UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD TECNOLÓGICA
PROYECTO CURRICULAR INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN POR CICLOS
ASIGNATURA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

Resumen Técnico. Ejemplo 1

PRESENTADO POR:

1. Nombre del estudiante

Fecha:

PRESENTADO A:

HERNÁN MAURICIO RIVERA ESCOBAR.

Lic Química., Esp Bioquímica., MSc Bioquímica., Candidato a Doctor en Ciencias

Título de artículo: From Lanosterol to Cholesterol: Structural Evolution and Differential Effects on Lipid
Bilayers. Miao et al; Biophysical Journal Volume 82 March 2002 1429–1444.

Antecedentes:

a. Yeagle et al; 1977 y Bloch 1983. Concluyeron que el colesterol disminuye la permeabilidad de las
membranas más eficientemente que el lanosterol.
b. Dahl et al 1980. Mide y compara la microviscosidad entendida como el orden conformacional de
las cadenas acil-lipídicas. Demostró que el colesterol incrementa la microviscosidad más
eficientemente que el lanosterol.
c. Bloch et al 1983, 1994. Describe el proceso bioquímico de la conversión de lanosterol a
colesterol, sugiriendo que el cambio en la estructura puede alterar el rol físico de cada molécula
como componente molecular en membranas de bicapa.
d. Yeagle 1985 y Urbina et al; 1995. Investigan el ordenamiento molecular y la dinámica de las
bicapas de fosfatidilcolina en presencia de esteroles en torno a las variables temperatura y
concentración.
e. Ipsen 1987. Establecieron la teoría del equilibrio de fase en el sistema lípido-colesterol.
f. Konrad Bloch 1994. Genera evidencia de una serie de estudios de la bioquímica de los esteroles
y su relación con la evolución de los organismos y propone un modelo de fósiles moleculares
vivientes.
g. Bloom 1991. Evidencia que las bicapas lipídicas deben estar en fase líquida ordenada para
realizar sus funciones biológicas.
h. Nielsen 1999. Establece un modelo para mezclas binarias de colesterol- fosfolípido en
membranas de bicapa y describe las interacciones moleculares del equilibrio de fase.
i. Xu y London 2000. Demostraron que el colesterol tiene una capacidad mayor de inducir un orden
conformacional en las cadenas de lípidos y promover la formación de dominios de membrana.
 j. Smondyreb y Berkowitz 2001. Estudiaron propiedades físicas del ordenamiento molecular,
bioquímica y organización de las moléculas de esterol en las membranas de bicapa lipídicas,
encontrando que a bajas concentraciones de esterol se presentan diferencias en la localización
y movilidad, encontrando que el lanosterol es más móvil que el colesterol. Al incrementar la
concentración de colesterol al 50 % se presenta un efecto de condensación de membrana.

Pregunta de investigación: ¿Qué diferencias presentan el sistema lípido-esterol (colesterol- lanosterol)

en cuanto a orden conformacional molecular y equilibrio de fase en las membranas de bicapa lipídica?

Marco teórico: Sistemas termodinámicos, equilibrio de fase en membranas.,

Estado del arte: estructura y función del colesterol, lanosterol y su ambiente de solvatación,
espectroscopia de RMN que estudia ordenamiento conformacional y DSC que estudia el comportamiento
térmico de los materiales. Modelamiento estadístico de probabilidad de Monte Carlo para medir fases de
equilibrio en un sistema estableciendo un ordenamiento conformacional específico.

Hipótesis: además de un estado de fase sólido ordenado (so) y líquido desordenado (ld), existe un
equilibrio de fase liquido-ordenado (lo) en los sistemas de bicapa esterol-lípido en función de una química
evolucionaría de los esteroles, de forma tal, que se presenta un diferencial en el ordenamiento molecular
de las membranas lípido-colesterol frente a las membranas lípido lanosterol, donde el colesterol favorece
un mayor ordenamiento molecular en el sistema.

Objetivo: Establecer la sistemática del comportamiento termodinámico de las membranas lípido-

colesterol y lípido-lanosterol en términos de equilibrio de fase y entender las bases moleculares que
subyacen al equilibrio de fase combinando modelamiento teórico con investigaciones experimentales.

Resultados experimentales.

Fig. 3. Mediante DSC se obtiene una gráfica de Flujo de calor para los sistemas lípido o lípido-esterol en
función de la temperatura. La gráfica muestra una disminución de la temperatura de fusión (T m) en
función de la concentración de esterol. También se observa una marcada disminución en el flujo de calor
en función de la concentración del esterol. Es posible establecer que durante la transición (15°C), el
sistema libre de esterol presenta una mezcla de moléculas en estado (so) y en estado (ld), sin embargo,
la presencia de esteroles aumentan el estado de desorden del sistema, siendo el colesterol el que
mantiene más ordenado la fase liquida, en un tercer estado: liquido ordenado (lo)

La disminución de la (T m) en función de la concentración sugiere un diferencial en el ordenamiento

conformacional de las moléculas que aumentaría el grado de desorden, provocando mayor fluidez y
menor requerimiento de energía libre para el cambio de fase, lo que implica una disminución en la altura
de los picos. Sin embargo, frente al ancho de la curva los autores no hacen mayor énfasis.
Consideramos que este ancho debe sugerir el rango de temperaturas requerido durante la transición de
fase. Al respecto, se observan diferencias significativas en el ancho del área bajo la curva entre el
sistema lípido y los sistemas lípido esterol.

Fig. 4. La figura presenta los espectros con la frecuencia (KHz) obtenida mediante resonancia magnética
nuclear (RMN) para los sistemas: lípido (Gráfica A), lípido colesterol (30%) (Gráfica C) y lípido lanosterol
(30%) (Gráfica B) en función del cambio de temperatura. En A, Hasta los 10°C se obtienen espectros
similares, pero a partir de los 15°C se presenta un cambio en la topología de la curva y el pico se
ensancha y se torna rectangular. De 30 a 40 °C se observa que el pico se perfila. Lo anterior sugiere que
a mayor ordenamiento conformacional se obtiene una fase solida ordenada representada en una única
línea lisa, a medida que aumenta la temperatura, se observan alteraciones en la gráfica indicando un
aumento en el movimiento de las partículas del sistema, de tal manera que a los 15°C se obtiene una
gráfica con cambios drásticos que sugieren cambio de fase. Los autores consideran que a los 15°C se
presenta la transición en el cambio de fase. En las gráficas B y C, a 0°C se observa una “mezcla” de los
espectros de 0° y 40°C del sistema lípido libre de esterol. Lo anterior sugiere un estado adicional entre el
estado (so) y (ld) el estado (lo).

El ancho de la curva en el sistema colesterol lípido es mayor que en el sistema lanosterol lípido,
indicando mayor ordenamiento de primer sistema con respecto al segundo. Con el aumento de la
temperatura la topología de los espectros intenta mantenerse constante, siendo más evidente para el
sistema colesterol que para el sistema lanosterol, sugiriendo que el colesterol mantiene un estado líquido
ordenado más eficientemente que el sistema lanosterol.

Fig. 5. La figura presenta dos gráficas donde se obtuvo los diagramas de fase para los dos sistemas
esterol-lípido. Graficando la temperatura en función de la concentración de esterol. En A, se observa dos
líneas verticales definidas que limitan y definen las fases: liquido ordenada, sólido ordenada y liquido
desordenada. En B, a concentraciones inferiores del 10% de lanosterol se diferencia el estado (so)
limitado por temperaturas menores a los 9°C. Por el contrario, en el sistema colesterol a esa
concentración (10%) es posible mantener el estado so hasta los 15°C. Así mismo, con concentraciones
superiores al 30%, el sistema colesterol define claramente los límites de las fases ld y lo, condición que
no es evidente para el sistema lípido-lanosterol. Lo anterior, sugiere que el colesterol presentaría la
habilidad de mantener límites definidos para un estado líquido ordenado en función de la temperatura.
Esos resultados son consistentes con los obtenidos por DSC.

Fig. 6. La figura 6, representa el espectro cuadrupolar del ordenamiento conformacional (M1) de las
cadenas lipídicas para los sistemas (lanosterol, colesterol) en las dos condiciones a diferentes
concentraciones de esterol en función de la temperatura. En ambos gráficas, se observa una disminución
de M1 al aumento de la temperatura. Esta variación es concentración de esterol dependiente. Sin
embargo, para el sistema colesterol-lípido es evidente la presencia de límites definidos a una
temperatura fija (15°C) que sugiere un claro cambio de fase, límite que no presenta el sistema lanosterol-
lípido, sugiriendo para este sistema un cruce de fases lo y ld, consistente con la gráfica 5.

Fig. 7. Presenta los resultados del modelamiento teórico, usando simulaciones de probabilidades de
Monte Carlo. Los Parámetros de corrido del modelo teórico de simulación incluyeron: Geometría planar
impuesta en el sistema, número total de moléculas (N), temperatura (T°) y presión lateral (π), Parámetro
teórico de ordenamiento conformacional de las cadenas lipídicas (Φ). Como criterios del modelo teórico
se incluyeron: representación de los grados de libertar traslacionales, descripción de los grados de
libertad conformacionales moleculares y modelos de interacciones mínimas entre las moléculas.
Mediante el modelamiento teórico de la figura 7, se obtuvo los diagramas de fase para los sistemas
lípido-esterol, congruentes con los obtenidos experimentalmente en la figura 5, validando el
modelamiento teórico.

Fig. 8. La gráfica A, presenta el ordenamiento conformacional teórico Φ en función de la concentración

de esterol (colesterol-lanosterol) a una temperatura fija, correspondiente al punto crítico lo/ld. La gráfica
B. presenta el ordenamiento conformacional teórico Φ en función de la temperatura a una concentración
fija de esterol (colesterol-lanosterol), correspondiente al punto crítico lo/ld. Los datos de Φ obtenidos por
el modelo teórico confirman los obtenidos en la figura 6. A mayor concentración de colesterol mayor
ordenamiento conformacional a temperatura constante y a mayor temperatura menor ordenamiento de
los lípidos.
Fig. 9 y Fig. 10. Representaciones de la micro-configuración de los sistemas de membrana lipídicas de
colesterol y lanosterol. Las gráficas proponen un patrón de distribución tipo hilos para los lípidos
intercalado por las moléculas del esterol.

Conclusión: para los autores, el colesterol, con su estructura molecular lisa interactúa más
eficientemente con las cadenas de lípidos con ordenamiento conformacional y estabiliza el estado
líquido ordenado de las bicapas lipídicas más eficientemente que el lanosterol.

Considero que la conclusión debería ser: si existen diferencias en el ordenamiento conformacional de los
sistemas lípido-colesterol y lípido-lanosterol. El colesterol estabiliza el estado líquido ordenado de las
bicapas lipídicas más eficientemente que el lanosterol, posiblemente, debido a su estructura molecular
lisa, que le permite interactuar más eficientemente con las cadenas de lípidos.

Resumen Técnico. Ejemplo 2

PRESENTADO POR:

1. Nombre del estudiante

Fecha:

PRESENTADO A:

HERNÁN MAURICIO RIVERA ESCOBAR.

Lic Química., Esp Bioquímica., MSc Bioquímica., Candidato a Doctor en Ciencias

Título de artículo: The Structure of the Potassium Channel: Molecular Basis of K+ Conduction and
Selectivity. Declan A. Doyle, et al; Science 280; 69 (1998). DOI: 10.1126/science.280.5360.69

Antecedentes:
1. El flujo de iones en una dirección muestra un alto orden de acoplamiento el flujo en la dirección
opuesta, y las mezclas iónicas resultan en un comportamiento de conducción anómalo. Hodking
(1955)

2. Los poros de todos los canales K+ pueden ser bloqueados con tetrametilamonio (TEA), estos
cationes orgánicos bloquean el canal por ambas caras de la membrana y en diferentes sitios.
Este Armstrong (1965) (1972)

3. Los canales de potasio (K+) usan diversos mecanismos de compuerta (el proceso por el cual el
poro el cual el poro y se cierra) pero todos ellos, aparentemente, pueden exhibir una
característica de permeabilidad a iones muy similares. Hille (1992)

4. Una mutación en la secuencia de aminoácidos crítica de la huella que identifica al canal K+

interrumpe la habilidad el canal de discriminar entre iones de K+ y Na+ Heginbotham (1992)
 5. Se obtuvo la secuencia de aminoácidos de los canales K+ de Streptomyces lividans (KcsA K1
channel). Schempf et al., (1995).

6. La secuencia de aminoácidos de los canales de K+ tienen dos segmentos transmembranales por

subunidad y hay algunos que contienen seis. En todos los casos, las proteínas de canales
funcionales K+ son un tetrámero típicamente de cuatro subunidades idénticas. Mackinnon
(1991), Ketchum et al; (1995)

7. La región del poro de los canales K+ pueden ser bloqueados con toxinas de escorpión. Estos
inhibidores interactúan con aminoácidos que comprenden la amplia vía de entrada de la cara
extracelular al poro. Mackinnon et al.,(1989 y 1990)

8. En cuanto a los canales KscA K+ de interacción con canales de toxinas eucariotas se ha

confirmado que la estructura del poro KscA es de hecho muy similar a los canales K+ eucariotas
y su estructura es mantenida cuando se remueve de la membrana celular con detergentes.
Mackinnon et al.,(1998)

Pregunta de investigación: ¿Cuáles son los principios fisicoquímicos que subyacen a la estructura de
los canales de Potasio (K+) de Streptomyces lividans KcsA y que explican el funcionamiento del canal a
través de un modelo propuesto?

Marco teórico: Estructura y conformación de proteínas, fuerzas electrostáticas, principios y restricciones

fisicoquímicos de selectividad en canales iónicos-catiónicos.

Hipótesis: Los canales de K+ contienen un patrón de ordenamiento conformacional, dicho patrón, debe
acoplar dentro de las restricciones termodinámicas un sistema de selectividad específico para un ion (10 4
veces más selectivo para el potasio que para el sodio, a pesar de sus radios de Pauling cercanos, de
1.33 Å y 0.95 Å respectivamente) y a su vez un sistema de desacoplamiento que explique la alta
velocidad de difusión del ión a través del canal (10 8). Lo anterior, propone fuertes interacciones
energéticas diferenciales a lo largo del canal, que tendría por base una composición y orden
conformacional proteico diferencial tanto a lo largo e interior del canal como en las zonas hidrofóbicas
externas asociadas a la membrana celular.

Objetivo: Caracterizar la arquitectura del canal iónico de Potasio KcsA de Streptomyces lividans,
estableciendo los principios fisicoquímicos que subyacen a la selectividad del canal por el ión K+.

Resultados experimentales.

Fig. 1. La figura muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos desde el residuo 61 a 110

(que incluye la región hélice del poro y la hélice interna) de canales de potasio en diferentes especies
desde procarias hasta eucarias y de dos secuencias de canales no selectivos de potasio. En el
alineamiento, se observan diferencias en la selectividad del filtro para la secuencia de aminoácidos
TVGYG o TIGYG que aparentemente serían los residuos asociados a la selectividad del filtro. Llama la
atención que las dos secuencias de canales no selectivos para el potasio (K+) presentadas al final de la
figura, presenten alta homología con los canales K+ excepto por los dos aminoácidos (YG) finales
asociados al filtro de selectividad.
Fig. 2. La figura presenta mapas de densidad electrónica para el canal de potasio KcsA de Streptomyces
lividans para la secuencia de aminoácidos del canal que comprende las posiciones 23 a 119. Estos
mapas son el resultado de un proceso de resolución cuyos parámetros incluyeron: selección de datos,
corrección de anisotropía, introducción de átomos pesados en residuos de aminoácidos específicos por
mutagénesis dirigida y corrección por solvente. En A, se observa una distribución helicoidal, que forma
una sección interior cilíndrica asimétrica y unas esferas que representan los residuos marcados con
mercurio durante el reemplazamiento isomorfo múltiple: MIR. B, es una vista alternativa de la misma
estructura de A, que refleja las hélices exteriores y del poro del canal. En C, se proyecta una estructura
condensada del canal y se observa un alineamiento de los grupos carbonilo hacia el interior del canal, en
la región del poro.

Fig. 3. La figura 3 refleja la estructura terciaría del canal de potasio. En A, se observa una vista
extracelular del canal y se observa 4 subunidades distribuidas simétricamente, formando una cavidad o
poro al interior, cada subunidad está conformada por dos dominios transmembranales (figuras B y C), un
dominio hacia el interior del poro y el otro en la cara exterior del poro, sugiriendo composición química
diferencial, hidrofóbica hacia el exterior e hidrofílica hacia el interior del poro. Así mismo, es evidente que
la distribución espacial de las hélices forma una especie de Teepe invertido o cono invertido (tienda
nativa norteamericana), donde las hélices del poro y de las hélices internas están dispuestas de forma
abierta en la cara externa de la membrana. La selectividad del poro estaría dada por una región de 30
aminoácidos del poro que contiene una hélice de poro y un filtro de selectividad.

Fig. 4. Teniendo en cuenta que el alineamiento de la figura 1 mostró regiones altamente conservadas
asociadas a la región del poro y por ende al filtro de selectividad entre canales de potasio, en la figura 4,
se extrapoló los resultados experimentales de mutagénesis dirigida obtenidos en el canal de potasio
Shaker de Drosofila melanogaster al canal de potasio de KcsA de Streptomyces lividans. La figura
muestra las hélices internas al poro y la distribución de residuos de aminoácidos asociados a la
selectividad del canal de potasio. Se observa en blanco, los potenciales sitios de interacción de residuos
de aminoácidos de la cara exterior del canal con toxinas de escorpión, en verde y rosado se muestra la
inhibición del canal por mutagénesis con cisteína y su correspondiente interacción con especies reactivas
al residuo aminoácido. Tetrametil amonio TEA es un catión orgánico que tiene la capacidad de bloquear
el canal en diferentes niveles (amarillo y mostaza en la figura). En rojo, se representa los residuos
asociados e indispensables para la selectividad del filtro por el potasio. la figura permite sugerir una
composición química diferencial a lo largo del canal, que puede dar luces frente a la funcionalidad del
canal.

Fig. 5. En A se representa la superficie molecular del canal y el contorno del poro, indicando por colores
las propiedades físicas al interior del poro, así, en rojo se representa los aminoácidos cargados
negativamente que estarían asociados electrostáticamente a la entrada del ión potasio; en amarillo, se
muestra la naturaleza hidrofóbica de la pared interna de poro que estaría relacionada con la disociación
del ión durante la salida del poro hacia la membrana interna; en azul referencian regiones de la parte
exterior del cana cargadas positivamente y en verde los iones de potasio a través de la vía de
conducción. En B, se referencian las distancias mínimas de van der Waals para los residuos de
aminoácidos al interior del poro, la gráfica muestra que el diámetro del poro varia a lo largo de su
distancia, siendo más grande hacia la mitad del poro.

Fig. 6. Según los autores, la figura muestra las diferencias en los mapas de Fourier para rubidio en A y
cesio en B y en C el mapa de densidad electrónica de la cavidad del ion. Sin embargo, para nosotros, la
figura no es clara para llegar a la conclusión de los autores en la cual el filtro de selectividad contiene dos
iones de potasio y que la diferencia en los mapas de densidad electrónica reflejan la presencia de unos o
más cationes pobremente relacionados con distancias de 4 Å respecto a los grupos proteicos más
cercanos.

Fig. 7. La figura los autores proponen el modelo para el paso y estabilización de los iones de potasio a
través del poro del canal. Se sugieren dos mecanismos para la estabilización del potasio: se requiere una
cavidad grande acuosa y segundo alineamiento de las hélices y sus residuos cargados negativamente
hacia el interior de la cavidad. Además los autores sugieren que la internalización y paso del ion a través
del poro debe incluir un largo trayecto hidrofóbico al interior de la cavidad.

Fig. 8. La figura 8 en A, integra los resultados de los mapas de densidad electrónica de iones de Fourier
con la ubicación y conformación de los residuos aminoacídicos asociados al filtro de selectividad del
canal. Se observan que las valinas y tirosinas están ubicadas hacia el exterior del filtro y las glicinas
hacia el interior. En B, se muestra una vista del filtro de selectividad mostrando dos iones de potasio
separados por una molécula de agua y en C se muestra una vista perpendicular del poro en el que se
observan las interacciones entre la tirosina 78 y los triptófanos 67 y 68 que confieren estabilidad del filtro
y el diámetro del filtro.

Conclusión: Se establece la caracterización del canal K+ KcsA de Streptomyces lividans encontrando

los siguientes particularidades: i. el poro tiene una forma de cono invertido, donde el filtro de selectividad
(YG son residuos indispensables para la selectividad del canal) se encuentra en el extremo más ancho
del cono, cuya arquitectura es común a otros canales iónicos; ii. el filtro es estrecho (12 Å) y presenta
una amplia zona hidrofóbica hacia la zona interna de la membrana, lo que explicaría la amplia tasa de
transferencia de potasio sobre las interacciones electrostáticas causadas por la selectividad del ión en la
zona externa de la membrana; iii. el canal presenta una larga cavidad llena de agua y dipolos en las
hélices que ayudan a sobrepasar la alta barrera de energía electrostática que un catión tendría que
alcanzar para atravesar la membrana a bajos potenciales dieléctricos; iv. la selectividad del filtro para
potasio está dado por el alineamiento de los átomos de oxigeno de los grupos carbonilos de los residuos
asociados al interior del poro, proporcionando múltiples sitios estrechamente espaciados; v. el filtro está
cerrado permitiendo solo el paso de iones de potasio deshidratados a una geometría óptima que no
permite el paso de otros cationes más pequeños que están asociados a agua; vi. por el canal siempre
pasan dos iones de potasio a la vez y la repulsión de cargas favorece el movimiento de los iones a través
del poro facilitando su paso.

Resumen Técnico. Ejemplo 3

PRESENTADO POR:

1. Nombre del estudiante

Fecha:

PRESENTADO A:

HERNÁN MAURICIO RIVERA ESCOBAR.

Lic Química., Esp Bioquímica., MSc Bioquímica., Candidato a Doctor en Ciencias

Título de artículo: X-ray structure of a ClC chloride cannel at 3.0 Å reveals the molecular basis of anion
selectivity. Raimund. Dutzler, et al; Nature 415; 287 (2002). DOI: 10.1038/415287a
Antecedentes:

1. Miller descubrió un canal de CI- de un órgano eléctrico de torpedo de rayo (ClC-0). Con base a
un análisis de canal único cuantitativo, predijo que estos canales contienen dos poros paralelos
independientes. (Un canal de doble barril) White, M. M. &Miller (1979)

2. Todos los canales parecen compartir dos características que son aparentemente inherentes a la
familia de canales de iones. La primera característica es la selectividad anión sobre catión, que
se manifiesta como la permeabilidad por los iones halógenos Cl- y Br- (en algunos casos I-), y
bloqueo de la corriente de Cl- por aniones más grandes tales como I-, SCN y otros aniones
orgánicos. White, M. M. & Miller, C. (1981).

3. Todos los canales parecen compartir dos características que son aparentemente inherentes a la
familia de canales de iones. La primera característica es la selectividad anión sobre catión, que
se manifiesta como la permeabilidad por los iones halógenos Cl- y Br- (en algunos casos I-), y
bloqueo de la corriente de Cl- por aniones más grandes tales como I-, SCN y otros aniones
orgánicos. White, M. M. & Miller, C. 1981.

4. Jentsch en 1990 clonó el del ClC-0 para su caracterización. Realizó uso de pruebas bioquímicas,
multifuncionales, mutacionales y análisis estructurales por microscopía electrónica confirmó la
presencia de un canal de doble barril.

5. La segunda característica de los canales de ClC Cl- es el fuerte acoplamiento funcional entre la
conducción iónica y apertura. Rychkov, et al (1998), Rychkov, et al (1990), Richard,et al (1990),
Pusch et al (1995).

6. Mutación de Serina 107 a Threonina en el sitio de unión a cloruro en ClC-0 afecta la selectividad
entre aniones y reduce dramáticamente la conductancia. Ludewing (1996)

7. En el musculo esquelético, los canales de ClC CI- estabilizan el resto del potencial de membrana
y regulan la excitabilidad eléctrica. En el riñón, estos canales operan en unión a los co-
trasportadores de Na+, K+, Cl- y a los canales de potasio para producir fluido transepitelial y
trasporte de electrolitos. Fahlke, (2001)

8. La arquitectura de los canales iónicos K+ revelaron características que probablemente sean

comunes para todas las familias de canales iónicos. Doyle et al (1998) Zhou et al (2001)

9. Los canales ClC CI- se han encontrado en células eucariotas y procariotas asociados a
diferentes procesos y con aparente patrones funcionales diferenciales. Jentsch et al. (1999)
Maduke (2001)

Pregunta de investigación: ¿Cuáles son los factores determinantes que definen la selectividad iónica
en los canales aniónicos CIC Cl- en cuanto a topología de membrana, componentes moleculares del
poro, y filtro de selectividad?

Marco teórico: Estructura y conformación de proteínas, fuerzas electrostáticas, principios y restricciones

fisicoquímicos de selectividad en canales iónicos-aniónicos.
Estado del arte: A través de la acción de las bombas de iones, una gran fracción de energía metabólica
celular se gasta en el establecimiento membranal de los gradientes iónicos. Estos gradientes, son
usados para producir señales eléctricas, activar señales de vías de transducción, regular el volumen
celular, y mediar el fluido y transporte de electrolitos Doyle (1998). Los defectos genéticos de los canales
de ClC Cl- desencadenan un desorden autosómico dominante y recesivo de Myotomia familiar y varias
neuropatías familiares incluyendo el síndrome de Batters y el síndrome de Dent. Steinmeyer (1994).
Bases teóricas y técnicas de la cristalografía de rayos X.

Hipótesis: El ión Cl- es un sustrato portador de corriente que fluye a través del poro y presenta
asociación funcional con los eventos alostéricos en las compuertas del canal. Aparentemente por el
acoplamiento electrostático del ion Cl- al poro, se afecta la apertura de las compuertas, dando lugar a
propiedades tales como gating (apertura o cierre) en algunos de los canales. Sin embargo, dada la
conservación de su secuencia junto a la selectividad de iones en un canal de ClC Cl- de E.coli se tiene la
certeza de que un set común de principios de selectividad de iones aplican para la familia entera de
canales iónicos.

Objetivo: Caracterizar la estructura por cristalografía de Rayos X de dos canales de CIC Cl-
simultáneamente pertenecientes a S. typhimurium y E. coli, estableciendo los principios fisicoquímicos
que subyacen a la selectividad del canal por el anión CIC Cl-.

Resultados experimentales

Fig 1. La figura muestra un alineamiento múltiple de secuencias de canales de ClC Cl- de diferentes
especies y se muestra la estructura secundaria del canal de cloro de Salmonella typhimurium, entre las
posiciones 130 y 460 en donde se resaltan los residuos altamente conservados de dicho canal tanto de
eucariotas como de procariotas y además se muestra las regiones asociadas al filtro de selectividad.
Todos estos canales muestran conservación a través de la proteína, lo cual no altera su estructura
tridimensional. De acuerdo con los autores se conserva una estructura cuya homología preserva la
configuración 3D entre especies. Las letras B hasta R hacen referencia a 17 de las 18 hélices alfa del
canal.

Fig 2. La figura presenta la densidad electrónica experimental a partir de la diferencia de mapas de

densidad electrónica entre la diferencia de los factores de estructura molecular FSe (muesta con selenio
para E. coli) – Fnative. Para ello, Se realizó mutagénesis dirigida (EcClC: E. coli), (StClC: S. typhimurium)
marcando a EcClC con selenio y a StClC con platino. En A se observa una distribución espacial
correspondiente al EcClC Cl- y en rojo la posición de las 17 metioninas marcadas con selenio en el canal
y en verde el FSe. En B, se muestra la estructura refinada en modelo de bastones para StClC Cl- en una
forma cristal específica a 3 A de resolución. El mapa fue calculado desde amplitudes nativas,
aplanamiento de solvente y promedio de fases.

Fig 3. Se muestra el canal de StClC Cl- que contienen dos subunidades idénticas las cuales están
conectadas por un eje perpendicular simétrico al eje de membrana. En B. cada subunidad tiene forma
triangular formando un rombo por la unión de las dos subunidades con las diagonales mayores y
menores de 100 y 55 Å respectivamente. La dirección perpendicular al plano de membrana, muestra que
el canal posee cerca de 65 Å de espesor al cual pertenecen dos extensiones helicáles que sobresalen
dentro de la solución acuosa. La superficie de contacto entre las subunidades es amplia acercándose a
los 2300 Å cuadrados. Cada subunidad forma su poro independiente y su propio filtro de selectividad
representado en la figura por esferas verdes. Sin embargo, observamos que para una de las
subunidades no está definida el extremo N terminal.
Fig 4. Se exhibe la topología compleja de las 18 hélices alfa de una subunidad del canal de StCIC Cl-.
En A, se presentan las hélices alfa desde la A hasta la R para el canal de StCIC Cl- donde se muestra
que las hélices A hasta la I forman una subunidad y de las Hélices J hasta R forman otra subunidad. Se
observan las cargas positivas parciales de las hélices asociadas al filtro de selectividad. En B, se
muestran una Estereovista dentro del plano de la membrana desde la interface dimérica. Se presentan
dos estructuras similares con orientaciones opuestas en la membrana que crean un pseudo doble
plegamiento desde la interface dimérica al interior de la membrana a pesar de la débil correlación de la
secuencia de las subunidades particularmente a la distribución de residuos de glicina, lo que los autores
llaman Arquitectura Anti paralela.

Fig. 5. En la figura se muestra el filtro de selectividad para el StCIC Cl-. En A, se observan sus hélices
D,F y N que tienen efecto dipolo, lo cual genera hacia el interior del poro un ambiente electrostático
favorable para la unión del cloruro. En B y C, se observan Estereovistas: En B, de densidad electrónica
en la selectividad del filtro y en C, los residuos de aminoácidos asociados al sitio de unión para el ion
cloruro, ya que los canales de cloruro conducen también iones de bromuro, los autores crecieron
cristales que contenían bromuro en vez de cloruro. Así, tras experimentos usando bromuro de sodio en
vez de cloruro de sodio se logró establecer la presencia de ion cloruro en un sitio de alta densidad
electrónica asociada al filtro de selectividad. En C, se observa que los aminoácidos Ile356, Phe357,
(átomos de nitrógeno del grupo amida de cadena principal), y Ser 107 y Tyr 445 de átomos de oxígeno
de cadena lateral, estarían definiéndose como factores determinantes durante la unión al ión cloruro. El
ion cloruro interactúa con grupos funcionales polares y a su vez está rodeado por un numero de
aminoácidos de cadena lateral hidrófobas. Es interesante que el cloruro interactúe con cargas parciales
de hélices que han generado momentos dipolares y no con residuos cargados positivamente como lisina
y arginina, los autores sostienen que estos canales de cargas parciales para estabilizar el ion cloruro
permitirían una rápida velocidad de difusión iónica.

Fig 6. En A, se observa de nuevo las hélices y aminoácidos comprometidos en el filtro de selectividad

N, F y E. por primera vez los autores presentan el Glu148 proyectado desde la hélice F hacia el interior
del poro, residuo que es altamente conservado en los canales CIC Cl- alineados en a Figura 1. Este
glutamato se encuentra empaquetado entre las Hélice F y N. La selectividad del filtro tiene dos aniones
en él, un anión cloruro cercano al sitio intracelular y un anión carboxilato cercano al sitio extracelular. Los
autores consideran que el glutamato podría tener una abertura hacia afuera asociada a la entrada del
anión a través del poro. En B, se presenta una vista de la entrada al canal rotada 90° con respecto al eje
y, y la asociación con Arg 451. En C, La distribución de las cargas en la superficie del canal completo
crea un potencial electrostático que probablemente proyecta los iones de cloruro en el poro en ambas
vías los dos poros en el dímero están separados por una larga distancia y por una región electrostática
repulsiva observada en color rojo.

Conclusión:

Se logró caracterizar la estructura del canal ClC Cl- para StCIC Cl-. Es posible que el cloro, esté
asociado tanto en el proceso de movimiento de los iones a través del poro abierto como en el mismo
proceso de abertura del poro. Así, el mecanismo puede implicar que cuando el poro está abierto la
conducción ocurre a través de la interacción de dos iones cloruro cercano en la selectividad del filtro. Sin
embargo, las figuras en su mayoría sólo presentan la caracterización del canal StCIC Cl- y no el de E.coli
a pesar que se proponía en el objetivo una caracterización simultánea. Para los autores es intrigante la
localización de la Hélice Alfa R ya que su N-terminal empieza en el filtro de selectividad donde la Tyr445
interactúa directamente con el ion Cloruro y por otro lado su C terminal se proyecta hacia el citoplasma,
ofreciendo una ruta directa para la regulación de la función del canal. La figura 7 presenta las dos
arquitecturas para las proteínas del canal iónico, que confirma la arquitectura anti paralela del canal
aniónico y compra su estructura con la del canal de potasio. Posiblemente se trate de un sistema
diferencial de transporte independiente al descrito por los autores en el artículo.