DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INFORME DE LABORATORIO: Cultivo batch de levaduras

María Alejandra Bastidas & María Camila Rodríguez

RESULTADOS

Los resultados obtenidos durante el desarrollo de la práctica se muestran en la tabla 1 y 2, en

las cuales se presentan los ensayos tanto de la fermentación aerobia y anaerobia
respectivamente. En las tablas se observa el comportamiento de las variables de fuente de
glucosa, nitrógeno, etanol y biomasa.

Tabla 1. Resultados obtenidos bajo condición aerobia

 Tabla 1. Resultados obtenidos bajo condición aerobia

ANÁLISIS Y PROCESAMIENTO DE DATOS

6.1. Para la determinación diferencial de parámetros metabólicos y cinéticos a partir de un

experimento en Batch, se utilizaron las siguientes ecuaciones en el intervalo de tiempo 𝑡𝑖 →
𝑡𝑖+1 entre dos valores de muestras. En la tabla 3 se muestran los valores obtenidos.

Ecuación 1. Velocidad específica de crecimiento (μ [h-1])

Ecuación 2. Tiempo de duplicación de las células (td [h])

Ecuación 3. Velocidad específica de consumo de

glucosa qGlc [g gTG-1 h-1]

Ecuación 4. Coeficiente de rendimiento Biomas/Glucosa.

[gTG g-1]

Ecuación 5. Velocidad específica de consumo de

Etanol [g gTG-1 h-1]

Ecuación 6. Coeficiente de rendimiento Biomas/Etanol

[gTG g-1]

Ecuación 7. Velocidad específica de formación de Etanol

[g gTG -1 h-1]
 Tabla 3. Velocidades específicas y tiempo de duplicación cultivo batch aerobio método
diferencial.

Para hallar la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación por medio del método
integral se realizó la gráfica biomasa vs tiempo obteniendo un ajuste polinómico de orden 3
con todos los datos experimentales que se puede observar en la ecuación 1. Posteriormente se
sacó la primera derivada de la ecuación con la que se obtuvo el cambio de la biomasa con
respecto al tiempo que es igual a la velocidad de crecimiento por biomasa como se muestra en
la ecuación 2. De la anterior ecuación se realizó el despeje para así obtener la velocidad de
crecimiento y el tiempo de duplicación para cada tiempo.

Ecuación 8. Ajuste polinomico de los datos

experimentales de la Fermentación aerobia

Ecuación 9. Ecuación genérica para el

crecimiento celular.
 Tabla 4. Velocidades específicas y tiempo de duplicación
cultivo batch aerobio método Integral.

Se realizó asimismo el método diferencial e integral como en la fermentación aerobia. Los

datos obtenidos se muestran en las tablas 5 y 6. El ajuste polinómico de orden 3 para la
fermentación anaerobia se observa en la ecuación 10.
Tabla 5. Velocidades específicas y tiempo de duplicación cultivo batch anaerobio método
diferencial.

Ecuación 10. Ajuste polinomico de los datos

experimentales de la Fermentación anaerobia
 Tabla 6. Velocidades específicas y tiempo de duplicación
cultivo batch anaerobio método integral.

6.2. ¿Cuál fue la concentración del inóculo que usó para arrancar con el valor inicial de
biomasa en el reactor que se le pidió? ¿Tiene sentido real este valor? Explique.

Para iniciar la fermentación se desarrolló el inóculo en un volumen de 200ml para lograr una
concentración inicial de biomasa de 4g/L en un biorreactor de 11,3L, por lo tanto para poder
llegar a la concentración de biomasa, el inóculo debería alcanzar una concentración de 226g/l.
El valor de la concentración del inóculo tiene sentido ya que se va a generar mucho producto
en muy poco tiempo por lo que la fermentación es mucho más rápida, esto teniendo en cuenta
que Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo que se caracteriza por tener altas
velocidades de crecimiento.

Por otra parte, si la concentración de inóculo es grande en un volumen pequeño se pierde

sustrato debido a una competición exagerada, entre microorganismos que genera muerte celular
y exceso de calor. (Humberto F, et.al, 2008). Además la consistencia del inóculo no permite
una fácil difusión, sin embargo podría hacerse un cultivo previo de litro de volumen de trabajo
que alcanza una concentración de biomasa seca de aproximadamente 44 g/l que se la procesa
mediante una centrifugación y luego se suspende en agua estéril de tal manera que se logra
concentrar la biomasa alrededor de 4 veces.

6.3. Cuál es el valor de v.v.m al cual funcionó el reactor durante el experimento?

𝑄'()*
𝑣𝑣𝑚 =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑜𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

Ecuación 11. Calculo Aireación

10 𝐿/𝑚𝑖𝑛
𝑣𝑣𝑚 =
11,3 𝐿

𝑣𝑣𝑚 = 0,88 𝑚𝑖𝑛?@

En el desarrollo de la práctica se tuvo en cuenta la aireación con un valor de 0,8 v.v.m que
indica la cantidad de oxígeno requerida por unidad de tiempo y por unidad de volumen de
cultivo. Al inicio de la fermentación la potencia de aireación no debe de ser muy intensa ya
que en estos instantes iniciales la concentración de alcohol es pequeña y el medio se hace
susceptible de ser infectado por microorganismos como los mohos, atacando a las levaduras
del cultivo. Los efectos de aireación son más críticos operando en continuo debido a la
necesidad de mantener el crecimiento de las levaduras y además el de procurar una velocidad
de fermentación satisfactoria

Generalmente la aireación del medio se realiza mediante el suministro de oxígeno (gas), el cual
constituye un factor determinante para lograr un alto rendimiento en el crecimiento de los
microorganismos aeróbicos, debido a que cuando el suplemento de aire se reduce, el
microorganismo, deja o suprime casi completamente su multiplicación (Guilliermond, 1920).
La glucosa puede ser utilizada de muchas maneras por S. cerevisiae dependiendo de la
presencia de oxígeno y otras fuentes de carbono (Feldmann, 2005).

Es necesario establecer condiciones adecuadas de agitación-aireación, que garanticen la

transferencia continua de nutrientes desde el medio de cultivo hasta las células sin generar
problemas de estrés hidrodinámico que afecten el crecimiento celular, la producción del
metabolito de interés y que no permitan la caída de la concentración de oxígeno disuelto en el
medio de cultivo, hasta valores críticos que puedan generar limitaciones en el proceso. Es
importante saber que sin suficiente oxígeno, la levadura no se reproducirá lo suficiente, dejando
una fermentación incompleta.

6.4. ¿Qué sucede con el valor de agitación del reactor a lo largo del experimento? ¿Cuál puede
ser la explicación de esa variación?, Explique.

Gráfica 1. Cambio de velocidad de agitación durante la fermentación aerobia

El comportamiento de la velocidad de agitación conforme pasa el tiempo en la fermentación es

representado en la gráfica 1, como es evidente la velocidad incrementa rápidamente iniciando
en 100 rpm y alcanzando un valor máximo de 837,4 rpm en el tiempo: 7836 segundos,
momento en el cual la fuente principal de carbono se agota en el medio; desde ese instante
ocurre el descenso de la velocidad de agitación hasta que el proceso fermentativo termina
(etanol y glucosa agotados).
Es necesario resaltar, que al llevarse este proceso bajo condiciones aerobias con un set point
de pO2 de 60% y un flujo de aire constante de 10 L/min, la agitación debía ser un factor de
gran importancia para controlar; por tal motivo, la velocidad del agitador se ajustó en modo
active de manera que cumpliera con la especificación inicial.
Durante un primer momento, el estrés hidrodinámico creado por velocidades de agitación
superiores a 100 rpm tuvo un efecto significativo sobre la acumulación de biomasa dentro del
biorreactor hasta que se alcanza un valor máximo de agitación, con el descenso de esta
velocidad el aumento de biomasa no ocurre en la misma proporción que en la primera etapa
del proceso.
𝐶B 𝐻@D 𝑂B → 2𝐶𝑂2 + 2𝐶D 𝐻I 𝑂𝐻 Ecuación 12

𝐶D 𝐻I 𝑂𝐻 → 𝐶𝑂D Ecuación 13
Este fenómeno de la agitación se puede explicar de acuerdo al sustrato que deben metabolizar
las células, en primera instancia siendo la glucosa el sustrato principal es metabolizada para
producir dióxido de carbono y biomasa, sin embargo en la segunda etapa del proceso el etanol
se convierte en el sustrato y debe ser igualmente metabolizado para producir dióxido de
carbono y biomasa. La diferencia radica en la demanda de oxígeno de la célula para realizar
estos dos procesos; debido a la estructura química de la glucosa ecuación 12, ésta requiere de
mayor cantidad de oxígeno para producir CO2 que el etanol (ecuación 13), por lo anterior el
aumento de la velocidad de agitación en la primera etapa asegura que se rompa la coalescencia
de las burbujas de aire, de manera que se aumente el área interfacial y se de la transferencia de
oxígeno desde más puntos de difusión en el medio (Huang, et al, 2002), satisfaciendo la elevada
demanda de oxígeno de las células. En ausencia de glucosa, la demanda de oxígeno por las
células disminuye y así mismo la velocidad de agitación.
Por lo anterior, es pertinente establecer condiciones adecuadas de agitación-aireación, que
garanticen la transferencia continua de nutrientes desde el medio de cultivo hasta las células
sin generar problemas de estrés hidrodinámico que afecten el crecimiento celular, la producción
del metabolito de interés y que no permitan la caída de la concentración de oxígeno disuelto en
el medio de cultivo, hasta valores críticos que puedan generar limitaciones en el proceso (Jeong
et al., 2006).

6.5. Qué sucede con el valor de pH del reactor a lo largo del experimento. ¿Cuál puede ser la
explicación de esa variación?, Explique.

Gráfica 2. Variación del pH a lo largo de la fermentación.

En la gráfica 2 se puede observar como el pH empieza a descender del rango de 7 a 4,9 en

aproximadamente 3 horas esto se puede deber a que durante la fermentación la levadura toma
el nitrógeno de los aminoácidos orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos,
lo cual origina una disminución del pH del medio que influye en el crecimiento y fisiología de
las levaduras. Saccharomyces cerevisiae es un hongo que crece en un rango amplio de pH, pero
esta capacidad de adaptación a cambios en el pH extracelular, puede deberse a la capacidad
eficiente para mantener la homeostasis de pH intracelular o a que posee un sistema de
regulación génica capaz de controlar la síntesis de enzimas extracelulares, permeasas y
metabolitos que son secretadas al medio. Dicho sistema entra en funcionamiento en respuesta
a variaciones en el pH, lo cual asegura que solo se produzca las proteínas en las condiciones
de pH ambiental existente (Serrano, 2006).
Según estudios se halló que el pH más favorable para el crecimiento de Saccharomyces
Cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, como se lo había mencionado anteriormente. Un
entorno neutro o moderadamente alcalino es poco favorable para el crecimiento de la levadura
y la alcalinización súbita del medio, le supone una importante situación de estrés que afecta
negativamente su crecimiento y productividad. (Vargas, 2010).

Los posibles mecanismos según Serrano (2006) que utiliza la levadura Saccharomyces
cerevisiae para regular el pH siendo el principal microorganismo presente en el proceso de
adaptación son: 1) Regular la salida de la ATPasas de protón de membrana plasmática Pma1
para acelerar la salida de protones al medio, 2) degradar polifosfatos, lo que genera la liberación
de fosfato generando a su vez protones y 3) acelerar la degradación de azúcares para generar
compuestos de naturaleza ácida.

6.6. Grafique concentración de biomasa seca en el reactor vs tiempo e identifique el punto de

crecimiento diaúxico. Haga lo mismo, pero graficando concentración de glucosa y etanol vs
tiempo.

Gráfica 3. Comportamiento de la biomasa en el tiempo bajo condiciones

aerobias.

El proceso fermentativo inicia con el consumo de glucosa por parte de la levadura para la
producción de etanol y biomasa, en ese momento se da lugar a la fase exponencial de
crecimiento en la cual el consumo de glucosa no cesa y se mantiene, sin embargo, pasadas 2,2
horas de iniciar el proceso se agota la glucosa del medio; en ese instante se esperaría que el
microorganismo entre en fase estacionaria, pero la concentración de biomasa en la hora 2,5 es
mayor a la que se encuentra en las horas 1,6 y 1,9. Este repunte en el crecimiento microbiano,
puede asociarse al fenómeno de crecimiento diaúxico, el cual consiste en que el
microorganismo ha agotado su fuente de carbono principal, pero entra en una nueva fase de
adaptación para empezar a consumir otro sustrato presente en el caldo de fermentación, en este
caso el etanol.
Cómo es posible observar en el gráfico 3 en el tiempo 2,2 h simultáneamente ocurre el descenso
de la concentración de etanol en el tiempo restante de la fermentación, lo cual permite
evidenciar desde otra perspectiva el crecimiento diaúxico.

Gráfica 4. Comportamiento de la glucosa y etanol en el tiempo en condiciones aerobias.

6.7. ¿Cuál es la descripción termodinámica completa del sistema que usted trabajó en la
simulación?
Inicialmente, es necesario considerar el sistema global como un biorreactor en modo batch y
tener en cuenta que el microorganismo, en este caso Saccharomyces cerevisiae actúa como un
subsistema más específicamente un sistema abierto muy complejo en donde se realizan
transferencias de masa y energía.
Desde que inicia el proceso, el comportamiento de todos los fenómenos y factores que influyen
en la fermentación pueden ser explicados por medio de los balances de materia y energía; por
ejemplo, todos los átomos que entran al fermentador en el momento 0 salen al finalizar el
proceso, ya sea siendo parte de otros compuestos. De igual manera, las reacciones que se
desarrollan dentro del fermentador son reacciones de oxidorreducción principalmente, por lo
tanto se puede realizar un balance de electrones.
 Gráfica 5. Sistema de crecimiento microbiano.

A nivel macro, los sustratos (glucosa y etanol) son degradados produciendo electrones ricos
en energía, quienes en última instancia van a ser transferidos a algún aceptor final, siendo este
el oxígeno en el caso de medio aerobio; como resultado el sustrato inicial queda reducido y se
transforma en algún compuesto (biomasa, dióxido de carbono y etanol).
Considerando entonces a Saccharomyces cerivisiae como un subsistema, o de otra forma una
caja negra donde ocurre un gran número de reacciones tanto endotérmicas como exotérmicas
(gráfica 4) que tienen lugar durante el metabolismo celular y están sujetas a las condiciones
ambientales; el crecimiento de la biomasa y la formación de productos se pueden describir a
partir de la ecuación estequiometrica siguiente:

𝐶𝐻J 𝑂K + 𝑎𝑁𝐻M + 𝑏𝑂D → 𝑦P 𝐶𝐻Q 𝑂R 𝑁Q + 𝑧𝐶𝐻) 𝑂T 𝑁U + (1 − 𝑦P − 𝑧)𝐶𝑂D + 𝑐𝐻D 𝑂 Ecuación

14.
El análisis termodinámico del proceso de fermentación se basa en considerar la ecuación 14
como un proceso parcial de oxidación reducción con una transferencia de electrones al oxígeno
como se dijo anteriormente, es importante considerar además el grado de reducción de la
biomasa, del producto y del sustrato (glucosa) el cual se define como el número de electrones
que se transfieren al oxígeno durante la oxidación completa de cada uno de estos componentes
del metabolismo celular.
La demanda energética del proceso es un factor de gran relevancia que se debe analizar; la
energía evolucionada en forma de calor metabólico (calor estándar de combustión de las
moléculas orgánicas) durante el proceso se extrae del sistema mediante el flujo de aire a través
del mecanismo de evaporación (Dustet et. al 2004).
Por último, para ser evaluado el proceso energéticamente, es necesario hablar de los
rendimientos energéticos de la biomasa y los productos que representan la energía que
contienen la biomasa y el producto formados con respecto a la energía del sustrato
metabolizado (en este caso al ser Saccharomyces cerevisiae una levadura heterótrofa la fuente
principal de energía para el metabolismo es además la fuente de carbono).
6.8. Presente un gráfico donde muestre usted el efecto Crabtree evidenciado durante el
experimento.

Gráfica 6. Comportamiento de glucosa, etanol y biomasa bajo

condiciones aerobias.

Otra particularidad de algunas levaduras, entre las que se encuentra S. cerevisiae, es la

presencia del efecto Crabtree. Este consiste en el cambio de metabolismo mixto fermentativo-
respiratorio a puramente fermentativo cuando la concentración de glucosa externa supera 0.8
mM en presencia de O2. Se piensa que los elevados niveles de glucosa excede la capacidad de
reacción de la piruvato deshidrogenasa, generando un sobre flujo sobre la piruvato
descarboxilasa y dirigiendo el metabolismo hacia la producción de etanol. Otra posible
explicación es la represión de genes que codifican para enzimas respiratorias por glucosa.

Cuando S. cerevisiae realiza fermentación, la producción de biomasa es menor comparado con

la respiración aerobia, dado que el rendimiento energético se dirige principalmente al
funcionamiento celular y no es suficiente para la división celular. En la fermentación el
consumo de glucosa aumenta, pues el sustrato se metaboliza con mayor velocidad para cubrir
las necesidades energéticas de la célula, produciendo etanol.

La presencia de azúcares asimilables superiores a 0.16 g/l produce inevitablemente la

formación de alcohol en el proceso de crecimiento de levadura Saccharomyces cerevisiae aún
en presencia de exceso de oxígeno. Por lo tanto, para debilitar el efecto del Crabtree en los
cultivos por lotes y continuos, el flujo de azúcar debería limitarse, lo que lamentablemente
reduce el rendimiento celular. Por lo anterior es preferible que la producción de levadura se
lleve a cabo con sistemas de "Batch" alimentado con alimentación programada de azúcares
para maximizar la formación de biomasa e impedir la formación de alcohol. (Altamirano C,
2013). En la gráfica 6 se puede observar que durante la fermentación no se presentó el efecto
crabtree ya que la producción de biomasa siempre permanece mayor con respecto a la
producción de etanol.
6.9. Con los datos obtenidos calcule el Ks y YX/S empleando el método numérico de ajuste
aprendido en su curso de diseño de biorreactores empleando Matlab. Revise en la literatura los
respectivos valores para S. cerevisiae y compárelos con los obtenidos.
Los parámetros del modelo cinético de Monod fueron estimados mediante el solver de
programación no lineal fminsearch de Matlab para lograr el mejor ajuste a los datos del cultivo
en condiciones aerobias en el intervalo en el cual no se consumía aún el etanol, ya que el modelo
usado no admite el uso de múltiples sustratos. Para lograr hacer uso de las herramientas
disponibles en el software se supuso una velocidad máxima por encima de la observada, 0.5 h
-1, obteniendo un valor de Ks de 0,4457 g/L (anexo 1); resultado que difiere con los datos
registrados en la literatura (gráfica 7), los cuales se encuentran en un intervalo mucho menor,
posiblemente debido a la concentración de glucosa utilizada en ese caso.
Posteriormente se calculó el rendimiento de sustrato en biomasa por medio de un ajuste
polinómico de la gráfica de concentración de glucosa con respecto al tiempo, la ecuación
obtenida se derivó y se obtuvo la velocidad de consumo de sustrato con la cual se despejo Yxs
(ecuación 16). Los datos obtenidos son similares a los valores del método diferencial y se
muestran en la tabla 7.

𝑦 = 0,332𝑥3 − 2,1796𝑥2 − 2,4941𝑥 + 12,249

R² = 0,9997

Ecuación 15. Ajuste polinomico de los datos

experimentales de glucosa en la fermentación aerobia

)a )Q
𝑟𝑠 = b + e + 𝑚T 𝑋
cd fg

Ecuación 16. Ecuación genérica para el consumo de

sustrato.
 Tabla 7. Valores rendimiento de sustrato en biomasa

Gráfica 7. Parámetros cinéticos de Saccharomyces cerevisiae

encontrados en la literatura. (Scheiblauer et.al 2018)
 BIBLIOGRAFÍA

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Scheiblauer, Johannes & Scheiner, Stefan & Joksch, M. & Kavsek, Barbara. (2018).
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(2010). Complementos nutricionales para el rendimiento y nutrición del cultivo de melon con
fertirriego y acolchado. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 5-15.
ANEXO 1

function [Vmax,Km,Ks]=parametres()
%Kinetic data
Data.s=[0;1.46;3.38;5.26;6.77;7.99;9.35;10.54;11.67];
Data.U0=[0.199;0.354;0.436;0.444;0.437;0.446;0.465;0.450;0.443];
%M-M plot
figure;plot(Data.s,Data.U0,'o')
xlabel('substrate concentration');ylabel('initial velocity')
title('M-Mplot')
%ask user for guess parameters
Umax_0=input('Enter guess for Umax: ');
KS_0=input('Enter guess for KS: ' );
theta_0=[Umax_0,KS_0];

%Call minimizer to fit rate law

theta=fminsearch(@SSE,theta_0,[],Data);
%Extraxct results
Umax=theta(1)
KS=theta(2)

Sys.Umax=theta(1); Sys.KS=theta(2);
return
function sse=SSE(theta,Data);
Sys.Umax=theta(1); Sys.KS=theta(2);
U0=nose(Sys,Data.s);
res=Data.U0-U0;
sse=0.5*dot(res,res);
return
function U0=nose(Sys,S);
U0=(Sys.Umax*S)./(Sys.KS+S);
return