Facultad Ciencias de la Salud

Escuela de Patología Médica

Licenciatura en Histotecnología

Paola Piruzza Profesor: Dr. Davide Mobili Rocaro

C.I.: 27.541.126
M. Verónica González B
C.I.: 23.863.791

Guía práctica de laboratorio

Coloraciones de rutina

Introducción.

Color: Es la impresión óptica en cuanto a absorción y reflejo de luz ocasionado por un

cuerpo según las longitudes de onda.

Colorante: Cuerpos químicos coloreados que pueden transmitir su color a otro cuerpo
provenientes de cuerpos incoloros de tipo de hidrocarburos aromáticos. Estos cuerpos
químicos pueden clasificarse en varios tipos, según su origen, naturaleza química,
mecanismos de acción. A continuación serán explicados cada uno a través de mapas
conceptuales.

Según su origen.

Naturales: Provienen de elementos que se Artificiales: Derivados de la destilación de la

encuentran cotidianamente en la naturaleza, hulla que es tipo de carbón.
como plantas, animales. Pueden ser extraídos a Nitrados, Azoicos, Quinoicos, Fenilmetanos,
través de procesos de pulverización o secado. Quinoleinas,
Hematoxilina, Azafrán, Carmín.

Según su naturaleza química.

Ácidos o citoplasmáticos: Son colorantes Básicos o nucleares: Son colorantes con pH

con pH menor a 7, que se unen por
mayor a 7, que se únen por atracción eléctrica a
atracción eléctrica a elementos de pH
básico que contienen grupos catiónicos elementos de pH ácidos que contienen grupos
(R+). Por lo tanto, estos elementos básicos catiónicos (R-). Por lo tanto, estos elementos
tienen apetencia por los grupos aniónicos ácidos tienen apetencia por los grupos
(R-) de los colorantes ácidos, a este catiónicos (R+) de los colorantes básicos, a este
fenómeno, se le denomina acidofília. fenómeno, se le denomina basofília Poseen
Poseen grupos NH3+ grupo Neutros: Están formados simultáneamente
amino
protonado. de colorantes ácido ygrupos sulfatos
básicos, (SO4=)
donde el o, fosfatos (PO4=).
Hematoxilina, Azul de Toluidina
Azul de anilina, Fucsina ácida precipitado resultante es soluble
exclusivamente en alcohol, tiene la
propiedad tintorial de sus componentes
ácidos y básicos.
 Según su mecanismo de acción.

Físicos. Químicos. Físicos-químicos.

Físicos: El colorante penetra en los intersticios del cuerpo coloreable y se mantiene allí por
la cohesión molecular. Pueden ser por disolución del colorante en distintas sustancias o
componentes tisulares, y por impregnación metálica que es la precipitación de sales
metálicas sobre estructuras con diferente densidad.

Químicos: Detección de una sustancia determinada a través de una unión química

específica, como por ejemplo, las células microbianas son ricas en ácidos nucleicos que
portan cargas negativas en formas de grupos fósfato combinándose como colorante básicos
cargados positivamente.

Físicos-químicos: En este caso el colorante se une a la sustancia coloreable combinándose

conjuntamente con ella por la presencia de agrupaciones moleculares básicas y ácidas en
los tejidos que se unirán con los grupos ácidos y básicos de los colorantes.

Actuación de los colorantes

Para que una sustancia incolora, pueda tener color y transmitirlo a su vez es necesario el uso
de algunos grupos químicos que llevan a cabo el proceso de tinción de muestras biológicas.
Toda sustancia incolora se combina inicialmente con grupos cromóforos que le confieren
color al cuerpo de la sustancia, esto grupos poseen un doble enlace que son capaces de
desplazar sus bandas hacia el espectro visible donde la sustancia presenta color, sin
embargo, esto no le proporciona a esta sustancia la capacidad de transmitir su color, este
producto recibirá el nombre de cromógeno. Por otro lado los grupos cromóforos se clasifican
en las siguientes moléculas, C=O (carbonilo), N=O (nitroso), N=N (azoico).

Aunado a esto, para que el cromogéno pueda conferir su color a otro cuerpo debe ser
ionizado, esta actividad la realizan los grupos auxocrómos que son moléculas o radicales
libres, se clasifican en grupos aminos, hidroxilos y halógenos, la unión de cromógeno más
auxocrómo conforman el colorante.

En resumen: Sustancia incolora + Cromóforos = CROMÓGENO

CROMÓGENO + AUXOCRÓMO = COLORANTE

Coloraciones de rutina
Son protocolos o pasos específicos aplicados en el laboratorio de anatomía patológica que
se utilizan para conferirle color a muestras biológicas para su posterior observación al
microscopio óptico, a causa de que las muestras extraídas de cuerpos biológicos son
incoloras en su naturalidad. Asimismo, existen gran cantidad de distintos métodos de
coloración, sin embargo, nos referimos a coloraciones de rutina cuando hacemos énfasis a
los más aplicados comúnmente. Estas coloraciones se pueden clasificar de distintas
maneras según su modalidad de aplicación.

Clasificación de las coloraciones

Simple: Se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamente el microorganismo,

utilizándose fundamentalmente para observar su morfología y tamaño.

Tinción compuesta: Se utiliza más de una sustancia tintórea, los colorantes se aplican a la
preparación separados o juntos formando parte de una solución, también reciben el nombre
de coloraciones diferenciales. Puede ocurrir de dos formas, sucesiva que se refiere a la
aplicación de varios colorantes en tiempos consecutivos, o simultánea que trata de la
aplicación de todos los colorantes que lo componen al mismo tiempo.

Progresiva: Se trata del proceso de tinción en donde la muestra o preparado biológico es

sumergido en el colorante por un tiempo determinado hasta lograr la coloración deseada.

Regresiva: Se trata de proceso de tinción en donde la muestra atraviesa un proceso de

sobre coloración para su posterior diferenciación, es decir, es impregnado con el colorante y
luego es diferenciado que se refiere a eliminar el exceso del reactivo hasta lograr la
coloración deseada.

Directa: El colorante es capaz de conferir su color a la muestra biológica sin la necesidad de

alguna sustancia adicional.

Indirecta: Se trata del mecanismo en donde se utiliza un mordiente que funcione como
eslabón o puente entre el colorante y el preparado biológico para poder conferirle su color.

Panóptica: Se refiere a un método de tinción que se realiza de forma sucesiva donde se

combinan colorantes neutros.

Pancrómica: Es una sola sustancia compuesta por todos los colorantes neutros que se
necesiten.

Ortocromática: El reactivo confiere a la muestra el mismo color que contenga.

Metacromática: El reactivo colorea algunos elementos tisulares de un color diferente al que

posee pudiendo colorear varios elementos de distintos colores.

Tinción Hematoxilina-Eosina
Hematoxilina: Sustancia cristalina incolora obtenida del palo de Campeche, es un colorante
de origen natural y básico. Introducida en la histología por un investigador llamado Waldeyer
en 1863. Se convierte en colorante mediante su oxidación o maduración donde el producto
resultante se denomina hemateína, una vez obtenido este producto es necesario el uso de
mordiente, el más rutinario es la sal férrica. Existen muchas fórmulas de hematoxilina, y
llevan los nombres de los investigadores que las crearon, como la hematoxilina de Mayer,
Harris, etc.

Eosina: Son colorantes sintéticos derivados de la fluoresceína. Las eosinas son usadas de
dos formas, solución alcohólica y solución acuosa, las principales son eosina A amarillenta,
es soluble en agua, metil eosina o soluble en alcohol, etc. Es un colorante ácido o
citoplasmático. Tiñe de color rosado, anaranjado, rojo.

Objetivos de la práctica.

1) Aprender los distintos conceptos generales referentes a los tipos de mecanismos de

acción, origen y naturaleza química de los distintos protocolos de tinción existentes
según los conceptos explicados aplicados a muestras biológicas.
2) Definir los mecanismos de acción, origen y naturaleza química acerca del protocolo de
coloración de hematoxilina-eosina utilizado como la tinción rutinaria para tejidos.
3) Explicar los resultados efectuados a través del protocolo de coloración de
hematoxilina-eosina sobre muestras biológicas.
4) Demostrar los conocimientos adquiridos a través de la práctica sobre las teorías
básicas de las coloraciones de rutina.

Materiales, instrumental y reactivos.

Estufa
Matraz Erlenmeyer
Matraz Aforado
Vidrio reloj
Gasa
Embudo
1lt de Agua destilada
50 gr de sulfato alumínico
1gr de hematoxilina cristalizada
1 gr de ácido cítrico
50 gr de hidrato de cloral
0,2 gr de yodato de sodio

100 ml de etanol a 95°

0,5 gramos de eosina “Y”
Gotas de ácido acético glacial

Fase experimental

Preparación de los reactivos

Hematoxilina
En un litro de agua destilada disolver 50 gramos de sulfato alumínico potásico o de amonio.
Cuando esté completamente disuelto, agregar 1 gramo de hematoxilina cristalizada. Al
disolver en su totalidad, se adiciona 1 gr de ácido cítrico junto a 50 gr de hidrato de cloral y
0,2 gr de yodato de sodio.
La mezcla se hierve por 5 minutos, luego se deja enfriar y se filtra para eliminar las partículas
sólidas que hayan quedado. El reactivo así preparado puede ser usado inmediatamente.

Eosina
Se puede preparar con base alcohólica o con base acuosa.

Eosina alcohólica
En 100 ml de etanol a 95° disolver 0,5 gramos de eosina “Y”. Luego adicionar unas gotas de
ácido acético glacial.
Eosina acuosa al 2%
En 1250 ml de agua destilada disolver 25 gramos de eosina “Y” hidrosoluble. Luego adicionar
unas gotas de ácido acético glacial.

Protocolo aplicado para muestras histológicas

La tinción de cortes histológicos pasa por una serie de pasos. Lo primero es la obtención del
corte histológico. Este debe ser parafinado para luego obtener los cortes (ultra-finos) con un
micrótomo. La técnica consta de los siguientes pasos:
Eliminación del exceso de parafina: Para ello se puede utilizar xilol o Hemo –D, sumergir
por 3-5 minutos.
Rehidratación de la muestra: Esto se logra sumergiendo la muestra en distintas
concentraciones de alcoholes (etanol) en orden descendente (100°, 90°, 70°). En todos los
casos por 7 minutos.
Eliminación del exceso de alcohol: Para ello se sumerge en agua por 7 minutos.
Coloración con hematoxilina: La muestra se sumerge por 6-10 minutos en una bandeja
que contiene hematoxilina. El tiempo de exposición depende del tamaño y grosor de la
muestra.
Eliminación del exceso de hematoxilina: Se lava con agua por 5 minutos y luego se
realiza un pasaje rápido (10-20 segundos) por alcohol ácido. Posteriormente se lava con
agua nuevamente por 5 minutos. Luego se sumerge en etanol a 96° por 1 minuto.
Coloración con eosina: Para ello se sumerge la muestra por 5 minutos en la bandeja de
eosina.
Deshidratación de la muestra: Para ello se vuelve a pasar por las bandejas de alcoholes
(etanol), pero esta vez en orden ascendente. (70°, 90°, 100°). (Por 5 segundos, 5 segundos,
1 minuto respectivamente).
Clarificación de la muestra: Para ello se expone al xilol por 5-10 minutos y se seca para
sellar de forma definitiva con bálsamo de Canadá u otro material similar.
Montaje: aplicar una o dos gotas de resina acrílica y colocar una laminilla cubreobjetos

Resultados.
Bibliografías
https://www.ecured.cu/Colorante
https://www.lifeder.com/tincion-hematoxilina-eosina/
https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/2-metodos-fijacion.php
Pre-laboratorio.

Complete el glosario colocando la palabra correcta sobre los conceptos definidos en esta
práctica y a su vez ubíquelos en el crucigrama.
Glosario coloreada y posteriormente se elimina el
exceso.
Verticales 9-_________________: tinción que
1-__________________: grupo químico presenta el mismo color que el colorante.
que se agrega a sustancia incolora para 10-________________: mecanismo de
conferirle color. coloración basado en la afinidad de pH
2-__________________: método de entre los elementos.
coloración en donde la muestra entra en 11-________________: apetencia de un
contacto con el colorante por tiempos elemento ácido por sustancias básicas.
determinados hasta que este adquiera la 13-________________: apetencia de un
coloración deseada. elemento básico por sustancias ácidas.
3-__________________: referente a 14-________________: radical libre que
biología. confiere la capacidad de transmitir color al
5-__________________: toda aquella cromógeno.
materia cuya propiedades y
características son estables y
homogéneas.
6-__________________: producto de la
unión entre sustancia incolora más
cromóforo.
7-__________________: coloración que
puede conferir varios colores a muestras
biológicas.
12-_________________: proceso en el
cual una sustancia es capaz de conferir su
color.

Horizontales
4-_________________: sustancia capaz
de transmitir su color a muestras
biológicas.
8-_________________: método de
coloración donde la muestra es sobre