Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de los Altos

Practica 2: Técnica histológica.

Materia: Histología 2021 B

Carrera: Médico Cirujano y Partero
Código: 221839809
Alumna: Ariana Emilse Reyes González
Profesor: Guillermo Domínguez Ríos
Fecha: 25 de agosto de 2021
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Competencias

1. Analiza los procedimientos fisicoquímicos de la técnica

histológica.

2. Explica los efectos de los agentes químicos (fijadores,

deshidratantes, aclarantes, agentes de inclusión, colorantes y
resinas) sobre los tejidos.

3. Explica la función del histoquinete, micrótomo y crióstato.

4. Define los términos tinción vital, cromofilia, cromofobia,

acidofilia, basofilia, metacromasia e impregnación
Para analizar los objetos al microscopio, éstos deben colocarse en el paso del haz luminoso justo

5. Determina
por debajo la técnica
del lente ocular, de estinción
por lo que empleada
necesario en las
tener cortes laminillas
de los tejidos deque
un grosor menor
observas.
al diámetro de las células que lo integran para observar los detalles.

En promedio, ¿cuál es el margen de los diámetros celulares del organismo humano?

En promedio el margen de los diámetros celulares del organismo humano es de 8 a 50 µm de

diámetro. Aunque algunas alcanzan hasta 100 µm

¿Qué observarías si tomaras un trozo de carne fresca, lo cortas en rebanadas muy finas,

lo colocas sobre un portaobjetos, lo dejas a la temperatura ambiente por 48 horas y luego

lo analizas al microscopio?
No mostrara una imagen con las características morfológicas que poseían cuando estaban

con vida, debido a la descomposición por bacterias.

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Técnica histológica. Procesos físico-químicos que en conjunto por los que deben pasar los

tejidos para poder observar la estructura de los mismos. La técnica histológica se realiza en

varios procedimientos que son: obtención de la pieza, fijación, deshidratación, aclaración, pre-

inclusión, inclusión definitiva, microtomía, adhesión, tinción y montaje final.

Resumen
Obtención de la pieza
• Consiste en la toma de muestras de tejido de los diferentes organismos

• La muestra de tejido se debe tomar de individuos sanos, vivos y anestesiados, esto

se logra con animales de experimentación; en el caso de tejidos humanos, las
muestras se obtienen de pacientes que son sometidos a cirugía y a biopsias, o de
cadáveres de muerte reciente, cuidando seccionar sólo órganos y tejidos sanos

• La separación de los órganos debe hacerse con tijeras evitando presionar y macerar
los tejidos; una vez fuera del organismo, los tejidos se cortan con un bisturí fino o
con una navaja de afeitar, sin presionar; las piezas de tejido deben medir 1 cm3 de
grosor pero deben incluir todos los elementos del órgano

• Tipos de cortes:

• Biopsia: consiste  en  tomar  un trozo de  tejido de  un ser vivo. Este 
procedimiento de  uso frecuente  en medicina requiere  el mismo cuidado 
de asepsia, antisepsia, etc., que se utiliza en todo acto quirúrgico menor o  mayor.

•   Necropsia: es el procedimiento en el cual se  extrae material de  un  cadáver · 

• Autopsia: consiste  en  el estudio analítico y sistemático completo. macroscópico y

microscópico de los órganos, aparatos y sistemas de un  cadáver. Se realiza
para establecer causas de muerte
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La tinción vital, es cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden

emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la estructura de ellas ni

interfieren en sus funciones. Puede de ser de dos tipos:

Puede ser de dos tipos:

1. Coloración intravital, consiste en la administración de colorantes vitales a través de las

vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, linfáticas, subcutánea, o

intraperitoneal.

2. Coloración supravital, En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a

células o tejidos provenientes de organismos vivos. Se demuestran: mitocondrias con el verde

de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, ramificaciones nerviosas con el

azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células con naranja de acridina (empleando el

microscopio de fluorescencia).
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Fijación

La insolubilización de las proteínas sirve para detener súbitamente la actividad vital

celular, los procesos de autolisis post mortem, proteger a las células del ataque
bacteriano y putrefacción y preparar los tejidos para los procedimientos
histológicos posteriores.

• Método físico. Consiste en cambios rápidos de temperatura, con calor y

por congelación inmediata sumergiendo el tejido en nitrógeno líquido; esto
produce endurecimiento del tejido dejándolo listo para cortarse
(Microtomía).

• Métodos químicos. Consisten en exponer el tejido a agentes químicos,

para provocar la formación de puentes transversales de unión entre moléculas
adyacentes de proteínas tisulares. Los agentes químicos más usados en
microscopia óptica son compuestos simples o puros como el formaldehído al
5% o el formol al 10% o mezclas de compuestos como el líquido de Bouin o el
líquido de Helly.

• Técnica de perfusión, primero se coloca el fijador en una jeringuilla y se

inyecta en el torrente sanguíneo del animal de manera que se distribuya por
todo el organismo; una vez fijado podemos disecarlo para obtener el órgano
de interés

• Técnica de inmersión, primero se cortan cubos de tejido de 1 cm3 , se

identifican, se colocan en una cápsula de plástico o metal y se pasan a un
recipiente con fijador; cuidando fijar la muestra lo más rápido posible, dado
que algunos tejidos son más lábiles que otros, se recomienda fijar las
glándulas de inmediato, páncreas y riñón no más de 15 min, el intestino no
más de 30 min, músculo y hueso no más de 60 min después de la muerte;
utilizar un fijador 50 veces mayor que el tamaño de la muestra y mantenerla
en el fijador una hora como mínimo y 24 h como máximo para evitar
estropear el tejido.
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Deshidratación

Se trata de eliminar el agua de los tejidos, sometiéndolos a una concentración gradual de

soluciones acuosas de un agente deshidratante, por ejemplo, alcohol etílico o acetona.

Se inicia con concentraciones del 50% hasta 90% para alcanzar de manera paulatina la
concentración de alcohol al 100%.

*Cambiar de inmediato el tejido de agua a una solución de alcohol al 100% produce una
rápida salida del agua lo cual deforma los tejidos, por lo tanto es necesario mantener los
bloques de tejido una hora por lo menos en las diferentes concentraciones crecientes, de
alcohol*

Aclaración/diafanización

Como la parafina no es capaz de mezclarse con el alcohol, la aclaración es un

procedimiento intermedio que elimina el alcohol de los tejidos para saturarlos de una
sustancia miscible tanto con el alcohol y el solvente de la parafina. La sustancia que se
utiliza con mayor frecuencia es el xileno o xilol.

Se coloca la muestra de tejido en un recipiente con alcohol-xilol a partes iguales, luego en

xilol absoluto hasta que el tejido se torne claro o transparente.

* El alcohol y el xileno disuelven los lípidos y causan desnaturalización de las proteínas de

la célula, por lo que para estudiar lípidos o enzimas se usa a técnica de congelación de
tejidos*

Fuente: Técnica Histológica de Cátedra de Biología I – Bioingeniería – Facultad de Ingeniería – U.N.S.J.

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Pre inclusión

Permite la impregnación de parafina fundida en los tejidos y se logra pasando el tejido del
xilol, a dos baños de parafina fundida, para lograr que el xilol sea sustituido por ésta. El
procedimiento se debe realizar en el calor de un horno para mantener la parafina en estado
líquido.

Todos los procesos mencionados se realizan manualmente cambiando de tiempo en tiempo,

las muestras de un frasco a otro.

. Inclusión

Consiste en mantener al tejido en el centro de un bloque sólido de parafina; por lo general

se coloca la muestra de tejido en un molde de papel, plástico o metal de forma rectangular,
se le vierte la parafina fundida a 60°C y se deja solidificar a temperatura ambiente.
Los medios de inclusión para microscopia electrónica que se utilizan con frecuencia son
resinas polimerizadas o epoxi como Epon o Araldita.
El bloque se puede cortar en secciones uniformes y delgadas que permitan el paso de la
luz. En general, las preparaciones para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 μ.
Para elaborar estos cortes se utiliza un micrótomo.
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Adhesión

Las tiras de cortes de parafina con el tejido incluido se depositan sobre la superficie de agua
caliente en un baño de flotación para eliminar los pliegues y extender el tejido; luego se
separa cada corte con una aguja histológica y se levantan con un portaobjetos limpio que
tiene un adhesivo sobre la superficie, después se ponen a secar en el borde del baño de
flotación.

Errores en los procedimientos que causan artefactos en los tejidos

 La deshidratación rápida en altas concentraciones de alcohol o el excesivo calor de la
parafina producen retracción, esto es separación de los tejidos que en vida eran
vecinos.
 La cuchilla del micrótomo mal afilada, presenta muescas microscópicas que al cortar
los tejidos producen líneas de destrucción llamadas estrías o mellas.
 Cuando el baño de flotación no tiene la temperatura adecuada, los cortes no se
extienden completamente, lo cual provoca dobleces anormales en el tejido llamados
pliegues o arrugas.

Previo a la coloración, se debe eliminar la parafina con calor en el horno con un solvente

orgánico, así los cortes de nuevo se sumergen en xilol. Los cortes de tejido también se deben

rehidratar haciéndolos pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta

llegar a una solución 100% de agua.

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Tinción

El propósito de la tinción es facilitar la visualización de las diferentes estructuras y

demostrar las diferencias químicas y físicas entre los componentes celulares y tisulares.
La técnica de tinción es simple, los colorantes se disuelven en soluciones acuosas o
alcohólicas según el caso, y las canastillas de cortes se pasan en una serie de recipientes
para hidratar, dar color y lavar los tejidos.
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Un colorante es un compuesto con color capaz de transferirlo a otros cuerpos. Se clasifican,

según su origen, en naturales, artificiales y metales, los cuales se utilizan para impregnar

estructuras celulares e hísticas.

Clasificación de los colorantes

 Colorantes naturales se obtienen de diferentes organismos como el rojo carmín, que se

obtiene del cuerpo de un insecto, la orceína que se extrae de ciertos líquenes, se usa para

teñir cromosomas y fibras elásticas; o la hematoxilina que se extrae de la madera del

palo de Campeche. Este producto requiere primero oxidarse (forma hemateína) y

después unirse a un agente intermedio llamado mordiente (acoplador) que le permite

establecer enlaces químicos con los diferentes elementos celulares e intercelulares; este

colorante es insoluble en agua y otros líquidos; cada mordiente confiere a la

hematoxilina propiedades tintoriales diferentes.

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 Colorantes artificiales son compuestos producidos por los seres humanos, tienen

propiedades físico- químicas que pueden aprovecharse en diferentes técnicas de tinción,

ejemplos: los derivados del alquitrán de carbón como el azul de tripano, colorante vital

que se usa para identificar a los macrófagos vivos, porque al mezclarse con el agua

forma partículas coloidales fagocitables por estas células.

Azul de tripano

 Colorantes ácidos como la eosina, el naranja G o la fuscina ácida tienen carga negativa

en la porción coloreada de la molécula que reacciona con los grupos aniónicos de las

proteínas en el citoplasma. Cualquier componente de la célula que reaccione con

colorantes ácidos es acidófilo y presenta acidofilia.

 Colorantes básicos como el azul de metileno o el azul de toluidina tienen una carga

positiva en la porción coloreada de su molécula que reacciona con los grupos catiónicos

de los ácidos nucleicos en la heterocromatina, los nucléolos y el ergastoplasma.

Cualquier componente celular que reacciona con los colorantes básicos es basófilo y

presenta basofilia.

 Las sales de los metales pesados, se precipitan en los tejidos y forman precipitados que

se depositan en las estructuras celulares impregnándolas, facilitando la identificación de

éstas, las sales que se usan con mayor frecuencia son: las sales de plata para demostrar el

aparato de Golgi y las neurofibrillas en las neuronales, etc.

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Diferentes colorantes y reactivos para tinciones especiales o histoquímicas.

Colorante Estructura Color
Orceína Fibras elásticas Rojo
Colorante de Weigert Fibras elásticas Café oscuro
Sales argénticas de Gomori Fibras reticulares Negro
Método argéntico de Fibras colágenas Rosado a rojo

Verhoeff
Técnicas de histoquímica
Reactivo de Schiff (PAS) Glucógeno y carbohidratos Magenta
Reactivo de Feulgen DNA Magenta
Rojo Sudán (Sudán II) Adipocitos Rojo
Negro Sudán (Sudán IV) Lípidos, vainas de mielina Negro

Montaje

Consiste en sellar el tejido para conservarlo por lo que se deben deshidratar los cortes
cuando se sacan de los colorantes (eliminar el agua en alcoholes) y se aclaran en xilol para
después ponerles una gota de bálsamo de Canadá o resina y cubrirlos con un cubreobjetos.

Un fijador suele ser una sustancia o mezcla de sustancias con la que se busca detener la vida de

las células e impedir las modificaciones post-morten que pueda sufrir la célula, manteniendo la

estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. Esto se

consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo

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principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la integridad de las

células y tejidos; se efectúa por mediante agentes químicos.

El problema que se presenta con los tejidos cuando se usa alcohol o acetona en altas

concentraciones como fijadores es que la capa externa del tejido se endurece y  retracción de los

tejidos.

Entiendo que la aclaración del tejido en el proceso de la Técnica histológica es para eliminar el

alcohol del tejido y así saturarlos de una sustancia miscible tanto con el alcohol y el solvente de

la parafina, ya que la parafina no se mezcla con el alcohol.

Algunas estructuras hísticas son basófilas y otras son acidófilas, porque reaccione con colorantes

básicos y ácidos según corresponda.

La técnica de tinción más común en basé al libro de ROSS. Histología se menciona que la

técnica más común para mostrar tejidos y órganos en la catedra es la tinción con hematoxilina-

eosina con fijación en formalina.

Micrografías Técnicas de tinción Pasos

Hematoxilina YEosina:

Sales argénticas de Gomori

Impregnación argentica
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Rojo Sudán (Sudán II)

La tinción de PAS (Periodic

Acid-Schiff)

Investiga cuántos colorantes se utilizan en la tinción del corte en la micrografía 2-3. Explica por

qué los núcleos se ven más oscuros.