta área de investigación está madura para la traducción clínica,
pero necesita un instrumento de bajo costo para su éxito. El mercado de dispositivos
ópticos ha visto un aumento reciente en el número de dispositivos Raman de mano
disponibles comercialmente; estos se venden principalmente para la identificación de
productos químicos puros y oligoelementos. Sin embargo, estos dispositivos indican que
existe la tecnología para la miniaturización de los actuales sistemas clínicos Raman, lo que
a su vez podría hacer realidad la perspectiva de una traducción comercial de los sistemas
Raman en entornos de bajos recursos.

ii. Esófago
El esófago de Barrett es una consecuencia del reflujo gastroesofágico que se ha asociado con
un mayor riesgo de adenocarcinoma esofágico. Mediante la adaptación de los diseños de las
sondas de fibra óptica Raman para la compatibilidad endoscópica, las mediciones in situ de
este objetivo de la enfermedad han sido facilitadas por muchos grupos. Wilson et al.
demostraron el potencial de adquisición espectral in vivo en una cohorte de 65 pacientes con
esófago de Barrett, con sensibilidades y especificidades del 86-88% y 88-89%,
respectivamente, para discriminar lesiones displásicas y de alto riesgo de casos no displásicos y
de bajo riesgo. 82 Esta demostración de un instrumento Raman clínicamente útil con
compatibilidad endoscópica y tiempos de integración de 5 segundos fue una indicación
temprana de la capacidad de la espectroscopia Raman in vivo para acceder a un órgano interno.
Un trabajo más reciente de otro grupo ha demostrado el rendimiento en tiempo real de la
espectroscopia Raman durante la endoscopia en 373 pacientes con tiempos de integración de
0,2 segundos por adquisición y podría discriminar el esófago de Barrett displásico de alto
grado del tejido normal y no displásico con un 87% de sensibilidad y un 84,7% de sensibilidad.
101 Otros trabajos han demostrado la importancia de considerar la ubicación anatómica de una

medición Raman; en un estudio de 107 pacientes, la variabilidad interorgánica (entre el

esófago y el estómago) fue significativa en
99 Estos

182 - 184

comparación con la variabilidad intraorgánica y el cambio neoplásico. resultados

apoyan la necesidad de contar con bibliotecas completas de espectros de enfermedades y

una comprensión completa de los tejidos sanos y enfermos.

iii. Estómago

Como causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, 156 el cáncer de estómago ha sido otro objetivo popular de detección para la espectroscopia Raman.

Al igual que con el esófago, la integración de sondas de fibra Raman con endoscopios
estándar ha permitido la evaluación in vivo de neoplasias gástricas. Utilizando una sonda
compatible con endoscopio, un modelo de tejido de componentes lineales y árboles de
clasificación y regresión, Huang et al. reportaron una sensibilidad del 94% y una
especificidad del 93,4% para discriminar el tejido gástrico normal del cáncer en 67
pacientes que se someten a una endoscopia con biopsia. 185 Huang et al. también han
reportado un estudio estadísticamente robusto donde 450 pacientes sometidos a endoscopia
superior fueron medidos con espectroscopia Raman para entrenar un algoritmo de
discriminación. 186 Este trabajo fue uno de los primeros informes en discriminar
prospectivamente el precáncer gástrico en tiempo real mediante espectroscopia Raman,
logrando una sensibilidad del 81% y una especificidad del 88%. En otro estudio del mismo
grupo, los investigadores investigaron úlceras estomacales en 71 pacientes y encontraron
que las mediciones endoscópicas de Raman podían diferenciar las úlceras de la mucosa
normal, benignas y malignas con un 82-90% de sensibilidad y un 93-95% de especificidad.
187 Un informe relacionado con este grupo investigó la capacidad de las técnicas Raman
para realizar discriminación multiclase de cáncer gástrico normal, precanceroso y de etapa
temprana en una cohorte de 83 pacientes, y demostró sensibilidad a las etapas tempranas
del proceso carcinogénico. 188 Finalmente, un informe que combina las técnicas Raman con
firmas de autofluorescencia en infrarrojo cercano (n = 81, 97,9% de sensibilidad y 91,5%
de especificidad)189 demostró resultados similares para la detección in vivo en pacientes
con cáncer gástrico de cohortes.
 187
56 La

iv. Colon/intestino
El cáncer colorrectal es una de las principales entidades de la enfermedad y se encuentra
entre los tres tipos de cáncer más frecuentes en todo el mundo en cuanto a casos nuevos y
muertes relacionadas con el cáncer. colonoscopia es la técnica más sensible disponible

para la detección precoz del cáncer o de pólipos precancerosos y la detección rutinaria de

colonoscopia en adultos mayores de 50 años se ha convertido en el estándar en países como
los Estados Unidos. Sin embargo, con frecuencia se desarrollan pólipos benignos, lo que
puede limitar su sensibilidad y complicar potencialmente la intervención. Se han reportado
estudios preliminares de Raman basados en muestras ex vivo y pequeñas cohortes in vivo,
discriminando pólipos benignos y malignos. Un estudio in vivo ha investigado el impacto
del segmento del colon en la señal Raman adquirida de 50 pacientes con colonoscopia, pero
encontró que la variabilidad entre segmentos fue menos influyente que el estado maligno.
190 Desde entonces, el mismo grupo ha informado de un estudio in vivo que combina
espectroscopia Raman tanto de huellas dactilares como de alta frecuencia durante la
endoscopia, con el fin de lograr una sensibilidad del 90% y una especificidad del 83% para
separar los pólipos adenomatosos e hiperplásticos en tiempo real. 128 En otros estudios,
nuestro grupo ha demostrado el potencial de la espectroscopia Raman endoscópica para
discriminar las enfermedades inflamatorias intestinales en una cohorte de 53 pacientes,
demostrando el potencial de la espectroscopia Raman para detectar cambios sutiles en los
tejidos relacionados con las enfermedades inflamatorias,34 otro problema clínico significativo
que ha visto un aumento en la incidencia en años recientes.

d. Otros objetivos de diagnóstico

Mientras que la mayoría de los informes publicados sobre grandes estudios clínicos in vivo
de Raman se han centrado en los tejidos mencionados anteriormente, otras enfermedades
también se han estudiado con la espectroscopia Raman. El cáncer de pulmón es una de las
causas más comunes de muerte relacionada con el cáncer que afecta a millones de personas
anualmente. 156 Similar a otros estudios endoscópicos con dispersión Raman, la
investigación de esta enfermedad se ha llevado a cabo en muestras ex vivo con una
precisión cercana al 100%. Se ha utilizado una sonda de fibra Raman compatible con
broncoscopio para estudiar el potencial de la espectroscopia Raman para la detección de
lesiones pre-neoplásicas en el árbol bronquial en 26 pacientes. 191 Sin embargo, no se
encontraron informes sobre el desempeño de esta técnica para una gran cohorte de
cánceres de pulmón in vivo.
La guía quirúrgica es otra área de investigación activa para la espectroscopia clínica
Raman, en la que los investigadores han desarrollado sondas de fibra compatibles con la
biopsia de aguja para detectar microcalcificaciones para el diagnóstico del cáncer de mama,
así como técnicas SORS para determinar el estado del margen del cáncer de mama durante
la resección quirúrgica con excelentes resultados. Los espectros Raman de las biopsias con
aguja gruesa podrían utilizarse con éxito para identificar la presencia de micro-calcificación
en estas muestras con una precisión del 82%. 192 Para evaluar la capacidad de esta técnica
para detectar la presencia de células cancerosas en muestras de mama extirpadas, se utilizó
el SORS de profundidad para la evaluación del margen con una sensibilidad del 95% y una
especificidad del 100%. 132 Actualmente se está llevando a cabo un gran estudio clínico para
validar estos hallazgos intraoperatoriamente. Otro estudio se ha centrado en la capacidad de la
espectroscopia Raman para evaluar los ganglios linfáticos axilares durante la cirugía de mama.
193 Los informes preliminares para este estudio utilizaron secciones de tejido congelado de

ganglios linfáticos de 58 pacientes inmediatamente después de la escisión del cuerpo y

reportaron 81% de sensibilidad y 97% de especificidad. Sin embargo, los autores indican que
las muestras recién extirpadas podrían analizarse para una evaluación intraoperatoria. Otra
aplicación de la espectroscopia Raman en la guía quirúrgica es la cirugía cerebral. Mientras que
en este punto los investigadores se han limitado a pequeños estudios de cohorte, han
caracterizado un sistema basado en la sonda Raman compatible con la cirugía194 y han
demostrado la discriminación del cerebro normal del cáncer denso y del cerebro normal
invadido por células cancerosas con hasta un 93% de sensibilidad y un 91% de especificidad
para los gliomas de grado 2 a grado 4 en 17 pacientes. 195 Este trabajo muestra una promesa
continua para la guía quirúrgica basada en las técnicas de dispersión Raman; sin embargo,
también requiere un reclutamiento expandido para la validación.
La mayor parte de la investigación de las técnicas de espectroscopia Raman se ha centrado
en el diagnóstico de enfermedades de los tejidos in situ. Sin embargo, también se han
investigado diagnósticos clínicamente relevantes para las muestras extraídas del cuerpo,
especialmente las relativas a los analitos sanguíneos. Puppels et al. publicaron un trabajo
utilizando una biblioteca espectral para evaluar prospectiva y rápidamente cultivos de
sangre para patógenos bacterianos y fúngicos, logrando una precisión de clasificación del
92% a partir de 121 muestras de pacientes. 196 Más comúnmente, los investigadores
introducen partículas SERS en especímenes ex vivo para mejorar las sensibilidades. Estos
han sido aplicados para numerosos criterios de valoración de detección, incluyendo una
publicación reciente para la detección del cáncer nasofaríngeo197 donde se analizaron
muestras de plasma sanguíneo de 156 pacientes con SERS. El estudio demostró una
sensibilidad del 95% y una especificidad del 91% para discriminar a los voluntarios sanos
de los pacientes con cáncer. Liu et al. utilizaron partículas SERS con suero de pacientes
sanos y con cáncer de vejiga para mejorar la detección temprana. Al combinar la
sensibilidad del SERS con algoritmos genéticos avanzados de aprendizaje automático, los
investigadores pudieron lograr una precisión diagnóstica del 94% en una cohorte de 91
pacientes. 198 Zeng et al. también han investigado las técnicas SERS para el análisis de
plasma sanguíneo con el objetivo de mejorar la detección del cáncer gástrico. 199 Se
analizaron muestras de 65 pacientes con iluminación polarizada de partículas SERS y técnicas
multivariadas. El estudio indicó una gran promesa para regímenes específicos de
polarización circular con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 97% para la
detección no invasiva del cáncer gástrico. Otro objetivo no invasivo de larga data incluye
el monitoreo de la glucosa en la sangre. Feld et al. desarrollaron concentradores
compuestos hiper-y parabólicos para mediciones transdérmicas de glucosa en sangre, sin
embargo, no se han reportado estudios de cohortes grandes con este dispositivo. 38,84 Otros
informes han utilizado la dispersión Raman para observar muestras de líquido
cefalorraquídeo de 61 pacientes ex vivo para diagnosticar meningitis tuberculosa y lograron
una sensibilidad del 91% y una especificidad del 82%. 200 Esto es sólo un vistazo a las
numerosas aplicaciones ex vivo de las técnicas espectroscópicas de Raman que son
relevantes para la detección clínica y el diagnóstico.
La espectroscopia Raman se ha utilizado en el ojo para estudiar condiciones tales como la
degeneración macular. Gellerman et al. desarrollaron un enfoque Raman de resonancia a
488 nm para estudiar el impacto de los carotenoides en la piel y los ojos. 113 En una
aplicación de este enfoque, Chakaravarthy y cols. midieron el pigmento macular de 107
pacientes y se correlacionaron con la fotometría de parpadeo heterocromático para
evaluar el pigmento antioxidante de la retina; sin embargo, las correlaciones fueron bajas
y fue necesario realizar más investigaciones. 114 Usando el mismo enfoque, Stevenson et
al. demostraron el efecto mejorado de la suplementación antioxidante en pacientes con
degeneración macular relacionada con la edad en un estudio de 433 pacientes in vivo. 112
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5. Resumen
A pesar del impresionante trabajo presentado aquí en una selección de campos clínicos, aún
quedan varios desafíos que se interponen en el camino de la traducción clínica de las
tecnologías basadas en Raman para uso humano generalizado. Demostrar la seguridad de
estos dispositivos a las agencias reguladoras es un paso vital que se debe dar para su
traducción. En la práctica, se necesita un diseño de sistema robusto con una calibración
interna consistente, de manera que con poca capacitación, el usuario pueda configurar un
sistema y recopilar datos repetibles. Para ello, se requieren sondas de fibra óptica de bajo
coste o duraderas, duraderas y de alto rendimiento (o un dispositivo de entrega de luz
equivalente). Tener un rendimiento fiable y consistente para la interfaz entre la muestra y el
sistema es fundamental para la transición del instrumento de investigación a la relevancia
clínica. Con este fin, también se necesita una calibración entre sistemas y grandes
bibliotecas de datos espectrales que puedan transferirse y compararse entre instrumentos,
para ampliar la utilidad de los dispositivos para múltiples objetivos médicos. Se necesitan
métodos estandarizados y fiables para el análisis de datos a fin de condensar los espectros
Raman, ricos en características, obtenidos por estos instrumentos, no sólo en las
características más destacadas utilizadas para una evaluación clínica, sino también en un
formato simple y fácilmente interpretable, incluyendo métricas clínicamente relevantes para
la evaluación (ROC, sensibilidad/especificidad). El trabajo preliminar sobre muchos de
estos aspectos para la traducción clínica está en curso, pero se necesita un esfuerzo
continuo para facilitar la transición de la mesa de trabajo a la cabecera de la cama. Por
supuesto, es de suma importancia que las tecnologías desarrolladas proporcionen
información nueva y significativa sobre un objetivo clínico; por lo tanto, la búsqueda de
colaboración y aportes de la comunidad médica es fundamental para asegurar que los
esfuerzos de investigación de las técnicas Raman se dirijan a las necesidades relevantes de
la medicina y la cirugía. Finalmente, el mayor obstáculo en este momento para la
traducción clínica es la necesidad de demostrar el valor añadido de estas tecnologías ópticas
sobre o en paralelo con los dispositivos médicos existentes en grandes estudios de cohortes
basados en los resultados de los pacientes y en relación con los estándares de oro
significativos y aceptados.
Las diversas aplicaciones descritas anteriormente demuestran el potencial de la
espectroscopia Raman para afectar el cuidado del paciente. Y sin embargo, pocos sistemas
basados en la espectroscopia Raman han sido procesados mediante aprobación regulatoria y
comercializados con éxito. Las barreras externas a la adopción de esta tecnología residen en
el tamaño limitado de los ingresos del mercado objetivo, que tiende a frenar a los posibles
socios e inversores industriales. Sin embargo, ha habido algunos éxitos, incluyendo el
sistema de River Diagnostics que ha vendido con éxito los instrumentos Raman para la
evaluación de la piel en la industria cosmética (aunque no para una aplicación clínica) y
Verisante Technology que ha lanzado recientemente dispositivos basados en Raman para
el diagnóstico del cáncer oral y de piel. Estos dispositivos comerciales indican que las
barreras para la implementación clínica de la espectroscopia Raman no son insuperables y
que se puede lograr una amplia aceptación de esta tecnología.
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Biografías

Isaac Pence obtuvo su licenciatura en Ingeniería Biomédica en Vanderbilt en 2010 y 2012,

respectivamente. Actualmente es candidato al doctorado en el mismo campo en Vanderbilt.
Isaac ha sido apoyado en su trabajo de postgrado por los Institutos Nacionales de Salud
Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Predoctoral Fellowship. Su
experiencia se centra en la espectroscopia clínica Raman y en el desarrollo de métodos
estadísticos para el análisis de datos Raman. Su investigación actual se centra en la
aplicación de la espectroscopia Raman para la detección clínica de enfermedades en la piel
y el colon.

La principal investigación de la Dra. Mahadevan-Jansen es la traducción clínica de

espectroscopias ópticas e imágenes para el diagnóstico de enfermedades y la orientación de la
terapia. Recibió su licenciatura y maestría en Física de la Universidad de Bombay, India, y su
maestría y doctorado en Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas en Austin. Se
incorporó a la facultad de ingeniería de Vanderbilt en 1996. Es la directora fundadora
del Centro de Biofotónica de Vanderbilt y es profesora de Orrin H. Ingram de Ingeniería
Biomédica y profesora de Cirugía Neurológica en la Universidad de Vanderbilt. El Dr.
Mahadevan-Jansen es editor asociado de Neurophotonics así como de Applied
Spectroscopy y es revisor de más de 20 revistas y presidente de numerosas conferencias
profesionales. Es autora de más de 75 publicaciones revisadas por pares y es miembro del
Instituto Americano de Ingeniería Médica y Biológica (AIMBE) y de la Sociedad
Internacional de Ingeniería Óptica (SPIE).