CURSO

DE

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

HPLC

1
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS HPLC

1.- INTRODUCCIÓN
La cromatografía se utiliza para separar los diferentes
analitos de interés a partir de mezclas con otros analitos
que interfieren. Los métodos cromatográficos se pueden
dividir en dos principales categorías: cromatografía de
gases (GC) y cromatografía de líquidos de alto desempeño
(HPLC).

La cromatografía de líquidos de alto desempeño

(HPLC) es una técnica de separación muy usual para
semivolátiles y no volátiles o para analitos que se
descompongan por calentamiento. El éxito de la
separación de cromatografía de líquidos requiere que los
analitos de interés sean solubles en el disolvente
seleccionado como fase móvil. Debido a que los
disolventes se trabajan a alta presión, la técnica
originalmente se le llamó cromatografía de alta presión,
pero ahora se le refiere como cromatografía de líquidos de
alto desempeño, (High Performance Liquid
Chromatography).

Todos los procesos alcanzan una separación por el

paso de una fase móvil sobre una fase estacionaria. Los
constituyentes de una mezcla son separados debidos a
sus diferentes coeficientes de partición entre la fase móvil
y la fase estacionaria teniendo así diferentes tiempos de

2
retención. Los compuestos que interaccionan fuertemente
con la fase estacionaria eluyen lentamente (tiempo de
retención grande), los compuestos que permanecen en la
fase móvil o que su interacción con la fase estacionaria es
débil, eluyen rápidamente (tiempo de retención corto).
2.0 DEFINICIONES
2.1 Tiempo de retención total ( tR1 o tR2 ) es el
tiempo, que es necesario para que el componente de una
muestra migre desde la entrada de la columna (inyección
de la muestra) al final de la columna(detector).
Tiempo muerto t0 (tiempo sin adsorción) es el tiempo
requerido por un compuesto inerte para que migre de la
entrada de la columna al final de la columna sin ninguna
interacción por la fase estacionaria.

2.2 Tiempo de retención neto o corregido (t´R1 o

t´R2) es la diferencia entre el tiempo de retención total y el
tiempo muerto t0 . Que es el tiempo que permanece el
analito en la fase estacionaria.
t´R1 = tR1 – t0 t´R2 = tR2 - t0

2.3 Factor de capacidad k´es una medida de la

separación de la muestra en el cromatograma. Este es
específico para una sustancia dada, k´ depende de la fase
estacionaria, la fase móvil, la temperatura, características
del empaque, etc.
k1´= tR1 – t0 = tR1 k1´= tR1 – t0 = tR1
t0 t0 t0 t0

3
2.4 Retención relativa  , también conocido como
factor de separación , es la relación entre dos factores de
capacidad, colocándose en denominador el compuesto de
referencia.

 = k´2
k´1

2.5 Velocidad lineal del disolvente µ (cm/seg). La

velocidad lineal es independiente de la sección transversal
de la columna y proporcional a la caída de presión de la
columna. La velocidad lineal puede ser calculada por
medio del tiempo muerto, en donde L es la longitud de la
columna en cm y t0 es el tiempo de retención de un
compuesto no retenido.

U=L
t0
2.6 Número de platos teóricos n caracteriza la calidad
del empaque de una columna y su transferencia de masa,
números grandes de n significa que se pueden separar
mezclas complejas de analitos.
2
N = 16 ( tR1 / w ) = 5.54 (tR1 / w1 )2
2

4
2.7 Altura equivalente de un plato teórico h (HETP),
es la longitud (o altura) de un plato teórico, cuando una
columna tiene un número grande de platos teóricos, h , la
altura deberá ser muy pequeña. El valor de h es un
criterio para la calidad de una columna, el valor de h
depende del tamaño de partícula, velocidad de flujo y de
la fase móvil.

h=L/n

3.0 CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE

LÍQUIDOS

3.1 En HPLC fase Normal, donde la fase estacionaria

es de elevada polaridad tal como el trietilenglicol colocada
sobre partículas de sílice o alúmina, y la fase móvil de
menor polaridad que la fase estacionaria (columna polar,
fase móvil no polar).
En HPLC fase Reversa, se refiere a que la fase
móvil es relativamente polar y la fase estacionaria no
polar (columna no polar, fase móvil polar). La fase
estacionaria con frecuencia se trata de un hidrocarburo y
la fase móvil puede ser como por ejemplo el agua, el
metanol o el acetonitrilo.
La fase Reversa de HPLC es la técnica seleccionada
para analizar residuos y analitos orgánicos no volátiles.
En cromatografía en fase normal, el componente
menos polar se eluye primero, debido a que relativamente

5
es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.

En cromatografía fase reversa: Las partículas sólidas

de partículas no tratadas son polares y no son muy
usuales para separar compuestos no polares, por la poca
afinidad que se tiene. Para resolver este problema la
superficie reactiva (polar) se le somete a un proceso
químico para cambiar ésta superficie a no polar,
teniéndose así diversas superficies no polares (fase
reversa).

Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase

inversa cuando el recubrimiento unido químicamente tiene
un carácter no polar, y de fase normal cuando el
recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Por lo
general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es
una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo).
En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de
cadena larga se alinean el uno junto al otro y en
perpendicular a la superficie de la partícula, dando una
estructura semejante a una brocha o un cepillo.
Las cadenas más largas originan rellenos o empaques
que proporcionan una mayor retención. Además, una
mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad
de muestra.
En la mayoría de las aplicaciones de la cromatografía en
fase inversa (o reversa) , la elución se lleve a cabo con
una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de

6
una solución acuosa conteniendo concentraciones diversas
de disolventes como el metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano.
Se debe procurar que el pH sea menor de,
aproximadamente a 7,5 porque si no puede tener lugar la
hidrólisis del siloxano, lo que originaría la degradación o
destrucción del empaque.
Con empaques de fase enlazada en fase normal, R en la
estructura del siloxano es un grupo funcional polar como
es el caso de los grupos ciano ( -C2H4CN ), diol
( _C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-C3H6NH2 ) Y Los
Dimetilamino ( -C3H6n(CH3)2.

4.0 COMPONENTES BÁSICOS DE UN

CROMATOGRAFO DE LÍQUIDOS

4.1 Componentes de HPLC

Los componentes fundamentales de un cromatógrafo de
líquidos de alta resolución son comúnmente los siguientes:

• Bomba
• Inyector/Automuestreador
• Columna
• Detector
• Recipientes de disolventes
• Disolventes
• Desgasificador
• Filtro (frit)

7
• Precolumna
• Válvula de drenado
• Sistema de datos/Integrador
• Todas estas partes pueden presentar problemas y
requieren diagnosticarlos.

4.1.1 Un aparato de HPLC se equipa con uno o más

recipientes de vidrio para contener los disolventes a utilizar
como fase móvil. El desgasificador que puede consistir en
un difusor de un gas inerte como helio que arrastra los
gases disueltos como el aire. Estos sistemas pueden tener
un dispositivo ( filtro) para la eliminación de partículas
sólidas en suspensión de los disolventes. Por otro lado,
conviene que todos los disolventes que se vayan a utilizar,
sean filtrados a vacío a través de una membrana de 0.45
micras.

4.1.2 Disolventes

El rango de disolventes que pueden ser usados en

cromatografía de líquidos es muy amplio. El agua y las
disoluciones acuosas buffer (reguladora) son de uso
común, así como los disolventes no acuosos de baja
viscosidad. Los disolventes no acuosos poseen diferentes
polaridades (ver tabla).

8
Tabla 1.- Disolventes grado cromatografía de líquidos en
orden de índice de polaridad.
Disolvente Polaridad Disolvente polaridad
Pentano 0.0 Metil terbutil éter 2.5
Heptano 0.1 o-Xileno 2.5
Hexano 0.1 Benceno 2.7
Eter petróleo 0.1 Clorobenceno 2.7
Isooctano 0.1 o-Diclorobenceno 2.7
Ciclohexano 0.2 Eter etílico 2.8
Hexadecano 0.5 Cloruro de metileno 3.1
Tricloroetileno 1.0 Dicloro etileno 3.5
Tetracloruro de carbono 1.6 Isopropanol 3.9
Tolueno 2.4 2- butanol 4.0

Disolvente Polaridad Disolvente Polaridad

Alcohol isobutílico 4.0 Metanol 5.1
Tetrahidrofurano 4.0 Piridina 5.3
Cloroformo 4.1 Carbonato de 5.5
dietilo
Metil isobutil cetona 4.2 2- Metoxi etanol 5.5
Acetato de etilo 4.4 Acetonitrilo 5.8
Metil n-propil cetona 4.5 Propilen carbonato 6.1
Metil etil cetona 4.7 Dimetil formamida 6.4
2- Etoxietanol 5.0 Dimetil acetamida 6.5
Fenetilamina 5.0 Dimetil sulfóxido 7.2
Acetona 5.1 Agua 10.2

4.1.3 Filtros

Los disolventes que se usen en cromatografía de líquidos,

deben de estar libres de partículas y de aire disuelto, para
ello se deben filtrar y desgasificar, de lo contrario pueden
causar problemas. Las partículas pueden bloquear el

9
empaque de la columna y el aire disuelto puede formar
burbujas en el sistema que provocan ruido en el detector.

Para eliminar las partículas es necesario filtrar haciendo

pasar el disolvente a través de una membrana de 0.45
micras, colocada en un sistema filtrante Millipore
accionada con vacío.
Para desgasificar se introduce al reservorio del disolvente
un tubing con un filtro de metal sinterizado mediante el
cual se le burbujea helio, con un flujo pequeño (5 -10 psi).
Otra opción para desgasificar los disolventes consiste en
colocar el reservorio dentro de un baño de ultrasonido
durante 10 – 15 min.
La muestra puede ser también un problema, para
asegurarse que no tenga partículas, deberá ser filtrada
mediante una membrana de 0.45 micras utilizando una
jeringa que en su extremo tenga colocado un filtro con
esta membrana (swinny).

4.1.4 Bombas

La bomba es una de las partes más importantes de un

cromatógrafo de líquidos.
Para obtener las mejores separaciones, la columna deberá
empacarse con partículas muy pequeñas, pero como se
puede observar que esto afecta grandemente a la presión
requerida. Esto significa que entre menor sea el tamaño
de partícula mayor será la presión desarrollada por la
bomba.

10
Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recíprocas,
bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas
neumáticas o de presión constante.
Las bombas recíprocas, son las que se usan en su mayoría,
consisten, en una pequeña cámara en la que el disolvente
es impedido por el movimiento de vaivén de un pistón
accionado por un motor. Dos válvulas con cierre de bola,
que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo
del disolvente hacia dentro y hacia fuera de un cilindro.
4.1.5 Inyectores
El inyector de un HPLC comúnmente consiste de una
válvula de inyector y un loop de muestra. La muestra se
disuelve en la fase móvil antes de ser inyectada en el loop
de la muestra. La muestra se carga con una jeringa y se
inyecta en el loop a través de la válvula de inyección. Con
un giro al rotor de la válvula, se cierra la válvula y se abre
el loop para inyectar la muestra en la corriente de la fase
móvil. Los volúmenes del loop pueden ser desde 10 µl
hasta 500 µl. Las inyecciones pueden ser automatizadas.

4.1.6 Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la

columna analítica, se coloca por delante una precolumna
que elimina la materia en suspensión y los contaminantes
de los disolventes. La composición del empaque de la
precolumna debe de ser semejante al de la columna

11
analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo
común mayor para minimizar la caída de presión.

Las columnas pueden bloquearse con partículas que se

van reteniendo sobre la superficie del empaque al paso de
la disolución de las muestras inyectadas o de la propia
fase móvil (disolvente) provocando un aumento en la
presión de trabajo, para minimizar este problema se tienen
2 formas de protección de la columna. Una forma es
utilizar una precolumna (o guarda columna) y la otra es
instalar un filtro en línea entre el inyector y la columna.
La precolumna consiste en una sección corta de columna,
alrededor de 5 cm de longitud, empacada con el mismo
material que la columna e instalada inmediatamente antes
de la columna. Esta columna actúa como un filtro, sí ésta,
empieza a bloquearse (la presión aumentará, para
mantener la misma velocidad de flujo, de ser necesario la
precolumna puede ser removida, limpiarla y reempacarla.
Las precolumnas eliminan materia en suspensión y
componentes de la muestra que se unen irreversiblemente
a la fase estacionaria. Las precolumnas deberán ser de
composición similar a la columna analítica, ayudando al
buen funcionamiento de la columna analítica,
reemplazando la precolumna cuando se contamine.

4.1.7 Columnas

Las columnas para cromatografía de líquidos se

construyen de acero inoxidable, con una resistencia de

12
presión de hasta 10000 psi. Estas son de una longitud de
10 a 30 cm de longitud, con un diámetro interno de 4 a 10
mm, tamaño de partícula del empaque de 5 a 10 micras.
Normalmente los números de platos se pueden situar en
100 000 platos/ metro.
Las columnas son rectas, de 10 a 30 cm de longitud, que
de acuerdo a necesidades es posible hacer extensiones
mediante acoples y así tener longitudes más largas.
Las columnas normalmente no requieren control de
temperatura trabajando a temperatura ambiente, sin
embargo la aplicación de temperatura puede mejorar los
cromatogramas.

De manera común las columnas son de 25 cm de longitud,

4.6 mm de diámetro, y tamaño de partícula de 5 micras y
con un número de platos de 10,000 platos.
Generalmente las columnas se trabajan en condiciones
isotérmicas, a temperatura ambiente. Los instrumentos
modernos tienen control de temperatura, desde la
ambiente a 100 o 150 o C.
El empaque de la columna consiste en micropartículas de
3 a 10 micras de diámetro, de silica , que están
recubiertas con películas de sustancias orgánicas unidas
fisicamente o químicamente a la superficie.

13
4.1.7 Detectores

Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos

tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de
la disolución, responden a una propiedad de la fase móvil,
tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o
la densidad, que se modifica por la presencia de los
analitos. Por otro lado se tienen los detectores basados en
una propiedad del soluto, que responden a alguna
propiedad del soluto, como la absorbancia UV,
fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias
de la fase móvil.

4.1.8.1 Detectores de absorbancia

Los métodos HPLC requieren del uso de detectores, de tal

forma que un flujo de la columna pasa a través de una
celda montada el extremo final de la columna. Un haz de
radiación ultravioleta pasa a través del flujo de la celda en
el detector. A medida que los compuestos eluyen de la
columna, pasan a través de la celda y absorben la
radiación, resultando en una energía medible.

14
5.0 CROMATOGRAFÍA

5.1 Inyección de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisión de las

medidas en cromatografía de líquidos es la
reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en
la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento
de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas.
Por ello, los volúmenes que se emplean deben de ser
pequeños, de unas cuantas décimas de microlitro hasta tal
vez 500 microlitros. Además, se ha de poder introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.

Normalmente los volúmenes con que se trabaja van de 5 a

50 microlitros ( μL). Una forma de inyectar consiste en
introducir la jeringa (que debe de ser de punta roma) al
inyector del cromatógrafo de líquidos, que tiene instalado
un “loop” o rizo, en el cual se descarga la muestra, para
posteriormente se accione el dispositivo de “inyectar
muestra”. Este tipo de inyector permite que la muestra
se introduzca sin interrumpir el flujo de la fase móvil. Con
estos loops o rizos se puede introducir la muestra hasta
presiones de 7000 psi (libras por pulgada cuadrada), con
una precisión de unas décimas de por ciento.

Nunca se debe de utilizar una microjeringa propia para

cromatografía de gases, ya que estas jeringas pueden
rayar las superficies del inyector y provocar fugas.

15
El loop es un tubing de acero inoxidable en forma de rizo
o aro. Estos loops o rizos son intercambiables de acuerdo
al volumen en microlitros con el que se quiere trabajar. Es
decir que el volumen de muestra se determina por el
tamaño del loop, lo común es de 10, 20 o 50 μL.

5.1.1 Cromatografía fase normal y fase reversa.

Se distinguen dos tipos de cromatografía de reparto: fase

normal y fase inversa o reversa. En la fase normal,
la fase estacionaria es polar (grupos ciano, amino, diol) y
la fase móvil no polar (hexano). En la fase inversa o
reversa, la fase estacionaria es no polar y la fase móvil
es polar (agua, metanol, acetonitrilo). En fase normal,
el componente menos polar es el que eluye primero y en
la fase inversa o reversa el componente más polar es el
primero en eluir.

5.1.2 Fases móviles ( Eluyentes)

Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles

con todos los disolventes orgánicos dentro del rango de
pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la
más alta pureza (grado HPLC). Además de que todas las
disoluciones preparadas se deben de filtrar a través de un
membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema
de HPLC.

16
El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorción
irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna.
Estas impurezas bloquean los sitios de adsorción, cambian
la selectividad de la columna y provocan que haya división
de picos. En gradiente de elución, las impurezas causan
los llamados picos “fantasmas”. Los picos fantasmas
pueden aparecer siempre en la misma posición en el
cromatograma. Generalmente estos picos son causados
por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que
es recomendable correr un gradiente sin inyección al
iniciar cada método para eliminar los picos fantasmas.

Para impedir la adsorción irreversible en la entrada de la

columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al
utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida
media. Como alternativa de precolumna es instalar un
filtro en línea. Estos filtros retienen sólidos del eluyente
pero no impiden la adsorción irreversible de impurezas
orgánicas.

ilRestricte17 July 2008Month ##, 200X Page 10

5.1.3 Fase estacionaria reversa

La fase móvil es polar y consiste de disoluciones acuosas

conteniendo concentraciones diversas de metanol,
acetonitrilo o tetrahidrofurano. El pH no debe de ser
mayor que 7.5 porque esto generaría la hidrólisis del
siloxano y la destrucción del empaque de la columna.

17
 Si – OH + Cl Si R3  Si – O – Si R3

En donde R puede ser radicales metilo o C8 H17 o C18 H37

(metilo, octilo o octadecilo).

Los eluyentes se clasifican en orden creciente de

polaridades de la siguiente forma:
Hidrocarburos; éteres; ésteres; cetonas; aldehídos; amidas;
aminas; alcoholes; y agua.

La polaridad de la fase estacionaria deberá ser bastante

similar a la de los analitos y para la elución se utiliza una
fase móvil de polaridad considerablemente distinta.

El tiempo de elución puede ser modificado con la polaridad

del eluyente, los factores de selectividad pueden
controlarse variando la naturaleza de la fase móvil o la
fase estacionaria. El eluyente puede estar formado por
una mezcla de disolventes, tales como metanol (49%) con
agua (51%), proporciones que en su momento pueden
cambiarse.

5.1.4 Gradiente de elución

Si la composición del disolvente se mantiene constante a

través de toda la corrida analítica, se tiene un proceso
llamado elución isocrática. Sí la composición del
disolvente se cambia de alguna forma (pH, fuerza
reguladora, mezcla con otros disolventes), entonces se

18
tendrá un proceso llamado elución por gradiente . El
gradiente de elución es muy usual cuando se tienen
mezclas de analitos con diversas características. Las
características del disolvente se cambian progresivamente,
que a su vez cambian el comportamiento de los analitos.
Sí se realiza apropiadamente, mezclas complicadas en su
separación pueden ser separadas eficientemente.
Generalmente para realizar este tipo de mezclas se
requiere de una segunda bomba, sin embargo es posible
con una sola bomba pero con una válvula de control y una
cámara mezcladora.

6.0 SELECCIÓN DE COLUMNAS DE HPLC

6.1 Parámetros de selección de columna

Fase estacionaria
Tamaño de poro
Tamaño de partícula
Longitud
Diámetro interno

6.1.1 Selección de la fase

Para esta selección se debe considerar el tipo de analitos

de interés y el pH.

19
•Las fases C18 y C8 son las mejores para iniciar el
desarrollo de métodos con muestras típicas.
•Tener en cuenta que el pH juega un papel crítico en la
separación y puede ser agresivo para la columna; buscar
la columna adecuada.
•Elegir la fase estacionaria más adecuada para la muestra
en particular.
Usar fases especiales como la SB-Aq para muestras
polares, difíciles de retener para disminuir los tiempos de
desarrollo.
•Buscar la columna que nos dé resultados con el mínimo
de problemas

C18 ofrece la mayor retención, puede ser más de lo

deseado para algunas muestras; recomendada para
analitos moderadamente polares.
C8 tiene menor retención que C18, pero su selectividad es
parecida en la mayoría de los casos; recomendada para
analitos polares, moderadamente polares y no polares.
Fenil tiene una retención significativamente menor para
compuestos no polares, pero retiene los compuestos
polares, por lo que reduce el tiempo de análisis para
mezclas de compuestos polares y no polares.
CN es la de menor retención, muestra cambios en la
selectividad, buena para reducir los tiempos de análisis de
los compuestos que tardan en eluir lo cual evita el uso de
gradientes. Buena para separaciones de compuestos
polares y moderadamente polares.
E- July
17 July 2008Month ##, 200X Page 3

20
6.1.2 Selección del Tamaño de Poro
Tamaño de las moléculas que serán analizadas.
• Las moléculas pequeñas (PM menor a 2000) pueden
distribuirse fácilmente en poros de 80-120Å
• Las moléculas mas grandes (PM mayores a 2000)por ej.
proteínas y péptidos, requieren un tamaño de poro mayor
300 Å
E-Semi17 July 2008Month ##, 200X Page 4
6.1.2.1 Selección del tamaño de poro de la columna.
•Las moléculas deben entrar al poro para interactuar con
la fase.
•La moléculas deben entrar y salir del poro libremente
para maximizar la eficiencia. 5
• El tamaño de la molécula en disolución determina el
tamaño de poro de la columna.
• Un pico estrecho indica acceso libre a los poros.
/Presentation TitleAgilent Restrictedonth ##, 200X Page 6
6.1.3 Tamaño de partícula
Para análisis convencionales de moléculas grandes y
pequeñas, el tamaño de partícula más usado es de 5
micras.
Mientras más pequeño sea el tamaño de partícula, mayor
es la eficiencia y la resolución.
Tamaños de partícula disponibles (en micras): 1.8, 3, 3.5,
5, 10.
E-SeminarGroup/Presentation Titl17 July##, 200X Page 7
6.1.4 Selección de longitud de la columna
•El tiempo de análisis es proporcional a la longitud de la
columna.

21
•Columnas de 250mm tienen tiempos de corrida más
largos
•Preferir columnas cortas de tamaño de partícula pequeño
para disminuir el tiempo de análisis.
E-Semin
arGr17 July 2008Month ##, 200X Page 8
6.1.4.1 Disminución del tiempo de análisis…
Disminuir la longitud de columna y disminución del
tamaño de partícula:

•disminución proporcional en el tiempo de análisis

(tiemp~long, L)
•disminución proporcional en el uso de disolventes
(~L)

•disminución de N, platos~ L y así N mantiene la

resolución, R.
Agilent
Restricted17 July 2008Month ##, 200X Page 9
6.1.5 Selección del diámetro interno
•El diámetro interno define cuánto del analito se puede
inyectar en la columna.
•Las columnas de i.d. pequeño, incrementan la
sensibilidad, por lo que son muy usadas en técnicas como
LC/MSD
•Mientras menor sea el i.d., requiere de menor cantidad
de disolvente
E-

22
7.0 DESARROLLOS DE MÉTODOS

7.1 pH – Un parámetro importante

•La retención de los compuestos ionizables es fuertemente

influenciada por el pH.
•Los compuestos ionizables (ácidos y bases) pueden ser
analitos o compuestos de matriz.
•Un control preciso del pH mejora la reproducibilidad del
método.
•El intervalo de pH de 1 – 12 provee la máxima flexibilidad
para el desarrollo de métodos pH 2.5, pH 6.5, pH 8, pH
11.5.…
2A/Presentation Title17 July 2008Month ##, 200X Page 18
7.1.1 pH medio
•Los compuestos de interés son inestables a bajos pH
•Se mejora la solubilidad de los analitos a pH medios.
•Incrementar la retención de los compuestos básicos.
•Puede existir una mejor selectividad en el intervalo de pH
de 3 a 8.E-SeminarGroup/Presentation TitleAgilent
Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 20
7.1.2 pH alto
•Los compuestos de interés pueden no ser solubles a pH
bajos.
•Los compuestos de interés pueden no ser estables a pH
bajos.
•Obtener un incremento en la retención de compuestos
básicos analizándolos en su forma no cargada.
•Mejorar la selectividad.

23
E-Se

8.0 CUIDADOS GENERALES PARA COLUMNAS DE

HPLC

La silica es el soporte ideal para las columnas HPLC . Esta

ofrece una gran estabilidad mecánica, excelentes
propiedades fisicoquímicas, un amplio rango de enlaces
químicos y es compatible con un amplio rango de
disolventes químicos. Los siguientes puntos son
importantes:

8.1 Estabilidad con el pH

En general, las columnas de HPLC son estables dentro de

un rango de pH de 2 a 8.

8.2 Estabilidad mecánica

Las fases estacionarias basadas en la silica,

mecánicamente son muy estables. Las columnas pueden
utilizarse hasta 6000 psi sin tener problemas. Sin
embargo se deben evitar “golpes o shocks” de presión
sobre las columnas. Los golpes de presión en las columnas
provocan canalizaciones en la columna, lo cuál resulta en
divisiones de picos en los cromatogramas.

24
8.3 Fases móviles ( Eluyentes)
Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles
con todos los disolventes orgánicos dentro del rango de
pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la
más alta pureza (grado HPLC). Además de que todas las
disoluciones preparadas se deben de filtrar a través de un
membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema
de HPLC.

El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorción

irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna.
Estas impurezas bloquean los sitios de adsorción, cambian
la selectividad de la columna y provocan que haya división
de picos. En gradiente de elución, las impurezas causan
los llamados picos “fantasmas”. Los picos fantasmas
pueden aparecer siempre en la misma posición en el
cromatograma. Generalmente estos picos son causados
por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que
es recomendable correr un gradiente sin inyección al
iniciar cada método para eliminar los picos fantasmas.

Para impedir la adsorción irreversible en la entrada de la

columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al
utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida
media. Como alternativa de precolumna es instalar un
filtro en línea. Estos filtros retienen sólidos del eluyente
pero no impiden la adsorción irreversible de impurezas
orgánicas.

25
8.4 Regeneración de columnas

La adsorción irreversible provocada por impurezas que

puede causar cambios en la selectividad o división de picos.
Frecuentemente estas columnas “sucias” pueden ser
regeneradas con los siguientes procedimientos:

8.4.1 Columnas fase reversa

Empaques tales como C18, C8, C4, C1, C30, CN o fases de

fenilos.
- Fluir la columna con 20 volúmenes* (de columna) de
agua.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
acetonitrilo.
- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de
isopropanol.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
heptano.
- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de
isopropanol.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
acetonitrilo.

8.4.2 Columnas fase normal

Empaques tales como Silica, Diol, Nitro, y fases amino.

- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
heptano.

26
 - Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de
isopropanol.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
acetonitrilo.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
agua.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
acetonitrilo.
- Fluir la columna con 5 volúmenes (de columna) de
isopropanol.
- Fluir la columna con 20 volúmenes (de columna) de
heptano.

* V= Πr2 h

9.0 PROBLEMAS y SOLUCIONES EN LOS SISTEMAS

DE HPLC.2008Mon

Tipos de problemas en columna

9.1 Línea base

9.2 Presión
9.3 Forma de pico
9.4 Retención
9.5 Resolución

27
9.1.1 Variaciones de la línea base

- Posible causa: Burbujas de aire atrapado en la celda

del detector debido a una mala desgasificación de los
disolventes de la fase móvil.
- Solución: Asegúrese de que todas las fases móviles
estén debidamente desgasificadas.

9.1.1.1 Presión con fluctuaciones.

- Posible causa: Burbujas en la bomba.

- Solución: Desgasifique el disolvente; Burbujee el
disolvente con helio.
- Posible causa: Fuga en la válvula check o sellos.
- Solución: Reemplace o limpie las válvulas check;
reemplace sellos de la bomba.

9.1.2 Línea base con mucho ruido

- Posible causa: Aire atrapado en la celda del detector o

en la bomba.
- Solución: Enjuague el sistema y purgue la bomba de
HPLC. Utilice disolventes desgasificados
adecuadamente para mantener constante la velocidad
de flujo de la fase móvil del sistema.
- Posible causa : problema de la lámpara del detector
o celda de flujo sucia.

28
 - Solución: Reemplace la lámpara UV (cada una tiene
un tiempo de vida de 2000h aprox.); limpie y fluya la
celda.
- Posible causa: Falla en el mezclado del disolvente, en
gradiente o isocrático.
- Solución: Use un equipo apropiado de mezclado;
compruebe la precisión de proporciones de
disolventes adicionando un compuesto que absorba al
UV y monitoreando la lectura en el detector.
- Posible causa: ocasionales “spikes” de interferencias
eléctricas.
- Solución: Usar estabilizador de voltaje para el sistema.
- Posible causa: Contaminación acumulada.
- Solución: Fluya la columna con un disolvente fuerte;
limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC.
- Posible causa: “spikes” por burbujas en el detector.
- Solución : Desgasifique el gas.

9.1.3 Spikes
- Posible causa: Burbujas en fase móvil.
- Solución: Desgasifique la fase móvil; Use restrictor de
presión a la salida del detector; Asegúrese que todas
la conexiones estén apretadas.
- Posible causa: Columna almacenada sin tapones.
- Solución: Almacene la columna con sus tapones
apretados; fluya la columna invertida con metanol
desgasificado.

29
9.2.1 Presión alta

• Posibles causas:
Frit de la columna tapado
Empaque tapado
Contaminación de la columna
Columna incorrecta, por error (d.i. menor)

• Soluciones:
• Verificar la presión con y sin columna, muchos de esto
problemas pueden ser causados por obstrucciones en el
sistema.
• Lavar la columna:
– Elimina la contaminación de columna y desbloquea el
empaque
– Compuestos de alto peso molecular o adsorbidos
–Precipitados de la muestra o del buffer
• Voltear la columna
– Desbloquea el frit
• Cambio de frit
– Elimina el frit tapado
E-SeminarGroup/Presentation Ti200X Page 33
9.2.2 Lavado de la columna:

Use al menos 26 ml de cada disolvente para

columnas analíticas (4.6 mm)

30
Purgar la columna con disolventes más fuertes que
la fase móvil.
Opciones de disolventes para columnas de fase
reversa (en orden de incremento de fuerza):
1. Fase móvil sin las sales del buffer
2. 100% Metanol
3. 100% Acetonitrilo
4. 75% Acetonitrilo: 25 % Isopropanol
5. 100% Isopropanol
6. 100% Cloruro de metileno*
7. 100% Hexano*
*Después de usar hexano o cloruro de metileno la
columna debe ser purgada con Isopropanol antes
de regresar a la fase reversa.
34

9.2.3 Lavado de la columna:

Opciones de disolvente para la fase normal

(En orden de incremento de fuerza)

• Use al menos 50 ml de cada disolvente

1. 50% Metanol: 50 % Cloroformo
2. 100% Acetato de etilo
• Es posible usar pequeñas cantidades de ácido, para
eliminar compuestos fuertemente retenidos, la
reequilibración es muy larga.
• Es más fácil comenzar con columnas ciano y diol que con

31
columnas de sílica cuando se va a comenzar a usar LC de
fase normal.
E-SeminarGroup/Presentation Tit17 July 2008Month ##,
200X Page 35
9.2.4 Prevención de la presión alta:

Instalar accesorios en línea:

Fase móvil filtrada
Pre-Columna
Inyector
Filtro
Guarda Columna:
Columna Analítica
Detector

Tanto el filtro como el guarda-columna actúan sobre la

muestra, mientras que la pre-columna lo hace sobre la
fase móvil.

• Proteger la columna
- Pre columnas
- Filtros en línea
• Preparación de la muestra
• Purga apropiada de la columna
• Filtrar los buffers
• Cambiar frecuentemente los buffers y el agua
(cada 1–2 días max.)

32
• Usar frascos ámbar o forrados con papel aluminio
para minimizar la exposición a la luz de las fases
acuosas.
E-SeminarGroup/Presentation Title
Agilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X PaPage 37
9.3.1 Forma de Pico:

• Picos divididos
• Coleo
• Ensanchamiento
• Baja eficiencia
Muchos problemas de la forma de pico, son una
combinación de problemas, esto es,
ensanchamiento con coleo o coleo con incremento
en el tiempo de retención.
E-SAgilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 38
9.3.1.1 Picos divididos
Pueden ser causados por:
• Contaminación de la columna
• Frit parcialmente obstruido
• Volúmen muerto en la columna
• Efectos del solvente de inyección
• Columna contaminada

Lavar la columna con 100 % ACN.

La respuesta mejora notablemente después de
lavar la columna con 100 % ACN.
E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 40
• Picos divididos Efectos del disolvente de inyección

33
La forma del pico mejora completamente si se utiliza como
disolvente de la muestra, a la fase móvil.

a) Disolvente de inyección 100 % Acetonitrilo

b) Disolv. de inyección, Fase móvil.
/Presentation Title
Agilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 41
• 9.3.1.2 Coleo del pico
Posible causa: “interacciones secundarias”
• El coleo se elimina agregando un modificador a la
fase móvil.
Reduciendo el pH de la fase móvil, se reducen las
interacciones con los silanoles que causan el
coleo.
E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 43
• Coleo del pico:
Posible causa: contaminación en la columna
Solución: invertir la columna y lavarla con un
volumen de alcohol isopropílico.

• Ensanchamiento:

Posible causa: Volúmen muerto en la columna

• Multiples cambios en la forma del pico pueden ser
causados por el mismo problema. Un caso, cuando
el elevado pH disuelve a la sílica y forma un
volumen en la columna.
El no ajustar el pH de la fase móvil, ocasiona
disolución de la sílica.

34
Solución: invertir la columna y lavarla con un
volumen de alcohol isopropílico.

•9.4.1 Cambios en la retención:

Posible causa: Cambios en la fase móvil

• Variación del modificador de la fase móvil.
•Solución: Corregir la fase móvil, resuelve el
problema.
•Posible causa: Cambios en las condiciones, pueden
causar cambios en la retención.
•Solución: Restaurar las condiciones iniciales.
•Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases
disueltos en fase móvil.
•Solución: Purgar el flujo de la fase móvil, para eliminar
burbujas de aire.
•Prevención: asegúrese de que la fase móvil sea
apropiadamente desgasificada, ya sea burbujeando helio o
por sonificación.

9.4.1.1 Aumento del tiempo de retención.

- Posible causa: Disminución de velocidad de flujo.
- Solución: Comprobar velocidad de flujo en la bomba,
comprobar fugas en los sellos y en el sistema.
- Posible causa: Composición variable de la fase móvil

35
 - Solución: Cubra las reservas de disolvente; asegúrese
de que el sistema desarrolla la composición correcta.
- Posible causa: Pérdida de fase enlazada
- Solución: Usar fase móvil con pH entre 2 y 8.
9.4.1.2 Disminución de tiempos de retención.

- Posible causa: Sitios activos en el empaque de la

columna.
- Solución: Use modificador de fase móvil, (compuestos
básicos), o aumentar la fuerza del buffer; utilizar columnas
con mayor desactivación (end capping).
- Posible causa: Columna sobrecargada con muestra.
- Solución: disminuya la cantidad de muestra o utilice
columna con diámetro mayor.
- Posible causa: Aumento de velocidad de flujo.
- Solución: Comprobar la velocidad de flujo en la
bomba.
- Posible causa: Pérdida de fase estacionaria enlazada o
sílica base.
- Solución: Usar fase móvil con pH entre 2 y 8.
- Posible causa: Variación de la temperatura de
columna.
- Solución: Equilibre la temperatura de columna o
aíslela; asegúrese que la temperatura del laboratorio
sea constante.

36
 9.5.1 Pérdida de resolución

- Posible causa: Obstrucción de la columna de HPLC o

del Guarda columna por partículas.
- Solución: Seguir las indicaciones de la presión alta.
- Prevención: Filtrar todo antes de que se introduzcan
las fases móviles en el sistema de HPLC.

9.6 Sensibilidad baja

-Posible causa: Bloqueo en las líneas del

automuestreador.
- Solución: Compruebe el flujo y limpie cualquier
obstrucción.
- Posible causa: Atenuación demasiado alta.
- Solución: Reducir la atenuación del detector.
- Posible causa: El loop del inyector no se esta llenando.
- Solución: Sobrellene el loop con muestra.
- Posible causa: No se esta inyectando suficiente
muestra.
- Solución: Aumente la cantidad de muestra inyectada.
- Posible causa: Los picos se salen del rango del
detector.
- Solución: Diluya o concentre la muestra para que los
picos estén dentro del rango lineal del detector.
- Posible causa: Pérdida de muestra durante su
preparación.
- Solución: Utilice estándar interno durante su
preparación; optimice el método de preparación de

37
 muestra.

9.6.1 Fuga en la columna o conexiones.

- Posible causa: Conexiones flojas.
- Solución: Apriete o reemplace conexiones.
9.6.2 Fuga en el detector
- Posible causa: Falla en el sello del detector.
- Solución: Reemplace el sello del detector o
empaque.
9.6.3 Fuga en la válvula del inyector

- Posible causa: Rotor de la válvula dañada.

- Solución: Reemplazar la válvula del rotor.

9.6.4 Fuga en la bomba

-Posible causa: Falla en el sello de la bomba.
-Solución: Reemplace el sello de la bomba; revisar el
pistón y si tiene rayaduras, reemplazar.
9.6.5 Picos negativos

- Posible causa: En detector de I.R., el índice de

refracción del soluto es menor que el de la fase móvil.
- Solución: Invierta la polaridad para hacer positivo al
pico.

38
 - Posible causa: en detector UV, la absorbancia del
soluto es menor que el de la fase líquida.
- Solución: Utilizar fase móvil con menor absorbancia
UV; sí se recicla el disolvente, detener el reciclado
cuando el reciclado afecte a la detección.

- Solución: Fluya la columna con un disolvente fuerte;

limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC.
- Posible causa: “spikes”(líneas verticales) por burbujas
en el detector.
- Solución: Desgasifique el gas.
##, 200Pa
10.0 CONCLUSIONES

Los problemas en columnas de HPLC son:

• Presión alta
• Forma de pico indeseable
• Cambios en la retención/selectividad
La mayoría de estos problemas se resuelven lavando la
columna.
Frecuentemente estos problemas no están asociados con
la columna y pueden ser causados por el instrumento y
condiciones experimentales.
La columna se comporta de acuerdo a cómo la
tratemos.

39