UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA DE INGENIERIA AGRONOMICA

GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE

SEMILLAS DE ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)

TRABAJO EXPERIMENTAL

Trabajo de titulación presentado como requisito para

la obtención del título de

INGENIERO AGRÓNOMO

AUTOR (A)
OTERO RUIZ KARISSA LISSETH

TUTOR(A)
ING. ARIADNE VEGAS

GUAYAQUIL – ECUADOR

2020
 2

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERIA AGRONOMICA

APROBACION DEL TUTOR

Yo, ARIADNE VEGAS, docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi

calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: “GERMINACIÓN Y
CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE ORQUIDEA (encyclia
angustiloba)”, realizado por la estudiante OTERO RUIZ KARISSA LISSETH;
con cedula de identidad N° 0706693298 de la carrera de INGENIERIA
AGRONOMICA, Unidad Académica Guayaquil, ha sido orientado y revisado
durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la
Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del
mismo.

Atentamente,

………………………………..
Ing. ARIADNE VEGAS

Guayaquil, 13 de octubre del 2019

 3

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERIA AGRONOMICA

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN

Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como

miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de
titulación: “GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE
ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)”, realizado por la estudiante OTERO RUIZ
KARISSA LISSETH, el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la
Universidad Agraria del Ecuador.

Atentamente,

Ing. Danilo Valdez M.Sc

PRESIDENTE

Ing. Augusto Marcillo M.Sc Ing. Ariadne Vegas M.Sc Ph.D

EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL

Ing. Wilmer Baque M.Sc

EXAMINADOR SUPLENTE

Guayaquil, 03 de julio del 2019

 4

Dedicatoria

Esta tesis se la dedico exclusivamente a mis padres

Diana Ruiz y Bolívar Otero, por ser las personas

más importantes en mi vida y que me han apoyado

incondicionalmente en todas las decisiones que he

tomado, También quiero dedicar este trabajo a mis

hermanos Kathia, y Kevin Otero Ruiz por apoyarme

en las buenas y en las malas, por estar en todo

momento conmigo.
 5

Agradecimiento

Agradezco primero a Dios, por acompañarme en

cada paso que doy en todo el transcurso de mi vida.

A mis padres Bolívar Otero y Diana Ruiz, a mis

hermanos Kathia Otero y Kevin Otero.

Le agradezco a mi directora de Tesis la Ing. Ariadne

Vegas M.Sc. P.hD, por sus enseñanzas y su

colaboración incondicional para lograr este proyecto.

A los profesores que con sus enseñanzas han

sabido guiarme día a día.

 6

Autorización de Autoría Intelectual

Yo OTERO RUIZ KARISSA LISSETH en calidad de autor(a) del proyecto

realizado, sobre “GERMINACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS

DE ORQUIDEA (Encyclia angustiloba)” para optar el título de INGENIERA

AGRÓNOMA por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL

ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los

que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor(a) me correspondan, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en

los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y

su Reglamento.

Guayaquil, 6 de agosto del 2019

OTERO RUIZ KARISSA LISSETH

0706693298
 7

Índice general

PORTADA………………………………………………………………………………1

APROBACION DEL TUTOR..............................................................................2

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN....................................3

Dedicatoria........................................................................................................4

Agradecimiento.................................................................................................5

Autorización de Autoría Intelectual................................................................6

Índice de tablas...............................................................................................15

Índice de figuras.............................................................................................17

1. Introducción................................................................................................21

1.1 Antecedente del problema..........................................................21

1.2 Planteamiento y formulación del problema..............................21

1.2.1 Planteamiento del problema............................................................21

1.2.2 Formulación del problema...............................................................22

1.3 Justificación de la investigación................................................22

1.4 Delimitación de la investigación................................................23

1.5 Objetivo general...........................................................................23

1.6 Objetivos específicos..................................................................23

 8

1.7 Hipótesis.......................................................................................24

2. Marco teórico..............................................................................................25

2.1 Estado del arte..............................................................................25

2.2 Bases teóricas..............................................................................29

2.2.1 Generalidades de Encyclia angustiloba.........................................29

2.2.2 Taxonomía de la orquídea Encyclia angustiloba..........................30

2.2.3 Morfología de la orquídea Encyclia angustiloba...........................30

2.2.4 Micropropagación de orquídeas.....................................................31

2.2.5 Propagación de orquídeas por semillas........................................31

2.2.6 Etapas de la Micropropagación......................................................31

2.2.6.1 Selección del explante.....................................................................31

2.2.6.2 Establecimiento de medios de cultivo....................................32

2.2.6.3 Multiplicación.............................................................................32

2.2.6.4 Desarrollo y enraizamiento......................................................33

2.2.6.5 Adaptación a medio externo....................................................33

2.2.7 Factores que afectan la propagación la germinación y crecimiento de

las orquídeas.....................................................................................................34

2.2.7.1 Luz...............................................................................................34

2.2.7.2. Temperatura..............................................................................34

2.2.7.3 pH................................................................................................35
 9

2.2.7.4 Humedad relativa (HR)..............................................................35

2.2.8 Medios de cultivos en orquídeas.......................................................35

2.2.9 Medios de cultivo con suplementos orgánicos...............................36

2.2.9.1 Agua de coco.............................................................................36

2.2.9.2 Medio PDA (Agar Dextrosa-Papa)...........................................36

2.2.10 Medios de cultivo con reguladores de crecimiento......................36

2.2.10.1 Citocininas (BAP) 6-benzilaminopurina................................36

2.2.11 Fitohormonas....................................................................................37

2.2.12 Conservación in vitro de semillas de orquídeas...........................37

2.3 Marco legal....................................................................................37

3. Materiales y métodos.................................................................................40

3.1 Enfoque de la investigación....................................................................40

3.1.1 Tipo de investigación..........................................................................40

3.2 Metodología.................................................................................................40

3.2.1 Variables...............................................................................................40

3.2.1.1. Variable independiente para la germinación in vitro de

semillas...................................................................................................40

3.2.1.2. Variables independientes para la conservación in vitro de

semillas...................................................................................................40

3.2.4 Recolección de datos.........................................................................42

3.2.4.2. Métodos y técnicas..................................................................43

 10

3.2.5 Análisis estadístico.............................................................................43

3.2.5.1. Análisis funcional.......................................................................43

3.2.5.3. Hipótesis estadística............................................................44

3.2.5.3.1. Hipótesis estadística para la germinación de las semillas.

...............................................................................................................44

3.2.5.5. Manejo del ensayo........................................................................45

3.2.5.6. Variables a evaluarse...................................................................46

3.3.Aspectos administrativos...........................................................48

3.3.1Recursos Bibliográficos......................................................................48

3.3.2Materiales y Equipos............................................................................49

3.3.3Recursos Humanos..............................................................................49

3.3.4Recursos Económicos.........................................................................50

4. Resultados...................................................................................................51

4.1 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia

angustiloba en medios de cultivos artificiales..............................................51

4.1.1 Primera Siembra..................................................................................51

4.1.2 Conservación de semillas de Encyclia angustiloba........................53

4.2 Identificar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de

Encyclia angustiloba........................................................................................54

4.3 Establecer métodos de conservación de semillas in vitro de Encyclia

angustiloba........................................................................................................55
 11

5. Discusión.......................................................................................................56

6. Conclusiones................................................................................................59

7. Recomendaciones........................................................................................60

8. Bibliografía....................................................................................................61

9. Anexos...........................................................................................................68
 12

Índice de tablas

Tabla 1. Tratamientos para evaluar para la germinación in vitro de las semillas de

Encyclia angustiloba.............................................................................37

Tabla 2. Tratamientos para evaluar para la conservación in vivo de las semillas de

Encyclia angustiloba.............................................................................38

Tabla 3. Esquema de andeva para la germinación in vitro de semillas.................40

Tabla 4. Características del experimento...............................................................41

Tabla 5. Valoración económica del proyecto..........................................................46

Tabla 6. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios de

cultivo apropiados para la germinación de semilas de Encyclia

angustiloba...............................................................................................48

Tabla 7.Composición básica fundamental medios de cultivo.................................65

Tabla 8.Componentes del medio Murishage & Skoog (MS)..................................66

13
 14

Índice de figuras

Figura 1. Criterios para establecer germinación y estadios de crecimiento de

encyclia angustiloba. (según Batigyna et al. 2003)..............................43

Figura 2. Plántulas de Encyclia angustiloba en medio PDA a los 120 dds (400X)

.................................................................................................................48

Figura 3. Ubicación geográfica del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad

Agraria del Ecuador, sede Guayaquil. (Tomado de Google Maps)........64

Figura 4. Anava Prueba de Kruskal Wallis en germinación in vitro........................67

Figura 5. Conservación de la semilla Encyclia angustiloba (Capsulas sanas)...67

Figura 6. Germinación de Encyclia angustiloba..................................................67

Figura 7. Germinación in vitro de semillas de E. angustiloba...............................68

Figura 8. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la conservación de semillas de

Encyclia angustiloba.............................................................................68

Figura 9. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios de

cultivo apropiados para la germinación de semillas de Encyclia

angustiloba.............................................................................................69

Figura 10. Cápsulas maduras de la orquídea Encyclia angustiloba donadas por

el jardín botánico de Guayaquil...............................................................70

Figura 11. Preparación de los medios de cultivos para la germinación de la semilla

de Encyclia angustiloba........................................................................70
 15

Figura 12. Pesado y desinfección de las semillas de Encyclia angustiloba en la

cámara de flujo laminar............................................................................71

Figura 13. Proceso de siembra de los medios de cultivo A) Siembra de las

semillas Encyclia angustiloba...............................................................71

Figura 14. Evaluación y contaje de la semillas de la orquídea en los medios de

cultivo.......................................................................................................72

Figura 15. Evaluación de la contaminación externa por hongos y bacterias en los

medios de cultivo.....................................................................................72

Figura 16. Observación de semillas y plántulas en Encyclia angustiloba en PDA

.................................................................................................................73

Figura 1. Evaluación y contaje de las semillas de la orquídea en los medios de

cultivo con mi tutora Dra. Ariadne Vegas………………………………..74

 16

Resumen

La orquídea Encyclia es una especie endémica de la provincia del Guayas, la

única en su clase y fue designada como la flor emblemática de Guayaquil. El

objetivo de la presente investigación fue determinar la germinación y

conservación in vitro de semillas de Encyclia angustiloba. Esta investigación

fue realizada en el laboratorio de biotecnología de la Universidad Agraria del

Ecuador. Se utilizaron tres medios de cultivo para la determinación del porcentaje

de germinación: MS adicionado con 20 % agua de coco (AC), MS suplementado

con BAP (3 mg L-1) y PDA, utilizando 10 repeticiones, con un total de 30 unidades

experimentales. Para la conservación, se utilizaron cuatro tratamientos:

refrigeración a 4 °C y temperatura ambiente (aprox 20 ± 2°C), ambos en

condiciones de oscuridad, durante 90 días, y sembrados posteriormente en dos

medios de cultivo, con 10 repeticiones para un total de 40 unidades

experimentales. Se utilizó la fórmula de análisis de varianza no paramétrico

Kruskal Wallis para determinar las mejores condiciones de germinación y

conservación. Entre los 90 y 120 días después de la siembra, se presentó el

0,1096 y 0,0509% de germinación en los medios de cultivos PDA y MS AC,

respectivamente, y no hubo germinación en el MS BAP. Las condiciones de

conservación de las semillas a las que fueron sometidas no favorecieron el

porcentaje de germinación y este fue nulo.

Palabras clave: Dextrosa, Epidendrum, medios de cultivo, Orchidaceae,

propagación in vitro,
 17

Abstract

The Encyclia orchid is an endemic species of Guayas province, the only one of its

kind and was designated as the Guayaquil emblematic flower. The objective of the

present investigation was to determine the in vitro germination and conservation of

Encyclia angustiloba seeds. This research was carried out in the biotechnology

laboratory of the Agrarian University of Ecuador. Three culture media were used to

determine the germination percentage: MS with 20% coconut water (AC), MS

supplemented with BAP (3 mg L-1) and PDA, using 10 repetitions, with a total of

30 experimental units. For conservation four treatments used: 4°C and room

temperature (approximately 20 ± 2°C), both in dark conditions for 90 days, and

later placed in two culture media, with 10 repetitions for a total of 40 experimental

units. For statistical analysis the Kruskal Wallis non-parametric variance formula

was used to determine the best germination and conservation conditions. Between

90 to 120 days after culture, 0.1096 and 0.0509% of germination occurred in the

PDA and MS AC culture medium, respectively, and there was no germination in

the MS BAP. The conservation conditions where the seeds were placed did not

favored germination percentage and it was null.

Keywords: Culture media, dextrose Epidendrum, Orchidaceae propagation in

vitro
 18

DA1. Introducción

1.1 Antecedente del problema

“Las orquídeas como se le denomina comúnmente se caracterizan por

presentar una muy variada gama de formas, colores, tamaños, fragancias

especialmente sus flores, hecho que suma a estas plantas un agregado, en su

valor comercial” (Jørgensen y León-Yánez, 1999).

Ecuador posee una gran diversidad de plantas y fue declarado como país de

orquídeas por la diversidad de especies que existen, pues en su territorio han

sido contabilizadas, hasta ahora, 4.032 especies, de las cuales 1.714 son

endémicas. En términos absolutos, es el país que más especies de orquídeas

tiene en todo el planeta. Ecuador alberga cuatro de las cinco familias de

orquídeas.

“La orquídea Encyclia angustiloba Schltr es una especie endémica de la

provincia del Guayas, la única en su clase entre los tipos de orquídeas que

crecen en los diferentes ecosistemas y fue designada como la flor emblemática

de Guayaquil”.

1.2 Planteamiento y formulación del problema

1.2.1 Planteamiento del problema

Debido a su belleza y rareza, las orquídeas se encuentran entre las plantas

más buscadas por horticultores, y por vándalos a nivel mundial (Mosquera et al.

2010). De hecho, algunas especies se encuentran amenazadas o en peligro de

extinción en nuestro país, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de

espacios, contaminación ambiental y deforestación, asociado a los problemas

de lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales

(León-Yanez et al., 2011).

 19

“Parte de la fragilidad de las orquídeas, es atribuida a lo complejo de su

biología reproductiva, en especial por las características de sus semillas, las

cuales son muy pequeñas y carecen de endospermo, lo que hace que la

viabilidad en su entorno natural sea muy precaria” (Flores-Escobar et al., 2013).

“Considerando lo antes mencionado, y en búsqueda de propagar y conservar

la especie Encyclia angustiloba se plantea desarrollar metodologías en cultivo

in vitro”.

1.2.2 Formulación del problema

¿Con uso de la técnica de cultivo in vitro se podrá germinar y conservar

semillas de Encyclia angustiloba para mejorar su propagación?

1.3 Justificación de la investigación

“Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para

germinar en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación

asimbiótica bajo condiciones in vitro” (Arditti y Ernst, 1993).

Para la comercialización de estas plantas, se requiere un largo periodo de

tiempo para la propagación; establecimiento, desarrollo y floración; sin

embargo, es posible disminuir este tiempo e incrementar las poblaciones a

través de técnicas biotecnológicas de cultivo, suministrando las condiciones

óptimas y los nutrimentos necesarios para su crecimiento y desarrollo (Nava,

2013).

De acuerdo con lo mencionado por Flores-Hernández et al. (2017) el cultivo in

vitro es una técnica que permite la germinación y propagación de

prácticamente cualquier orquídea, esto debido a que se lleva a cabo en

condiciones de asepsia, con una fuente de nutrimentos y condiciones físicas

 20

controladas, lo que facilita su capacidad de reproducción y crecimiento. Sin

embargo, cada especie de orquídea tiene diferentes necesidades de nutrientes

para germinar, por lo que hay que evaluar cuál es el medio de germinación

adecuado para cada una de ellas.

En este sentido, el objetivo es evaluar la eficacia de diferentes medios de

cultivo como son Murashige y Skoog (MS) más un ingrediente adicional, a

saber: Agua coco, BAP (Bencil Amino Purina) y medio Papa Dextrosa Agar

(PDA) para la micropropagación de semillas de Encyclia angustiloba, con el

fin de propagar y conservar esta emblemática orquídea ecuatoriana.

1.4 Delimitación de la investigación

 Espacio: Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Agraria del

Ecuador, sede Guayaquil.

 Tiempo: El periodo de esta investigación será de 10 meses

aproximadamente, desde octubre de 2018 hasta agosto 2019.

 Población: Dirigido a la comunidad universitaria, comunidad científica en

general, productores y conservacionistas de orquídeas.

1.5 Objetivo general

Establecer un protocolo para la germinación y conservación in vitro de

semillas de Encyclia angustiloba.

1.6 Objetivos específicos

 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia

angustiloba en medios de cultivos artificiales.

 Identificar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de

Encyclia angustiloba.
 21

 Establecer métodos de conservación de semillas in vitro de Encyclia

angustiloba.

1.7 Hipótesis

Al menos uno de los tratamientos ayudará la germinación y conservación de las

semillas de Encyclia angustiloba.

 22

2. Marco teórico
2.1 Estado del arte

Las orquídeas son conocidas en todo el mundo, principalmente debido a la

exuberante belleza de sus flores. Por su rareza y dificultad de propagación, es

una planta que se cotiza muy bien en el mercado de la floricultura, bien sea

como flor cortada o como planta ornamental. Ecuador es reconocido como un

país megadiverso en la diversidad de estas plantas, de hecho, el 24% de su

flora nativa está constituida por las Orquídeas (Cerna et al., 2014).

Estas plantas poseen adicionalmente un incalculable valor en el equilibrio de la

biodiversidad, ellas poseen diferentes roles dentro de los ecosistemas, entre

ellos el de proveedoras de néctar y aceites esenciales para colibríes,

murciélagos, mariposas, palomillas, abejas, abejorros y otros polinizadores; se

pude mencionar también como sus hojas y pseudobulbos proveen alimento

para insectos y ciertos mamíferos, las orquídeas por ser mayoritariamente

epifitas agregan estructura a los troncos de árboles y sustratos en donde

crecen y por lo tanto, son importante fuente de refugios para insectos, arañas y

aves. Por estas razones, existen actualmente grandes esfuerzos por preservar

la diversidad de especies, tanto en su estado natural como en viveros.

Ejemplos de este trabajo los podemos apreciar en los Jardines Botánicos de

Quito y el Jardín Botánico de las Orquídeas en Puyo (IARNA, 2017).

“La germinación y desarrollo de plántulas de híbridos de Encyclia, en general,

presentó la mejor germinación en el medio de cultivo MS+AC” (Salazar, 2013).

 23

“Al inicio de la fase de germinación de la semilla de orquidea, la cual inicia al

finalizar la semana 4, donde el desarrollo se da de en forma muy equilibrada,

alcanzando el mayor porcentaje de germinación en el medio MS+AC con un

67.53%” (Barrientos, 2010).

“La Encyclia debe desarrollarse a temperaturas algo frescas o cálidas;

preferiblemente entre los 20-28 °C. No soporta las heladas” (Tropical, 2016).

Debido a lo complejo de sus ciclos reproductivos y su indudable valor

económico, las orquídeas son objeto de diversos estudios dentro del campo de

la biotecnología. En este sentido, la aplicación del cultivo in vitro en estas

hermosas plantas tiene como principal uso la conservación de germoplasma,

además, los especímenes producidos de esta manera son de gran interés para

los programas de reintroducción de especies nativas en áreas de preservación

del medio ambiente (Araujo, 2014).

Las orquídeas presentan problemas serios para su propagación en forma

natural debido a que la mayor parte de las semillas están escasamente

diferenciadas por lo que no se les distinguen los cotiledones ni las radículas ya

que carecen de endospermo (Duarte, 2014).

La primera propagación exitosa de orquídeas en condiciones in vitro a partir de

la germinación de semillas fue lograda por Knudson (1922) con especies de

Cattleya, posterior a este trabajo ha habido muchos otros, entre ellos, Lo et al.
 24

(2004) con Dendrobium tosaense y Damon et al. (2004) con Cattleya

aurantiaca, Encyclia angustiloba y Brassavola nodosa.

“El medio cultivo es una mezcla de sustancias que proveen a la planta las

condiciones nutritivas necesarias para su desarrollo” (Robles, 2015).

Recientemente, como indica Cedrés et al. (2015) se han modernizado las

técnicas para la siembra in vitro de orquídeas mediante semillas, Este método

asimbiótico suma ya varios protocolos, el primero considera tener cápsulas

cerradas ó verdes, realizar la desinfección antes de la siembra, ya que las

semillas se mantienen estériles en el interior del fruto. En el segundo caso, con

las cápsulas abiertas es necesario desinfectar las semillas.

Posterior a estos pasos de esterilización, viene la siembra de las semillas, las

cuales se ha venido haciendo con éxito en medio MS, sin embargo,

recientemente, Torrente et al. (2013) han determinado que en el medio BM1

(Terrestrial Orchid Medium Phyto Technology Laboratories) se desarrolla más

rápido el protormo de las especies de orquídeas como: Orchis papilionacea,

Orchis. coriophora, Ophrys speculum, Ophrys. Fusca.

Actualmente se conocen dos principales alternativas de conservación de

especies: conservación in situ y ex situ ambas deben ser complementarias y

deben trabajarse en conjunto para poder establecer una estrategia de

conservación integral. Cuando se trata de conservar la mayor diversidad

genética durante la micropropagación, las semillas constituyen normalmente el

 25

material de propagación elegido, ya que se induce de manera sencilla, la

brotación múltiple en un estado precoz de su desarrollo, con una tasa de

multiplicación muy alta debido a su bajo grado de diferenciación celular en un

tejido con alto grado de estabilidad genética (Robles, 2015).

La conservación ex situ de germoplasma de especies raras y amenazadas se

basa principalmente en utilización de bancos de germoplasma, estos son

centros orientados en el almacenamiento de propágulos de una parte

representativa de la variabilidad genética que corresponde a una determinada

especie (Iriondo, 2001).

Para determinar los medios de cultivo y condiciones óptimas para esta

conservación, se cultivaron plántulas en medio MS modificado, variando la

concentración de sus componentes de MS + 170 ml L -1 agua de coco, MS + 1

mg L-1 BAP y PDA (15 g papa L-1 - 10 g L-1 Dextrosa- 10 g L-1 agar) bajo

refrigeración a 5°C (Avila, 2006).

“Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para

germinar en forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación

asimbiótica bajo condiciones in vitro” (Ruiz, 2008).

La germinación de orquídeas sucede en cinco estadios secuenciales; la

primera etapa comienza con la imbibición de las semillas a través de a testa lo

cual produce un aumento en el volumen del embrión; en la segunda etapa

existe una división celular; en la tercera etapa el protocormo empieza a

 26

desarrollarse; en la cuarta etapa el protocormo sigue creciendo y se desarrolla

una yema apical y la quinta etapa aparecen las primeras hojas fotosintéticas y

raíces (Barbery y Morales, 2011).

La preservación de especies con semillas ortodoxas como lo son la mayoría de

las orquídeas es viable y puede garantizar su almacenamiento. Y las semillas

para su conservación se mantienen bajo humedad y temperatura (refrigeración

o ambiente) (Ortega, 2012).

2.2 Bases teóricas

2.2.1 Generalidades de Encyclia angustiloba

Encyclia es un género de 242 especies de orquídeas epífitas que se han

reclasificado procedentes del género Epidendrum son diferentes a los bulbos

parecidos a las Cattleya y en la estructura de las flores. Se encuentra en

Centroamérica, y Caribe, donde por las noches llena el aire con las fragancias

de su perfume parecido a los cítricos (Asociación ecuatoriana de

Orquideología, 2018). En el período 2005 – 2010, la familia Orchidaceae es la

que mayor número de adiciones, nuevos registros y cambios taxonómicos ha

presentado para el país: se han añadido 340 nuevas especies, 25 nuevos

registros, 275 cambios taxonómicos y se han identificado dos nuevos géneros

de orquídea para el país (Orquidea, 2013).

“Entre sus usos se destaca el ornamental, medicinal como agua para bañar a

las parturientas, y según estudios etnobotánicos esta planta aporta vitaminas”

(Villavicencio et al., 2005).

 27

2.2.2 Taxonomía de la orquídea Encyclia angustiloba

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Liliopsida

Orden: Asparagales

Familia: Orchidaceae

Género: Encyclia

Especie: E. angustiloba

2.2.3 Morfología de la orquídea Encyclia angustiloba

“Según Stevens et al. (2011) Encyclia angustiloba presenta las siguientes

características morfológicas”:

Hojas: Las hojas son angostas y crecen hasta 25 cm de longitud. Las plantas

que están expuestas al sol brillante adquieren una coloración rojiza.

Cada pseudobulbo tiene una o dos hojas.

Inflorescencia: Una por pseudobulbo, originada en la base del pseudobulbo

maduro, paniculada, de 60 a 150 cm de largo, pedúnculo de 20 a 50 cm de

largo, provisto de brácteas triangulares de 1,7 a 3,5 cm de largo, de 1 a 1,4 cm

de ancho, brácteas florales triangulares, de 4 a 8 mm de largo, de 4 a 5 mm de

ancho, ovario ligeramente surcado, de 20 a 32 mm de largo.

Flores: La panícula atractiva está erguida, ramificada y tiene las flores

agrupadas en la punta. Los pétalos y sépalos son de color marrón rojizo y el

labio es blanco, lo que contrasta muy bien con los pétalos.

 28

Fruto: Cápsula elipsoide o fusiforme, 4 cm de largo, 1 cm de diámetro

2.2.4 Micropropagación de orquídeas

En el caso de las orquídeas, las semillas representan el material de

propagación de primera opción, ya que induce de manera sencilla la brotación

múltiple en un estado precoz de su desarrollo, con una tasa de multiplicación

muy alta, debido a su bajo grado de diferenciación celular en un tejido con alto

grado de estabilidad genética (Salazar, 2013). En este caso en particular, la

técnica de cultivo in vitro puede contribuir a mejorar los porcentajes de

germinación (Iriondo, 2011; Raya et al., 2013).

2.2.5 Propagación de orquídeas por semillas

Según Mosquera et al. (2010), la germinación in vitro de semillas de orquídeas

puede ser efectuada por dos vías: a) Co-cultivo de las semillas con diversos

hongos micorrízicos para establecer una relación simbiótica. Para lo cual es

necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un medio de cultivo específico. b)

Inoculación de las semillas en un medio de cultivo, que, en ausencia de hongos

simbióticos, proporciona los nutrientes requeridos para el desarrollo de la semilla.

2.2.6 Etapas de la Micropropagación

2.2.6.1 Selección del explante

En esta etapa se escoge el material vivo (planta) que genera las cápsulas

(semillas) a trabajar, con preferencia que estas aun estén verdes, es decir que

no hayan abierto. Cuando se trabaja con cápsula verde, debe estimarse el

tiempo requerido para su maduración (este es diferente para cada especie), de

saltar este paso es posible que la cápsula se encuentre en un estadio inicial de

 29

maduración, lo que afectaría negativamente el proceso de germinación (Otero y

Bayman, 2014).

Algunos de los indicadores para determinar si una cápsula presenta semillas

maduras, son el cambio de coloración (generalmente inicia la presencia de

tonalidades amarillas), la base de la cápsula en el lugar del relicto floral se

encuentra seco y cuando se presiona no se deforma debido a que se encuentra

llena de semillas (Seaton y Ramsay, 2005; Tirado, Naranjo y Atehortúa, 2013).

Una vez seleccionado el explante debe de seguirle la etapa de desinfección, ya

que el éxito de la micropropagación de plantas depende en gran medida del

control y prevención de la contaminación microbiana. Los contaminantes más

frecuentes en el cultivo in vitro son los hongos filamentosos, las bacterias y las

levaduras (Mosquera et al., 2010).

2.2.6.2 Establecimiento de medios de cultivo

Un medio de cultivo es el soporte artificial sobre el cual germinarán y se

desarrollarán las plántulas seleccionadas, por tal razón este sustrato debe de

poseer una serie de características, según se muestra en la tabla 1.

2.2.6.3 Multiplicación

El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para

los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a

la siguiente etapa de producción: enraizamiento, bulbificación, etc. (Cedrés et

al. 2015).
 30

En el caso de las orquídeas para asegurar una óptima multiplicación, se

recomienda cultivar a una temperatura de 27 °C ± 2, con iluminación difusa, y

se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten problemas de

fenolización (Mosquera et al. 2010).

2.2.6.4 Desarrollo y enraizamiento

Esta etapa consiste en la aparición de raíces y desarrollo de las plántulas. El

enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el

primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de

crecimiento (auxinas) para promover la rizogénesis. Se transfieren los brotes

obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de

crecimiento o que sólo contenga auxinas.

2.2.6.5 Adaptación a medio externo

Representa la etapa final de la micropropagación, es la adaptación paulatina de

las plantas al medio ex vitro. Para ello, se recomienda seguir una serie de

pasos para obtener la mayor efectividad posible en este proceso. Según

Cedrés et al. (2015) estos pasos básicos son:

1.- Verificar la presencia de raíces, hojas y tallos

2.- Lavar con abundante agua el medio de cultivo de las plantas a trasplantar

3.- Tratar las plantas con fungicidas

4.-Preparar un sustrato adecuadamente, adicionando musgos, perlita, carbón

vegetal, poliestireno, arcilla, etc

5.- Acondicionar domo o maceta cerrada con tapa plástica para el trasplante,

para evitar la desecación.

 31

2.2.7 Factores que afectan la propagación la germinación y crecimiento de

las orquídeas

Existe un gran número de factores que afectan a la germinación y crecimiento

de las orquídeas, que depende en gran medida de las especies con las que se

desee trabajar. Según López-Villalobos et al. (1995), esto dependerá en gran

medida de las especies de orquídea que se trabaje, no obstante, los factores

básicos que influyen el desarrollo de estas plantas son las siguientes:

2.2.7.1 Luz

Las plantas como organismos autótrofos requieren indispensablemente de luz

solar. Dependiendo de la especie podemos observar que un cambio de

intensidad lumínica puede causar organogénesis y cambios morfogenéticos

específicos debido a la longitud de onda de la luz (González, 2003).

“En el caso de Encyclia angustiloba se ha reportado que requiere alta

intensidad lumínica (1000 - 3000 µmdm2s-1)” (López- Villalobos et al. 1995).

2.2.7.2. Temperatura

Es uno de los factores más importantes en el desarrollo de orquídeas, y que

inciden en la mayoría de los procesos fisiológicos; por lo que debe ser

considerado como un factor fundamental a controlar durante el proceso (Arditti

y Ernest, 1993). Generalmente cada especie tiene un intervalo de temperatura

en el que se produce el crecimiento óptimo, que oscila entre los 20-25º C

(Pierik, 1990; citado por González, 2003).

 32

2.2.7.3 pH

“Según Mosquera et al. (2010) el pH en el rango 5,0- 6,5 es apto para el

crecimiento, con un máximo alrededor de 6,0. Un pH bajo (menor de 4,5), o alto

(mayor que 7), generalmente frena el crecimiento y desarrollo in vitro”.

Por su parte, Robles (2015), señala que, si el pH es demasiado bajo, pueden

presentarse las siguientes complicaciones: la auxina, Acido Indol Acético (AIA)

y el ácido giberélico (AG3) se hacen menos estables, el agar pierde su rigidez,

precipitación de sales (fosfato o hierro) y finalmente, la vitamina B1 y el ácido

pantoténico se hacen menos estables.

2.2.7.4 Humedad relativa (HR)

Representa al igual que los otros factores un aspecto limitante, no obstante, en

orquídeas es un factor clave en su óptimo crecimiento, ya que de esta depende la

formación de raíces y la calidad de los brotes, En Encyclia angustiloba se ha

determinado que el óptimo es 45 – 60 % HR (López- Villalobos et al. 1995).

2.2.8 Medios de cultivos en orquídeas

Dentro del campo de la propagación in vitro de las orquídeas existen

actualmente varios medios de cultivo, como lo son: Murishage y Skoog (MS)

completo, MS, MS con reguladores de crecimiento, Knudson, Coco-tiamina.

Independientemente del medio elegido, el procedimiento general para preparar

un medio de cultivo es hacer una solución stock por separado. En el caso del

MS se recomienda hacer una solución de macronutrientes; una solución de

calcio, otra de hierro, una de micronutrientes y otra de vitaminas (IARNA,

2017). A continuación, se detallarán las proporciones en la preparación del

medio MS.
 33

2.2.9 Medios de cultivo con suplementos orgánicos

Según Salazar, Amaya y Barrientos (2013), con el fin de minimizar los costos

de la micropropagación de orquídeas, entre otros cultivos, se ha incursionado

en el uso de suplementos para los medios de cultivos con componentes

orgánicos. Tal es el caso del uso de alternativas como:

2.2.9.1 Agua de coco

El agua de coco es un suplemento de los medios de cultivo debido al alto

contenido de azúcares, aminoácidos, antioxidantes, minerales, ácidos

orgánicos y agentes promotores del crecimiento. Adicionalmente, se observado

con la adición de compuestos orgánicos como el agua de coco, un incremento

porcentual de la sobrevivencia ex vitro de las plántulas (Moreno y Mencha,

2007).

2.2.9.2 Medio PDA (Agar Dextrosa-Papa)

Este medio es ampliamente utilizado para aislamiento, purificación y

mantenimiento de hongos. Tiene la infusión de papa como fuente de almidones

y la dextrosa que son la base para el crecimiento de hongos. Este medio debe

presentar un pH de 5,6, el cual evita el crecimiento de las bacterias y es óptimo

para el desarrollo de los hongos (Narrea, 2006).

2.2.10 Medios de cultivo con reguladores de crecimiento

2.2.10.1 Citocininas (BAP) 6-benzilaminopurina

El BAP es un tipo de citocinina sintética que aporta al medio de cultivo la

mencionada fitohormona, esta se utiliza para estimular la división celular

(Cedrés et al. 2015). Adicionalmente, González et al. (2009) indica que esta

hormona puede retardar el envejecimiento celular e influye en el transporte de

auxinas.
 34

2.2.11 Fitohormonas

También llamadas hormonas vegetales, intervienen en la regulación celular de

los procesos de crecimiento y desarrollo de plantas; así una misma hormona es

capaz de intervenir en varios procesos y esto depende de la concentración de

la misma y su respuesta ocurre en un tiempo determinado. De acuerdo a la

especie que se utilice como objetivo de estudio se aplicará un tipo y

concentración determinada de estos reguladores de crecimiento (Espinoza,

2018).

2.2.12 Conservación in vitro de semillas de orquídeas

“Se recolectaron semillas de 12 especies que se extrajeron y se desecaron,

estas fueron almacenadas en tubos vacutainers, a través de dos métodos”:

• En refrigeración a 4◦C, más oscuridad

• a temperatura ambiente 20±2 ◦C, más luz

Se evaluaron cinco tratamientos: Murashige & Skoog M&S (T1), M&S+

vitaminas (T2), M&S + auxinas (T3), M&S + carbón activado 1% (T4) y

Knudson C (T5), se determinó que los medios óptimos de germinación in vitro

para todas las especies en estudio fueron: (T4), seguido de (T1). Las

orquídeas, indistintamente del tratamiento, que presentaron mayor viabilidad

fueron: Sobralia rosea (90%), Sievekingia marsupialis (90%), Maxillaria

rufescens y Epidendrum sp. (75%). (Cerna et al., 2014).

2.3 Marco legal

Régimen del Buen Vivir

Capitulo Segundo (Biodiversidad y Recursos Naturales)

Según la Constitución de la Republica de Ecuador (2008), indica lo siguiente:

 35

Articulo 73.- EI Estado aplicará medidas de precaución y restricción para las

actividades que puedan conducir a la extinción de especies, la destrucción de
ecosistemas o la alteración permanente de los ciclos naturales. Se prohíbe la
introducción de organismos y material orgánico e inorgánico que puedan alterar
de manera definitiva el patrimonio genético nacional.

Articulo 400.- El Estado ejercerá la soberanía sobre la biodiversidad, cuya

administración y gestión se realizará con responsabilidad intergeneracional. Se
declara de interés público la conservación de la biodiversidad y todos sus
componentes, en particular la biodiversidad agrícola y silvestre y el patrimonio
genético del país.

Articulo 405.- EI sistema nacional de áreas protegidas garantizará la

conservación de la biodiversidad y el mantenimiento de las funciones
ecológicas. El sistema se integrará por los subsistemas estatal, autónomo
descentralizado, comunitario y privado, y su rectoría y regulación será ejercida
por el Estado. El Estado asignará los recursos económicos necesarios para la
sostenibilidad financiera del sistema, y fomentará la participación de las
comunidades, pueblos y nacionalidades que han habitado ancestralmente las
áreas protegidas en su administración y gestión.

Artículo 406.- El Estado regulará la conservación, manejo y uso sustentable,

recuperación, y limitaciones de dominio de los ecosistemas frágiles y
amenazados; entre otros, los páramos, humedales, bosques nublados,
bosques tropicales secos y húmedos y manglares, ecosistemas marinos y
marinos-costeros.

En cumplimiento Ley orgánica de Agrobiodiversidad, semillas y fomento de la

agricultura sustentable, en la cual se expresa lo siguiente:

Artículo 7.- De los beneficios e incentivos. A fin de estimular la conservación y

uso de la agrobiodiversidad, la semilla nativa y tradicional así como la
producción de semilla certificada de forma sostenible, orientada a garantizar la
soberanía alimentaria, el Estado en sus diferentes niveles de gobierno,
realizará las siguientes acciones: a) Establecer programas de transferencia e
innovación tecnológica participativa para la conservación de las zonas de alta
de agrobiodiversidad, Fitomejoramiento de semilla, producción y se
comercialización con énfasis en el desarrollo de proyectos para los pequeños y
medianos productores de semillas; b) Promover la generación de productos
financieros, líneas de crédito y tasas de interés preferencial, para estimular la
producción y comercialización de semilla; y, c) Impulsar la formación de
organizaciones de productores de semillas y de empresas semilleristas
públicas, privadas y comunitarias; generar programas de provisión de capital de
riesgo, servicios financieros de apoyo, infraestructura, equipamiento,
tecnificación, seguro agrícola y garantía crediticia.
Artículo 22.- De la investigación e innovación de los recursos fitogenéticos. La
Autoridad Agraria Nacional en coordinación con la institución rectora de la
educación superior, ciencia, tecnología e innovación, centros de educación
superior y entidades privadas establecerá planes, programas y proyectos para
fomentar la investigación, el desarrollo y la innovación tecnológica en materia
 36

de los recursos fitogenéticos y semillas. Además, fortalecerá y se promoverá la

generación de capacidades del talento humano.
Artículo 28.- Semilla nativa. Para efectos de esta ley, la semilla nativa es todo
material reproductivo sexual y asexual vegetal que mantiene su capacidad de
reproducción, originario o autóctono, que ha sido domesticado, conser-vado,
criado, cuidado, utilizado e intercambiado por productores, comunas,
comunidades, pueblos y nacionalidades de acuerdo a sus diversos saberes y
culturas, cuyo uso, conservación, calificación, intercambio, promoción y
protección corresponde a las personas, y colectividades con el apoyo del
Estado. La semilla nativa patrimonio de pueblos y nacionalidades, es parte de
los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura, cuyo competente
genético no es susceptible apropiación.
PROTECCIÓN DE LA AGROBIODIVERSIDAD
Artículo 7. Protección de la agrobiodiversidad.- El Estado así como las
personas y las colectividades protegerán, conservarán los ecosistemas y
promoverán la recuperación, uso, conservación y desarrollo de la
agrobiodiversidad y de los saberes ancestrales vinculados a ella. Las leyes que
regulen el desarrollo agropecuario y la agrobiodiversidad crearán las medidas
legales e institucionales necesarias para asegurar la agrobiodiversidad,
mediante la asociatividad de cultivos, la investigación y sostenimiento de
especies, la creación de bancos de semillas y plantas y otras medidas similares
así como el apoyo mediante incentivos financieros a quienes promuevan y
protejan la agrobiodiversidad.
Artículo 8. Semillas.- El Estado así como las personas y las colectividades
promoverán y protegerán el uso, conservación, calificación e intercambio libre
de toda semilla nativa. Las actividades de producción, certificación,
procesamiento y comercialización de semillas para el fomento de la
agrobiodiversidad se regularán en la ley correspondiente. El germoplasma, las
semillas, plantas nativas y los conocimientos ancestrales asociados a éstas
constituyen patrimonio del pueblo ecuatoriano, consecuentemente no serán
objeto de apropiación bajo la forma de patentes u otras modalidades de
propiedad intelectual, de conformidad con el Art. 402 de la Constitución de la
República.
 37

3. Materiales y métodos

3.1 Enfoque de la investigación

Se detalla el tipo, nivel de conocimiento y diseño de investigación.

3.1.1 Tipo de investigación

La presente investigación fue de carácter inductivo con las diferentes variables

o tratamientos que se realizaron en forma experimental, para acceder a la toma

de datos y así comprobar la hipótesis estadística.

3.1.2 Diseño de investigación

Investigación experimental: esta investigación permitió relacionar los resultados

de las variables a medir para ver el efecto que causan en las dependientes.

Investigación descriptiva: se recolectaron los datos que fueron basados en el

planteamiento de cada una de las variables, y así poder establecer características

y propiedades sobre el objeto de estudio.

Investigación explicativa: se relacionaron los datos obtenidos y los resultados

que se obtuvieron en la investigación.

3.2 Metodología

3.2.1 Variables

3.2.1.1. Variable independiente para la germinación in vitro de

semillas

Aplicación de tres medios de cultivos distintos, todos basados en la formulación

de Murashige and Skoog (MS) más un ingrediente adicional, a saber: Agua de

coco, Bencilaminopurina (BAP) y (Papa Dextrosa Agar) (PDA).

3.2.1.2. Variables independientes para la conservación in vitro de

semillas
 38

Se cosecharon las semillas en capsulas Petri y colocaron en sobres de papel

filtro dentro fundas plásticas herméticas, conteniendo silicagel y se conservaron

en dos condiciones: Temperatura ambiente 25 ± 2 ºC y bajo refrigeración a 4°C,

en condiciones de oscuridad, por un período de tres meses.

3.2.1.3. Variable dependiente para la germinación in vitro de semillas

Se evaluó porcentaje de germinación de las semillas.

3.2.1.4. Variable dependiente para la conservación in vitro de semillas

En las semillas de Encyclia angustiloba se evaluó el porcentaje de

germinación, después de transcurridos tres meses de los tratamientos de

conservación, de manera de elegir las mejores condiciones.

3.2.2 Tratamientos

A continuación, se describen los tratamientos a utilizar en la germinación in

vitro de las semillas:

Tabla 1. Tratamientos para evaluar para la

germinación in vitro de las semillas de
Encyclia angustiloba.
No. Tratamiento Descripción

1 MS + 200 ml L -1 agua de coco

2 MS + 3 mg L-1 BAP
PDA (30 g papa L-1 - 20 g L-1
3
Dextrosa- 18 g L-1 agar)
Otero, 2019
 39

Tabla 2. Tratamientos para evaluar para la

conservación in vivo de las semillas de

Encyclia angustiloba.

No. Tratamiento Descripción

1 Bajo refrigeración a 4°C y oscuridad.

Temperatura del laboratorio (aprox 20 ± 2°C) y luz
2 ambiental

Otero, 2019

3.2.3 Diseño experimental

Para llevar a cabo esta investigación se utilizó un Diseño Completamente al

azar (DCA), compuesto de tres tratamientos con 10 repeticiones cada uno, que

dan un total de 30 unidades experimentales a evaluar el mejor medio de cultivo

para la germinación de las semillas. Para determinar la mejor condición de

almacenamiento se aplicó el método de análisis de varianza no paramétrico de

Kruskal Wallis, compuesto de dos tratamientos con 10 repeticiones cada uno, que

dan un total de 40 unidades experimentales.

3.2.4 Recolección de datos

3.2.4.1. Recursos

Materiales y equipos: Para llevar a cabo la realización del proyecto se

emplearon semillas de Encyclia angustiloba donadas por el Biólogo

James Pérez, recolectadas en el 08 mes de enero del 2019. Así mismo, se

emplearon medios de cultivo, agua destilada, cajas Petri, bisturí, pinzas, papel

aluminio, vaso de precipitación, silicagel, balanza analítica, autoclave, cámara

 40

de flujo laminar, microscopio estereoscópico, computadora portátil.

Recursos bibliográficos: la información que se presentó en este estudio fue

basada en artículos científicos, boletines, libros y sitios web encontrados en la

biblioteca virtual del centro de información agraria.

Recurso humano: este recurso fue representado por el tutor y por el autor de

este proyecto.

Recurso Financiero: la inversión de este proyecto fue financiado por el autor

del proyecto y la Universidad Agraria del Ecuador.

3.2.4.2. Métodos y técnicas

 Método inductivo: Este método permitió observar los resultados obtenidos

con la finalidad de cumplir los objetivos e hipótesis planteada.

 Método deductivo: Permitió observar casos particulares de la

investigación a través de principios, teorías y leyes.

 Método sintético: Permitió establecer y relacionar los resultados para

construir la discusión, conclusiones relacionadas bajo la perspectiva de

totalidad de la investigación.

3.2.5 Análisis estadístico

3.2.5.1. Análisis funcional

Con los resultados obtenidos en cada unidad experimental en función de las

variables a medir se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para la germinación

y conservación de las semillas para la determinación de las diferencias entre dos

muestras independientes, comparando dos poblaciones, mediante la aplicación

del software estadístico INFOSTAT.

 41

3.2.5.2. Esquema de Andeva

Tabla 3. Esquema de andeva para la germinación

in vitro de semillas
Fuente de Variación Grados de libertad

Tratamientos (T-1) = 2

Error (N -T) = 27

Total N-1 = 29

Otero, 2019

3.2.5.3. Hipótesis estadística

3.2.5.3.1. Hipótesis estadística para la germinación de las semillas.

Ho: Ningún tratamiento contribuyó a la germinación de semillas de Encyclia

angustiloba.

Ha: Al menos uno de los tratamientos contribuyó a la germinación de semillas de

encyclia angustiloba.

3.2.5.3.2. Hipótesis estadística para la conservación de las semillas.

Ho: Ningún tratamiento contribuyó a la conservación de semillas de Encyclia

angustiloba

Ha: Al menos uno de los tratamientos contribuyó a la conservación de semillas de

Encyclia angustiloba.
 42

3.2.5.4. Delimitación Experimental

Tabla 4. Características del experimento

Variable Descripción

Germinación de las semillas

Tipo de Siembra In vitro
Número de tratamientos 3
Número de Repeticiones 10
Número de unidades experimentales 30

Conservación de las semillas

Tipo de Siembra In vitro
Número de tratamientos 2
Número de Repeticiones 10
Número de unidades experimentales 40

Otero, 2019

3.2.5.5 Manejo del ensayo

Preparación: se realizó en forma manual con uso de medios de cultivo y

condiciones de conservación.

Material genético: Encyclia angustiloba proveniente del Jardín Botánico de

Guayaquil.

Proceso de desinfección y siembra de las semillas in vitro: se colocó

aproximadamente 0.025 mg de semillas de Encyclia angustiloba y con ayuda de

la micropipeta coloque 3000 microlitros de agua destilada estéril. Al momento de

la siembra con una agitadora o varilla de vidrio procedí a mezclar las semillas y el

agua destilada, luego por cada caja Petri se colocó 100 microlitros de la mezcla y

se lo esparcío por todo el medio de cultivo. Las semillas se desinfectaron en una

 43

solución de etanol al 70% durante 5 minutos, para después transferirlas a una

solución de hipoclorito de sodio al 0,5% de cloro 10 minutos y por último se

enjuagaron con agua destilada estéril. El proceso de siembra se llevó a cabo en la

cámara de flujo laminar la cual previamente fue desinfestada, al igual que todas

las superficies de contacto utilizando isopropanol al 70%, y todo el material

utilizado para la siembra.

Dosificación: Se realizaron tres diferentes tratamientos de medios de cultivo para

poder demostrar cuál de estos es el mejor para la germinación y dos condiciones

diferentes para determinar la mejor conservación de semillas.

Toma de muestra: Las muestras se tomaron al azar.

3.2.5.6 Variables a evaluarse

Tratamientos para la germinación in vitro: se utilizaron tres medios de cultivos

distintos, todos basados en la formulación de Murashige y Skoog (MS) más un

ingrediente adicional, a saber: MS + Agua coco, MS + Bencilaminopurina (BAP) y

Papa Dextrosa Agar (PDA), para determinar cuál fue el mejor para la germinación

de las semillas de Encyclia angustiloba.

Porcentaje de contaminación externa: Se evaluó en todo el proceso de la

propagación in vitro de las semillas de Encyclia angustiloba.

Porcentaje de germinación: Para evaluar el porcentaje germinación, en cada

uno de los tratamientos, se consideró la descripción de estadios descritos y

propuestos por Batigyna et al. (2003), (Figura 1).

 44

El criterio que se siguió para establecer que el inicio de la germinación fue a partir

del estadio 2 o semilla hinchada y verde. Durante 3 meses se registró

semanalmente el porcentaje de semillas germinadas para cada réplica y

tratamiento. La suma de los porcentajes de cada réplica deberá ser el total o 100

% de los individuos evaluados.

Figura 2. Criterios para establecer germinación y estadios de crecimiento de

Encyclia angustiloba. (según Batigyna et al. 2003).

Conservación de las semillas de E. angustiloba: Las semillas de Encyclia

angustiloba extraídas de las cápsulas desinfectadas se dividieron en dos lotes,

una para las pruebas mencionadas anteriormente y el otro lote para evaluar su

capacidad de conservación o almacenamiento. La capsula de Encyclia midió de

largo aproximadamente 3cm y de diámetro 4cm. La desinfección se realizó

lavando varias veces las semillas, colocando alcohol al 70% aproximadamente

por cinco minutos, cloro al 2% por 10 minutos y se puso a remojar en agua

destilada estéril las tres semillas cada uno por cinco minutos. Previamente al

almacenamiento, las semillas recién extraídas de las cápsulas se introdujeran en

 45

papel filtro y se aseguran los sobres con un clic metálico. Posteriormente, se

colocaron en fundas herméticas transparentes que contenían silicagel, esto ayuda

a extraer la humedad de las semillas, luego se mantuvo cada funda en dos

condiciones de almacenamiento distinto:

a) Bajo refrigeración a 4°C y oscuridad.

b) Temperatura del laboratorio (aprox 20 ± 2°C) y luz ambiental.

Luego de transcurridos tres meses se colocaron 0,025 mg de semillas de

cada condición de almacenamiento en cápsulas de Petri con el medio de

cultivo que arrojó los mayores porcentajes de germinación de las 10

repeticiones. Posteriormente, se registró el número de semillas germinadas y

se reportó como porcentaje de germinación de cada réplica. En este caso,

igualmente se empleó un análisis de varianza no paramétrico de Kruskal

Wallis.

3.3. Aspectos administrativos

3.3.1 Recursos Bibliográficos

Los recursos de consulta que se utilizaron son:

 Biblioteca de la Universidad Agraria del Ecuador.

 Tesis de grados de varias universidades

 Informes técnicos

 Revistas agrícolas

 Boletines de instituciones de investigación

 Páginas Web.

 Diarios.
 46

3.3.2 Materiales y Equipos

Los materiales que se utilizaron para recopilar la información de carácter

experimental son:

 Hojas

 Bolígrafos

 Instrumentos de laboratorio

 Cámara fotográfica

 CPU, impresora

 Mapa de Ubicación

3.3.3 Recursos Humanos

Los recursos más importantes para levantar esta investigación fue el talento

humano, tales como:

 Estudiante tesista

 Catedrático de la Universidad Agraria del Ecuador

 47

3.3.4 Recursos Económicos

Tabla 5. Valoración económica del proyecto.

Materiales Costo total
Cajas Petri $ 200
Agua de coco $ 2,00
Bencilaminopurina (BAP) $ 60,00
Papa- Dextrosa-Agar (PDA) $ 60,00
Papel aluminio $ 2,00
Arroz deshidratado $ 1,00
Alcohol $18,00
Tubos de ensayo $ 30,00
Algodón $ 3.50
Transporte $ 150
Materiales varios $ 200
Marcadores $ 5,00
Total $ 731,5

Otero, 2019
 48

4. Resultados

4.1 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de Encyclia

angustiloba en medios de cultivos artificiales.

4.1.1 Primera Siembra

A partir del séptimo día de la siembra de semillas de Encyclia angustiloba en los

medios de cultivo MS suplementados con BAP y agua de coco, y PDA se registró:

BAP (70%), PDA (50%) y Agua de coco (80%) de contaminación externa debida a

la presencia de hongos y bacterias.

En el medio PDA, las semillas germinaron entre los 90 y 120 días después de

la siembra, en un porcentaje de 70% (2 en 1824 semillas sembradas); en MS

suplementado con agua de coco se logró la germinación a los 120 días, en un

porcentaje de 80% (1 en 1963 semillas sembradas). En ambos casos no hubo

formación de protocormos iniciales sino de plántulas directamente; en el medio de

cultivo MS BAP no se logró la germinación de las semillas (0 en 1654) (Tabla 7,

Figura 2).
 49

Tabla 7. Porcentajes de germinación y contaminación de las semillas

sembradas en los tres medios iniciales (PDA, MS Agua de coco y MS BAP).

Medios de cultivo % de germinación % de % Organismos

contaminación contaminante
s externos
Medio de cultivo 0,1096% 50% Hongos
PDA

MS Agua de coco
0,0509% 80% Hongos y
bacterias

Medio de cultivo Hongos y

0 70%
BAP bacterias

Otero, 2019

Figura 3. Plántulas de Encyclia angustiloba en medio PDA a los 120 dds (400X)

Según el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis con p-valor de >0,9999 no

hubo significancia estadística con un H = 1,50 y P = >0,9999 en los resultados

obtenidos en la germinación de semillas de Encyclia angustiloba (Tabla 8).

 50

Tabla 8. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la

germinación in vitro de semillas de E. angustiloba.
Variable Trat. N Medias D.E Medianas H P

Germinación MS BAP 1 3,00 0,00 3,00 1,50 >0,9999

Germinación PDA 1 2,00 0,00 3,00

Germinación MS Agua de 1 3,00 0,00 2,00

coco

Otero, 2019

4.1.2 Conservación de semillas de Encyclia angustiloba

En este ensayo en las placas Petri sembradas con las semillas de Encyclia

angustiloba conservadas a 4ºC y temperatura ambiente, a los 30 días después

de la siembra se observó el 65 % de cajas Petri con contaminación externa

debida a la presencia de hongos y 12.5 % por bacterias.

En las placas Petri sembradas en PDA y MS agua de coco que se mantuvieron

sin contaminación durante un período de 120 días, no se observó la germinación

de las semillas en esos medios de cultivo.

Según el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis con p-valor de >0,9999 no

hubo significancia estadística con un H = 2,70 y P = >0,9999 en los resultados

obtenidos en la conservación de semillas de Encyclia angustiloba (Tabla 9).

 51

Tabla 9. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la

conservación de semillas de Encyclia angustiloba.
Variable Trat. Cons. N Media D.E Mediana H P
s s

Germinación Agua 4ºR 1 1,00 0,0 1,00 2,70 >0,999

de 0 9
coco

Germinación Agua TA 1 1,00 0,0 1,00

de 0
coco

Germinación PDA 4ºR 1 4,00 0,0 4,00

0
Germinación PDA TA 1 3,00 0,0 3,00
0

Otero, 2019

4.2 Identificar el medio de cultivo más apropiado para la germinación de

Encyclia angustiloba

En la tabla 10 se pudo determinar que el medio de cultivo más apropiado para

la germinación de la semilla de Encyclia angustiloba fue el PDA con un 0,1096%

seguido del medio de cultivo MS suplementado BAP (3 mg.L -1) con un 0, 060%, y

no se obtuvieron resultados en el tercer medio MS agua de coco (al 200 ml). En el

análisis de varianza se pudo observar que no hay significancia con un H = 2 y P =

>0,9999.
 52

Tabla 6. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios

de cultivo apropiados para la germinación de semilas de Encyclia
angustiloba

Variable Trat. N Medias D.E Medianas H P

Germinación Medio de 1 1,00 0,00 1,00 2 >0,9999

cultivo MS
Agua de
coco
Germinación Medio de 1 0,00 0,00 0,00
cultivo MS
BAP

Germinación Medio de 1 2,00 0,00 2,00

cultivo PDA

Otero, 2019

4.3 Establecer métodos de conservación de semillas in vitro de Encyclia

angustiloba.

Al conservar las semillas de Encyclia angustiloba en refrigeración a 4°C y a

temperatura ambiente, por un período de tres meses se pudo observar que no

hubo germinación en los medios de cultivo PDA y MS Agua de coco. Esto quiere

decir que las semillas de esta orquídea en esas condiciones de conservación no

mantuvieron la poca viabilidad inicial que tenían, aun cuando se contabilizaron un

total de 3.361 semillas sembradas.

 53

5. Discusión

Considerando los resultados sobre la germinación y conservación in vitro de

semillas de la orquídea Encyclia angustiloba tenemos que:

En la fase de germinación in vitro de las semillas de orquídea Encyclia

angustiloba, los porcentajes de germinación fueron bajos en comparación con

otras especies de orquídeas, incluyendo las del genero Encyclia, además los

tiempos de germinación son más largos, aun cuando se utilizaron capsulas

maduras cerradas.

En el medio de cultivo PDA se logró un 0,1096% de germinación, a los

primeros 90 días, seguido por el medio de cultivo MS suplementado 20% de AC

donde se obtuvo un porcentaje menor del 0,0509 %, en un tiempo más

prolongado de 120 días, y no hubo germinación con el medio basal MS BAP. En

la literatura no existen señalamientos sobre los porcentajes de germinación de

semillas de esta especie. Barrientos (2010) indica que el inicio de la fase de

germinación de semillas de Phalaenopsis fueron breves, en unos 30 días,

alcanzando un alto porcentaje de germinación del 67.53 en este medio de cultivo

MS AC. Para la especie E. aspera se ha citado por Espinoza (2018) que se logró

el 52 % de los medios de cultivo MS solo y en combinación con ANA y BAP.

Durante la evaluación de la germinación de esta orquidea se evidenciaron los

cinco estadios secuenciales, tal como los describe Barbery y Morales (2011), los

cuales son: inhibición de las semillas a través de la testa, que produce un

aumento en el volumen del embrión; división celular y desarrollo inicial; desarrollo

de la yema apical y aparición de hojas fotosintéticas.

Existen varios factores complejos que influyen en la germinación y el

crecimiento de las orquídeas, entre ellos están la madurez de la capsula, la

 54

composición de los medios de cultivo, la temperatura, el fotoperiodo y la

humedad. Considerando que en el protocolo de germinación se proporcionaron

las condiciones idóneas citadas en la literatura para las orquídeas relacionadas

con esta especie, se podría decir que el genotipo podría influir en la germinación

de la especie, pero no existe información al respecto.

Con respecto a la constitución de los medios de cultivo utilizados para la

germinación de semillas de orquídeas la información es extensa y se han descrito

innumerables medios de cultivo. Muchos autores mencionan al medio de cultivo

MS básico o en combinación con agua de coco y otros reguladores de

crecimiento. Sin embargo, no existen precedentes en la especie Encyclia

angustiloba y en la utilización del medio de cultivo PDA. Existen algunos

trabajos relacionados con el género Encyclia y la especie relacionada como el

Phalaenopsis, como indica Barrientos (2010) que utilizaron (MS; MS

suplementado con jugo de piña, agua de coco, AIA, GA3) (200 mL /L, 200mL/ L,

0.5 mg/L, 0.5 mg/L,), respectivamente, alcanzando el mayor porcentaje de

germinación (63.53%) y formación de plántulas en el hibrido Phalaenopsis en el

medio MS AC. Para este propósito. En la especie E. aspera Espinoza (2018) uso

los medios de cultivo MS; MS suplementado con ANA y BAP, 2-0.5, 1-0.5, 0.5-0.5

mg/L, obteniendo que el tratamiento más efectivo fue el T2 (MS ANA+ BAP), con

un porcentaje de germinación del 52%.

En este trabajo se utilizaron medios de cultivos similares a estas especies, no

obstante, se obtuvieron porcentajes bajos en la germinación de semillas de

orquídea E. angustiloba
 55

En la conservacion de las semillas de E. angustiloba, como hubo una

germinacion baja al inicio del experimento, no resulto una buena estrategia

conservar estas semillas en refrigeración a 4°C y en temperatura ambiente

durante 90 dias, esto está en contraposicion a lo que dice Espinoza (2018) sobre

la conservacion de las semillas de la orquidea Encyclia aspera, porque obtuvo un

alto porcentaje de germinacion, aun cuando estas fueron conservadas bajo

refrigeracion a 4°C en un periodo largo de 6 años, desmostrando asi la capacidad

de viabilidad de esta especie. En general, Ortega (2012) indica que la

preservación de especies con semillas ortodoxas como lo son la mayoría de las

orquídeas es viable y puede garantizar su almacenamiento, y para ello, las

semillas se mantienen bajo humedad y temperatura (refrigeración o ambiente). No

obstante, en el caso de E. angustiloba se podria utilizar la conservacion in vitro

de plántulas en medios de cultivo básicos debido a que esta orquidea es de

crecimiento lento, como se evidenció en esta investigación.

 56

6. Conclusiones

La germinación in vitro de semillas de Encyclia angustiloba es una manera de

contribuir a la diversidad genética y al manejo sustentable de esta especie y

disminuyendo así el peligro de su extinción. En este trabajo se pudo determinar

que el porcentaje de germinación en el medio de cultivo PDA fue de 0,1096%,

seguido por medio cultivo MS+AC de 0,0509 % y fue un proceso lento que ocurrió

entre los 90 y 120 días; y que la contaminación externa acumulada durante ese

período fue de 66,66%.

Los medios de cultivo PDA y MS AC fueron los más adecuados para obtener la

germinación y formación de plántulas de la orquídea Encyclia angustiloba, en

comparación con el medio de cultivo MS BAP, demostrando que posiblemente la

adición de compuestos orgánicos en los medios de cultivo in vitro fue importante

para respuesta de esta especie.

Las condiciones de conservación a las que fueron sometidas las semillas de la

orquídea no fueron favorables y el porcentaje de germinación fue nulo,

posiblemente debido a que la germinación inicial fue baja.

 57

7. Recomendaciones

Realizar ensayos de iniciación in vitro a partir de las capsulas verdes o

inmaduras de Encyclia angustiloba, ya que representa una alternativa aceptable

para la germinación de sus semillas.

En posteriores experimentos con la orquídea Encyclia angustiloba, es

necesario probar diferentes tratamientos y concentraciones, ya que no existen

investigaciones para este tipo de orquídea. La utilización de otros tratamientos

que induzcan la germinación del embrión, tales como adición de la hormona de

crecimiento Ga (Giberelinas) y el carbón activado en los medios de cultivo.

Debido a que el crecimiento de esta especie es muy lento, se podría conservar

y multiplicar in vitro en forma de plántulas sobre todo si la germinación inicial es

muy baja, como la que se consiguió en este trabajo, en vez de realizarlo a partir

de semillas.
 58

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 65

9. Anexos

Figura 4. Ubicación geográfica del Laboratorio de Biotecnología de la Universidad

Agraria del Ecuador, sede Guayaquil. (Tomado de Google Maps).
Otero, 2019
 66

Tabla 7.Composición básica fundamental medios

de cultivo
Compuestos Medios de cultivo
Agua Destilada

Compuestos orgánicos Suplementos macroorgánicos: Carbohidratos

Suplementos microorgánicos:

Vitaminas,

Aminoácidos

Reguladores de crecimiento (auxinas,

citocininas, giberilinas, brasinoesteroides,

etileno, ancymidol)

Antibióticos

Compuestos inorgánicos Macronutrientes

Micronutrientes

Compuestos indefinidos Agua de coco

Infusión de papa

Extractos de levadura

Caseína hidrolizada

Agentes solidificantes

Carbón activo

Cedrés et al., 2015

 67

Tabla 8.Componentes del medio Murishage &

Skoog (MS)
Solución (g/Lt) Compuesto MS (g.L-1)
Macronutrientes NH4NO3 1,65
KNO3 1,90
MgSO4. 7 H2O 3,70
KH2PO4 1,70
Calcio CaCl. 2H2O 4,40
Micronutrientes H3BO3 3,10
MnSO4.4H2O 4. 11,1500
Zn.SO4.7H2O 4,3000
KI 0,4150
NaMoO4.2H2O 0,1250
CuSO4.5H2O 0,0125
CoCl2.6H2O
Hierro Na2EDTA 0,03725
FeSO4.7H2O 0,0278
Vitaminas Myo-inositol 10,0000
Glicina 0,2000
Acido Nicotínico 0,0500
Piridoxina-HCL 0,0500
Tiamina-HCL 0,0100
IARNA, 2017.

Figura 5. Anava Prueba de Kruskal Wallis en germinación in vitro

Otero, 2019
 68

Figura 6. Conservación de la semilla Encyclia angustiloba (Capsulas sanas)

Otero, 2019

Figura 7. Germinación de Encyclia angustiloba

Otero, 2019

Figura 8. Germinación in vitro de semillas de E. angustiloba

Otero, 2019
 69

Figura 9. Anava Prueba de Kruskal Wallis en la conservación de semillas de

Encyclia angustiloba
Otero, 2019

Figura 10. Anava Prueba de Kruskal Wallis para la comparación de los medios de
cultivo apropiados para la germinación de semillas de Encyclia
angustiloba
Otero, 2019
 70

Figura 11. Cápsulas maduras de la orquídea Encyclia angustiloba donadas por

el jardín botánico de Guayaquil.
Otero, 2019

A B
Figura 12. Preparación de los medios de cultivos para la germinación de la semilla
de Encyclia angustiloba A) Fase de elaboración y B) Medios de cultivos antes
de la esterilización en autocable.
Otero, 2019
 71

BA

Figura 13. Pesado y desinfección de las semillas de Encyclia angustiloba en la

cámara de flujo laminar. A) Pesado de la semilla en la balanza analítica; y B)
Proceso de desinfección de la semilla.
Otero, 2019

A B
Figura 14. Proceso de siembra de los medios de cultivo A) Siembra de las
semillas Encyclia angustiloba; y B) Colocación de los medios de cultivo en la
cámara de crecimiento
Otero, 2019
 72

BA

Figura 15. Evaluación y contaje de la

semillas de la orquídea en los medios de
cultivo. A) Contaje de las semillas de
Encyclia angustiloba. B) Evaluación de la
germinación de la semilla de Encyclia
angustiloba mediante el uso de
microscopio (400x)
Otero, 2019

AB

Figura 16. Evaluación de la contaminación externa por hongos y bacterias en los

medios de cultivo. A) Contaminación en el medio de cultivo PDA. B)
Contaminación en el cultivo MS AC
Otero, 2019
 73

AB

C D

Figura 17. Observación de semillas y plántulas en Encyclia angustiloba en PDA

(A) Semillas de la orquídea, bajo microscopio en el medio de cultivo PDA a los 30
días después de la siembra (400x), (B) Plántula germinada a los 3 meses, bajo
microoscopio en PDA. (C) Plántula en medio de cultivo de MS a los 8 meses
después de la siembra en condiciones de luz. (D) Plántula en medio de cultivo de
MS complementado con BAP y ANA a los 10 meses después de la siembra en
condiciones de luz.
Otero, 2019
 74

Figura 18. Evaluación y contaje de las semillas de la orquídea en los medios de

cultivo con mi tutora Dra. Ariadne Vegas
Otero, 2019