INFORME DE LABORATORIO #1: ELABORACIÓN DE FROTIS Y

COLORACIÓN DE GRAM

INTEGRANTES: LEAL FLÓREZ ORIANA GABRIELA

VILORIA CABALLERO MANUEL ANDRÉS

DOCENTE: Microbióloga Médica NERLYS THOMAS SERRANO

ASIGNATURA: LAB. DE MICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA
SEMESTRE IV
 INFORME DE LABORATORIO #1: ELABORACIÓN DE FROTIS Y
COLORACIÓN DE GRAM

 PROPÓSITO
El objetivo de esta práctica fue realizar la introducción a las técnicas de estudio
para la observación de microorganismos en el laboratorio de microbiología a
través de la adquisición de conocimientos acerca de los fundamentos necesarios
para una elaboración de frotis y una coloración de Gram de forma correcta, sus
utilidades en la práctica médica, además de su posterior realización. De igual
manera, aprender cómo se visualizan las estructuras con la coloración de Gram a
través del microscopio.

 MARCO TEÓRICO
La coloración de Gram es una de las técnicas de identificación de bacterias más
usadas en el campo de la medicina y bacteriología, descubierta en 1884 por Hans
Christian Gram. El objetivo de Gram era diferenciar los grupos de bacterias para
poder estudiar sus propiedades, esto a través de colorantes específicos,
permitiendo, de esta manera, no solo distinguir el tipo de bacteria sino también su
morfología.
Para lograr realizar este tipo de tinción se hace necesario la utilización de dos
colorantes; Uno de carácter primario, como el cristal violeta, y otro de contraste,
como la safranina. También se utiliza un fijador para el colorante de contraste,
como es el lugol, y además un decolorante como el alcohol/acetona.
Existen dos clasificaciones que se pueden obtener en el procedimiento: bacterias
grampositivas y bacterias gramnegativas, y su fundamento radica en la
conformación de la pared celular de dichas bacterias; las bacterias grampositivas,
por su parte, poseen una pared celular compuesta, principalmente, por una gruesa
capa de peptidoglucanos y ácidos teicoicos, mientras que las gramnegativas
presentan una gran cantidad de lípidos en su pared celular, como lipopolisacáridos
y lipoproteínas, una capa muy delgada de peptidoglugano y carecen de ácidos
teicoicos. En lo que se refiere a la coloración, las grampositivas adquieren una
tonalidad violeta y las gramnegativas obtienen una tonalidad rosácea.
Figura 1. Composición de la pared celular de bacterias grampositivas y
gramnegativas.

La técnica de tinción de Gram junto con la morfología anteriormente descrita

funciona para categorizar las bacterias en cocos gramnegativos, cocos
grampositivos, bacilos gramnegativos o bacilos grampositivos.

Esta técnica de tinción cuenta a su vez con algunas limitaciones puesto que sólo
sirve para la tinción y clasificación de bacterias, ya que en los hongos se observa
una tinción irregular y las células vegetales y animales superiores no tienen la
capacidad de conservar uno de los colorantes. De igual manera, no funciona para
la clasificación de bacterias como mycobacterias y mycoplasmas, debido a que
las mycobacterias poseen una estructura anexa y variable llamada capsula y los
mycoplasmas carecen de pared celular.

A pesar de su descubrimiento hace ya varias décadas, esta técnica tiene una gran
vigencia hoy en día debido a su recurrente utilización en los laboratorios de
diagnóstico clínico. Los laboratorios de microbiología cuentan, incluso, con
aparatos de tinción automática. Tras la realización de un frotis bacteriano a partir
de una muestra cultivada, ésta se introduce en el aparato y se realiza la tinción de
Gram.
  MATERIALES

 Colorantes para la coloración de Gram: Cristal violeta, solución de Lugol,

alcohol-acetona, Safranina.
 Cultivos de bacterias (cocos y bacilos)
 Láminas de portaobjetos y de cubreobjetos
 Solución salina

 ESQUEMAS DE PROCEDIMIENTO

1. Al iniciar la práctica la profesora realizó una introducción acerca de la temática a

trabajar. Esta introducción contó con la participación de los estudiantes
2. Se preparó el área de trabajo encendiendo el mechero y colocándose los
guantes junto a las otras medidas de protección
3. Se prepararon dos portaobjetos a los que se les añadió una gota de agua
destilada.
4. Se procedió a tomar una muestra de mucosa bucal obtenida del carrillo de la
boca tras realizar un raspado con un mondadientes o palillo. Con este objeto (con
la punta que tenía la muestra) se realizó el frotis en uno de los portaobjetos sobre
la gota de agua destilada. Se cubrió con el cubreobjetos y se observó al
microscopio con el aumento de 40x.
5. Luego se tomó un asa bacteriológica, se esterilizó en el mechero y se enfrió a
un costado de la caja de Petri donde se encontraba el medio de cultivo con las
colonias de bacterias. Se tomó una muestra de una de las colonias con el asa y se
procedió a realizar el extendido masivo al colocar el asa sobre la gota de agua en
el portaobjetos.
6. Se dejó secar el portaobjetos con la muestra a temperatura ambiente y se
flameó en el mechero 3 veces para fijar la muestra.
7. Procedimos a realizar la tinción de Gram en el área especificada con la ayuda
del técnico de laboratorio
8. Se añadió a la muestra el colorante primario (cristal violeta) el cual tiñe el
citoplasma bacteriano y se dejó actuar por un minuto, luego se lavó el
portaobjetos.
9. Posteriormente se añadió lugol que actúa como fijador, se dejó reposar por un
minuto también y se realizó nuevamente el lavado.
10. Luego se agregó el decolorante (alcohol-acetona) pero este sólo se dejó
actuar por 15 segundos. Se procedió a lavar la muestra nuevamente.
11. Por último se agregó el colorante de contraste Safranina por 5 segundos, se
lavó la muestra y se dejó secar.
12. Una semana después nos dispusimos a observar los resultados colocando la
muestra en el microscopio y observándola con un aumento de 40x. Luego
agregando una gota de aceite de inmersión la muestra fue observada con el
objetivo de 100x para la identificación del tipo de bacteria.

Figura 2. Se adicionó el
colorante primario (Cristal
Violeta)

Figura 3.
Se adicionó el fijador (Lugol).
Figura 4.
Se adicionó el colorante de
contraste (Safranina)

Figura 5.
Lavado realizado tras la adición
de cada reactivo utilizado en la
tinción.
  RESULTADOS

Figura 6.
Membrana
plasmática Observación del frotis de la mucosa
bucal en aumento de 40x.
Se identifican células epiteliales
que recubren esta cavidad.

Núcleo

Figura 7.
Observación de la muestra de
tinción de Gram realizada por
el grupo en aumento de 100x.
Se identifican bacilos cortos
gramnegativos.
 Figura 8.
Observación de una muestra
de tinción de Gram facilitada
por la docente en un aumento
de 100x.
Se identifican bacilos largos
gramnegativos.

 ANÁLISIS DE DATOS

En la figura número 6 se pueden observar células del tejido epitelial de la mucosa

bucal, con una forma irregular o ameboide. Estas células lograrían apreciar mejor
con la adición de algún tipo de colorante, pero en esta caso podemos confirmar
que son células epiteliales al apreciar las delimitaciones que nos indican su nucleo
y su membrana plasmática, las cuales se encuentran señalas en la imagen. Cabe
resaltar que en esta práctica no se logran observar microorganismos debido a
inconvenientes a la hora de tomar la muestra.
En las figuras numero 7 y 8 se pueden identificar bacilos cortos gramnegativos y
bacilos largo gramnegativos, respectivamente. Se dicen que son bacilos ya que
tienen una estructura alargada, que se diferencia de las demás formas que
pueden adquirir las bacterias, sin embargo, estos bacilos se pueden distiguir entre
cortos y largos debido a su longitud, y son gramnegativos por poseer una
coloración rosa con la tinción de Gram. Esto se debe a que su pared celular está
compuesta, en su mayoría por lípidos, y tienen una capa muy delgada de
peptidoglucano. Estos lipidos, al hacer contacto con el solvente orgánicos, se
disuelven y la pared de proteoglucano no tiene el grosor o la fuerza suficiente para
contener el colorante (Cristal Violeta), por tanto, la bacteria se decolora. (Las
grampositivas al tener una pared gruesa de peptidoglucano logran contener en su
interior el colorante, de esta manera, quedan muy teñidas de color violeta).
  CAUSAS DE ERROR
Al momento de observar el frotis con la muestra de mucosa bucal no se encontró
lo que se pretendía hallar al comienzo de la práctica, que era la presencia de
células epiteliales junto a microorganismos que se encuentran de forma natural y
hacen parte de la flora o microbiota de la cavidad bucal. Esto pudo presentarse
por dos motivos; al inicio de la práctica el primer microscopio utilizado tenía
suciedad presente en la lente de aumento de 40x lo que impidió la correcta
visualización de las diferentes células. Al pasar la muestra a un microscopio en el
que la lente estaba limpia simplemente se visualizaron las células epiteliales, aquí
es donde entra el segundo motivo, no se tomó con suficiente fuerza la muestra de
la parte interna de la mejilla con el palillo o mondadientes.
Al observar los resultados de la tinción de Gram tomada por este grupo el
microscopio asignado presentó el mismo problema de suciedad en su lente de
aumento 100x por lo que debió utilizarse otro microscopio en el que si se
observaron los resultados deseados que se pueden apreciar en la figura 7.

 CONCLUSIONES
Al finalizar la práctica se pudo concluir que para realizar y observar los
procedimientos correspondientes, tanto el frotis como la tinción de Gram, de
manera correcta es necesario que cada uno de los implementos indispensables
para llevarlos a cabo se encuentren en una excelente condición y cumplan con los
requisitos de limpieza y mantenimiento. Asimismo, los procedimientos realizados
por parte de los estudiantes deben realizarse de forma cuidadosa y precisa para
evitar incurrir en errores y nos priven de obtener los resultados acertados.
Además se puede concluir que el aprendizaje de las bases de la coloración de
Gram más su correcta realización, es esencial para la práctica médica, ya que no
solo contribuye a obtener información acerca de la diferenciación de la bacteria,
sino también sobre su morfología y su respuesta leucocitaria, que nos brinda un
apoyo para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades producidas por estos
microorganismos.

 CONSULTA

1) Investigar causas que alteran la coloración de Gram

Entre los factores que alteran la concentración de Gram:

 Edad de la bacteria: En los cultivos viejos de bacterias grampositivas
existe la posibilidad de que estas hayan perdido varias capas de
peptidoglicano de su pared celular, tendiendo a dar como resultado en la
coloración una tinción rosácea, correspondiente a los gramnegativos.

 Uso de antibióticos: Si existe el uso previo de antibióticos antes de tomar

la muestra para la tinción de Gram, la pared de los microorganismos
existentes resultará afectada y podría no teñir, dando como resultado un
falso positivo.

 Error del operador: Si durante el procedimiento, la persona encargada de

realizar la tinción comete errores como: fijar el frotis antes de estar seco, no
escurrir el Lugol completamente, no esperar el tiempo suficiente para dejar
el alcohol-acetona actuar, dejar la solución de Safranina por mucho tiempo,
no dejar actuar el Lugol, dejar por mucho tiempo el alcohol-acetona, etc.
Todas estas acciones pueden conllevar a un falso-positivo.

2) ¿Cuáles son las bacterias resistentes a la coloración de Gram?

 Mycoplasmas (carecen de pared)
 Mycobacterias (poseen cápsula)
 Bacterias con forma L (pierden su pared ocasionalmente)
 Protoplastos (eliminan totalmente su pared)
 Esferoplastos (eliminan parcialmente su pared)

3) ¿Qué fin tiene la fijación de las muestras al realizar un frotis

bacteriano?
El Lugol se utiliza como mordiente para que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad en la pared de la célula bacteriana.

4) Señale cuatro géneros bacterianos Gram positivos y cuatro Gram

negativos

-Grampositivos:
-Clostridium
 -Corynebacteirum
-Staphylococcus
-Streptococcus

-Gramnegativos:
-Pseudomonas
-Helicobacter
-Moraxella
-Legionella

ANEXO
PRÁCTICA #2: COLORACIÓN DE ZIELH NEELSEN

 MARCO TEÓRICO

Existen bacterias cuya composición de pared no permite que estas se coloreen

con la tinción de Gram como el Mycobacterium tuberculosis lo que las clasifica
como microrganismos ácido-alcohol resistente, y en este caso sería un bacilo
ácido-alcohol resistente (BAAR), lo que conlleva a la necesidad de utilizar calor
sumado un colorante diferencial llamado Ziehl Neelsen para así lograr la tinción y
su posterior estudio. Además, al tratarse de una tinción diferencial, es necesario el
uso de más de un colorante para poner de manifiesto la afinidad por ciertos
colorantes de determinados microorganismos o estructuras de los mismos. Esta
afinidad puede definirse como la «fuerza» con la que queda retenido el colorante,
que no se elimina con ácido-alcohol.
Es una tinción diferencial ideada por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un
bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Su finalidad es la de identificar
mycobacterias (fuertemente ácido-alcohol resistentes), nocardias (débilmente
AAR), actinomices (débilmente AAR) o parásitos como cryptosporidium.
Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden identificarse mediante la
coloración de Gram, técnica común para la identificación de bacterias, debido a
que dichas bacterias poseen una pared celular con una alta cantidad de ácidos
micólicos que le confieren esta resistencia a los decolorantes usados
normalmente, como la combinación de alcohol-ácido. Además, con la tinción de
Zielh Neelsen no es necesario el uso de fijadores como el Lugol, ya que el calor
empleado convierte la pared en un medio maleable para permitir el paso del
colorante.
Existen variantes para este tipo de tinción; Una de ellas es la denominada variante
en frío o Tinción de Kinyoun. Y la otra es la variante histológica destinada a la
búsqueda e identificación de microorganismos ácido-alcohol resistentes en tejidos.

Figura 9. Pared celular de

las bacterias ácido-alcohol
resistente
 Figura 10. Tinción con Zielh-
Neelsen de Mycobacterium
tuberculosis

Figura 11. Tinción de Zielh-Neelsen

de Mycobacterium tuberculosis

 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Rodríguez, F. Tinción de Gram. Blog de Laboratorio Clínico y Biomédico.
[Consultado en: 28 agosto 2019]. Disponible en: https://www.franrzmn.com/tincion-
de-gram/
- Saceda, D. Webconsultas. Tinción de Gram. [Consultado en: 28 agosto 2019].
Disponible en: https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/tincion-de-gram-
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- Garrido Farña Germán Isauro, Miguel Angel Cornejo Cortes y Elsa Salinas
Jiménez , 2003 “Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas”
UNAM México 95 pp.
- Forbes, B.A., Sahm D. F. Weissfeld A.S. 1993 Bailey & Scott's Diagnostic
Microbiology. 506 pp
- Schlegel, H. G.. 1997. “Microbiología general” 9. ed. Barcelona : Omega, 654pp
-Jiménez, G. Investigaciones dinamica. Tinción de Gram de tejido: alcances y
limitaciones. [Consultado en: 28 agosto 2019].
https://www.dinamicaips.com.co/files/investigaciones/2013_investigacionesdinamic
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-Wikipedia. Tinción de Gram. [Consultado en: 28 agosto 2019]. Disponible
en:https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci
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-
-Montenegro, D. SlideShare. Tinción Gram. [Consultado en: 28 agosto 2019].
Disponible en: https://www.slideshare.net/armandomontenegrojordan/tincin-gram-
70454332

-Rodríguez, F. Tinción de Gram. Blog de Laboratorio Clínico y Biomédico.

[Consultado en: 28 agosto 2019]. Disponible en: https://www.franrzmn.com/tincion-
diferencial-de-ziehl-neelsen/