EL EXTRACTO DE HOJA ACUOSA DE PASSIFLORA MANICATA (JUSS.

)
PROTEGE CONTRA ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y GLICACIÓN DE
PROTEÍNAS EN MODELOS IN VITRO Y EX VIVO
Los extractos de hojas de muchas especies del género Passiflora se han investigado
extensamente por sus actividades biológicas en varios tejidos de rata, pero principalmente
en el sistema nervioso central y el hígado. Poseen efectos ansiolíticos, sedantes y
propiedades antioxidantes. Las evidencias sugieren un papel clave de los C-
glicosilflavonoides en las actividades biológicas de los extractos de Passiflora. Algunas
especies (como P. manicata) del género todavía están poco investigadas por su actividad
química y biológica. En este trabajo, nuestro objetivo es investigar las propiedades
antioxidantes y antiglicantes del extracto acuoso de hojas de P. manicata (PMLE) en
modelos in vitro y ex vivo. El extracto crudo mostró la isovitexina C-glicosilflavonoide
como el compuesto principal. También se identificaron isoorientina y vitexina. En el
ensayo TRAP / TAR, PMLE mostró una actividad antioxidante significativa. La PMLE a
concentraciones de 10 y 100 µg/mL disminuye significativamente la pérdida de LDH en
cortes de hígado de rata. El efecto antioxidante también se observó por la disminución de
los marcadores de daño oxidativo en las rodajas, por lo que se añadió peróxido de
hidrógeno como inductor de estrés oxidativo. La PMLE inhibió la glicación de proteínas en
todas las concentraciones ensayadas. En resumen, el extracto de hoja acuosa de P. manicata
posee propiedades protectoras contra especies reactivas de oxígeno y también glicación de
proteínas, y podría considerarse una nueva fuente de antioxidantes naturales.
Abreviaturas: AAPH, 2,2-azobis [2-amidinopropano]; ANOVA, análisis de varianza; AUC,
área bajo la curva; BSA, albúmina de suero bovino; CAT, catalasa; CDNB, cloro-
dinitrobenceno; SNC, sistema nervioso central; DNPH, dinitrofenilhidrazina; DTNB,
ácido 5,5-ditionitrobis 2-nitrobenzoico; GPx, glutatión peroxidasa; HPLC-UV DAD,
cromatografía líquida de alta resolución equipada con detección de matriz de diodos;
LDH, lactato deshidrogenasa; PMLE, extracto de hoja de Passiflora manicata; TRAP,
potencial antioxidante reactivo total; TAR, reactividad antioxidante total; H2O2, peróxido
de hidrógeno; TBARS, especies reactivas tiobarbitúricas; SOD, superóxido dismutasa.
Introducción
El género Passiflora es el género más importante de la familia Passifloraceae, que
comprende unas 500 especies (Lewis y Lewis, 1977; Pio Corrêa, 1978). Popularmente
conocida en Europa y Norteamérica como pasiflora, en Sudamérica se encuentran
ampliamente distribuidas varias especies de Passiflora, siendo popularmente denominadas
como '' maracuyá '', '' curuba '' y '' badea '', entre otras (Arbelaez, 1996; Mors et al., 2000).
Muchas de estas especies se cultivan por su uso como frutos comestibles o en la
preparación de jugos, pero sus hojas también se emplean en la medicina popular,
principalmente como sedantes y tranquilizantes (Pio Corrêa, 1978; Lorenzi y Matos, 2008).
Los extractos de hojas de P. incarnata, P. edulis var. edulis, P. edulis var. flavicarpa y P.
alata, se han investigado extensamente por sus actividades biológicas en varios tejidos de
ratas, pero principalmente en el sistema nervioso central (SNC) (Speroni et al., 1996;
Soulimani et al., 1997; Petry et al., 2001 ). En este contexto, los extractos de P. alata y P.
edulis presentan efectos ansiolíticos y sedantes sin afectar los procesos de memoria en ratas
Wistar (Barbosa et al., 2008). En el hígado, los extractos de hojas de P. alata y P. edulis
ejercen una actividad protectora contra el daño oxidativo de las biomoléculas, como los
lípidos y las proteínas (Rudnick et al., 2007). Estudios recientes han demostrado que los C-
glicosilflavonoides juegan un papel importante en las actividades biológicas de los
extractos de Passiflora (De Paris et al., 2002; Coleta et al., 2006; Santos et al., 2006; Sena
et al., 2009).
La actividad biológica de muchas plantas medicinales y otros productos naturales está
directamente relacionada con su contenido de flavonoides (Rice-Evans, 2004). Se sabe que
los flavonoides (polifenoles) poseen propiedades antioxidantes y podrían desempeñar un
papel en la prevención de diversas enfermedades asociadas con el estrés oxidativo, como
cáncer, diabetes, enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas (Havsteen, 2002;
Manach et al., 2004). Estas moléculas actúan como antioxidantes eliminando especies
reactivas de oxígeno (ROS) y quelantes de metales de transición redoxactivos (Rice-Evans
et al., 1996). En condiciones fisiológicas regulares, las ROS participan como mensajeros
intracelulares y moléculas reguladoras. Sus concentraciones están reguladas por sistemas de
equilibrio compuestos por diferentes antioxidantes, enzimas antioxidantes y proteínas
(Kowaltowski et al., 2009). Además, los antioxidantes no enzimáticos obtenidos de la dieta
u otros procesos regulan las reacciones oxidativas en el cuerpo que previenen el estrés
oxidativo al eliminar las ROS (Halliwell, 2007).
A pesar del interés por estudiar algunas especies comunes del género Passiflora (P.
incarnata, P. edulis var. Edulis y P. edulis var. Flavicarpa), otras especies aún están poco
investigadas por sus actividades químicas y biológicas, aunque estas son ampliamente
utilizadas en la medicina popular tradicional, en la dieta y en las ceremonias psicodélicas en
los países de América del Sur. Ese es el caso de P. manicata, que produce una fruta similar
a la maracuyá del banano (curuba) que tradicionalmente se reporta como frutas tóxicas y
alucinógenas, popularmente llamado como "el diablito" en los países andinos del norte.
Además, las hojas de esta planta se reportan como agente antimicrobiano (Ramón, 2008) y
tienen resistencia a los ataques de helmintos (Torres, 2007). Trabajos anteriores han
reportado la presencia de flavonoides como vitexina, isovitexina y orientina en extractos de
hojas de P. manicata (Abourashed et al., 2002; Zulcolotto et al., 2011). Se cree que estos
compuestos, cuando se presentan en extractos, actúan como antioxidantes; sin embargo,
aún se desconocen las propiedades biológicas de estos extractos de hojas. De esta manera,
el objetivo de este estudio fue investigar las propiedades antioxidantes y antiglicantes del
extracto acuoso de hojas de P. manicata (PMLE) en modelos in vitro y ex vivo.
Materiales y métodos
2.1. Reactivos
2.1.1. Ensayo de HPLC
El acetonitrilo y el ácido fórmico (grado HPLC) fueron proporcionados por Tedia (Brasil).
El agua se purificó con un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, EE. UU.). Todas las
soluciones preparadas para HPLC se filtraron a través de una membrana de 0,45 mm antes
de su uso. Se adquirieron isoorientina, vitexina e isovitexina de Sigma-Aldrich Co. (St.
Louis, EE. UU.). Todos los demás reactivos utilizados se adquirieron de Sigma – Aldrich
Co. (St. Louis, EE. UU.).
2.2. Material vegetal
Las hojas de P. manicata (Juss.) Se recolectaron en Villa de Leyva, Boyacá, Colombia. El
material vegetal fue identificado por el Prof. Luis Carlos Jiménez y el espécimen del bono
fue depositado en el Instituto Nacional de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia
(COL 530663).
2.3. Preparación de extracto
Las hojas de P. manicata se secaron al aire a 40 ° C, se pulverizaron y se extrajeron
mediante infusión con agua hirviendo (95°C, planta: disolvente 1:10, p/v) durante 10 min.
A continuación, el extracto acuoso se filtró, se liofilizó y se almacenó a -20 ° C hasta que se
ensayó.
2.4. Ensayo de HPLC
El sistema de HPLC consistió en un PerkinElmer Serie 200 equipado con Detección de
matriz de diodos (DAD), bomba cuaternaria, desgasificador en línea y muestreador
automático, y la separación se logró en una columna Vertical VertSep C18 (250 x 4,6 mm
di; 5 lm), utilizando un sistema de gradiente lineal de acetonitrilo (disolvente A) y ácido
fórmico al 0,5% (disolvente B), de la siguiente manera: 15–35% A (0–15 min). El caudal se
mantuvo constante a 1,2 ml/min y los cromatogramas se registraron a 340 nm, con
espectros adquiridos en un rango de 200 a 450 nm. El volumen de inyección fue de 20 uL y
los datos se procesaron utilizando el software Chromera.
2.5. Capacidad antioxidante reactiva total (TRAP) y capacidad antioxidante total (TAR)
La actividad antioxidante in vitro de los extractos de hojas de P. manicata se estimó
mediante el ensayo del potencial antioxidante reactivo total (TRAP), como se describió
anteriormente (Lissi et al., 1992). Este ensayo se basa en la extinción del radical peroxilo
(generado por la solución de AAPH, 2,2-azobis [2-amidinopropano], con luminol)
mediante compuestos de muestra. La medición se realiza mediante detección por
quimioluminiscencia. Los resultados se transformaron en porcentaje y el área bajo la curva
(AUC) se calculó como describen Dresch et al. (2009) con GraphPad Software (San Diego,
CA, EE. UU. - versión 5.00). La reactividad antioxidante total (TAR) se analizó utilizando
las mismas muestras utilizadas para las lecturas de TRAP. Los resultados de la TAR se
calcularon como la relación entre la intensidad de la luz en ausencia de muestras (I0) /
intensidad de la luz inmediatamente después de la adición del extracto. Aunque las
evaluaciones de TAR y TRAP se obtienen en el mismo experimento, representan
observaciones diferentes, ya que TAR está más relacionada con la calidad antioxidante
(reactividad, la capacidad de barrido en un período de corto plazo) y TRAP está más
relacionada con la cantidad de antioxidante y cinética. comportamiento (Lissi et al., 1995).
2.6. Procedimiento animal y preparación de tejidos
En el presente estudio se utilizaron ratas Wistar macho (Rattus novergicus) de nuestra
colonia reproductora. Se sacrificaron diez ratas por decapitación en cada experimento. Se
diseccionaron la corteza cerebral y el hígado completos, se pesaron y se cortaron en rodajas
de 0,3 mm utilizando un cortador de tejido McIlwain. El protocolo utilizado en esta
investigación siguió las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Recursos Animales
Experimentales, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de São
Paulo, Brasil, y fue aprobado por el Comité de Ética Local (Comitê de Ética no Uso de
Animais - UFRGS).
2.7. Ensayos ex vivo - actividad antioxidante
La actividad antioxidante de la PMLE se evaluó primero en ensayos usando solo el extracto
diluido en medio de incubación para medir los efectos citotóxicos del extracto y los
parámetros redox en rodajas. Para aclarar mejor el efecto antioxidante del extracto, se
realizó una nueva incubación, pero utilizando H2O2 como inductor de estrés oxidativo
diluido en el medio de incubación. Al principio, los resultados se compararon con ambos
grupos que contenían Trolox [200 nM] y el sistema de control. En la segunda incubación,
los efectos de la PMLE en los cortes se compararon con los grupos de control, inducidos y
Trolox. La corteza frontal del SNC y las rodajas de hígado de rata se separaron en cinco o
seis grupos en la segunda incubación: control (sólo con medio); Trolox 200 nM, control
inducido por estrés (H2O2 [0,5 M] en medio); y tres grupos de diferentes concentraciones
de extracto (1, 10, 100 ug / mL) diluidos en el medio en ausencia o presencia de peróxido
de hidrógeno.
Las incubaciones fueron las siguientes: en el primer ensayo, las rodajas se incubaron con
extractos diluidos en el medio durante 1 h. El segundo procedimiento fue similar, pero se
añadió H2O2 [0,5 M] al final de los 60 min en los grupos predeterminados durante más de
30 min. Tanto la corteza frontal del SNC como los cortes de hígado de rata (300 mM) se
incubaron durante 60 o 90 min a 37 ° C bajo 95% de O2 / 5% de CO2 en un baño de agua
con agitación (60 oscilaciones / min) en un medio de oxígeno tampón de fosfato de Krebs
Ringer equilibrado - glucosa 10 mM, pH 7,4. Después de las incubaciones, se retiraron las
rodajas y se centrifugó el medio a 12.000 g durante 10 min. En la primera incubación, la
porción sobrenadante se usó para cuantificar la actividad de la lactato deshidrogenasa
usando un equipo comercial (LDH Liquiform ™, Brasil).
2.8. Ensayos redox
2.8.1. Cuantificación de proteínas
Todos los resultados se normalizaron por el contenido de proteína utilizando albúmina
bovina como estándar (Lowry et al., 1951).
2.8.2. Ensayo TBARS
La formación de especies reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARS) se midió durante una
reacción de calentamiento ácido como índice de peroxidación lipídica. Este es un parámetro
ampliamente adaptado para medir el estado redox de lípidos, como se describió
anteriormente (Draper y Hadley, 1990). Las muestras se mezclaron con 0,6 mL de ácido
tricloroacético (TCA) al 10% y 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico al 0,67%, luego se
calentaron en un baño de agua hirviendo durante 25 min. Los TBARS se determinaron
mediante la absorbancia en un espectrofotómetro a 532 nm.
2.8.3. Contenido total de tiol proteico
Después de la incubación, se analizaron muestras de tejido para determinar el contenido de
tiol de proteínas, que se utilizó como una estimación de las alteraciones oxidativas en las
proteínas. Como describió previamente Ellman (1959), una alícuota de la muestra se diluyó
en SDS al 0,1%. Luego, se añadió ácido 5,5-ditiobis-2 nitrobenzoico (DTNB) 0,01 M en
etanol. El color amarillo intenso se desarrolló y leyó en un espectrofotómetro a 412 nm
después de 60 min.
2.8.4. Carbonilación de proteínas
La formación de grupos carbonilo en cortes de hígado se utilizó como parámetro de daño
oxidativo a proteínas, basado en la reacción con dinitrofenilhidrazina (DNPH), como
describieron previamente Levine et al. (1990). Las proteínas se precipitaron mediante la
adición de TCA al 20% y se resolubilizaron en DNPH. Luego, se leyó la absorbancia en un
espectrofotómetro a 370 nm.
2.8.5. Actividades de las enzimas antioxidantes
Las actividades de tres importantes enzimas antioxidantes se analizaron en rodajas después
de las incubaciones: catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y superóxido dismutasa
(SOD). La actividad CAT se ensayó midiendo la velocidad de disminución de la
absorbancia de H2O2 en un espectrofotómetro a 240 nm. Para determinar la actividad de
GPx, se midió la velocidad de oxidación de NAD(P)H en un espectrofotómetro a 340 nm
en presencia de glutatión reducido, hidroperóxido de terc-butilo y glutatión reductasa. La
actividad de SOD se evaluó cuantificando la inhibición de la autooxidación de adrenalina
dependiente de superóxido en un espectrofotómetro a 480 nm (Aebi, 1984; Flohé y
Gunzler, 1984; Misra y Fridovich, 1972).
2.9. Glicación de proteínas
De acuerdo con el método descrito anteriormente (Vinson y Howard, 1996), se preincubó
albúmina de suero bovino (BSA, 7 mg / mL) en tampón fosfato (50 mM, pH 7,4) que
contenía azida sódica al 0,02% (p / v) con la PMLE a concentraciones finales de 1, 10 y
100 ug / mL durante 30 min a temperatura ambiente (25 ° C). Se añadieron soluciones de
glucosa (25 mM) y fructosa (25 mM) a la mezcla de reacción. Después de incubar a 37 ° C
durante 7 días, los productos de reacción fluorescentes se ensayaron en un lector de
fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 350 nm y una longitud de onda de
emisión de 450 nm. Se utilizó ácido tánico aislado (Sigma-Aldrich) como control positivo
de polifenoles a dos concentraciones. Los resultados se expresaron como unidades
arbitrarias de fluorescencia de la proteína glicada.
2.10. análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) de triplicados de tres
experimentos independientes. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se
compararon mediante ANOVA bidireccional, seguido de la prueba de Tukey para variables
aproximadamente distribuidas normalmente.
Resultados
El análisis químico por HPLC-UV / DAD del extracto crudo de P. manicata mostró
isovitexina (rt = 8,8 min) como el compuesto principal. Además, también se identificaron
isoorientina (rt = 6,7 min) y vitexina (rt = 8,2 min) (Fig. 1).
Las propiedades redox de PMLE se evaluaron primero usando un método basado en la
extinción de la quimioluminiscencia (CL) mejorada con luminol de AAPH, los ensayos
TRAP y TAR (Fig. 2). Todas las concentraciones probadas produjeron un efecto
antioxidante, observado en el ensayo TRAP (Fig. 2A). A las concentraciones de 1, 10, 100
ug / mL y 1 mg / mL el extracto también mostró una capacidad antioxidante significativa de
acuerdo con las mediciones de TAR (Fig. 2B).
Con el fin de evaluar los posibles efectos biológicos de la PMLE, seleccionamos las
concentraciones que resultaron efectivas en los ensayos TRAP / TAR (1, 10 y 100 ug / mL)
para las pruebas en un modelo experimental ex vivo de cortes de tejido. Se incubaron
rodajas de hígado y cerebro de rata con el extracto diluido en el medio de incubación y se
comparó el efecto de las diferentes concentraciones de PMLE sobre la liberación de lactato
deshidrogenasa (LDH), un parámetro de citotoxicidad, con el efecto del antioxidante
estándar Trolox (200 nM ), un análogo sintético de la vitamina E (Fig.3). Mientras que la
adición de Trolox en el medio de incubación disminuyó sustancialmente la muerte celular
detectada por la reducción de la fuga de LDH tanto en la corteza frontal del SNC como en
los cortes de hígado de rata, la PMLE a concentraciones de 10 y 100 ug / ml mostró un
efecto similar en los cortes de hígado de rata, disminuyendo significativamente Fuga de
LDH.
Además, los parámetros redox también se cuantificaron en cortes de tejido para evaluar el
efecto de la PMLE sobre el estrés oxidativo. En los cortes de la corteza frontal del SNC, los
grupos incubados con extracto de P. manicata no mostraron efectos significativos en
comparación con el grupo de control. No hubo diferencias significativas en los marcadores
de daño oxidativo y en las actividades de las enzimas antioxidantes de las rodajas incubadas
con PMLE en comparación con los grupos de control (no se muestran los datos).
A continuación, estudiamos los efectos protectores de la PMLE contra el inductor de estrés
oxidativo H2O2. Esta molécula fue elegida debido a su papel en el estrés fisiológico y
patológico tanto en la corteza frontal del SNC como en el hígado. Se co-incubaron rodajas
de cerebro e hígado con PMLE y peróxido de hidrógeno. En cortes de corteza frontal de
rata, PMLE inhibió la formación de TBARS inducida por H2O2 (Fig. 4a); La oxidación del
tiol de la proteína total también se revirtió mediante el tratamiento conjunto con PMLE
(Fig. 4b). Además, Trolox a una concentración de 200 nM pudo prevenir tanto la formación
de TBARS como la oxidación total del tiol de la proteína cuando se co-incuba con peróxido
de hidrógeno en la corteza frontal de las rodajas del SNC. Los niveles de carbonilo de
proteína en las muestras de cerebro no fueron detectables en todos los grupos (datos no
mostrados). En cortes de hígado, la PMLE no afectó la oxidación del tiol inducida por
H2O2 (datos no mostrados). Por otro lado, la formación de TBARS inducida por H2O2 se
inhibió significativamente por el tratamiento conjunto con PMLE en todas las dosis
(Fig.5a) mientras que la carbonilación de proteínas se invirtió a la concentración más alta
de PMLE, lo que indica una actividad antioxidante en el tejido hepático (Fig. 5b).
Especialmente en el hígado, Trolox 200 nM no fue capaz de prevenir tanto la carbonilación
de proteínas como la formación de TBARS en comparación con el grupo de control.
Finalmente, para evaluar el efecto de la PMLE sobre la glicación de proteínas, realizamos
un ensayo in vitro utilizando un sistema de reacción inductora de glicación con albúmina
bovina, fructosa y glucosa purificadas. Se añadió PMLE a este sistema de incubación y se
observó una inhibición significativa de la glicación de proteínas a concentraciones de 1, 10
y 100 ug / ml (Fig. 6). También se probó el compuesto polifenólico clásico ácido tánico y
mostró una inhibición significativa de la glicación de proteínas a concentraciones de 1 y 10
ug / mL. Estos resultados indican una acción protectora de la PMLE contra la glicación
cuando se aplica en este modelo in vitro.
Discusión
Estudios recientes llevados a cabo en los últimos años han demostrado que los flavonoides
(polifenoles) de las plantas medicinales pueden desempeñar un papel protector contra el
estrés oxidativo (Rice-Evans et al., 1996; Manach et al., 2004). Además, los agentes
bioquímicos antioxidantes y prooxidantes han estado presentando papeles importantes en
las estrategias terapéuticas para la prevención y / o el tratamiento del daño oxidativo. En
nuestro trabajo, se identificaron isovitexina, vitexina e isoorientina en el extracto crudo
mediante el análisis HPLC-DAD. Trabajos anteriores sobre la composición de flavonoides
de las hojas de P. manicata informaron la presencia de isovitexina, vitexina, orientina e
isoorientina (Abourashed et al., 2002). Dado que la capacidad del extracto vegetal para
eliminar ROS y / o quelantes de metales parece estar relacionada con la estructura química
de los compuestos fenólicos (Halliwell et al., 1995; Rice-Evans et al., 1996), suponemos
que el extracto acuoso de hojas de P. manicata puede presentar algunas propiedades
antioxidantes importantes, probablemente relacionadas con su contenido fenólico. En este
sentido, decidimos investigar las posibles interacciones del extracto de hoja con diferentes
tipos de ROS.
El potencial de la PMLE para eliminar los radicales peroxilo in vitro, mediante el uso de
ensayos TRAP / TAR, indicó una capacidad antioxidante significativa. La actividad
antioxidante de los extractos de hojas de plantas medicinales (Zainol et al., 2003) y frutos
(Banerjee et al., 2005) muestra una relación lineal directa entre el contenido fenólico total y
la actividad antioxidante total, lo que indica que los compuestos fenólicos podrían ser los
principales contribuyentes a las actividades antioxidantes de estos extractos. En nuestro
estudio, identificamos los compuestos polifenólicos (isoorientina, vitexina e isovitexina) en
el extracto mediante análisis HPLC-DAD y también confirmamos la actividad antioxidante
de PMLE eliminando radicales peroxilo mediante ensayos TRAP / TAR. Estos resultados
nos llevan a concluir que la presencia de los compuestos identificados por HPLC-DAD en
nuestra muestra podría estar relacionada con su actividad antioxidante in vitro (Halliwell et
al., 1995; Rice-Evans et al., 1996).
El desequilibrio de la producción de ROS y la defensa antioxidante en las células conduce a
diversas formas de modificaciones oxidativas reversibles e irreversibles de proteínas
(carbonilación), lípidos (formación de derivados de hidroperóxido de lípidos) y ADN
(formación de aductos y roturas de hebras) que eventualmente resultan en la pérdida de
funciones moleculares (Giorgio et al., 2007). Trolox, un antioxidante estándar utilizado en
varios estudios de evaluación del potencial antioxidante in vitro, in vivo y ex vivo (Chung
et al., 2006; Itoh et al., 2000; Perfeito et al., 2007) se utilizó aquí para evaluar y comparar
las propiedades protectoras de PMLE en modelos ex vivo del SNC y del hígado. La co-
incubación con PMLE a concentraciones de 10 y 100 µgmL proporcionó una protección
antioxidante significativa a las rodajas de hígado de rata (de manera similar a Trolox),
como lo demuestra la disminución en la pérdida de LDH. Cuando analizamos los cortes de
la corteza frontal del SNC, este parámetro no se alteró significativamente en relación con el
grupo no tratado (control). En nuestro segundo modelo ex vivo, utilizamos peróxido de
hidrógeno como inductor de estrés oxidativo. La peroxidación lipídica es uno de los efectos
inducidos por el estrés oxidativo y se produce fácilmente en los tejidos debido a la
presencia de ácidos grasos poliinsaturados altamente oxidables en las membranas celulares
(Cini et al., 1994). Además, otras moléculas oxidadas (proteínas) a menudo se inactivan
funcionalmente por el estrés oxidativo, lo que puede afectar la actividad de enzimas,
receptores y transportadores de membrana (Stadman, 2001).
Un estudio anterior de nuestro grupo mostró propiedades antioxidantes de extractos de
hojas de P. alata y P. edulis en un modelo ex vivo: las rodajas de hígado que se co-
incubaron con los extractos tenían niveles más bajos de grupos carbonilo y TBARS cuando
el estrés oxidativo fue inducido por hierro sulfuro (Rudnick et al., 2007). Aquí, los grupos
de rodajas tratadas con el extracto y H2O2 también mostraron niveles más bajos de
carbonilo y TBARS. En cortes de corteza frontal, los grupos co-incubados con todas las
dosis de PMLE mostraron una disminución significativa de TBARS, lo que indica el
potencial del extracto como agente antioxidante (Fig. 4a). En los mismos cortes, la PMLE
también previene la oxidación total del tiol de la proteína como se muestra en la Fig. 4b, ya
que este parámetro podría considerarse un producto muy temprano de la oxidación de la
proteína. Por otro lado, la actividad antioxidante del extracto en los cortes de hígado fue
eficaz para prevenir la formación de TBARS en todas las dosis e inhibió la carbonilación de
proteínas a mayor concentración como se muestra en la Fig. 5. De esta manera, los
marcadores de daño oxidativo (lípidos y proteínas) presentaron una atenuación en rodajas
de hígado co-incubadas con el extracto en todas las concentraciones. Además, en los
hígados de rata, la PMLE fue más eficaz para prevenir el estrés oxidativo en comparación
con el antioxidante estándar Trolox, ya que esta última molécula, cuando estaba presente en
el medio de incubación, no pudo prevenir los marcadores de daño oxidativo que se
presentan aquí.
El proceso de glicación representa una modificación postraduccional común de proteínas
que puede afectar sus funciones en los organismos vivos. La glicación de proteínas es una
reacción no enzimática entre la glucosa y las proteínas que da como resultado la formación
de AGE (productos finales de glicación avanzada) que son moléculas tóxicas (Ulrich y
Cerami, 2001). Se ha demostrado que los radicales libres mejoran la formación de AGE
(Halliwell, 2001), y estudios anteriores han informado que los antioxidantes inhiben estos
procesos (Nakagawa et al., 2002). De esta manera, la contribución de la generación de AGE
a la diabetes, el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer ha recibido una atención
considerable en los últimos años (Chace et al., 1991; Jakus y Rietbrock, 2004). Aquí, la
PMLE mostró efectos protectores contra las modificaciones proteicas inducidas por la
glucosa, inhibiendo significativamente la glicación de la proteína en todas las
concentraciones probadas. Tal protección fue similar a los resultados observados para el
ácido tánico, ya que esta molécula es una forma comercial específica de tanino, un tipo de
polifenol. El ácido tánico se encuentra más comúnmente en la corteza y los frutos de
muchas plantas y tiene una estructura que consta de un carbohidrato central y 10 grupos
galloílo (Haslam, 1989). Nuestro grupo ha demostrado previamente que esta propiedad
también se puede encontrar en extractos de hojas de otras especies de Passiflora (Rudnick
et al., 2007). Sin embargo, existen evidencias que demuestran que la actividad antioxidante
podría no ser el mecanismo único requerido para proteger las proteínas contra las primeras
etapas de la glicación (Vasan et al., 1996). El mecanismo protector que evita el proceso de
glicación de proteínas provocado por los extractos de Passiflora aún requiere más
investigación. Nuestros resultados sugieren que los compuestos polifenólicos identificados
en la PMLE pueden actuar como captadores de ROS y como agentes antiglicantes in vitro.
En resumen, los datos aquí presentados sugieren que el extracto acuoso de hojas de P.
manicata posee propiedades protectoras contra la oxidación de proteínas, la peroxidación de
lípidos y también la glicación de proteínas inducida por la agresión aguda de H2O2. Se
necesitan más estudios para dilucidar el perfil de contenido de polifenoles y antioxidantes
del extracto crudo de P. manicata, ya que nuestros resultados proporcionan solo evidencias
significativas de la presencia de isovitexina C-glicosilflavonoide. De esta forma, otros
trabajos previos reportaron la relación entre la presencia de isovitexinas (entre otros
flavonoides también presentados) y las propiedades antioxidantes de los extractos de hojas
de Passiflora (Pereira et al., 2004; Petry et al., 2001; Ulubelen et al., 1982) . Sin embargo,
los extractos de hojas de P. manicata podrían considerarse como un nuevo antioxidante
natural. Se necesitan más estudios para examinar y comprender las propiedades potenciales
de este extracto en la prevención de patologías, como enfermedades neurodegenerativas y
diabetes mellitus, donde el daño por estrés oxidativo a proteínas y lípidos parece jugar un
papel importante.