Practica - PCR y Electroforesis

ESCUELA SUPERIOR POLTÉCNICA DE
CHIMBORAZO
FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA: BIOQUÍMICA Y FARMACIA
GUÍA DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA

PARALELOS: A
PRÁCTICA No. – REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORÉSIS
1. DATOS GENERALES
NOMBRE (S): estudiante(s) CODIGO(S): estudiante(s)
Mayra Galarza 3895

Michelle Madrid 3265
Pamela Mañay 3102
Joseline Vizueta 4028
FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

11/02/2021 18/02/2021
2. MARCO TEÓRICO
Imagen 1. Fundamentos de PCR

La técnica de PCR, cuyas siglas en inglés significan “Reacción en cadena de la polimerasa” es una
técnica de biología molecular que permite detectar un fragmento de ADN de un patógeno (virus,
bacterias, hongos u otro) o mutaciones genéticas que deseamos saber si se encuentran en una
muestra clínica (sangre, esputo, biopsia, suero, etc.). Dentro del ADN de un patógeno existen regiones
únicas que lo diferencian de otros patógenos, a esta región se le denomina marcador molecular.
Antes de realizar una PCR, se debe extraer el ADN mediante el uso de reactivos que permitan liberarlo
de una muestra clínica. Debido a que el ADN es difícil de observar o detectar por métodos serológicos,
inmunológicos o microscópicos, se emplea la técnica de PCR. Esta técnica se basa en la multiplicación
exponencial de una región de interés del ADN mediante el uso de elementos (enzima, cebadores,
nucleótidos) que son específicos para cada patógeno o mutación, y empleando un equipo llamado
termociclador. Este equipo va realizar cambios de temperatura sobre el ADN permitiendo que se
duplique a un número tan grande que pueda ser detectado por un software donde el resultado es
obtenido de manera objetiva. La forma de detección depende del tipo de PCR. (Herschhorn & Hizi ,
2010)
Existen dos tipos de PCR: PCR convencional y PCR en tiempo real. Ambas tienen el mismo principio
de multiplicar la región de interés, pero se diferencian en que la PCR en tiempo real es más específica
debido al uso de otros elementos denominados sondas y tiene la ventaja de que la detección se va
realizando mientras aumenta el número de copias de la región de interés, es decir que la detección se
hace en tiempo real permitiendo de esta forma, además de detectar, cuantificar la cantidad de ADN del
patógeno que pueda encontrarse en la muestra clínica.
Entre otros tipos de PCR tenemos:
• PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de
fragmentos, ya que se realiza en 2 PCR consecutivas.
• PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios fragmentos de ADN a la vez, en
una sola reacción y con una sola muestra. Esto nos permite detectar varios patógenos en una
sola muestra.
• PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): en este caso se extrae ARN a partir de la muestra.
Luego, este ARN se convertirá en ADN por un proceso llamado transcripción reversa. En este
proceso se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utilizan algunos virus como
el VIH, la hepatitis C, entre otros. Además, de detectar virus, este tipo de PCR también nos
permite determinar el nivel de expresión de un gen en particular. (Tamay de Dios, Ibarra , &
Velasquillo, 2013)
TIPOS DE PCR QUE SE LLEVA A CABO PARA EL ANÁLISIS DEL SARS-COV-2

La RT-PCR en tiempo real es un método nuclear que detecta la presencia de material genético
específico de los patógenos, como los virus. Inicialmente el método utilizaba marcadores de isótopos
radiactivos para detectar materiales genéticos específicos pero, tras la realización de mejoras, el
marcado isotópico se ha sustituido por marcadores especiales, que suelen ser colorantes
fluorescentes. A diferencia de la RT-PCR convencional, que solo arroja los resultados al final, esta
técnica permite a los científicos observar los resultados de manera casi inmediata mientras el proceso
sigue en curso. (Jawerth, 2020)
Imagen 2. Técnica RT-PCR tiempo real para la detección del coronavirus
Aunque actualmente la RT-PCR en tiempo real es el método que más se utiliza para detectar los
coronavirus, muchos países siguen necesitando ayuda para poner en marcha la técnica y utilizarla.
La RT-PCR en tiempo real es una técnica muy sensible y precisa que puede ofrecer un diagnóstico
fiable tan solo en tres horas, aunque a los laboratorios suele tomarles entre seis y ocho horas de
media. En comparación con otros métodos disponibles de aislamiento de virus, la RT-PCR en tiempo
real es bastante más rápida y tiene menos posibilidades de contaminación o error, ya que todo el
proceso puede llevarse a cabo en tubos cerrados. De los métodos existentes, sigue siendo el más
exacto para detectar el coronavirus.
La RT-PCR en tiempo real no sirve para saber si alguien estuvo infectado por el virus, lo cual es
importante para comprender su desarrollo y propagación, ya que los virus solo están presentes en el
organismo durante un período determinado. Para detectar, seguir y estudiar infecciones pasadas, en
particular las que han podido cursarse o propagarse de manera asintomática, se precisan otros
métodos. (Jawerth, 2020)
3. OBJETIVOS:
3.1. Objetivo General
• Conocer cómo se lleva a cabo el análisis de ADN a través de la reacción en cadena de la
polimerasa y electroforesis.
3.2. Objetivos Específicos
• Determinar la utilidad de la reacción en cadena de la polimerasa.
• Establecer la utilidad del procedimiento de electroforesis
4. INSTRUCCIONES
4.1. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Equipos y materiales
• Termociclador
• Tuvo especial (PCR)
• Pipeta automática
Reactivos
• Extracción de muestra de ADN
• PRIMER 1 y 2
• Nucleótidos
• ADN polimerasa
Procedimiento
4.2. ELECTROFORESIS
Equipos y materiales
• Microondas
• Cámara de electroforesis
• Erlenmenyer
• Molde (gel)
• Peine (gel)
• Tuvo especial
• Pipeta automática
Reactivos
• Extracción de muestra de ADN
• Agarosa
• Buffer
Procedimiento
1. Preparación del gel
2. Proceso Electroforesis
5. RESULTADOS OBTENIDOS
Como resultados puedo decir que la PCR es una reacción enzimática in vitro la que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia del
blanco es copiada. Por lo que la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que
tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. Si usamos en la reacción, como
sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN
complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-
PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante una
reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz
de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. La PCR es una herramienta importante porque
produce suficientes copias de una secuencia de ADN para poder ver o manipular esa región de ADN.
(Espinosa, 2007, págs. 517-526.)
La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a
través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se
incluye un estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los
fragmentos en la muestra de PCR. (Tamay de Dios L, 2013)
Esta técnica es muy importante en la biología molecular porque con ella se ha logrado la
simplificación e innovación de muchas técnicas moleculares que permiten abordar nuevas líneas de
investigación en diferentes ramas de la ciencia como biotecnología, ecología, evolución, biología de la
conservación, arqueología, patología, medicina forense.
6. CONCLUSIONES
• Al realizar la práctica de PCR se obtiene una amplificación de una secuencia específica de ADN que
se repite millones de veces, lo que permite identificar material genético de microorganismos.
La Electroforesis por otro lado permite separar fragmentos de ADN en función del tamaño de
estos fragmentos utilizando para ello una matriz hecha de gel.
• La PCR se utiliza forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis
forense de ADN, el diagnóstico de infecciones y a comprobar la eficacia de un determinado
tratamiento frente a esa infección.
• La electroforesis tiene utilidad en varias ramas de la investigación, tales como: biotecnología,
ecología, evolución, biología de la conservación, arqueología, patología, medicina forense.
7. RECOMENDACIONES
• La presión en cuanto a la cantidad de reactivos a utilizar tanto en PCR como en la Electroforesis
debe ser exacta para evitar errores.
• Se debe tener el procedimiento de la técnica que se va a llevar a cabo para evitar confusiones.
• En el caso de la electroforesis se debe analizar el tipo de gel mas adecuado al resultado que se
desea obtener.
ANEXOS
ANEXO I: BIBLIOGRAFÍA:
1. Herschhorn , A., & Hizi , A. (2010). Transcriptasas inversas retrovirales. Madrid. Recuperado el 16
de Febrero de 2021, de https://yuenlab.com/pcr-2/
2. Jawerth, N. (29 de 09 de 2020). Organismo Internacional de Energía Anatómica. Obtenido de
https://www.iaea.org/es/newscenter/news/pcr-en-tiempo-real-covid-19
3. Tamay de Dios, L., Ibarra , C., & Velasquillo, C. (Agosto de 2013). Fundamentos de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Tecnología en salud, 2(2), 70-78.
México, Xochimilco, México. Recuperado el 16 de Febrero de 2021, de
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
4. Espinosa, L. (2007). Guía práctica sobre la técnica de PCR. México, D. F.: Universidad Nacional
Autónoma de México.
5. Tamay de Dios L, I. C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
de la PCR en tiempo real. medigraphic, 1-9.
-----------------------------------------------
LCDA. KAREN ACOSTA LEÓN, MSC.
FARMACOGNOSIA I

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Imagen 2. Técnica RT-PCR tiempo real para la detección del coronavirus

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