Unidad 2 - 1a Parte
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Unidad 2
MATERIAL BIOLÓGICO
Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo característico del hombre su afán
por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de ordenamiento surge la
Taxonomía como la ciencia de la clasificación, nomenclatura e identificación. La Clasificación es algo
creado por el hombre. Consecuencia de esta artificialidad es la controversia que existe desde
mediados del siglo XVIII sobre las divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenzó
con Linneo siendo una sencilla división de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido
haciéndose cada vez más complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros días
con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no será la última, ya
que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, así como las posibilidades de
aumentar esos conocimientos.
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, ordenó a todos los seres vivos en dos Reinos bien
definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos móviles y heterótrofos; y el
Reino Plantae que incluía a los vegetales, individuos inmóviles, autótrofos y fotosintéticos. Según el
esquema de los dos reinos, los protozoos se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de
microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificación encontró pronto dificultades ya que existían numerosos
microorganismos que poseían características intermedias que no permitían su clara adscripción a uno
de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un tercer reino, el Reino Protista,
para reordenar todos los seres vivos con organización biológica sencilla ya fueran unicelulares,
cenocíticos o multicelulares, pero todos ellos carentes de especialización tisular y en los que cada
individuo era capaz de realizar las funciones propias y específicas que los tejidos de organismos
superiores, animales y plantas, tenían encomendadas. Según Haeckel, el Reino Protista incluiría
bacterias, algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fué cuestionada a
medida que se obtenía más información acerca de la estructura interna de los microorganismos debido
a los avances en microscopía electrónica.
En 1937 Chatton dividió el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos según tuvieran o no
membrana nuclear. Aparecieron así los términos eucariota para definir organismos con células
nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los animales y plantas; y procariota
para agrupar células sin membrana nuclear, como es el caso de las bacterias. La dicotomía eucariota-
procariota fué utilizada por los taxónomos como una característica filogenética de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos procariotas
constituyeron un grupo taxonómico filogenéticamente independiente. El más aceptado de todos ellos
fué el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de clasificación de los seres vivos basado en los
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dos niveles de organización celular y las tres formas principales de nutrición (fotosíntesis, absorción e
ingestión) que dieron lugar a los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares),
Plantae (eucariotas fotosintéticos), Animalia (eucariotas fagótrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos).
En el esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluidos en los Reinos Monera
(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras). Hasta este
momento se utilizaron características morfológicas y fisiológicas hasta que el desarrollo de la biología
molecular permitió utilizar los constituyentes moleculares como nuevos criterios clasificatorios.
Así, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprobó que, a través de la
secuenciación de esta molécula, los procariotas quedaban divididos en dos grupos. El primero de ellos
incluye las bacterias más comunes, aisladas en su mayoría del cuerpo, suelo y agua denominándose
eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias que producen metano (metanógenas), ciertas
bacterias del azufre que pueden crecer en ambientes muy ácidos y calientes (termófilas extremas) y
bacterias que viven en ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron
arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxón superior a Reino que denominó Dominio (Dominio ---->
Reino ----> División ----> Clase ----> Orden ----> Familia ----> Género ----> Especie). Todos los seres
vivos se agruparían en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los cuales, dos son
exclusivamente microbianos y están compuestos únicamente por células procariotas pertenecientes al
Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero (Eukarya), formado por eucariotas, incluiría entre otros
los Reinos Protista, Plantae, Animalia y Fungi.
Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas
ventajas para su uso en la industria. La más fundamental, el pequeño tamaño de la célula microbiana y
su correspondiente alta relación de superficie a volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes
al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de
producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de
soya, que, a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana
extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos
(Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han
encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y
el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han
desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en
forma de esporas permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable,
permita el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una
extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Versatilidad
que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en
cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra
característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el
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producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un
relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo
industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito
importante es la facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son
aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que
estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de
filtrar.
Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos
pocos centenares de especies de entre las más de 100,000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que
se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se
puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos.
2.3.1 Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas
alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por
el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de
cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora
de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la
leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña
un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme
capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras
levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.
Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el
daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia
orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia
viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden
destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización industrial. Los hongos
son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soya, habichuelas, arroz y cebada
que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de
muchas enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico),
antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de los
champiñones.
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2.3.3 Bacterias
Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético,
Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es
productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del género
Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando
acetona y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros
Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante
fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a compuestos volátiles
(geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la producción de
antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
Los microorganismos presentan una gran variedad metabólica por lo que en distintos aislados
microbianos podemos encontrarnos una amplia variedad de compuestos. Una de las tareas de la
Microbiología Industrial es desarrollar procedimientos que permitan el aislamiento y selección de
microorganismos de interés industrial. A fin de tener éxito, los métodos de selección deben constituir
una actividad interdisciplinaria que combine actividades de microbiología, química, bioquímica,
ingeniería y bibliográficas. El éxito de un programa de selección depende de la fuente utilizada para la
obtención de los microorganismos y del método elegido para detectar la actividad deseada.
iii. Suelo: es el mayor almacén, pero también el más difícil de manejar ya que se pueden encontrar
todo tipo de microorganismos y en una concentración de 100 millones por gramo de suelo (gran
variedad y cantidad).
Para el aislamiento de nuevos productos metabólicos, los investigadores intentan aislar cepas a partir
de ambientes extremos o poco corrientes con la esperanza de que tales cepas sean capaces de
producir nuevos metabolitos. Por ejemplo, se están examinando microorganismos de las grandes
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altitudes, hábitats fríos, aguas marinas, profundidades de los océanos, desiertos, géiseres, campos de
petróleo, etc.
El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente en
microbiología, siguiendo el siguiente esquema a partir de una muestra de suelo:
3.- Muestras de estas series de diluciones (p.ej. 100 µL) se siembran sobre diversos medios de cultivo
(dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban.
5.- Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en medio sólido listos para
realizar las pruebas de selección.
Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar
los que tienen interés potencial de los que tienen interés real y mejorar estas cepas seleccionadas.
Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una población mixta (suelo,
fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de
microorganismos potencialmente útiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es
utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que interesa aislar. A este medio se
le pueden añadir inhibidores para eliminar los que no interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un
microorganismo aerobio lo creceríamos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no crecerían; o
bien si queremos seleccionar hongos, añadiríamos cloranfenicol, antibiótico que actúa frente a
bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parámetros generales que tenemos que tener en
cuenta son: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, aireación, temperatura, pH e inhibidores.
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Posteriormente se reaislan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su
posterior estudio.
Temperatura:
pH:
Una vez crecidas las colonias que interesan, se utiliza un medio que contenga el microorganismo que
sea susceptible de inhibirse su crecimiento por los antibióticos que queramos seleccionar: Gram +,
Gram -, amplio espectro, etc. Se aíslan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que produzcan
halos de inhibición.
Se necesita, al igual que para la detección de antibióticos, un microorganismo test que posea un
requerimiento absoluto para el factor de crecimiento que interesa (auxótrofos). Estos microorganismos
pueden ser bien mutantes naturales o mutantes provocados por la acción de agentes mutágenos. El
screening se realiza de forma similar al de la producción de antibióticos, aunque en este caso al medio
de cultivo le falta el factor de crecimiento buscado, de tal manera que el microorganismo test sólo
crecerá alrededor de las colonias que produzcan este factor de crecimiento (halo de crecimiento).
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3.- Selección de microorganismos productores de enzimas
Debido a la dificultad que entraña el manejo de microorganismos, siempre que sea posible, se recurre
a utilizar las enzimas producidas por éstos en lugar de las células enteras. A la hora de realizar el
screening se debe utilizar en el medio de enriquecimiento como fuente de carbono el sustrato del
enzima que buscamos (Amilasas ----> Almidón; Celulasas ----> Celulosa).
1. Subcultivo seriado
Este método es válido para cortos períodos de tiempo (semana - 15 días) por lo que deben ser
resembrados con frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminación. Además, al mantenerlos a
temperatura ambiente, pueden crecer y espontáneamente cambiar sus características genéticas
(mutación, pérdida de plásmidos, etc.) que pueden afectar al carácter por el que fueron seleccionados.
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Estos dos inconvenientes pueden subsanarse en parte enlenteciendo el metabolismo de los
microorganismos al mantenerlos a 4°C con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer
subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses. En microbiología industrial hay que pensar en mantener las
colecciones durante períodos de años y no de meses, por lo tanto se utilizan otras técnicas que
ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.
2. Desecación
Los soportes que se suelen utilizar son arena, suelo, sílica gel previamente secados y esterilizados por
calentamiento con aire caliente (no utilizar autoclave y sí calor seco). Sobre estos soportes se añade la
suspensión de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. También se pueden
utilizar como soportes discos o tiras de papel, agar , discos de gelatina donde se añade la suspensión
de microorganismos y posteriormente se seca al vacío evitando la congelación, lo que se denomina L-
secado (L-drying).
Estos métodos de secado son particularmente útiles para conservar microorganismos productores de
esporas, p.j. actinomicetos.
3. Congelación
Al bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el metabolismo
drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo con nitrógeno líquido (-196°C).
Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La formación de cristales
de hielo pueden romper las células, además al eliminar el agua líquida por convertirse en hielo existe
una concentración de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar
suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles así como utilizar agentes protectores como
el glicerol (25%) o dimetilsulfóxido (DMSO c.a. 10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar
el proceso de congelación de una forma rápida o gradualmente no está claro. Algunos recomiendan
una bajada gradual (1°C/min) hasta -20°C para posteriormente enfriar rápidamente. Sin embargo, la
descongelación debe ser rápida.
Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservación de los microorganismos por
congelación son:
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-70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) o ultracongeladores. Es el método más utilizado en los
laboratorios de microbiología.
-196°C: nitrógeno líquido. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares.
Existen varios problemas prácticos: el nitrógeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar
regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien
cerrados para evitar la entrada de nitrógeno líquido.
4. Liofilización
Es el método más utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo para la conservación de
los microorganismos. Básicamente consiste en congelar rápidamente una suspensión de
microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado
intermedio líquido. Por lo tanto, combina las dos técnicas anteriormente citadas ya que es una
desecación por sublimación. El sistema requiere tres componentes: mecanismo de congelación,
bomba de vacío y una trampa de agua.
Los liófilos se conservan entre 0 y 5°C durante muchos años. Para su recuperación se resuspende el
liófilo en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que
estudiar, como en los casos anteriores (desecación y congelación), las condiciones óptimas de
supervivencia de nuestro microorganismo.
Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no existe ningún método óptimo para
todos e incluso para un grupo particular de microorganismos ya que lo que funciona bien para algunos
no es útil para otros. No obstante, en líneas generales podemos asumir lo siguiente:
1. Algas y cianobacterias
La mayor parte de los cultivos se han mantenido como subcultivos seriados a temperaturas entre 10 y
15°C. Para crecer estos cultivos se necesita luz (fotosintéticos). Algunas cianobacterias pueden
conservarse bien desecadas ya que presentan formas de resistencia (akinetos). En general, las algas
no aguantan bien la liofilización ni la desecación. En cuanto a la congelación los mejores resultados se
obtienen con nitrógeno líquido.
2. Bacterias
Prácticamente se han usado todos los métodos conocidos con buenos y malos resultados, aunque en
líneas generales el mejor método es la liofilización debido a su facilidad de transporte.
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3. Virus
Se han utilizado todos los métodos obteniendo en líneas generales baja supervivencia. Se recomienda
para su conservación durante largos períodos de tiempo el nitrógeno líquido.
4. Hongos
La mayoría de los hongos pueden conservarse por desecación en suelo. Aunque, al igual que las
bacterias, presentan una gran diversidad encontrándonos de todo.
Cuando los microorganismos se separan de su hábitat (donde adquieren los nutrientes) y se cultivan
en laboratorio o industrias, se deben usar medios de cultivo que contengan los elementos químicos
necesarios para su crecimiento. Los nutrientes que requiere una célula para su crecimiento
(duplicación) vendrán determinados por la composición de la célula, que atendiendo a sus
necesidades se clasifican en cuatro grupos:
· Vitaminas y hormonas
Por lo tanto, los medios utilizados en el cultivo de los microorganismos contienen todos los elementos
en una forma adecuada para la síntesis del material celular y para la producción de productos
metabólicos. En la investigación con microorganismos en un laboratorio pueden utilizarse productos
químicos definidos puros para la obtención de medios de cultivo, pero en las fermentaciones
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industriales se utilizan frecuentemente, por motivos económicos, sustratos complejos casi indefinibles.
En muchos casos los ingredientes de los medios son subproductos de otras industrias siendo
extremadamente variados en su composición.
1. Fuentes de Carbono
Las melazas, un subproducto de la producción del azúcar, es una de las fuentes más baratas de
carbohidrato. Además de una gran cantidad de azúcar, las melazas contienen sustancias
nitrogenadas, vitaminas y elementos traza. Sin embargo, la composición de las melazas varía
dependiendo de la materia prima utilizada para la producción de azúcar (caña o remolacha) y la
calidad de las melazas depende de la localidad, condiciones climáticas y proceso de producción.
El extracto de malta, un extracto acuoso de la cebada malteada (cebada germinada que produce
enzimas que hidrolizan el almidón), es un sustrato excelente para muchos hongos filamentosos,
levaduras y actinomicetos. El extracto seco de malta contiene aproximadamente 90-92% de
carbohidratos y está compuesto de hexosas (glucosa y fructosa), disacáridos (maltosa, sacarosa),
trisacáridos (maltotriosa) y dextrinas (polímeros de glucosa a 1,4 con ramificaciones a 1,6). Las
sustancias nitrogenadas presentes en el extracto de malta incluyen proteínas, péptidos, aminoácidos,
purinas, pirimidinas y vitaminas. Los medios de cultivo que contienen extracto de malta deben ser
esterilizados cuidadosamente. Cuando existe sobrecalentamiento se produce la reacción de Maillard
debido al bajo pH y a la alta proporción de azúcares reductores. En esta conversión los grupos aminos
de las aminas, aminoácidos (especialmente lisina) o las proteínas reaccionan con los grupos carbonilo
de los azúcares reductores, aldehídos y cetonas, lo que resulta en la formación de productos de
condensación de color tostado. Estos productos de reacción no son sustratos adecuados para los
microorganismos.
Debido a su amplia disponibilidad y bajo coste, la celulosa está siendo extensamente estudiada como
sustrato de fermentación. La producción anual de celulosa se estima en 1011 toneladas; la mayor parte
de ella existe como residuos en formas tales como paja, residuos de las mazorcas, desechos de la
madera y residuos de papel. Frecuentemente no es posible utilizar la celulosa directamente como
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fuente de carbono, de forma que ha de ser hidrolizada primero química o enzimáticamente.
Los aceites vegetales como el aceite de soja, el aceite de algodón y el aceite de palma son utilizados
principalmente como cosustratos, siendo añadidos al medio en el que los carbohidratos proporcionan
la principal fuente de energía.
2. Fuentes de Nitrógeno
Una fuente de nitrógeno que es metabolizada eficientemente es el líquido de maceración del maíz, que
se forma durante la producción de almidón a partir de maíz. Este líquido contiene numerosos
aminoácidos como alanina, arginina, ácido glutámico, isoleucina, treonina, valina, fenilalanina,
metionina y cisteína.
Los extractos de levadura son excelentes sustratos para muchos microorganismos. Son producidos a
partir de la levadura de panadería mediante autolisis a 50-55°C o mediante plasmólisis en presencia
de altas concentraciones de NaCl. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas
solubles en agua y carbohidratos. La composición del extracto varía de un lote a otro, parcialmente
debido a que los sustratos utilizados para el cultivo de las levaduras afectan a la calidad del extracto
de levadura obtenido.
Las peptonas (hidrolizados de proteínas) pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son
relativamente caras para la aplicación industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, caseína,
gelatina, queratina, semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodón y semillas de girasol.
La composición de las peptonas varía dependiendo de su origen. El producto final está también influido
por el tipo de hidrólisis (ácida o enzimática) especialmente en relación a su contenido en triptófano.
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