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Instituto Tecnológico de Mazatlán, Calle Cosario 1 No. 203, Col. Urias, C.P. 82070, Mazatlán, Sinaloa, México.
RESUMEN ABSTRACT
Debido a la continua incidencia de intoxica- Given the incidence of human poisonings at-
ciones humanas ocurridas en el sur de Sinaloa y norte tributed to raw shrimp consumption in southern of Sina-
de Nayarit, las cuales son atribuidas al consumo de ca- loa and northern of Nayarit in recent years, white shrimp
marón crudo, de mayo a diciembre de 2012, se evaluó la (Litopenaeus vannamei) was sampled from three wild-
posible presencia de Vibrio parahaemolyticus toxigénico estuaries where it’s been captured and one sample was
en muestras de camarón blanco (Litopenaeus vannamei; taken from a sale center in order to determine the possible
Boone, 1931), muestreando mensualmente en 3 esteros y presence of toxigenic Vibrio parahaemolyticus, from May to
un centro de venta, analizándolas mediante pruebas bio- December of 2012. Samples were analyzed by Biochemi-
químicas y moleculares, utilizando la Reacción en Cadena cal test and Polymerase Chain Reaction (PCR), they were
de la Polimerasa (PCR) para la identificación de especie y also tested for the specific an toxicological identification,
de toxicidad, empleando los oligos nucleótidos genéticos; using molecular oligo nucleotides markers tlh, tdh and trh.
tlh, tdh, y trh. Los casos positivos se contabilizaron me- The number of positives results were recorded to a table of
diante la técnica del Número Más Probable (NMP). Siete most probable number (MPN).The number of samples po-
de las 32 muestras, resultaron positivas a Vibrio parahae- sitive for V. parahaemolyticus, weren’t toxigenic and it was
molyticus, pero negativos a los trazadores de toxigenia. demonstrated that they were below the limit established
El NMP se encontró debajo del límite establecido en la in the Mexican Official Standard NOM-242-SSA1-2009. In
NOM-242-SSA1-2009, concluyendo que el camarón en el conclusion, the present study revealed that consumption of
período y sitios muestreados, no representaron un riesgo raw shrimp from the dates and sites sampled did not show
para contraer enfermedades gastrointestinales relaciona- to be a risk for human gastrointestinal diseases.
das con Vibrio parahaemolyticus.
KEY WORDS
*Autor corresponsal:
Méndez-Gómez, E. Instituto Tecnológico de Mazatlán, Calle Cosario 1 No. 203 Col. Urias C.P. 82070. Mazatlán, Sinaloa, México. Correo
electrónico: evaristo3@hotmail.com
aplicación de programas de vigilancia permanente, per- cuerpos de agua denominados; Sistema Lagunar Hui-
miten además de establecer medidas preventivas para zache-Caimanero (Sur del estado de Sinaloa); Laguna
proteger los sistemas productivos, el asegurar la cali- Pescadero y Laguna San Pedro (Norte del estado de
dad e inocuidad de los alimentos (CONAPESCA, 2010). Nayarit) efectuando muestreos mensuales de mayo a
diciembre del 2012, obteniendo un total de 32 muestras
A través de la COFEPRIS, se ha promovido la implemen- de camarón blanco (L. vannamei) silvestre estuarino y
tación de nuevas estrategias como la aplicación de bue- el cuarto se estableció en un centro de venta al menu-
nas prácticas sanitarias, orientadas a minimizar el impac- deo y medio mayoreo de camarón, ubicado en el centro
to de los agentes infecciosos, estrategias que plantean de la ciudad de Mazatlán, Sinaloa. Este último punto de
entre otras cosas, la vigilancia y detección preventiva, con muestreo se definió con el propósito de establecer la
fines de prevención y/o reducción de riesgos sanitarios. posible contaminación microbiológica post-captura de-
bido al manejo del camarón.
Desde 1988, en México se han empleado técnicas de vigi-
lancia, que aunque efectivas, hoy en día se consideran no Las muestras de camarón fueron colectadas directa-
prácticas, por la cantidad de tiempo que estas demandan mente en las lagunas de los esteros mediante atarra-
para obtener un resultado oportuno; dichas técnicas son los yeo (arte de pesca) con la ayuda de los pescadores de
análisis microbiológicos (pruebas bioquímicas) y serológicos, zona, aplicando rigurosamente el criterio de protección
y se encuentran establecidas en la Norma Oficial Mexicana de la muestra contra contaminación secundaria desde
NOM-242-SSA1-2009, sin embargo, con la aparición de téc- el momento de la captura, transporte y almacenaje, se-
nicas moleculares, basadas en la identificación de genes o ñaladas en la norma mexicana NOM-242-SSA1-2009.
segmentos específicos, mediante el empleo de la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es posible la Se recolectaron 200 g de camarón y se midieron los pa-
identificación de microorganismos de una manera eficiente, rámetros de salinidad y temperatura del agua en cada
rápida y económica (Aguirre y Lara, 2011; Castro, 2009). punto de muestreo. Las muestras de camarón fueron
preservadas para su traslado y siembra microbiológica
La técnica de PCR para la especie de V. parahaemo- en hielo, por un tiempo no mayor de 6 horas.
lyticus se basa en el uso de oligonucleótidos que se
identifican como tlh, tdh y trh (genes indicativos de la a) Preparación de la muestra
especie y toxicidad) los cuales están relacionados con
la proteína con actividad hemolítica (tdh) o la hemolisi- Se desarrolló la metodología establecida en
na termoestable directa relacionada (trh) (Ortega, 2011, la NOM-242-SSA1-2009-México, que consiste en colo-
Alam et al., 2009 y Cárdenas, 2009). car 200 g de la muestra de camarón en un vaso de li-
cuadora con 200 g de solución buffer de fosfatos (PBS)
El objetivo de esta investigación fue el evaluar la pre- estéril y con pH ajustado a 7.2, en una proporción 1:1,
sencia o ausencia V. parahaemolyticus en camarón procediendo a homogenizar la muestra durante 2 minu-
blanco (L. vannamei) silvestre y estuarino, capturado tos a alta velocidad. A partir de este homogenizado se
en el sur de Sinaloa y norte de Nayarit, y en muestras prepararon diluciones 10 -1, 10-2 y 10 -3.
obtenidas en un expendio de venta al menudeo y ma-
yoreo; empleando pruebas bioquímicas, la técnica de Las diluciones se sembraron por triplicado en tubos de
PCR con los oligos trazadores: tlh, tdh y trh con el fin ensaye estériles con 10 mL de Agua Peptonada Alcali-
de comparar la precisión entre ambas técnicas, y simul- na (APA), ajustado a un pH de 7, se incubaron a 35°C
táneamente se cuantificó al V. parahaemolyticus con la entre 18 a 24 h. Al término de la incubación, los tubos
técnica del número más probable. que desarrollaron turbidez, fueron considerados presun-
tamente positivos a V. parahaemolyticus, realizándose
una resiembra en placas con Agar Tiosulfato Citrato Bilis
Materiales y Métodos Sacarosa (TCBS), tomando 1 µL de cada dilución que se
extendió mediante la técnica de rastrillo. Las placas fue-
La presente investigación se realizó en cua- ron incubadas a 35°C entre 18 a 24 h y se procedió a con-
tro puntos de muestreo, tres de los cuales fueron los tabilizar las colonias sospechosas a V. parahaemolyticus.
b) Procesamiento de la muestra para la Identifica- controles; un control positivo con ADN de las cepas con-
ción de Vibrio parahaemolyticus trol de referencia V. parahaemolyticus CAIM 1772 propor-
cionada por el Centro de Investigación en Alimentación y
Análisis microbiológico: De las placas con Desarrollo (CIAD) unidad Mazatlán y un control negativo,
medio de cultivo TCBS, fueron seleccionadas 3 colo- sin los segmentos del ADN específico. En la (Figura 1)
nias sospechosas a V. parahaemolyticus para su aisla- se muestra la respuesta positiva al gel con los oligonu-
miento en medio Triptona con 3 % de NaCl, incubándo- cleótidos tlh, tdh y trh. La amplificación del ADN se llevó
las a 35°C entre 18 a 24 h. Se realizaron las siguientes a cabo en un termociclador Marca Bio Products, modelo
pruebas bioquímicas para la identificación de V. para- Select Cycler. Los ciclos y temperaturas empleadas en
haemolyticus: Oxidasa, Agar Hierro Triple Azúcar, Agar estas pruebas fueron los siguientes: Primero la muestra
Kliger, Agar Triptona, Agar para evaluar la capacidad de fue desnaturalizada a 94 °C por 10 min, enseguida se
Oxidación-Fermentación, Agar Gelatina, Agar Gelatina realizaron 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante
con 3 % de NaCl, y pruebas con los aminoácidos Orni- 1 min, seguida de un alineamiento a 72 °C por 2 min y por
tina, Lisina y Arginina (MacFaddin, 2003). último se efectuó una extensión final a 72 °C por 10 min.
• Aislamiento de ADN
Para realizar la identificación de los fragmentos de los ge- Se cuantificó la presencia de la bacteria V.
nes trazadores de especie y toxicidad se incluyeron dos Parahaemolyticus de acuerdo al procedimiento estable-
Tabla 1.
Primers utilizados para V. parahaemolyticus, propuestos por
Gómez-Gil y Lizárraga-Partida (2011).
cido para la técnica del NMP descrita en la NOM-224- En esta investigación se registraron los pa-
SSA1-2009 con modificaciones propuestas por Gómez- rámetros de salinidad y temperatura en cada una de las
Gil y Lizárraga-Partida, (2011), la cual consiste en zonas muestreadas, observándose que las temperaturas
contabilizar los resultados positivos a la PCR en los más altas se registraron durante los meses de mayo, junio,
12 tubos de las cuatro diluciones y tres repeticiones julio y agosto de 29.9 a 34.5 °C. En lo que se refiere a la
y confrontarlos en la tabla estadística de probabilidad salinidad, las más altas se presentaron durante los meses
correspondiente a las diluciones utilizadas. de mayo y junio variando desde los 34.5 a los 84 g L-1,
con lo cual se observa que estos parámetros (temperatura
D) Análisis Estadístico y salinidad) pueden estar involucrados en el desarrollo de
esta bacteria, ya que durante estos meses se presentó la
Los datos obtenidos fueron analizados em- bacteria de V. parahaemolyticus en las muestras analiza-
pleando la herramienta estadística denominada Prueba das de camarón blanco (L. vannamei).
de bondad de ajuste (Tabla de Contingencia), ya que
los datos a analizar corresponden a datos no paramé- Nuestros resultados coinciden con lo reportado por la
tricos. Para ello se empleó una matriz de 2x4; donde el FAO (2003), Dabanach (2009); Rodríguez et al., (2010)
2 corresponde a las dos metodologías empleadas y el y Gavilán y Martínez (2011) quienes mencionan que las
4 a las cuatro estaciones de muestreo. La fórmula em- infecciones por V. parahaemolyticus se relacionan con
pleada para este análisis fue la siguiente: los cambios físicos, químicos y biológicos del ambiente,
que van a modular su presencia y abundancia median-
te un equilibrio entre crecimiento y depredación, ya que
las variaciones en las condiciones ambientales y ecoló-
gicas del medio, repercuten sobre la dinámica biológica
de estos microorganismos, favoreciendo o limitando su
El valor resultante X2 se llevó a la tabla de distribución de abundancia y promoviendo la aparición de infecciones,
Chi cuadrada empleando un α = 0.05. cuando las condiciones ambientales permiten el desarro-
llo de estos organismos en altas cantidades en alimentos
marinos de consumo. El número de V. parahaemolyticus
Resultados y Discusión aumenta a medida que la temperatura del agua se eleva,
lo cual explica, en parte, el aumento de casos de intoxi-
a) Temperatura y Salinidad cación en los meses de verano (Figura 2).
Se aislaron un total de 384 colonias sospe- Los resultados señalaron la presencia de V. para-
chosas a V. parahaemolyticus de las muestras analiza- haemolyticus en las muestras correspondientes a los meses
das, de las cuales 43 resultaron positivas para V. pa- de mayo, junio y julio del 2012, identificada con el marcador
rahaemolyticus; registrándose durante el mes de mayo tlh (Tabla 3). Por otra parte, los oligonucleótidos específicos
en las cuatro estaciones muestreadas, mientras que tdh y trh, empleados para determinar la toxicidad de la bac-
en el mes de junio, se detectó solamente en la Laguna teria, fueron negativos para todas las muestras (Figura 3),
de Pescadero y Laguna de San Pedro; en el Sistema coincidiendo con los resultados reportados por Cabanillas et
Lagunar Huizache-Caimanero, solamente la muestra al., (2006), pero contrario a lo que reportaron Gómez et al.,
del mes de julio resulto positiva (Tabla 2). Los resul- (2006) en muestras obtenidas en la misma zona que este tra-
tados de esta investigación difieren con los obtenidos bajo, quienes detectaron la bacteria durante el mes de Mayo
por Aguilar (2007), quien realizó estudios en el sistema del 2006 y positiva al gen tdh (implicado en la toxigenia), y le
lagunar Huizache-Caimanero y no detectó la presencia atribuyeron el primer brote de gastroenteritis por V. parahae-
de V. parahaemolyticus. molyticus en el sur de Sinaloa y Norte de Nayarit.
Tabla 2.
Respuesta a la evaluación de la presencia de V. parahaemolyticus en
las muestras de camarón blanco L. vannamei empleando el método mi-
crobiológico (Pruebas bioquímicas).
Tabla 3.
Resultados de los marcadores utilizados en la detección de
V. parahaemolyticus por la técnica de PCR.
a) b)
c) d)
Figura 3. Respuesta Luminiscente a la luz ultravioleta de geles de agarosa
positivos a tlh (indicador de especie) en las muestras colectadas el mes de
mayo: a) Huizache-Caimanero, b) Laguna de San Pedro, c) Laguna Pescador
y d) Centro de venta, empleando la cepa CAIM 1772 como control positivo.
Tabla 4.
Resultados de la cuantificación de V. parahaemolyticus por la
técnica del NMP descrita en la NOM-224-SSA1-2009.
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Como citar este artículo: Rodríguez-Camacho, J.C., Méndez-Gómez, E., Rivas-Montaño, A.M.,
Cortés-Ruiz, J.A. (2014). Evaluación de la presencia de Vibrio parahaemolyticus en camarón blan-
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