FLUOROINMUNOANÁLISIS Los fluoroinmunoanálisis (FIA) utilizan para el marcaje los compuestos

fluorescentes. Las características principales que deben tener estos compuestos para su uso en los
FIA son:

1. Poseer una intensidad de fluorescencia elevada.

2. Que sea posible diferenciar su fluorescencia de la de fondo que producen las muestras
biológicas. 3. Que su unión al antígeno o al anticuerpo no afecte de forma adversa sus
propiedades.

Los compuestos fluorescentes más utilizados como marcadores en este tipo de inmunoanálisis son
los derivados de la fluoresceína, la rodamina y la umbeliferona.

FLUOROINMUNOANÁLISIS HOMOGÉNEOS Los fluoroinmunoanálisis homogéneos son los análisis

en los que la reacción antígeno-anticuerpo altera significativamente las propiedades fluorescentes
del marcador, de forma que es posible determinar la cuantía de la reacción de unión en cualquier
momento a partir de la mezcla homogénea de reacción. Las principales desventajas de los FIA
homogéneos respecto a los heterogéneos son su menor sensibilidad y los problemas relacionados
con la presencia de compuestos fluorescentes endógenos y otras sustancias que extinguen la
fluorescencia de la sonda marcada. Entre los compuestos séricos que contribuyen a que la
fluorescencia de fondo sea signifi cativa están las proteínas, el nicotinamida adenindinucleótido
reducido (NADH), las porfirinas y los fármacos. También es importante la elevada absortividad de
los especímenes hemolizados y de los ictéricos. Otro factor de interferencia es la unión de la sonda
fluorescente a las proteínas del suero, que causa efectos significativos de extinción de la
fluorescencia. Los FIA homogéneos no requieren separar las fracciones ligada y libre, una vez
producida la reacción inmunológica. Se han propuesto varias técnicas de FIA homogéneo; la
mayoría son competitivas y se han desarrollado para medir compuestos de bajo peso molecular,
como los fármacos y las hormonas derivadas de aminoácidos.

Inmunoanálisis de polarización de fluorescencia (FPIA) Esta técnica se ha utilizado mucho en los

laboratorios clínicos, principalmente en su forma automatizada, limitada a la determinación de
moléculas de bajo peso molecular. Se basa en la cantidad de luz fl uorescente polarizada que se
detecta cuando el trazador, esto es, la sustancia unida a un compuesto fluorescente (fluoroporo),
se ilumina con luz polarizada plana. El grado de polarización de la fl uorescencia depende del giro
del complejo fluoroporo-ligando en solución. Las moléculas pequeñas giran libremente y, en
consecuencia, la luz fluorescente que emiten cuando se iluminan está polarizada. Por otro lado, las
moléculas grandes, como las proteínas, giran más lentamente, lo que origina un mayor grado de
polarización de la fluorescencia emitida al iluminarse. Cuando el trazador se une al anticuerpo, el
giro del complejo es lento y la polarización de la fluorescencia, grande. Como prueba competitiva,
en el FPIA, la sustancia que quiere medirse, presente en la muestra, compite con la sustancia
marcada con el compuesto fluorescente (trazador) por un número limitado de lugares de unión en
el anticuerpo. Cuanto mayor sea la cantidad de la sustancia en el espécimen, menor será la
cantidad de trazador unido al anticuerpo, y el valor de la polarización de la fluorescencia será bajo.
La relación precisa entre la polarización de la fluorescencia y la concentración de la sustancia se
establece midiendo un conjunto de calibradores de concentración conocida. Para evitar el
problema de las propiedades de unión con poca afinidad de la albúmina y otras proteínas que
aumentan la polarización de forma inespecífica, se diluye el espécimen o se trata previamente con
iones caotrópicos, enzimas proteolíticas, precipitantes de proteínas o disolventes. El FPIA se utiliza
para medir fármacos de seguimiento terapéutico, rastrear drogas de abuso, medir algunas
hormonas, como la tiroxina y el cortisol, e incluso algunas proteínas como la proteína Creactiva
(PCR) y la creatina cinasa.

FLUOROINMUNOANÁLISIS HETEROGÉNEOS requiere separar las fracciones ligada y libre de la

reacción inmunológica antes de medir la fluorescencia. Se ha propuesto un gran número de
modalidades para determinar muchas sustancias que utilizan diversos soportes sólidos para la
separación

FLUOROCROMOS Son productos químicos que al ser estimulados con fotones con longitud de
onda comprendí-da entre determinados rangos (de excitación) emiten a su vez otro fotón de
longitud de onda mayor (de emisión). MARCAIE DE CÉLULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES
Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales de ratón contra antígenos concretos
en Ia superficie de las células, marcadas con colorantes fluorescentes verde (fluoresceina) y/o rojo
(picoeritrina).

Técnicas básicas de marcaje celular Anticuerpos directos Se utilizan anticuerpos monoclonales

específicos contra antígenos concretos que vienen ya marcados con el fluorocromo en su
presentación comercial. Anticuerpos indirectos Habitualmente los anticuerpos contra los
principales marcadores de superficie ya vienen conjugados con fluorocromos.

Para buscar marcadores poco comunes o en experimentación no siempre es posible disponer de

dicho anticuerpo conjugado en presentaciones comerciales en esos casos se debe de usar el
anticuerpo sin conjugar y detectar la fijación del mismo a través de marcaje indirecto.

Inmunafluorescencía directa La identificación de un Ag determinado se lleva a cabo mediante el Ac

específico fluorescente. Las células o un frotis conteniendo microorganismos se ponen en
evidencia mediante el anti- cuerpo marcado. Inmunofluorescencía indirecta La puesta en
evidencia de un antígeno o de un anticuerpo puede ser efectuada después de la unión del
anticuerpo al antígeno, haciendo reaccionar sobre el inmunocomplejo una antiinmu7 noglobulina
conjugada con fluoresceína.

Inmunofluorescencia Ciertas moléculas, la mayoría compuestos orgánicos con estructura en anillo,

denominadas fluorocromos o compuestos fluorescentes, tienen capacidad de excitarse a un
estadio energético superior por una longitud de onda determinada. Cuando una de estas
moléculas es irradiada con luz de longitud de onda adecuada quedan excitados sus electrones y
cambian a un estado de mayor energía. Posteriormente al recuperar estos e| estado basal
anterior, la energía se libera en forma de fotones, de menor nivel energético (mayor longitud de
onda) que el de la luz excitante. Por tanto, la longitud de onda dela luz emitida suele ser más larga
que la longitud de onda utilizada para Ia excitación de las moleculas. EI proceso de excitación-
emisión se denomina fluorescencia. En Ia actualidad, las diversas modalidades de inmunoanálisis
por fluorescencia son ampliamente utilizadas en el diagnóstico microbiológico y en Ia
determinación de concentraciones de una extensa gama de proteinas, hormonas y farmacos
diversos.

Los dos marcadores más utilizados son eI isotiocianato de fluoresceína (fluoresceina) y el

isotiocianato de tetrametilrodamina (rodamina). Ambas moléculas poseen longitudes de onda de
excitación y emisión características. La fluoresceína emite un color amarilloe verdoso y Ia
rodamina. anaranjadOÍrojizo. Las sustancias marcadas se detectan mediante el microscopio de
fluorescencia. Las diferentes técnicas de inmunoanálisis por fluorescencia pueden dividirse
atendiendo a diferene tes parámetros: de fase sólida o no, competitivos o no competitivos y
homogéneos en los que no es necesaria la separación mediante lavado de las fracciones unida y
libre del marcador fluorescen- te en la sustancia problema, ya que es posible medir e| grado de
reaccion inmunológica sin tener que efectuar la separacion de los componentes libres y marcados
o heterogéneos, que exigen un grado de lavado para separar el marcador unido del libre.

Inmunofluorescencia directa La identificación de un Ag determinado se lleva a cabo mediante el

Ac específico fluorescente. Las células o un frotis conteniendo microorganismos se ponen en
evidencia mediante el anticuerpo marcado. Aparte de su sencillez y rapidez, tiene la ventaja de
permitir revelar gérmenes difícilmente cultivables. Anti cuerpo marcado Anlígano

Inmunofluorescencia indirecta La puesta en evidencia de un antígeno o de un anticuerpo puede

ser efectuada después dela unión del anticuerpo al antígeno, haciendo reaccionar sobre el
inmunocomplejo una anti inmunoglobulina Á conjugada con fluoresceína. La reacción se realiza en
dos etapas con un lavado intermedio. Suprime la necesidad de hacer flu rescentes tantos
anticuerpos como sistemas inmunológicos se vayan a estudiar, y es mas sensible que la
inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia en” sándwich", mediante esta tecnica se
pueden detectar anticuerpos ligados a células o tejidos. Una vez fijado el Ag específica del Ac
problema y tras el correspondiente lavado se añade el anticuerpo específico del antígeno,
marcado con fluoresceína. El antígeno queda en medio de los otros dos componentes y de ahí el
nombre de la reacción. En general, las reacciones de inmunofluorescencia son muy sensibles, ya se
trate de poner de manifiesto, antígenos o anticuerpos. Entre las aplicaciones más destacadas de la
inmunofluorescencia indirecta, se encuentran la detección de anticuerpos antinucleares y
antimitocondriales, y la demostración de anticuerpos específicos en el curso de infecciones
bacterianas (Legionella, Treponema, Coxiella), víricos (rubéola) y parasitarias (Entamoeba,
Toxoplasma, Trichinella).

Martín-Romo Mejías, J. (Coord.) (2012). Actualización en estudios de Inmunología y Genética (2a.

ed.). Editorial ICB. Recuperado de https://dbvirtual.un
iatlantico.edu.co:3357/es/ereader/uatlantico/105451?page=122 .

Importante: Rodamina

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos aura- mina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado
como contraste, evita la fluorescencia inespe- cífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Barranco Martos, A. (2013). Tutorial Técnico Especialista en Laboratorio. Tomo II. Madrid, Spain:
Editorial CEP, S.L. Recuperado de
https://dbvirtual.uniatlantico.edu.co:3357/es/ereader/uatlantico/50553?page=275.

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o

desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está
muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleído, el germen viabIe se
inactivará poco tiempo después dela tinción. El uso de naranja de acridina para detectar la
presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran
cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es
tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

ROBERT JOSE FRANCO ROMERO

ALUVIS LISETH GARRIDO OSORIO

JEHIBER DAVID MORENO PAJARO