UFPS Biología Molecular 2018

TIPOS DE ELECTROFORESIS PARA ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS

Rosa María Valero 1610140, Jhon Jairo Tobar 1610925
Universidad Francisco de Paula Santander
Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente
Ingeniería Biotecnológica
Abril, 2018

ELECTROFORESIS

En la mayoría de las biomoleculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del

medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un

campo eléctrico.

Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en

disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica

fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos.

Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad

constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al

avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

Ph.D. Liliana Yanet Suarez Contreras.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

 De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la

disolución y se determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera

con el disolvente.

 Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran

a través de un disolvente, utilizando además un medio que da soporte a éste. En

este caso no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es

separar los componentes de la muestra.

 Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra

continuamente a lo largo del proceso.

Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones

mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o

similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por

lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la

muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por

polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las

moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como

consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta

relevancia en la separación.

Electroforesis
 Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

 Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja

tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,

respectivamente, los componentes separados.

 Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se

hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

 Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar).

Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta

porosidad.

 Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de

acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se

consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

 Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

 Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo:

laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las proteínas,

desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS.

Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a

su longitud en aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS

que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad

electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.

Electroforesis
Modos de disposición del soporte en la electroforesis.

 Horizontal

El papel para aminoácidos u otras moléculas pequeñas; en soportes similares (especialmente,

acetato de celulosa), para proteínas.

En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos. Casi

siempre el tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar

la corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.

El soporte se impregna por capilaridad de disolución tampón, que disuelve la muestra y mantiene

el contacto eléctrico.

Se aplica la muestra depositándola (con pipeta o un aplicador específico) como una gota sobre el

soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel.

 Vertical

Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se desliza),

para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.

El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido entre 2

placas rectangulares.

Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o

compartimentos del ánodo y cátodo.

Electroforesis
La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.

En cuanto a la composición del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel)

y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente diferente).

Tinción de proteínas y de ácidos nucleicos

Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las proteínas o los ácidos

nucleicos.

 Tinción de proteínas

En el primer caso suelen ser colorantes orgánicos que interaccionan con las proteínas de forma

poco selectiva, principalmente electrostática. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro

amido, rojo Ponceau.

 Tinción de ácidos nucleicos

Para los ácidos nucleicos se usa el azul de metileno o, más frecuentemente, compuestos

fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio. Un compuesto intercalante es aquél que

se introduce entre los pares de bases apilados del DNA.

Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se

espera a que aquél se impregne y así el colorante se una a las moléculas separadas en el gel. Tras

lavar el gel para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se observa, fotografía o

cuantifica mediante densitometría.

Electroforesis
Ensayo enzimático

Si entre las moléculas separadas hay una enzima, se puede detectar añadiendo sus sustratos

(naturales o sintéticos) y sus cofactores, y detectando la aparición del producto, generalmente

coloreado.

Autorradiografía

Tanto proteínas como ácidos nucleicos pueden marcarse isotópicamente previamente a la

electroforesis, en cuyo caso la detección se hace mediante autorradiografía del gel.

Inmunoensayo (Western)

En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la detección selectiva del componente de

interés (proteína o grupo marcador unido químicamente a la proteína o al ácido nucleico antes de

la electroforesis). La permeabilidad de los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo

que se hace una transferencia de las moléculas separadas en el gel hacia una membrana de

nitrocelulosa o de nailon, la cual se somete luego a la disolución que contiene el anticuerpo. Los

detalles de esta técnica de inmunotransferencia o ensayo Western blot se tratarán en un tema

posterior.

Electroforesis
Detección de ácidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)

Las moléculas con una secuencia determinada de nucleótidos se pueden detectar mediante

hibridación con sondas específicas, pequeñas moléculas de ácido nucleico monocatenario

(oligonucleótidos) con la secuencia complementaria a la buscada y marcadas con un isótopo

radiactivo, un grupo fluorescente, etc. Para llevar a cabo con éxito la hibridación se requiere

también la transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Los detalles de

estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot para RNA) se estudian en un tema

posterior.

Técnicas especiales

 Isoelectroenfoque

(También se llama enfoque isoeléctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de

electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura.

Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK

diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se

encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH

local es igual al punto isoeléctrico de la molécula muestra y, en consecuencia, ésta detiene su

avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separación de los componentes de la

muestra de acuerdo con su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la

geometría del gradiente de pH fijado al gel.

Electroforesis
  Electroforesis bidimensional

Tras realizar una primera separación su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en

dirección perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilíndrico

estrecho que luego se coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen así mapas

complejos de bandas, muy característicos de cada muestra, cuya utilidad principal es la

comparación con el obtenido de otra muestra similar pero conocida.

 Electroforesis de campo pulsante

Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver

(separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer

lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa

que requerirían (inferior al 0,4%). Además, las moléculas de DNA, que adoptan una

conformación más o menos globular, poseen un tamaño excesivamente grande para atravesar los

poros del gel y no se separan en función de su tamaño. Para solventar este problema se ha ideado

una modificación de la técnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado,

pulsed-field gel electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera

periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado, activando alternativamente dos pares

de electrodos. El frecuente cambio de dirección del campo eléctrico consigue que las moléculas

se desplieguen y avancen a través de los poros en conformación extendida. A mayor tamaño, se

reorientan con más dificultad, por lo que avanzan más despacio.

Electroforesis
 BIBLIOGRAFIA

 Lopez, C. (2014) Electroforesis vertical, horizontal. Recuerado

https://matematicas.udea.edu.co-c.lopez/cnq533/electroforesis-vertical-horizontal.pdf.

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https://www.math.chalmers.se/math/dna/research-electrophoresis/pdf.

 Gustafsson. J, Blomerg. A Rudemo M (2007) manual de electroforesis. Recuperado

https://www.manual-online.net /molbil /DNA /dna-electrophoresis.htm.

 Roe. B, (2012) Polyacrilamide gel electroforesis. Recuperdo https://archive.uwcm.ac.uK

/uwc /mm /page.htm.sds-bact.

Electroforesis
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