Electroforesis en gel:

Proteínas en suero
I. Técnica
SEBIA y sus distribuidores alrededor de todo el
mundo

UK Belgium
Germany
USA Italy
Spain
China

Brasil

80 COUNTRIES IN 2009
Una empresa especializada en electroforesis de
proteínas para el diagnóstico clínico desde
1967
 Proteinas

• Las proteínas son macromoleculas compuestas por aminoacidos.

• Las proteínas pueden tener carga positiva o negativa (de acuerdo a la composición
del aa y al pH del ambiente)

• Las proteínas son los principales componentes de nuestro cuerpo y desempeñan

diversas funciones (estructurales , transporte , regulación, defensa …)

• En el diagnóstico clínico, el análisis de proteínas se puede realizar en diversos

líquidos biológicos: sangre (suero o GR), orina, Fluido cerebroespinal (CSF)…
Carga eléctrica de las proteínas
El pH determina la carga de las proteínas.

Las proteínas son moléculas anfotéricas (Tienen grupos que pueden

estar cargados positivamente y grupos que pueden estar cargados
negativamente)

 pH alcalino, moleculas están cargadas negativamente y migran de

cátodo (-) a ánodo (+).
 pH ácido, moleculas están cargadas positivamente y migran de
ánodo (+) a cátodo (-).

Como la alcalinidad de un buffer aumenta, la fuerza de atracción de las

moléculas al ánodo también aumenta.
Principio de la electrophoresis de proteínas

• Electroforesis es la separación de moléculas cargadas en un campo eléctrico.

• Las moléculas migran hacia el ánodo (+) o catodo (–) de acuerdo a la carga.

• Las proteínas pueden ser separadas usando un buffer de medio sólido

(electroforesis de agarosa) o usando solo fase líquida (electrophoresis capilar)
 Automated
SEBIA systems for MINICAP/CAPILLARYS 2
electrophoresis

Semi-automated
HYDRASYS/HYDRASYS 2

Manual
2001->2010
K20 System
1993->2008
Capillary electrophoresis

1986 Electrophoresis on
agarose gel
 Principle of agarose electrophoresis

---
--
---
- ---
+-
+
Cathode --
0 Anode
----
--

Application point

In the majority of methods, alkaline buffer is used. In these conditions,

proteins are negatively charged and migrate towards the anode
 Ejemplos de diferentes métodos de
coloración

Serum protein Lipoprotein Isoenzymes of LDH

electrophoresis electrophoresis (chromogenic
(amidoblack stain) (Black sudan Stain) substrate)
 SEBIA electrophoresis
Proteins product range Immunoglobulins

HYDRAGEL 7 PROTEIN HYDRASYS Screening Typing

HYDRAGEL 15/30 PROTEIN
HYDRAGEL 54 PROTEIN
HYDRAGEL 7 PROTEIN b1 b2 HYDRAGEL 1 IF
HYDRAGEL 15/30 PROTEIN b1 b2 HYDRAGEL 6 IF PENTA HYDRAGEL 2 IF
HYDRAGEL 54 b1 b2 HYDRAGEL 12 IF PENTA HYDRAGEL 4 IF
HYDRAGEL 7 HR HYDRAGEL 9 IF
HYDRAGEL 15 HR HYDRAGEL 2IF/BJ HR
HYDRAGEL 5 PROTEINURIE HYDRAGEL 1 BENCE JONES
HYDRAGEL 2 BENCE JONES
Lipoproteins HYDRAGEL 4 BENCE JONES
HYDRAGEL 2 URINE PROFILE
HYDRAGEL 4 URINE PROFILE
Qualitative techniques Quantitative techniques
Hyperlipemia typing + Lp(a) screening
HYDRAGEL 3 CSF
HYDRAGEL 6 CSF
HYDRAGEL 3 CSF ISOFOCUSING
HYDRAGEL 7 LDL/HDL CHOL DIRECT HYDRAGEL 9 CSF ISOFOCUSING
HYDRAGEL 7 LIPO
HYDRAGEL 15/30 LDL/HDL CHOL DIRECT
HYDRAGEL 15/30 LIPO
HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a)
HYDRAGEL 15/30 LIPO + Lp(a)
Iso-enzymes

Hemoglobins

HYDRAGEL 7 ISO-LDH HYDRAGEL 7 ISO-PAL

Glycated HYDRAGEL 15/30 ISO-LDH HYDRAGEL 15 ISO-PAL
Hemoglobinopathies
Thalassemia hemoglobins
HYDRAGEL 7 ISO-CK
HYDRAGEL 15/30 ISO-CK
HYDRAGEL 7 Hb HYDRAGEL 7 HbA1c Others
HYDRAGEL 15 Hb HYDRAGEL 7 HYDRAGEL 15 HbA1c
Hb acid HYDRAGEL 15 Hb acid

HYDRAGEL A1AT HYDRAGEL B2 Transferrin

 Ensayos cuantitativos y cualitativos en
Hydrasys
Ensayos cuantitativos Ensayos cualitativos

Hydragel protein Hydragel HR (Urine, CSF in HR2/3)

Hydragel b1b2 Hydragel Proteinurie
Hydragel HR (serum in HR1) Hydragel acid Hemoglobin
Hydragel Penta IF Hydragel IF
Hydragel lipoprotein Hydragel BJ
Hydragel Lipoprotein+Lp(a) Hydragel UP
Hydragel Hemoglobin Hydragel CSF
Hydragel LDL/HDL direct Hydragel CSF isofocusing
Hydragel iso-pal Hydragel A1AT
Hydragel iso-CK
Hydragel iso-LDH
Hydragel LDL/HDL direct
 Electroforesis en el campo Clínico

 Los patrones electroforéticos obtenidos se interpretan en

términos de anomalías cualitativas y/o cuantitativas.

 Estas anormalidades son el reflejo de diversas condiciones

fisiológicas y patológicas, por tanto proporcionan información
importante para sugerir o confirmer el diagnóstico de la
enfermedad.

 Como las anormalidades pueden ser menores al comienzo de la

enfermedad, es necesario elegir un método electroforético
sensible con una resolución adecuada.
It allows to screen a broad spectrum of diseases

 Hydragel Protein: patologías inflamatorias, nefróticas y cirróticas, myeloma.

 Hydragel IF : myeloma, leukemia, enfermedades autoimmunes
 Hydragel Hb : enfermedad de la célula falciforme (HbS), talasemia…
 Hydragel LIPO, Chol LDL/HDL: enfermedades cardiovasculares (LDL, Chol-
LDL)
 Hydragel CSF, Iso-CSF: esclerosis multiple, meningitis crónica, neurosífilis (
intrathecal Ig synthesis)
Manual and Automated Sebia
GEL electrophoretic Systems

Hydrasys
Hydrasys 2 gel Scan
K20
 Posicionamiento del gel en la cámara

 Sistema Manual

El gel debe posicionarse correctamente en la cámara de tal manera de

evitar la evaporación que conduce a las distorsiones de la migración.
Un gel posicionado hacia arriba en la cámara electroforética conduce a
una alta deshidratación.
Un gel posicionado hacia abajo reduce la deshidratación.

 Sistema Automatizado:

Sistema Hydrasys evita la deshidratación del gel manteniendo la

temperature a 20°C (efecto por Peltier) durante la migración.
El gel debe colcocarse en la cámara de migración del Hydrasys con una
gota de agua extendiendo uniformemente por debajo del plástico del gel
para una regulación eficaz del calor.
Preparación del buffer

 Sistema Manual:
Buffer debe prepararse con una buena calidad de agua
(destilada o desionizada).
La calidad pobre de agua puede significativamente
incrementar la fuerza iónica del buffer y causar
sobrecalentamiento, causando distorsiones y migraciones
cortas.

 Sistema automatizado:
Con el equipo Hydrasys, el buffer viene como esponja listo
para usar. Por lo tanto, no require reconstituirlo.
Volumen buffer
La fuerza del campo eléctrico (potencial gradiente) esta definida como:
E = V/L
(V = diferencia potencial entre los 2 electrodos, L = distancia entre los 2
electrodos).

 Sistema Manual:
La geometría de las cámaras de Sebia es tal que cuando el volume del
buffer es mayor que el volume prescrito, la distancia “L” se hace más corta
y la velocidad de migración más rápida (distancia de migración más larga).
Volúmenes de buffer más bajos, la distancia “L” se hace más larga y la
distancia de migración es más corta.

 Sistema Automatizado:
La distancia entre los dos electrodos está arreglado en el Hydrasys. La
velocidad de la migración solo depende de la aplicación del voltage.
Temperatura del buffer y temperatura del
ambiente

 Sistema Manual:
Con el buffer y la temperature ambiente mayor a 30°C, la
distancia de migración puede incrementar y las fracciones
serán difundido.

Sistema Automatizado:
Con el Hydrasys, la temperatura del medio (gel de agarosa)
está perfectamente controlado por el efecto Peltier durante la
migración (20°C). Por lo tanto, la longitud de la migración no
se afecta por la temperatura de buffer o ambiente.
Aplicación de la muestra

 La nitidez de las bandas (fracciones) depende

fuertemente de la aplicación de la muestra y de la
concentración de la proteína.
 Los aplicadores SEBIA de microporos desechables
permite la aplicación fina de la muestra (debido al
bajo espesor de los dientes del aplicador). En el
hydrasys el tiempo de aplicación está estrechamente
controlado por el software y contribuye fuertemente
la reproducibilidad de los resultados.
Migration parameters (voltage, current and
power)
The length and quality of migration depend on the applied voltage.
Low voltage and current lead to slow migration. High voltage leads to a faster
migration but also to a higher current and thus to higher heat output.

 Manual system:
o The prescribed voltage is a compromise to minimize the diffusion and
overheating problems.
o Migration length is proportional to migration time.

 Automated system:
o For Hydrasys systems, higher voltage may be applied because the
temperature is controlled by Peltier effect (20°C).
o Constant repeatable migration length is obtained by controlling the
volt/hour output instead of the migration time
Electroforesis en gel: Proteínas
en suero
 Serum Protein
Electrophoresis on gel

K20
Manual system
 Manual K20 system for electrophoresis
on gel
Hydragel K20 Applicator MG300 Power supply K20 electrophoretic chamber

IS 80 incubator/drier Staining/destaining system

Sample applicator
Sample loading

10mL of serum per well followed by 5min

incubation in the wet chamber
K20 applicator carrier
Gel loading
Application of samples

Insertion of the applicator with samples in

position 5 and application on gel (40 sec)
 150ml
buffer Gel must place protein side down
150ml and immerge 1cm in buffer for
buffer each side

MIGRATION ON THE K20

ELECTROPHORETIC CHAMBER
(22min, 90 V, 12±3mA*)
* 12mA for one gel, 24mA for 2 gels…
 Staining solution

• Perfect reconstitution of Amidoblack stain

• Incomplete reconstitution leads to an under-

evaluation of albumin fraction
• One stain vial allows to stain10 gels
 Destaining solution
1 mL + 999 mL of deionizated
 4 min staining
water
(amidoschwarz)
 1 min30 destaining 1
 3-4 min destaining 2
 1 min destaining 3

GEL STAINING
 GEL DRYING IN INCUBATOR DRIER IS 80

Gel fixation 10min

at 80°C

Alternative method: 15min in a fixative solution (60% ethanol, 10% acetic acid)
Reading instruments

HYRYS 2 Densitometer
Scanner V700

Phoresis
 Gel Scan

New possibility to read K20

gel on gel scan using Phoresis 8.60
Adjustable reading length for K20 gel
Electroforesis en gel: proteínas en
suero

Sistemas Hydrasys and Hydrasys 2

Semi-automatico Hydrasys/Hydrasys 2 para
electroforesis en gel

Hydrasys 2

Hydrasys
 HYDRASYS 2 Scan

STAINING SCANNING
COMPARTMENT COMPARTMENT

LOADING AND MIGRATION MIGRATION AND STAINING

COMPARTMENT PROGRAMS
 Kit de Proteinas
b1 y b2 (Ref. 4100)
Contenido del kit:
 Geles de agarosa
 Esponjas tamponadas
 Colorante negro amido
 Diluyente del colorante
 Aplicadores
 Papeles de filtro

Productos relacionados y accesorios no suministrados en el kit:

 Controles de calidad:
• Suero control normal (Ref. 4785)
• Suero control hipergamma (Ref. 4787)
 Solución Decolorante (Ref. 4540)
 Solución de Lavado HYDRASYS (Ref. 4541)
 FLUIDIL (Ref. 4587)

Los geles de la técnica β1-β2 muestran una mejor separación e identificación de algunas bandas monoclonales
que migran en esta zona.
Procedimiento
en EFE
Muestras para análisis:

Extracción y almacenamiento de las muestras

Se recomienda analizar muestras frescas. El suero y la orina deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos
establecidos de uso en los
laboratorios clínicos.
Refrigere las muestras (2 a 8 °C) tan pronto como sea posible después de su obtención, durante una semana.
(NOTA: la fracción beta-2, el complemento C3, desaparece al cabo de 3 días). Para períodos de almacenamiento
más prolongados, almacene las muestras congeladas (son estables durante un mes al menos).

Congelar los sueros con azida sódica, 0.2 g/l, mejora la estabilidad del almacenaje.

IMPORTANTE:
No utilizar ácido bórico como conservante.
Las muestras descongeladas pueden dar lugar a ligeras marcas de aplicación debidas a la desnaturalización de
proteínas o lipoproteínas. El almacenamiento entre 2 y 8 °C y la congelación causan un desplazamiento anódico
de las beta-lipoproteínas del suero, desde la fracción beta-1 hasta las fracciones alfa-2 o alfa-1 ; cuanto más
antiguo sea el suero mayor será el desplazamiento.
Muestras para análisis:
Preparación de las muestras

1. Suero
Use muestras de suero no diluidas.
Tratamiento de los sueros con Fluidil:

El tratamiento de los sueros con Fluidil debe ser aplicado en los casos siguientes:
 Sueros que no difunden bien en los dientes del aplicador, por ejemplo, sueros viscosos o turbios tras la
conservación en nevera (entre 2 y 8 °C) o la congelación (en particular, aquellos que contiene una
crioglobulina).
 Sueros con una Ig M polimerizada.
 Sueros con un perfil electroforético de baja intensidad.

Trate previamente estos sueros con el Fluidil: añada 25 μL de Fluidil a 75 μL de suero, agite 15 segundos en el
vortex y luego siga con el procedimiento habitual.

Muestras a descartar
 No utilice muestras de suero hemolizadas. La hemólisis incrementa las fracciones alfa-2 y beta.
 No utilice muestras de plasma. El fibrinógeno da lugar a una banda cerca del punto de aplicación que puede
ser confundida con una inmunoglobulina monoclonal y afectaría al porcentaje de la fracción beta
correspondiente.
Aplicador de muestra
Carga de muestra

10mL of serum per well followed by 5min

incubation in the wet chamber

Cargar cada aplicador en el plazo máximo de 2 minutos

Gel

Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para
absorber el exceso de líquido. Retire el papel inmediatamente.

ADVERTENCIA: No deje que el papel de filtro contacte demasiado rato con el gel para evitar
que se deshidrate.
Tiras de
Buffer

Carga del gel HYDRASYS

HYDRASYS APPLICATOR CARRIER:
Automatic sample loading
 51 MIGRATION 12 STAINING
PROGRAMS PROGRAMS

Ex: Hydragel 7 Protein: 33Vh (7min), Hydragel 7 b1b2: 36Vh (7min)

Proteínas en suero mediante electroforesis en
gel

• Las proteínas se separan en 5 o 6 fracciones dependiendo

en el tipo de gel que se use.

• Para la determinación de la intensidad:

El uso de la densitometría/ scanner (Hyrys, Phoresis,
Hydrasys 2 scan) es requerido.
Ejemplos de proteínas en suero mediante la
electroforesis en gel
Fracciones de als proteínas en suero

Albúmina

a1: Orosomucoide, a1 Antitrypsina

a2: Haptoglobina, a2 Macroglobulina, a Lipoproteina,

Ceruloplasmina
b: Transferrina, Hemopexina, C3 Complemento,
b Lipoproteina
g: Immunoglobulinas
 Albumin Albumin
Orosomucoïd Orosomucoïd
a1 Antitrypsin a Lipoprotein a1 Antitrypsin a Lipoprotein
a1 Antichymotrypsin Haptoglobin a1 Antichymotrypsin Haptoglobin
Ceruloplasmin Ceruloplasmin
Gc globulin Gc globulin
Transferrin Transferrin a2 Macroglobulin
a2 Macroglobulin
Hemopexine Hemopexine
b Lipoprotein b Lipoprotein C 3 Complement
C 3 Complement

g Globulins
g Globulins
G-A-M-D-E
G-A-M-D-E
Densitómetro

• Permite la medida de la absorbancia en el patrón

eletcroforético.

• La altura de los picos es proporcional a la concentración de

proteína .
 V700
HYRYS 2 Densitometer

Phoresis Software

HYDRASYS 2 Scan
Resultados
Reading of stained gels with HYDRASYS 2 SCAN to
quantify the intensity of each band per profile and
obtain the SEP curves
Leyendo gel
Leyendo la electroforesis de suero usando el
scanner o la densitometría

Alb a1 a2 b g
Expresión de resultados

 Los valores de cada fracción de proteína se encuentran en

in %. Pero el resultado debe interpretarse en g / L para la
interpretación y el diagnóstico .
 La concentración total de proteínas debe cuantificarse
usando otros métodos y debe entrar con la información
del paciente
Control de Suero Normal (Ref. 4785)
Control de calidad

Albumin

β
α1 α2 γ
Expected values

Enter name and Lot

number Enter expected
values for
this control