17 de agosto 2020

Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación espectrométrica

de biomoléculas
​Laura Valentina Buendia​ ; ​Michelle Ramirez Buitrago
Estudiantes de pregrado ingeniería química. Universidad de la Sabana. Chía, Colombia

Abstract

In this study, spectrophotometry is validated as an appropriate tool for the quantification of

total polyphenols present in yerba mate seed and their principals characteristics, via the Folin-
Collin method, using concepts such as absorbance and concentration for the construction of a
calibration curve, a technique that will allow to find the concentration of polyphenols in the
sample.
About polyphenols, these compounds in recent years have become known for their
antioxidant capabilities and the benefits these bring to the cardiovascular system. Its great
importance is due to the fact that cardiovascular diseases are the main cause of death actuality
(Quiñones, 2012). The principal objective of this study is to test by means of
spectrophotometry the high concentrations of polyphenols in the yerba mate, since these
compounds are found in everyday food but in particular to show how the polyphenols give
most of this antioxidant characteristics to this plant. At the same time different extraction
methods, ultrasound and filtering, were proven expecting much better ultrasound results, still
it is exposed as other factors can affect this extraction.

Key words: Spectrophotometry, Folin-Colin methods, calibration curve, polyphenols,

extraction methods, ultrasound.

Introducción

De acuerdo con los avances que se han ido presentado en el estudio de las biomoléculas
mediante algunas técnicas, se puede resaltar el principio de la espectroscopía que aprovecha
la capacidad que tienen las moléculas para absorber radiaciones, gracias a esta técnica
analítica se puede realizar la caracterización y la cuantificación de biomoléculas empleando
diferentes reactivos que van a reaccionar con el compuesto que se desea analizar formando
una coloración la cual se podrá medir espectrofotométricamente en cierto intervalo de
longitud de onda.

Así mismo, es muy importante tener claros algunos conceptos ya que son claves para esta
práctica de laboratorio debido a que facilitan la realización de la curva de calibración y la
determinación cuantitativa y cualitativa de los polifenoles en una muestra problema, entre
ellos podemos encontrar la transmitancia, absorbancia, el coeficiente de extinción molar, la
ley de Lambert-Beer , los polifenoles y el reactivo ​Follin-Ciocalteau.

La transmitancia (T) es la relación entre la intensidad transmitida al pasar por la muestra, I​t, ​y
la intensidad incidente, I​o ​. Se expresa en forma de porcentaje de la siguiente manera:

% T = I​t/​I​o ​x 100 ​(1)

La absorbancia (A) indica la cantidad de luz absorbida por la muestra, la cual depende de la
distancia que atraviesa la luz a través de la solución del cromóforo y la concentración de éste,
representada de la siguiente manera:

A = log 1/T = -log T = -log I​t​/ I​o​ ​(2)

El coeficiente de extinción molar (ε) es una constante de proporcionalidad que es específica

de cada cromóforo, sus unidades son M​-1​cm​-1​.(Crowder, 1973, 2078)

La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre la absorbancia de luz monocromática y la

concentración de un cromóforo cuando se encuentra en una solución (Garcia,2012), donde A
es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción molar en unidades de M​-1​cm​-1​, C es la
concentración del cromóforo en unidades molares y l es la longitud de onda emitida en
unidades de cm.

A = ​ε​·c·l ​ ​(3)

Por otro lado, los polifenoles son metabolitos secundarios que pueden ser clasificados como
flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos y lignanos en función de su estructura química
(Matic, 2017, p.1795), cabe resaltar que la cuantificación de polifenoles se puede llevar a
cabo a partir de distintas técnicas, una de estas es por espectrofotometría, usando el método
de Folin-Collin (FC), el cual consiste en un ensayo de un reactivo estable, sensible a la luz y a
agentes reductores, generando un mecanismo de óxido reducción, donde el grupo fenólico es
oxidado y el ión metálico reducido (Folin, 1927, p.627), sin embargo este método no es
específico y usualmente se usa para evaluar el total de polifenoles dentro de una muestra
vegetal (Matic, 2017, p.1795). Finalmente los polifenoles representan un papel importante
para mantener la salud, al ser parte de los antioxidantes, ayudan a proteger las células del
cuerpo del daño de los radicales libres, por lo que tienen un papel importante en la
prevención de enfermedades cardiovasculares, cáncer u otras patologías (Quiñones, 2012).
Metodología

Determinación de la humedad
Para la extracción de los polifenoles fue necesario preparar una muestra
vegetal, en este caso fue yerba mate, aproximadamente dos gramos de hojas de
esta. El procedimiento para la determinación de la humedad consta de un
tiempo de secado de la muestra en una estufa a 60°C por lo menos de un día.
Al cumplirse el tiempo requerido, la muestra fue retirada y se llevó a
temperatura ambiente, donde nuevamente se peso para llevar a cabo el cálculo
de la humedad.

Extracción de los polifenoles

Posteriormente al pesaje de 5 gramos de yerba mate cortada finamente se

transfiere la muestra a un tubo Falcón de 50 ml protegido de la Luz con papel
aluminio, De manera seguida se adicionan veinte mililitros de etanol y se agita
en vortex cinco veces durante intervalos de cuatro minutos. Se filtra en
algodón y se recoge el sobrenadante (líquido) en un matraz aforado de 25 ml
y finalmente se lleva al volumen con etanol, siendo la muestra problema.

Efecto ultrasonido
Se repite el procedimiento anterior pero en este caso se introduce el tubo
Falcón en un baño ultrasonido durante Intervalos de 10 segundos cuatro veces.

Cuantificación de polifenoles
Realización de la curva de calibración
Se preparan en tubos eppendorf de 100 ​µL,​cada uno de los diferentes
estándares de ácido gálico( 5, 10, 20, 40, 80, 160 ​µg/ml) en etanol a partir de
un estándar fresco de 1 mg/ml.
Cuantificación
Se adicionan 20 ​µl de cada estándar a cada pozo.Posteriormente se adicionan
100 ​µl del reactivo FC diluido en agua y 75 ​µl de carbonato de sodio, se
protege la placa de la luz (pues el reactivo es sensible a esta) y finalmente se
determina la absorbancia a 750 nm usando el lector de microplacas.

Resultados y Cálculos
 1. Determinación de la humedad:

Para determinar el peso de la muestra húmeda y de la muestra seca se realizó de la siguiente

manera:

Peso muestra húmeda: Peso cápsula con material húmedo (gr) - Peso cápsula vacía (gr)
Peso muestra seca: Peso cápsula con material seco (gr) - Peso cápsula vacía (gr)

Al tener los pesos, se determinó el porcentaje de humedad:

% de humedad = * 100%

% de humedad = * 100%

% de humedad = 39,6%

Tabla 1. Determinación de la humedad de Yerba Mate.

Peso muestra húmeda (gr) 2,7498

Peso muestra seca (gr) 1,6618

% de humedad 39,6%

2. Extracción de los polifenoles:

Tabla 2. Datos para realización de la curva de calibración (Patrón).

Volumen tomado patrón o Concentración (ug/mL) Volumen tomado etanol

estándar (uL) (uL)

Dilución # 1 :​ 0,5 5,0 99,5

Dilución # 2 : ​ 1,0 10,0 99

Dilución # 3 :​ 2,0 20,0 98

Dilución # 4 :​ 4,0 40,1 96

Dilución # 5 : ​ 8,0 80,2 92

 Dilución # 6 :​ 16,0 160,3 84

Volumen final cada dilución (100 uL)

Volumen final reacción colorimétrica (195 uL)

Se determinó la concentración patrón o estándar solución ácido gálico (mg/mL):

Masa de ácido gálico pesada (mg): 10,02

Volumen final solución ácido gálico (mL): ​10

C​1 ​=

C​1 =
​ 1,002 mg/mL

C​1 =
​ 1002 ug/mL

Para determinar la concentración de cada dilución, se realizó con la ecuación C​1​V​1 (Solución
​
patrón) = C​2​V​2 ​(Solución aforada), donde C​1 ​es la concentración patrón de la solución de
ácido gálico, V​1 ​es el volumen tomado de patrón, V​2 ​es el volumen final de cada dilución y C​2
es la concentración que vamos a determinar.
Posteriormente, para determinar el volumen tomado de etanol de cada dilución, se realizó de
la siguiente manera:

Volumen tomado de etanol (uL) = Volumen final de cada dilución (uL) – Volumen tomado
de patrón (uL).

Tabla 3. Absorbancias sin el blanco.

Diluciones de la solución patrón Absorbancia (750 nm)

Blanco 0,062

1 0,009

2 0,037

3 0,079

4 0,171
 5 0,303

6 0,297

Figura 1. Curva de calibración.

Se determinó el coeficiente de extinción molar con la pendiente de la ecuación de la recta

pasándola a las unidades correctas:

m@ε

0,0039 = 663,468 M​-1 ​cm​-1

Tabla 4. Absorbancias en función del ultrasonido sin el blanco.

Absorbancia (750 nm)

Blanco: ​0,049 Sin ultrasonido Con ultrasonido

original 0,246 0,365

 Duplicado 0,242 0,338

Promedio 0,367 0,3515

Con la ecuación de la recta se determinó la concentración en función del ultrasonido,

teniendo en cuenta que y es el promedio de la absorbancia en función del ultrasonido y x es la
concentración que queremos determinar:

y = mx + b
x=

Sin ultrasonido:

x=

x = 94,36 ug/mL

x = 0,09436 mg/mL

Con ultrasonido:

x=

x = 90,38 ug/mL

x = 0,09038 mg/mL

Tabla 5. Concentración polifenoles promedio solución 25mL con y sin ultrasonido.

Concentración polifenoles promedio solución 25 mL aforada sin 94,36

ultrasonido (ug/mL)

Concentración polifenoles promedio solución 25 mL aforada con 90,38

ultrasonido (ug/mL)

3. Cuantificación de polifenoles:
Tabla 6. Datos de la muestra con y sin ultrasonido.

Muestra tomada para sin ultrasonido (gr) 2,0654

Volumen inicial de etanol (mL) 20

Volumen aforado con etanol (mL) 25

Muestra tomada para con ultrasonido (gr) 1,9803

Volumen inicial de etanol (mL) 20

Volumen aforado con etanol (mL) 25

Volumen tomado muestra sin ultrasonido

para colorimetría (original y duplicado) (uL) 20

Volumen final muestra sin ultrasonido para

colorimetría (original y duplicado) (uL) 195

Volumen tomado muestra con ultrasonido

para colorimetría (original y duplicado) (uL) 20

Volumen final muestra sin ultrasonido para

colorimetría (original y duplicado) (uL) 195

Se determinó la cantidad de polifenoles por medio de la concentración concentración en

función del ultrasonido y el volumen aforado con etanol. Posteriormente, se determinó los gr
de hoja seca, usando el peso de la muestra usada (con y sin ultrasonido) y el porcentaje de
humedad anteriormente calculado para posteriormente hacer la relación de mg polifenoles/g
de hoja seca y mg polifenoles/g de hoja húmeda.

Cantidad de mg de polifenoles

​Sin ultrasonido:

(0,09436 mg/mL) * (25 mL) = 2,359 mg

Con ultrasonido:

(​0,09038 mg/mL) * (25 mL) = 2,2595 mg

gr de hoja seca

Sin ultrasonido:

2,0654 gr * = 0,8179 gr

2,0654 gr - 0,8179 gr = 1,2475 gr

Con ultrasonido:

1,9803 gr * = 0,7842 gr

1,9803 gr - 0,7842 gr = 1,1961 gr

Relación mg polifenoles/g de hoja seca

Sin ultrasonido:

= 1,891

Con ultrasonido:

= 1,889

Relación mg polifenoles/g de hoja húmeda

Sin ultrasonido:

= 1,142

Con ultrasonido:

= 1,141

Tabla 7. Cuantificación de polifenoles.

 Cantidad mg polifenoles/ g mg polifenoles/ g
polifenoles (mg) hoja seca hoja húmeda

Muestra sin 2,359 1,891 1,142

ultrasonido

Muestra con 2,2595 1,141

ultrasonido 1,889

Análisis y discusión

En primer lugar, es necesario aclarar que para la cuantificación de polifenoles se hizo uso del
método Folin-Colin, el cual consiste en una reacción de óxido-reducción entre los
compuestos fenólicos de la muestra con el reactivo a un pH básico,generando una coloración
azul que puede ser determinada espectrofotométricamente cerca de 765 nm (Garcia, 2015),
como asegura Singleton (2004) es gracias a que la reacción sea independiente, cualitativa y
predecible que el análisis de una mezcla de fenoles se puede calcular en términos de
cualquier estándar​.
Se realizó una curva de calibración con el fin de determinar la concentración en la muestra
vegetal, en este caso yerba mate. Como se puede observar en la figura 1, la curva está
determinada por la concentración y la absorbancia, como se alcanza a visualizar en esta
figura se determinó una ecuación de la recta, donde en este caso la variable dependiente (y)
es la absorbancia, mientras que la dependiente (x) es la concentración. Cabe aclarar que se
trató como blanco a una muestra solo de solvente, ácido gálico, a la cual se le aplicó el mismo
tratamiento que a las demás muestras, sin embargo al momento de realizar la curva se decidió
descartar este dato, ya que no cumple con la ley de Lambert-Beer, afectando de esta manera
la linealidad de la curva. Adicionalmente como se puede observar en la tabla 3 fue necesario
restar el valor de la absorbancia del blanco pues este representa, como se ha mencionado
antes, el disolvente usado.
Es necesario señalar que para obtener un coeficiente de determinación aceptable y mejor
ajustado al modelo de datos fue preciso retirar el dato del extremo inferior, generandonos así
un valor de 0,9927. Es así como a partir de la gráfica y de la ecuación de la recta se determinó
el valor de la concentración de los polifenoles. Al comparar con la literatura el R​2 ​(0,9994) da
un valor muy cercano al encontrado experimentalmente, así mismo, se puede observar que
utilizaron el mismo método para determinar el valor de concentración de los polifenoles
(Mereski, 2018). ​Un aspecto importante a señalar es que la técnica de Folin-Collin nos
permite evaluar el total de polifenoles dentro de una muestra, sin embargo no es muy
específica al respecto ​(Matic, 2017).
Con el propósito de entender cuál método fue más eficiente para la extracción de polifenoles
fue necesario realizar el mismo procedimiento con y sin ultrasonido. Teniendo en cuenta la
ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración se determinó el valor de
concentración de polifenoles con cada método, el valor de concentración obtenido se puede
observar en la tabla 5. Dichos resultados arrojaron que existe una mayor concentración de
compuestos sin ultrasonido, sin embargo esto se puede considerar como erróneo debido a que
comparando, la técnica de ultrasonido es mucho más eficiente, ya que favorece la ruptura de
la pared celular, la permeabilidad del tejido y el fraccionamiento de los tejidos de celulosa
facilitando la difusión del disolvente dentro de la parte inerte del material vegetal y así mismo
la liberación de mayor cantidad de la sustancia de interés (Rodriguez, 2014), de esta manera
se puede entender que en la toma del ultrasonido pudo existir alguna interferencia. Es así que
dicho resultado provocó que la relación de polifenoles en gramo de hoja seca y en gramo de
hoja húmeda fuese más alta en la muestra sin ultrasonido.
Según Merski (2018) la cantidad de polifenoles en yerba mate se encuentra en un rango entre
0,2165 hasta 0,0281 mg/g, donde al comparar con los resultados expuestos en la tabla 5 se
pueden deducir dos aspectos, el primero es que sin ultrasonido, la cantidad de polifenoles es
aún mayor que el expuesto en la literatura, sin embargo los factores de dónde procede la
muestra son importantes tenerlos en cuenta, temperatura, frescura, pH, entre otros, afectan la
cantidad de polifenoles en la muestra. Por ejemplo, una hoja fresca de yerba mate contiene
una mayor cantidad de compuestos fenólicos, mientras que en hojas deshidratadas no cuenta
con una considerable cantidad de estos (Mereski, 2018). El segundo aspecto importante es la
cantidad de polifenoles obtenidos en ambos casos (tabla 5) que comparados a la literatura son
las cantidades esperadas y aceptables de compuestos fenólicos en yerba mate en buenas
condiciones.
Por otro lado, es necesario justificar el resultado expresado en la tabla 1, donde se puede
observar el porcentaje de humedad de yerba mate en la muestra tomada, este dato es de gran
significancia ya que nos brinda información a cerca de la extracción de polifenoles pues es
así como se conoce el estado de la muestra, es decir frente a una muestra con un porcentaje
de humedad como el expuesto en la tabla 1 se espera obtener una alta concentración de
polifenoles ya que como se ha mencionado anteriormente los compuestos fenólicos se ven
afectados por la humedad de la muestra y la temperatura a la que se encuentre (​Mereski,
2018), un resultado similar fue encontrado por Nawas (2005), donde observó que la
temperatura como la composición de la muestra tiene un gran efecto en el rendimiento de la
extracción de las sustancias fenólicas.
Finalmente, los resultados obtenidos y expuestos tanto en la tabla 5 como en la 7 son lógicos,
teniendo en cuenta que la yerba mate es reconocida por sus altas capacidades antioxidantes y
efectos positivos en el sistema cardiovascular, es acorde que esta contenga una alta
concentración de polifenoles (Deladino, 2014) siendo una de las más importantes
características de los compuestos fenólicos sobre el sistema biológico su capacidad
antioxidante (Quiñones,2012), sin embargo cabe resaltar que compuestos bioactivos como el
ácido clorogénico,el ácido cafeico y la cafeína, contenidos en la yerba mate también aportan a
su capacidad antioxidante (Anesini, 2011).

Conclusiones

● Se logró identificar dos maneras para determinar la concentración de polifenoles en

yerba mate, por medio del coeficiente de extinción molar y la relación entre los
miligramos de polifenoles y los gramos de hoja seca y húmeda, siguiendo la ley de
Lambert-Beer y la ecuación de la recta consecuencia de la construcción de la curva
de calibración.
● Asimismo fue posible comparar técnicas de extracción como lo fue con y sin
ultrasonido, además se demostró que el ultrasonido, es una técnica óptima y confiable
sin embargo se puede ver afectado por factores externos modificando los resultados.
● Finalmente, fue posible analizar la concentración de polifenoles en yerba mate, siendo
la concentración resultante un valor esperado, primero por las propiedades con las que
cuenta esta planta lo que nos dió desde un principio una expectativa de altas
concentraciones y además se pudo comprobar la alta cantidad de polifenoles dentro de
alimentos cotidianos.

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