METABOLISMO DE LA PIRIMIDINA

Análisis molecular de la síntesis de pirimidina de novo

La biosíntesis del nucleótido de novo pirimidina se conserva evolutivamente en todas las
especies examinadas y se define como la formación de UMP a partir de carbamoilfosfato
(CP), aspartato y 5-fosforiribosil-1-pirofosfato (PRPP); La biosíntesis del nucleótido de
novo pirimidina también se conoce como vía de orostato. La biosíntesis del nucleótido de
pirimidina consta de seis pasos enzimáticos (Figura 1). La carbamoilfosfato sintasa
(CPSasa) produce CP a partir de una combinación de carbonato, ATP y un grupo amino.
CP se utiliza no sólo en la síntesis de pirimidina de novo, sino también como precursor de
la biosíntesis de arginina. El siguiente paso, en el que la aspartato transcarbamoilasa
(ATCasa) cataliza la condensación de CP con aspartato para formar carbamoilaspartato
(CA), es específico para la biosíntesis de pirimidina. Ciclación del carbamoilaspartato para
producir el anillo de pirimidina es catalizado por la enzima dihidroorotasa (DHOase).
Posteriormente, dihidroorotate (DHO) se oxida por dihydroorotate dehydrogenase
(DHODH) para producir orotate (OA). Orotate se condensa con PRPP a orotidina 5
-monofosfato (OMP) por fosforiribosiltransferasa de orotato (OPRTasa), que luego es
descarboxilada por decarboxilasa de orotidilato (ODCase) para formar uridina-5
-monofosfato (UMP).
Aunque la síntesis de pirimidina de novo se conserva, muestra diferencias distintivas
entre bacterias, levaduras y eucariotas superiores (86). En Escherichia coli y otras
bacterias, cada paso enzimático es catalizado por una proteína diferente que es codificada
por un gen diferente (88). En las plantas, los tres primeros pasos son catalizados por tres
proteínas separadas (40), mientras que en los mamíferos los tres pasos son realizados por
una única proteína multifuncional llamada CAD (Carbamoylphosphate synthase-Aspartate
transcarbamoylase-Dihydroorotase) (60). En mamíferos y plantas (137), los dos últimos
pasos son catalizados por dominios distintos de una proteína bi-funcional llamada UMP
sintasa (UMPSasa). Desde un punto de vista filogenético, la organización de la vía en las
plantas es quimérica: Las subunidades CPSasa se agrupan en el clado de cianobacterias,
DHOase en proteobacterias, ATCase en eucariotas, y DHODH y UMP synthase en el clado
de eucariotas superiores (86).
La primera secuencia completa del genoma vegetal (127) junto con estudios bioquímicos
(139) revelan que las plantas superiores, como E. coli, poseen una sola forma de CPSasa
que suministra CP tanto a la pirimidina como a la arginina. La mayoría de los otros
eucariotas superiores tienen dos tipos de CPSasa. CPSaseI es específico para el amoniaco,
se encuentra en las mitocondrias, y contribuye a la biosíntesis de arginina, mientras que
CPSaseII utiliza preferentemente la glutamina, se encuentra en el citosol, y contribuye a la
biosíntesis de pirimidina. Planta CPSase consta de dos subunidades. La subunidad pequeña
exhibe una actividad glutamina-amidotransferasa y proporciona amoniaco a la subunidad
grande. La gran subunidad cataliza la reacción CPSase y posee propiedades reguladoras. La
clonación y caracterización de las respectivas subunidades cDNAs de varias plantas
revelaron que las subunidades están codificadas por genes individuales (números de
adhesión NCBI U73175 y U40341, respectivamente) (47). Hay un informe de una planta
CPSase cDNA con organización bicistrónica en Medicago (NCBI número de acceso
AF191301). Las secuencias de aminoácidos deducidas de estos ADNc sugieren que las
proteínas vegetales se sintetizan como precursores que contienen péptidos de tránsito de
cloroplasto. Este hallazgo es consistente con evidencia bioquímica (112) e inmunológica
(R. Zrenner, observaciones inéditas), en las que se han detectado proteínas de 125 kDa para
la subunidad grande y de 45 kDa para la subunidad pequeña en cloroplastos.
Las secuencias que codifican proteínas con actividad ATCase se han caracterizado desde
varias plantas (47, 87, 140). Las secuencias de aminoácidos deducidas de estos cDNAs
sugieren que la planta ATCase se sintetiza como precursor que contiene un péptido de
tránsito de cloroplasto. Este hallazgo es consistente con evidencia bioquímica (41) e
inmunológica (15) que muestra que una proteína de 36 kDa es detectada en cloroplastos.
Las secuencias que codifican proteínas con actividad DHOase se han caracterizado a partir
de Arabidopsis y patata (Solanum tuberosum) (AF000146 para Arabidopsis y AX093580
para patata) (47). Las secuencias de aminoácidos deducidas de estos cDNAs sugieren que la
DHOase de la planta se sintetiza como precursor que contiene un péptido de tránsito N-
terminal, pero no indican si la proteína se encuentra en los plásticos o mitocondrias. Sin
embargo, la evidencia bioquímica (41) e inmunológica (R. Zrenner, observaciones no
publicadas) revelan que la proteína 42 kDa se encuentra en los cloroplastos.
Las secuencias que codifican proteínas con actividad DHODH se han caracterizado a partir
de Arabidopsis y tabaco (Nicotiana tabacum) (47, 81). Todos los DHODHs de plantas
secuenciados hasta la fecha pertenecen a la familia de las deshidrogenasas dihidroorotate 2,
que son flavoproteínas. Las secuencias de aminoácidos deducidas sugieren que la proteína
vegetal se sintetiza como precursor que contiene un péptido de tránsito N-terminal para la
orientación mitocondrial. Pruebas bioquímicas (41) e inmunológicas (130) confirman que
la proteína de 45 kDa se encuentra en la superficie exterior de la membrana mitocondrial
interna, como se ha demostrado en mamíferos (30). La actividad de la enzima Arabidopsis
muestra diferencias significativas en la especificidad del sustrato y la inhibición de la
enzima animal (130).
Las secuencias que codifican proteínas con actividad UMPSasa se han caracterizado desde
varias plantas (87, 100). Las secuencias de aminoácidos deducidas indican que la proteína
vegetal se sintetiza como un precursor que contiene un péptido de tránsito N-terminal. La
evidencia bioquímica (41) confirma que la proteína se encuentra en los cloroplastos.
A diferencia de otras vías en el metabolismo primario del carbono de las plantas donde
generalmente más de un gen codifica una sola función enzimática, la vía biosintética de
pirimidina tiene una organización genómica simple. En las especies de plantas analizadas
hasta ahora, cada especie tiene un solo gen para cada función enzimática (47). Esta imagen
general se confirma mediante la inspección de la secuencia genómica completa de
Arabidopsis thaliana (19). Una excepción es el arroz, en el que se ha encontrado más de un
gen para la UMPSasa (AF210323, AF210324, AF210325). Otra excepción bien conocida
es ATCase de guisante, para el cual se han caracterizado tres cDNAs diferentes. El cribado
de toda la información disponible de la secuencia EST para la soja también revela dos
isoformas putativamente diferentes de ATCase. Se puede especular que la presencia de
múltiples genes ATCase en las legumbres podría deberse a las funciones adicionales de los
nucleótidos en los procesos de fijación de nitrógeno en la simbiosis de las legumbres. Los
proyectos de secuenciación del genoma completo actualmente en ejecución para Lotus
japonicus y Medicago trunculata revelará si la presencia de múltiples genes ATCase es una
característica general de las leguminosas fijadoras de nitrógeno. Hasta ahora, sin embargo,
sólo se ha encontrado un ATCase en el proyecto de secuenciación de Medicago.
En contraste con su organización genómica bastante simple, las reacciones en la vía de
síntesis de novo tienen lugar en un número de diferentes ubicaciones subcelulares. Mientras
que los tres primeros pasos de la vía tienen lugar en el plastificado, la reacción de
deshidrogenasa tiene lugar en la superficie externa de la membrana mitocondrial interna y
se acopla a la cadena respiratoria; los dos últimos pasos, catalizados por UMPSase, de
nuevo tienen lugar en los plásticos (véase más arriba). Por lo tanto, para producir UMP,
DHO debe salir del plástico y acceder a la superficie exterior de la membrana
mitocondrial interna, donde se convierte en OA. Posteriormente, el OA debe moverse
hacia atrás a través de la membrana exterior de las mitocondrias y volver a entrar en
los plásticos, donde se convierte en UMP. Hasta ahora, no se han descrito proteínas de
transporte para estos intermediarios. Es casi seguro que se requiere un sistema de transporte
especializado para el movimiento entre el plastid y el citosol. Mientras que el movimiento
de metabolitos de bajo peso molecular a través de la membrana externa de las mitocondrias
se ha pensado que ocurre a través de porinas inespecíficas, cada vez hay más evidencia de
que tales proteínas pueden exhibir un cierto grado de especificidad (20). Este hallazgo
amplía la posibilidad de acceso regulatorio porque los procesos de transporte a través de
varias membranas tienen que estar involucrados en la biosíntesis de novo pirimidina.
Regulación de la Pirimidina de novo Biosíntesis
El control transcripcional de los genes de la pirimidina de novo biosíntesis no parece ser
muy pronunciada en las plantas, excepto en algunos cambios de expresión a lo largo de
gradientes de desarrollo (47). Datos de AtGenExpress de la expresión atlas de desarrollo de
Arabidopsis (103) y análisis de Genevestigator (154) de bases de datos de hibridación del
conjunto Arabidopsis confirmar esta suposición, aunque no todos los genes de esta vía se
representan en el Arabidopsis ATH1, matriz genómica completa (95). Como la síntesis de
novo de nucleótidos representa una función celular básica, no es sorprendente que la
expresión de todos los genes involucrados esté correlacionada con el crecimiento de las
plantas. Sin embargo, incluso cuando la actividad mitótica y de expansión ha cesado
completamente, todavía hay una cantidad considerable de ARNm en estado estacionario
detectable a partir de los genes (47). Esta observación puede reflejar el papel de los
nucleótidos de pirimidina en la provisión de precursores ricos en energía para la biosíntesis
de sacarosa y pared celular, así como en la división y expansión celular.
El control transcripcional también se encuentra durante la limitación del fosfato o después
de alimentar al inhibidor metabólico ácido 5-fluoroorótico. Tras la inanición por fosfato, las
transcripciones para UMPSase y ATCase en raíces de Arabidopsis se elevan, junto con las
transcripciones para genes de la vía de rescate; esta observación indica un control
transcripcional coordinado de la formación de UMP (58). La inducción de un fenotipo de
tiroinización mediante la alimentación del inhibidor metabólico ácido 5-fluoroorótico a
cultivos de células de tabaco aumenta la expresión de la UMPSasa (99).
La regulación de toda la vía se ejerce a nivel de actividad enzimática a través de la
retroalimentación y los bucles de retroalimentación que actúan sobre CPSase y
ATCase. Las respuestas de estas enzimas se dilucidaron por primera vez en microbios y
representan ejemplos clásicos de regulación alostérica. Se ha descrito la regulación
alostérica de la CPSasa vegetal mediante inhibición de la retroalimentación con UMP y
activación de avance con PRPP (65, 91). La inhibición alostérica de la CPSasa por UMP
puede ser superada por la ornitina, presumiblemente para permitir que la CP se produzca
para la biosíntesis de arginina independientemente del requisito de CP en la síntesis de
nucleótidos de pirimidina (90). En los mamíferos, el dominio de las subunidades grandes
CPSase de la proteína CAD está sujeto a regulación a través de la fosforilación por la
proteína quinasa A (27) y la quinasa MAP (51). Estos sitios de fosforilación putativa se
conservan dentro de la proteína vegetal, pero la fosforilación de la CPSasa planta no se ha
analizado hasta ahora. La actividad de la ATCasa vegetal también puede ser disminuida in
vitro mediante la unión de la UMP a un sitio putativo de unión a la pirimidina de la enzima
(31).
Como se ha señalado anteriormente, los pasos enzimáticos de la vía de síntesis de
pirimidina de novo suelen codificarse mediante genes únicos, ninguno de los cuales
parece ser funcionalmente redundante. Este hecho puede explicar por qué no se conocen
mutantes de la biosíntesis de pirimidina. Hasta el momento, sólo se ha informado del
establecimiento de cultivos celulares de tabaco con actividad reducida de UMPSasa (100,
101). El cribado de las líneas de inserción de ADN-T de Arabidopsis disponibles para cada
paso de la vía de síntesis de novo solo produjo líneas de inserción de ADN-T heterocigotas,
presumiblemente porque el genotipo mutante homocigoto era letal (R. Zrenner,
observaciones no publicadas).
Por esta razón, los inhibidores metabólicos o las plantas transgénicas con inhibición parcial
o aumento de expresión son potentes herramientas para el análisis funcional de esta vía. Las
plántulas de arabidopsis cultivadas en presencia del inhibidor ATCase N-(fosfonatílico)-
Laspartato (PALA) (16) muestran una reducción general en el crecimiento y desarrollo, y
esta reducción va acompañada de clorosis. Recientemente se ha realizado un análisis
funcional completo de la vía de síntesis de pirimidina de novo mediante el uso de
estrategias antisentivas y de cosuppression para crear plantas con expresión reducida de
cada gen implicado (107). Una reducción gradual de la abundancia de la proteína
ATCasa o DHOase resultó en una inhibición del crecimiento sin más efectos
pleiotrópicos obvios en la apariencia visual o incluso en los niveles de nucleótidos de
pirimidina en los órganos fuente maduros. La principal razón de la reducción del
tamaño de los órganos fue la disminución del número de células por órgano; esta
observación indica que la reducción de la síntesis de pirimidina de novo se compensa
con la reducción de las tasas de crecimiento (107).
Otro mecanismo compensatorio muy interesante fue encontrado por la reducción de la
expresión de UMPSase específica de un órgano (46). Aquí, el silenciamiento específico del
tubérculo de la UMPSasa conduce a una disminución de la síntesis de pirimidina de novo
que fue acompañada por una estimulación de la vía de rescate menos consumidora de
energía. Esta estimulación conduce a una sobrecompensación, incluso mayores niveles de
pirimidina en los tubérculos en comparación con las plantas silvestres no transformadas, y,
posteriormente, a un mayor contenido de almidón en los tubérculos.
En aras de la exhaustividad, la CTP sintasa, que cataliza la aminación de UTP a CTP en
una reacción de consumo de energía, y la timidatasa, que produce dTMP, también se
enumeran en la Tabla 1. Las sintasas CTP no se han analizado hasta ahora en las plantas.
La timidato sintasa junto con la dihidrofolato reductasa se encuentran en una proteína bi-
funcional que se encuentra en Arabidopsis (74) y la zanahoria (Daucus carota) (79). Esta
organización es bastante inusual en comparación con los microorganismos o la mayoría de
los eucariotas superiores.
Análisis molecular del catabolismo de pirimidina
Los nucleótidos de pirimidina se catabolizan a nucleósidos de pirimidina mediante la
eliminación del grupo fosfato en una reacción catalizada por 5 - nucleotidasas [por ejemplo,
uridina monofosfato hidrolasa (UMPH)]. A continuación, los nucleósidos se convierten en
bases libres de pirimidina mediante la eliminación del grupo ribosa, en una reacción
catalizada por nucleosidasas [por ejemplo, nucleosidasa de uridina (URH)]. Como las
plantas y los animales no poseen citosina deaminasa, la citoidina nucleósida es desaminada
por la citoidina deaminasa (ACD) para orinar, y esta última se metaboliza a uracilo. Las
bases pirimidina uracilo y timina se degradan luego por una vía reductiva (138) en tres
reacciones secuenciales catalizadas por dihidrouracilo deshidrogenasa (PYD1),
dihidropirimiddinasa (PYD2), y β-ureidopropionasa (PYD3). Alternativamente, el uracilo y
los tres nucleósidos se pueden volver a convertir en nucleótidos a través de las vías de
rescate (ver más abajo).
Químicamente, la vía degradante es una reversión de la vía de síntesis de novo enzimas
están implicadas en la degradación de nucleótidos o si cualquiera de estas deaminasas
citoidina está implicada en el proceso de edición de ARN de las plantas mitocondrias y
cloroplastos sigue desconocido (126).
Los ADNc vegetales que codifican para proteínas que potencialmente tienen actividad
dihidropirimidina deshidrogenasa han sido identificados por homología de secuencia con el
gen humano de la dihidropirimidina deshidrogenasa, PYD1. Proteínas codificadas por
cDNAs homólogas PYD1 de Arabidopsis (AF545062) y tomate (Lycopersicon esculentum;
número de acceso AF545063) junto con los cDNAs homólogas PYD1 de Homo sapiens
(número de acceso U09178), Drosophila melanogaster (número de acceso U65491), y
Caenorhabditis elegans (número de acceso U39742) están relacionados filogenéticamente
con las enzimas biosintéticas de novo DHODH (86). Las secuencias de aminoácidos
sugieren que la proteína vegetal se sintetiza como un precursor que contiene un péptido de
tránsito cloroplasto N-terminal. La proteína madura predicha comparte alta homología con
la enzima de otros eucariotas, pero la enzima vegetal carece del dominio N-terminal que
alberga el sitio de unión a NADPH. Esta observación sugiere que en las plantas se necesita
otra proteína que interactúa para una función completa. El cribado de todos los datos de
expresión comúnmente disponibles para genes coexpresados (120; ver
http://csbdb.mpimpgolm.mpg.de) que contienen un sitio de unión a NADPH y una señal de
localización de cloroplasto predicha no reveló un candidato obvio para este gen putativo.
Un único cDNA PYD2 que codifica para la dihidropirimiddinasa se ha caracterizado a
partir de plantas (50). La secuencia de aminoácidos deducida sugiere que la proteína
vegetal se sintetiza como un precursor que contiene un péptido de señal N-terminal. Las
comparaciones del cDNA de Arabidopsis con secuencias de varios otros organismos
indican que el PYD2 está filogenéticamente relacionado con las enzimas DHOase
biosintéticas de novo (50).
Walsh et al. (136) han clonado y caracterizado la primera planta de cDNA que codifica
PYD3 de Arabidopsis. La proteína madura predicha comparte un 55% de homología con la
enzima de otros eucariotas. Las secuencias de aminoácidos deducidas sugieren que la
proteína vegetal se encuentra en el citosol. La actividad del maíz (Zea mays) PYD3
también se ha caracterizado (136), y se ha demostrado que el β-ureidopropionato (derivado
del uracilo) y el β-ureidoisobutirato (derivado de la timina) son ambos sustratos.
La organización genómica de la degradación del uracilo es tan simple como la de la vía de
síntesis de novo: Código de genes únicos para PYD1 a PYD3. La organización genómica
simple se superpone de nuevo por una distribución subcelular putativa bastante complicada,
en la que los plásticos, el retículo endoplasmático y el citosol hospedan las proteínas
maduras. Por lo tanto, debe considerarse el transporte por membrana de productos de
degradación del uracilo. Los datos de AtGenExpress del atlas de expresión del desarrollo de
Arabidopsis (103) muestran un patrón de expresión altamente coordinado de los tres genes
PYD, con un fuerte aumento de la expresión en las hojas senescentes.
En contraste con el caso de la vía de síntesis de novo, los mutantes homocigotos knockout
de los genes que codifican para los tres pasos de la degradación del uracilo se pueden aislar
de Arabidopsis. Estas plantas ya no son capaces de degradar el uracilo, pero no muestran
diferencias fenotípicas con las plantas silvestres cuando se cultivan bajo condiciones de
crecimiento estándar en el invernadero (R. Zrenner, observaciones no publicadas). Estos
resultados implican que la vía de degradación del uracilo es de menor importancia en
Arabidopsis bajo condiciones de no estrés.
Análisis molecular del salvamento de pirimidina
Como discutimos arriba, los nucleótidos son catabolizados a nucleósidos de pirimidina y
bases libres por acción secuencial de 5 nucleotidasas (por ejemplo, UMPH) y nucleosidasas
(por ejemplo, URH). Como la síntesis de novo de nucleótidos es muy consumidora de
energía (ver arriba), las células han desarrollado una estrategia para reutilizar nucleósidos y
nucleobas preformados a través de reacciones de rescate. Los nucleósidos uridina/citoidina
y timidina se salvan a sus respectivos nucleótidos mediante nucleósidos quinasas
específicas [uridina cinasa (Reino Unido) y timidina cinasa (TK)] y el uracilo se salva
directamente con PRPP en UMP a través de la uracilfosforicosiltransferasa (UPRT).
La mayoría de los tejidos vegetales analizados hasta ahora contienen mucha más actividad
del Reino Unido que UPRT (8). Aunque la actividad del Reino Unido se ha caracterizado
repetidamente en plantas (37, 38), hasta la fecha no se ha caracterizado funcionalmente
cDNA planta. En el genoma de Arabidopsis se han identificado dos cDNAs que codifican
la supuesta actividad del Reino Unido, y su transcripción se confirma con datos de
expresión de fuentes comúnmente disponibles (103, 146). Hasta ahora no se ha
caracterizado funcionalmente ninguna actividad de CT ni ADN de las plantas. En el
genoma de Arabidopsis se identifican dos cADNs de Arabidopsis que codifican la supuesta
actividad de CT, y su transcripción ha sido confirmada por datos de expresión de fuentes
comúnmente disponibles (103, 146).
De las bases de pirimidina, sólo el uracilo se salva directamente en UMP, en una reacción
dependiente de PRPPdependiente catalizada por UPRT (21). Hasta ahora sólo se ha
clonado un cDNA de Arabidopsis (número de adhesión AF116860). Este UPRT es
estructuralmente similar a las fosforicosiltransferasas de otros organismos y
presumiblemente se encuentra en el citosol. La finalización de la secuencia del genoma de
Arabidopsis reveló que la PRPP sintetasa y la UPRT están codificadas por pequeñas
familias de genes, y que diferentes miembros pueden estar ubicados en el citosol o el
plástico. Los datos de expresión de fuentes comúnmente disponibles (103, 146) confirman
que todas las isoformas se expresan diferencialmente. De este hallazgo se asume que el
rescate de pirimidinas puede ocurrir en el citosol y los plastides.
Las vías de rescate también pueden desempeñar un papel importante en el suministro de
nucleobasas a las células, que son incapaces de sintetizar cantidades suficientes para sus
necesidades. Recientemente los sustratos fisiológicos de los homólogos de los
transportadores de ureida permeasa (SAI) en Arabidopsis han sido identificados como
uracilos y potencialmente otros nucleobasos (104). Tiene también se ha demostrado que la
familia génica de transportadores de nucleósidos equilibrados (ENT) codifica proteínas que
transportan nucleósidos de purina y pirimidina con la misma especificidad (62). Hasta
ahora no se conoce ningún mutante en la ruta de rescate de pirimidina.