Revista peruana de biología 24(1): 093 - 100 (2017)

Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a VISSN-L 1561-0837

ibrio alginolyticus
doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v24i1.13103 Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

NOTA CIENTÍFICA

Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a Vibrio alginolyticus

Isolation and characterization of specific bacteriophage Va1 to Vibrio alginolyticus

Carla Fernández Espinel 1*, Violeta Flores Dominick 1, Marco Medina Morillo 1

Instituto del Mar del Perú, Laboratorio de Patobiología Acuática, Centro de Investigaciones Acuícolas “Alexander Von Humboldt”, Esquina Gamarra y
General Valle S/N Chucuito, Callao, Lima. Perú
Email Carla Fernández: cafernandez@imarpe.gob.pe
Email Marco Medina: mmedina@imarpe.gob.pe
Email Violeta Flores: vflores@imarpe.gob.pe

Resumen
Vibrio alginolyticus está asociado a enfermedades en acuicultura. El uso indiscriminado de antibióticos ha
conllevado a la búsqueda de alternativas en el tratamiento de enfermedades bacterianas, entre ellas la apli-
cación de bacteriófagos, los cuales infectan y destruyen selectivamente bacterias. En ese sentido, en este
trabajo se aisló un bacteriófago altamente lítico a V. alginolyticus el cual fue denominado Va1, con el objetivo
de evaluar los parámetros físicos químicos en los cuales es viable. Para esto, se evaluó al bacteriófago Va1
en diferentes condiciones de pH, temperatura, cloroformo. El fago Va1 presenta mayores títulos a 20 y 30 °C
y pH de 5 a 8 disminuyendo su viabilidad a partir de 40 °C y en unidades de pH menores de 5. La exposición
al cloroformo redujo la viabilidad del fago Va1 en un 25%. A partir de la curva de un paso se determinó que el
periodo de latencia y el tamaño de la explosión fueron de 20 minutos y 192 UFP/centro infectivo respectiva-
mente. Al microscopio electrónico de transmisión el fago Va1 evidencio una cabeza icosaedrica y una cola no
contráctil, características propias de la familia Podoviridae. En conclusión, el fago Va1 presenta características
potenciales para su uso en fagoterapia.
Palabras clave: Bacteriófago; fagoterapia; Vibrio alginolyticus; acuicultura.
Abstract
Vibrio alginolyticus is associated with diseases in aquaculture. The misuse of antibiotics has led to the search
for alternatives in the treatment of bacterial diseases, among them the application of bacteriophages that infect
and destroy bacteria selectively. In this way, a highly lytic V. alginolyticus bacteriophage, termed Va1, was
isolated, with the aim to evaluate its physical chemical parameters. For this purpose, different temperature,
pH, chloroform exposure and host range conditions were evaluated. The temperature stability of phage Va1
showed higher titers at 20 and 30 °C decreasing from 40 °C. With respect to pH, the highest titers for the bac-
teriophage were between 5 and 8, and chloroform exposure reduced viability of the Va1 phage by 25%. The
one-step curve determined that the latency period and the burst size were 20 minutes and 192 PFU / infective
center respectively. Under the transmission electron microscope, the Va1 phage showed an icosahedral head
and a non-contractile tail, belonging to the Podoviridae family. In conclusion, Va1 phage presents potential
characteristics for use in phage therapy.
Keywords: Bacteriophage; phagotherapy; Vibrio alginolyticus; aquaculture.

Citación: Información sobre los autores:

Fernández Espinel C., V. Flores Dominick, M. Medina Morillo. 2017. CFE, VFD y MMM, realizaron el aislamiento, las pruebas de caracter-
Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a Vibrio ización y redactaron el manuscrito.
alginolyticus. Revista peruana de biología 24(1): 093 - 100 (Abril 2017). Los autores no incurren en conflictos de intereses.
doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v24i1.13103

Presentado: 06/12/2016
Aceptado: 19/02/2017
Publicado online: 20/04/2017

Journal home page: http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/index

© Los autores. Este artículo es publicado por la Revista Peruana de Biología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0
Internacional.(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), que permite el uso no comercial, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre
que la obra original sea debidamente citadas. Para uso comercial, por favor póngase en contacto con editor.revperubiol@gmail.com.

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (April 2017)

93
Fernández Espinel et al.

Introducción abdominocentesis se extrajo el líquido ascítico del interior de

Vibrio alginolyticus es una bacteria Gram negativa, presente la cavidad peritoneal utilizando una jeringa hipodérmica de 20
en todos los ambientes y organismos marinos y se encuentra mL. Las muestras fueron almacenadas en frascos de 50 mL. En
asociado a enfermedades oportunistas (Thompson & Austin seguida, se realizó el aislamiento del bacteriófago siguiendo la
2006), esto debido a su capacidad de adhesión al mucus del metodología de Phumkhachorn (2010) con modificaciones. Las
huésped, el cual es un factor crucial en el mecanismo de viru- muestras fueron centrifugadas a 3300x g a 4 °C por 20 minutos
lencia (Luo et al. 2016). y el sobrenadante fue filtrado por medio de un equipo de fil-
tración con filtro de membrana de 0.22 µm de porosidad (Merck
En acuicultura, las enfermedades infecciosas, especialmente Millipore®, Alemania). La muestra filtrada fue enriquecida con
las bacterianas, son los principales problemas en la expansión un volumen igual de caldo Tripticasa de Soya (TSB) (Merck®,
en esta industria y son fuente de pérdidas económicas (Flegel Alemania), suplementado con 1% de NaCl y con CaCl2 20 mM,
2006). En ese sentido, se ha reportado a V. alginolyticus como a la cual se le adicionó 1 mL de un cultivo de V. alginolyticus
el causante de enfermedades en organismos acuáticos cultivados ATCC ® 33787. Esta mezcla fue incubada a 25 °C por 24 horas.
(Gómez-León et al., 2005, Martins et al. 2010), especialmente
en los estadios iniciales de vida (Zorrilla et al. 2003) produciendo Luego de la incubación, la bacteria fue removida mediante
septicemia, hemorragias, úlceras a nivel epitelial con necro- centrifugación a 3300xg a 4 °C por 15 minutos y en seguida el
tización progresiva (Gómez-León et al. 2005) y acumulación sobrenadante fue filtrado (0.22 µm PES Syringe Filter MS®).
de líquido ascítico en la cavidad peritoneal (Paperna 1984). Posteriormente, se realizó la prueba del “spot test” según Phum-
A consecuencia de ello, el uso de antibióticos tradicionales ha khachorn (2010), para la cual, 80 µL de sobrenadante filtrado
sido la estrategia más aplicada contra las infecciones bacterianas, fue inoculado sobre un tapiz de V. alginolyticus ATCC ® 33787
pero su uso indiscriminado ha originado la aparición de bac- previamente mezclado con 3 mL de agar Tripticasa de Soya TSA
terias multidrogo resistentes, lo que ha conllevado en muchas (70%) 1% NaCl a 45 °C y vertido sobre placas con TSA (100%)
ocasiones, al desarrollo de patologías que no pueden ser tratadas 1% NaCl. La presencia de zonas de aclaramiento fue verificada
con antibióticos convencionales e incluso al desarrollo de cepas luego de 24 horas de incubación a 25 °C como evidencia de la
bacterianas resistentes que pueden infectar a otros organismos, presencia de bacteriófagos.
incluyendo al hombre (Defoirdt et al. 2007). La purificación del bacteriófago se realizó mediante la técnica
Por ello, en los últimos tiempos las investigaciones se han de la doble capa según Hernández (2007). A partir del sobrena-
orientado en la búsqueda de tratamientos alternativos. Los dante filtrado, se realizaron diluciones seriadas en buffer fosfato
bacteriófagos, virus que infectan bacterias, son considerados salino (PBS). Un mililitro de cada dilución fue mezclado con
como una alternativa prometedora para prevenir y controlar en- 1 mL de un cultivo de V. alginolyticus ATCC® 33787 en tubos
fermedades de etiología bacteriana en cultivos acuícolas (Ronda estériles conteniendo 3 mL de TSA (70%) con 1 mL de ClCa2
et al. 2003, Lomelí 2011, Nakai & Park 2002); por medio de 20 mM (45 °C), los cuales se vertieron sobre placas con agar
ellos, las enfermedades bacterianas podrían ser tratadas de una TSA (100%) y se incubaron a 25 °C por 24 horas. Transcurrido
forma específica y selectiva, sin afectar la microbiota normal en el tiempo de incubación, se evidenció la formación de placas de
los sistemas de cultivos acuícolas (Clark & March 2004), además lisis las cuales fueron recortadas con ayuda de un asa de siembra
de no generar resistencia bacteriana a antibióticos (Sulakvelidze con el aro de nicrom en ángulo recto, trasladadas y depositadas
et al. 2001, Loc-Carrillo & Abedon 2011). Sin embargo, para en microtubos de 2 mL conteniendo PBS estéril. En seguida, se
fines aplicativos, es necesario comprender en primera instancia, el agregaron 3 gotas de cloroformo y se agitaron en vortex por 1
comportamiento del fago en diferentes condiciones fisicoquími- minuto. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 3300xg
cas, para aumentar las probabilidades de éxito de la terapia fágica. a 4 °C por 10 minutos y se filtraron a 0.22 µm. El filtrado fue
almacenado en microtubos estériles de 1.5 mL a 4 °C.
El objetivo de este estudio fue el aislamiento y caracterización
de un bacteriófago lítico contra Vibrio alginolyticus ATCC® Para la cuantificación de las unidades formadoras de placas
33787 para optimizar su aplicación como agente terapéutico por mililitro (UFP.mL‒1) se utilizó la siguiente fórmula (Segundo
en acuicultura. et al. 2010):

Materiales y métodos UFP.mL‒1= (Número de placa* Factor de dilución)/ Volumen

de la alícuota.
Cepa bacteriana huésped y cinética de crecimiento.- La
cepa de V. alginolyticus ATCC ® 33787, proporcionada por el Caracterización del bacteriófago Va1
Banco de Germoplasma del Instituto del Mar del Perú, fue
Evaluación de Termoestabilidad.- El test de estabilidad
utilizada como bacteria huésped para el aislamiento del bacte-
térmica del bacteriófago aislado, fue realizado de acuerdo a la
riófago. Esta cepa fue cultivada en caldo Tripticasa de soya (TSB)
metodología utilizada por Haq (2012). Un mililitro de PBS
con 1% de NaCl (Merck, Alemania) a 25 °C por 24 horas. En
conteniendo bacteriófagos (título: 6 x 108 UFP.mL‒1), fueron
las pruebas sucesivas, se utilizó V.alginolyticus ATCC® 33787 en
dispensados en tubos de ensayo, los cuales fueron sometidos
fase logarítmica de su crecimiento (6 horas).
a temperaturas de 20, 30, 40, 50 y 60 °C en baño maría, por
Aislamiento y purificación de bacteriófagos.- El bacte- 1 hora. Concluido el tiempo se determinó el título final de los
riófago fue aislado del líquido ascítico procedente de un ejemplar bacteriófagos mediante la técnica de la doble capa. Los trata-
de Paralichthys adspersus “lenguado”, con signos aparentes de mientos fueron realizados por triplicado.
enfermedad, procedente del laboratorio de Cultivo de Peces
Evaluación de la sensibilidad al cloroformo.- La evaluación
del Instituto del Mar del Perú. La superficie epitelial del ejem-
de la sensibilidad de los bacteriófagos al cloroformo fue realizado
plar fue desinfectada con alcohol de 70°, posteriormente, por

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (Abril 2017)

94
 Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a Vibrio alginolyticus

de acuerdo a la metodología utilizada por Wong (1994). Medio trónica de Transmisión (TEM), con tinción negativa y acetato
mililitro de bacteriófagos en solución PBS (título: 7 x 107 UFP. de uranilo 2%. Las muestras fueron examinadas utilizando un
mL‒1) fueron dispensados en tubos de ensayo a los cuales se les microscopio electrónico de transmisión (JEOL JEM-1200EX)
adicionó 0.1 mL de cloroformo (grado: PA) e inmediatamente a 80 kV.
se mezclaron por 10 minutos a temperatura ambiente utilizando
Curva de un paso.- El periodo de latencia y el tamaño de la
un Vortex. Una vez concluido el tiempo, los tubos de ensayo
explosión fueron determinados a partir de la curva de un paso,
fueron sometidos a centrifugación, a 3300xg a 4 °C por 10
la que fue realizada de acuerdo a la metodología utilizada por
minutos. El sobrenadante fue utilizado para determinar el título
Phumkhachorn (2010). Diez mililitros de V. alginolyticus ATCC®
final de bacteriófagos. El mismo procedimiento fue llevado a
33787 en fase logarítmica fueron centrifugados a 3300xg a 4 °C
cabo con el grupo control al cual se sustituyó el cloroformo por
por 20 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet fue
solución salina estéril 0.85%. Los tratamientos fueron realizados
resuspendido en 10 mL de caldo TSB 1% NaCl ajustado a 108
por triplicado.
UFC.mL‒1. A esta suspensión se le adiciono 5 mL de bacteriófa-
Evaluación de la sensibilidad a diferentes pH.- La evalu- gos en PBS (7 x 10 8 UFP/mL) a una MOI de 0.1 (Middelboe et
ación de la sensibilidad de los bacteriófagos a diferentes pH al. 2010) y se incubó a 25 °C por 30 minutos. Una vez concluido
fue realizado de acuerdo a la metodología utilizada por Haq el tiempo de incubación, la mezcla fue centrifugada a 3300xg a
(2012). Quinientos microlitros de bacteriófagos en solución 4 °C por 20 minutos y el pellet fue resuspendido en 50 mL de
buffer PBS (título: 7 x 107 UFP.mL‒1) fueron dispensados en caldo TSB 1% NaCl. Se tomaron muestras cada 10 minutos
tubos de ensayo los cuales contenían 5 mL de PBS, el cual fue en un periodo de 3 horas e inmediatamente fueron tituladas
previamente ajustado en intervalos de 1 unidad de pH, desde por el método de la doble capa (Hernández 2007). La prueba
2 hasta 8, utilizando HCl 1N o NaOH 1N a 25 °C durante se realizó por triplicado.
una hora. Concluido el tiempo, se determinó el título final
Resultados
de los bacteriófagos mediante la técnica de la doble capa. Los
tratamientos fueron realizados por triplicado. Cinética de crecimiento de la cepa V. alginolyticus ATCC®
33787.- La cinética de crecimiento de V. alginolyticus ATCC®
Evaluación del espectro de hospedero.- Se utilizó la técnica 33787 evidenció que entre las 3 horas y las 9 horas la cepa se
del “spot test” según Phumkhachorn (2010) modificada. Cin- encuentra en la fase logarítmica de su crecimiento. (Fig. 1)
cuenta microlitros de cada cepa indicadora se dispensaron en
tubos de 13 x 100 mm conteniendo 3 mL de agar TSA (70%) a Aislamiento y purificación de bacteriófagos.- La prueba
45 °C. Esta mezcla se vertió sobre placas Petri de 16 x 150 mm del spot test, utilizando a V. alginolyticus ATCC® 33787 como
conteniendo agar TSA (100%) con la finalidad de formar un la cepa indicadora, dio positivo a la presencia de bacteriófagos
césped bacteriano. Una vez solidificada la doble capa, se goteo (Fig. 2A). Además, mediante el método de la doble capa, se
50 µL del bacteriófago para cada una de las cepas indicadoras. aisló un bacteriófago al cual se le nombró como Va1. Las placas
de lisis observadas fueron claras, uniformes, de forma circular
Las cepas indicadoras fueron: Listonella anguilarum NCIMB y pequeñas de aproximadamente 0.1 – 0.5 mm de diámetro
6, V. splendidus NCIMB 1, Photobacterium damselae subsp. promedio (Fig. 2B).
damselae NCIMB 2184, P. damselae subsp. piscicida NCIMB
2058, V. harveyi NCIMB 1280, Flexibacter maritimus NCIMB Evaluación de la Termoestabilidad.- Los resultados eviden-
2153, Aeromonas hydrophila (ATCC®7966TM), A. hydrophila cian que el bacteriófago Va1 es estable hasta los 20 y 30° C por
(ATCC®49140TM), A. hydrophila (ATCC®35654TM), A. salmoni- 60 minutos, disminuyendo su viabilidad a partir de los 40 y
cida (ATCC®33658TM), Streptococcus iniae (ATCC ® 29178TM), siendo nula a 60 °C. (Fig. 3).
Enterobacter cloacae subsp. cloacae (ATCC® 13047™), Alcaligenes Evaluación de la sensibilidad al cloroformo.- La viabilidad
faecalis subsp. faecalis (ATCC® 35655™), Enterococcus faeca- del bacteriófago Va1 fue reducida casi un 25% al exponerla al
lis (ATCC® 14506™), Edwardsiella tarda (ATCC® 15947™), cloroformo (Fig. 4).
Citrobacter braakii (ATCC® 10625™), Escherichia coli (ATCC®
25922™), V. alginolyticus (ATCC® 17749™), V. alginolyticus ( 0.6
ATCC ® 33787), Yersinia ruckeri (ATCC® 29473™), Pseudomonas
Absorvancia (DO600)

fluorescens (ATCC® 13525™), P. putida (ATCC® 31483™) y V. 0.5

parahaemolyticus (ATCC® 17802™).
0.4
Reducción del crecimiento bacteriano.- El test de cinética
de infección del bacteriófago fue realizado de acuerdo a la
0.3
metodología utilizada por Haq (2012). Un mililitro de un cultivo
de V. alginolyticus ATCC® 33187 fue inoculado en matraces con- 0.2
teniendo 50 mL de caldo TSB 1% NaCl al que se le adicionó 1
mL del bacteriófago en solución PBS (título: 8 x 108 UFP.mL-1). 0.1
Posteriormente se incubaron a 25 °C en agitación continua. Se
utilizó un grupo control al cual no se le inoculó bacteriófagos. 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14
La densidad óptica (DO600) fue medida en intervalos de 1 hora
Tiempo (horas)
por 9 horas. La prueba se realizó por triplicado.
Figura 1. Cinética de crecimiento de la cepa de V. algino-
Morfología de los bacteriófagos.- La morfología de los lyticus ATCC ® 33787. Barras verticales son la desviación
bacteriófagos aislados fue observada mediante Microscopía Elec- estándar, n= 3.

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (April 2017)

95
Fernández Espinel et al.

120
110
100
90

Supervivencia (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20 30 40 50 60

Temperatura (°C)

Figura 3. Estabilidad del bacteriófago Va1 sometido a diferen-

tes temperaturas por 30 minutos. El gráfico muestra la inviabi-
lidad del bacteriófago a medida que la temperatura sobrepasa
los 30 °C. Barras verticales son la desviación estándar, n=3.

120
110
100
90
80
Supervivencia (%)

70
60
50
40
30
20
10
0
Solución Cloroformo
Figura 2. (A) Prueba del “Spot test” contra la cepa V. alginolyti-
Salina
cus ATCC® 33787. Se observa la zona de aclaramiento en la
región de goteo la cual sugiere la presencia de bacteriófagos Figura 4. Viabilidad del fago Va1 tratado con cloroformo y sin
(flecha) (B) Placas de lisis del bacteriófago Va1 específico a cloroformo. Barras verticales son desviación estándar, n=3.
V. alginolyticus ATCC® 33787.

120 1.6
110
1.4
100
Densidad optica O.D 600nm

90 1.2
Supervivencia (%)

80
1
70
60 0.8
50 control
0.6
40 bacteria+fago
30 0.4
20
0.2
10
0 0
2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (horas)
pH
Figura 6. Efecto del fago Va1 sobre la cepa de V. alginolyti-
Figura 5. Viabilidad del fago Va1 tratado con diferentes pH. cus ATCC® 33787 en fase logarítmica. Barras verticales son
Barras verticales son desviación estándar, n=3. desviación estándar, n=3.

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (Abril 2017)

96
 Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a Vibrio alginolyticus

10000000

1000000

100000

Log(UFP/mL)
192 virus liberados
10000 por célula bacteriana

1000

Periodo del tiempo

100 de latencia
(20 minutos)
10

1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (horas)

Figura 7. Curva de un paso del bacteriófago Va1. Barras verticales son desviación estándar, n=3.

(1978) y Solís et al. (2016) para otros fagos contra bacterias del
género Vibrio, quienes aislaron placas de 0.5 mm y 1mm contra
Resistencia a diferentes pH.- El fago Va1 mantiene su viabi-
V. parahaemolyticus y V. cholerae respectivamente.
lidad en un rango de pH entre 5 a 8, adicionalmente observamos
que a pH 2, 3 y 4 la infectividad del fago es prácticamente nula La microscopia electrónica reveló que el fago Va1 concuerda
(Fig. 5). morfológicamente con los fagos ØA318 (Lin et al. 2012) y VAP1
Espectro de hospedero.- De las 23 cepas utilizadas para
determinar el espectro de hospedero del bacteriófago Va1 por
medio de la prueba del “spot test”, V. alginolyticus ATCC® 33787 Tabla N°1: Evaluación del espectro de hospederos del bac-
evidencio una elevada susceptibilidad en la región de goteo, teriófago Va1.
reflejada por el crecimiento nulo de la cepa, adicionalmente
se evidenció un ligero aclaramiento para V. parahaemolyticus Cepa Especie
Fago
ATCC® 17802™. (Tabla 1). Va1
NCIMB 6 L. anguilarum –
Reducción del crecimiento bacteriano.- La infección de V.
alginolyticus ATCC® 33787 con el fago Va1 (7 x 108 UFP.ml-1) NCIMB 1 V. splendidus –
fue monitoreada por 9 horas. Se observó que el bacteriófago Va1 NCIMB 2184 P. damselae subsp. damselae –
es capaz de lisar a V. alginolyticus ATCC® 33787 impidiendo su NCIMB 2058 P. damselae subsp. piscicidae –
normal crecimiento. (Fig. 6). NCIMB 1280 V. harveyi –
La curva de un paso.- Los parámetros de multiplicación del NCIMB 2153 F. maritimus –
ciclo lítico del bacteriófago Va1 fueron determinados a partir ATCC®7966 TM
A. hydrophila –
de la curva de un paso (Fig. 7). Se determinó que el periodo de ATCC®49140TM A. hydrophila –
latencia dura aproximadamente 20 minutos, y el tamaño de la
ATCC®35654 TM
A. hydrophila –
explosión fue de 192 fagos por centro infectivo.
ATCC®33658TM A. salmonicida –
Microscopia electrónica.- Se observó que el fago Va1
ATCC ® 29178 TM
S. iniae –
pertenece a la familia Podoviridae por presentar cabeza de forma
ATCC® 13047™ E. cloacae subsp. cloacae –
icosaédrica con un talo corto no contráctil y un diámetro menor
al diámetro de la cabeza. (Fig. 8). ATCC® 35655™ A. faecalis subsp. faecalis –
ATCC® 14506™ E. faecalis –
Discusión
ATCC® 15947™ E. tarda –
En el presente trabajo se aisló un bacteriófago altamente
ATCC® 10625™ C. braakii –
lítico contra la cepa de V. alginolyticus ATCC ® 33787 a partir
del líquido ascítico de un ejemplar de P. adspersus con signos ATCC® 25922™ E. coli –
aparentes de enfermedad, lo que sugiere la posible presencia ATCC® 33787™ V. alginolyticus +
de Vibrio alginolyticus en la infección, ya que se encuentra ATCC® 17749™ V. alginolyticus +
asociado a enfermedades oportunistas (Thompson & Austin ATCC® 29473™ Y. ruckeri -
2006). Además, otros autores han reportado el aislamiento de
ATCC® 13525™ P. fluorescens -
bacteriófagos líticos contra V. alginolyticus a partir de muestras
de ambiente acuático (Lin et al. 2012, Kalatzis et al. 2016). ATCC® 31483™ P. putida -
ATCC® 17802™ V. parahaemolyticus +/-
El fago Va1 aislado contra V. alginolyticus produjo placas claras
* += Intenso aclaramiento,
de un diámetro de 0.5 a 1 mm de diámetro. Estos diámetros de - = no se evidenció aclaramiento,
placas son semejantes a los reportados por Hidaka y Tokushige +/-= ligero aclaramiento

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (April 2017)

97
Fernández Espinel et al.

Figura 8. Microfotografía electrónica del bacteriófago Va1 perteneciente a la familia Podoviridae.

(Heo et al. 2012) ambos especificos a V. alginolyticus y el fago a que una MOI más alta incrementa la probabilidad de que
VpV262 (Hardies et al. 2003) específico a V. parahaemolitycus. una bacteria sea infectada por más de un fago incrementado así
El fago Va1 se clasifica dentro del tipo C en el manual de Bradley el número total de fagos por centro infectivo (Middelboe et al.
(1967), clasificación que corresponde a la familia Podoviridae, 2010). Así, el fago Va1 tiene un tamaño de explosión de 192
que se caracteriza por tener una cabeza de seis lados, una cola unidades víricas por centro infectivo utilizando un índice de
no contráctil más corta que el diámetro de la cabeza y presencia multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 comparado con otros
de ácido nucleico del tipo ADN (Bradley 1967, Ackermann fagos específicos a V. alginolyticus cuyo tamaño de explosión fue
2001, Sillankorva et al. 2008, Moebus & Nattkemper 1981 ). de 97 y 44 fagos por centro infectivo utilizando un MOI de
0.01 (Kalatzis et al. 2016). Se ha evidenciado que mientras más
La curva de un paso mostró las etapas implicadas en el ciclo
corto es el periodo de latencia y mayor el tamaño de explosión,
de multiplicación de los bacteriófagos. El periodo de latencia y
el bacteriófago puede ser aplicado con mayores probabilidades
el tamaño de la explosión son parámetros esenciales para com-
de éxito en fagoterapia (Middelboe et al. 2010, Abedon et al.
prender las propiedades y variación entre fagos y hospederos
2001), ya que al producirse más partículas virales a partir de un
(Middelboe et al. 2010; Wang 2005). Algunos autores han
centro infectivo, aumentan las posibilidades de controlar mejor
reportado para el género Vibrio, periodos de latencia de 30, 120
las poblaciones bacterianas.
y 65 minutos y tamaño de explosión de 78 y 23 partículas víricas
por centro infectivo (Phumkhachorn y Rattanachaikunsopon El pH ácido disminuye la viabilidad del bacteriófago Va1,
2010, Sung Lee et al. 2014). Sin embargo, la curva de un paso mientras que a unidades de pH cercanas al valor neutro se man-
depende del índice de multiplicidad de infección (MOI), la cual tiene estable. Resultados similares fueron hallados en bacteriófa-
se sugiere que debe utilizarse en un rango de 0.1 y 0.01 debido gos de otros vibrios (Phumkhachorn y Rattanachaikunsopon

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (Abril 2017)

98
 Aislamiento y caracterización del bacteriófago Va1 específico a Vibrio alginolyticus

2010). La importancia de este ensayo radica en la posibilidad ture.2006.05.013

de aplicaciones futuras de fagoterapia vía oral, en ese sentido, Gómez J., L. Villamil, M. Lemos, et al. 2005. Isolation of Vibrio
el bacteriófago de este estudio estaría probablemente limitado alginolyticus and Vibrio splendidus from aquacultured
carpet shell clam (Ruditapesdecussatus) larvae associated
de administrarse por esta vía. Además, el bacteriófago Va1 es with mass mortalities. Applied Environmental Microbiol-
estable entre 20 y 30 °C y disminuye su viabilidad conforme la ogy. 71(1):98–104. https://doi.org/10.1128/AEM.71.1.98-
temperatura se eleva. Lin et al. 2012, reportaron que la estabili- 104.2005.
dad para el fago OA318 específico a V. alginolyticus estuvo en 20 Hardies S., A. Comeau. Et al. 2003. The complete sequence of
marine bacteriophage VpV262 infecting vibrio parahae-
y 40 °C. Posiblemente las limitaciones respecto a los parámetros molyticus indicates that an ancestral component of a T7
ambientales extremos se deba al origen natural de sus bacterias viral supergroup is widespread in the marine environment.
huésped, ya que los vibrios se han reportado en ambiente ma- Virology. 310(2):359-271. http://dx.doi.org/10.1016/
S0042-6822(03)00172-7
rinos (Thompson & Austin 2006), donde la temperatura y el Hernández A. 2007. Aislamiento, caracterización y detección precoz de
pH se mantienen constantes. bacteriófagos de Streptococcus thermophilus en la industria
láctea. Memoria, Doctor, Biología Funcional y Molecular.
El resultado de la prueba de rango de hospederos fue positivo Universidad de Oviedo, España.
para V. alginolyticus ATCC® 17749™ y V. alginolyticus ATCC® Heo Y., C. Lee, M. Baek. Et al. 2012. Morphological characterization
33787™ y negativo para la mayoría de cepas testigos a los que of Vibrio alginolyticus specific bacteriophage isolated from
fue enfrentado el fago Va1. La cepa V. parahaemolyticus ATCC® fish farms on west coast of Korea. Journal of fish pathology.
25(3):165–172. https://doi.org/10.7847/jfp.2012.25.3.165.
17802™ resultó en un ligero aclaramiento cuando se enfrentó Hidaka T. & A. Tokushige. 1978. Isolation and Characterization
con el fago Va1. Esto se debería probablemente a que V. para- of Vibrio parahaemolyticus Bacteriophages in Sea Water.
haemolyticus y V. alginolyticus son cepas altamente homogéneas, Memoirs of Faculty of Fisheries. 27(1):79-90.
entre 99,88 y 61,77% de nucleótidos idénticos (Osorio & Klose Haq U, Chaudhry W, Andleeb S, et al. 2012. Isolation and Partial
2000). Sin embargo, el aclaramiento para V. parahaemolyticus Characterization of a Virulent Bacteriophage IHQ1 Specific
for Aeromonas punctata from Stream Water. Microbial
fue considerado (+/-) por que no se evidenció una lisis total, a Ecology. 63:954–963. https://doi.org/10.1007/s00248-
pesar del elevado título del fago Va1. 011-9944-2.
Kalatzis P., R. Bastías, C. Kokkari, et al. 2016. Isolation and charac-
En el proceso de purificación de bacteriófagos, el cloroformo terization of two lytic bacteriophages, St2 and Grn1; phage
cumple un rol importante al lisar al remanente bacteriano, sin therapy application for biological control of vibrio algino-
embargo en este estudio se evidenció que su utilización dis- lyticus in aquaculture live feeds. PLOS ONE. https://doi.
org/10.1371/journal.pone.0151101.
minuyó la viabilidad del bacteriófago en un 25%. Resultados Lin Y., C. Chiu & F. Chang.2012. Characterization of a new phage
similares fueron reportados por Wong (1996). En ese sentido, ,termed A318, which is specific for Vibrio alginolyticus.
en nuestro laboratorio, hemos evitado el uso de este químico en Arch Virology. Springer Vienna. 157(5):917–926. https://
el proceso de purificación con resultados satisfactorios. doi.org/10.1007/s00705012-1244-8.
Loc-Carrillo C., & S, Abedon. 2011. Pros and cons of phage therapy
En conclusión, el bacteriófago aislado en este estudio, con bacteriophage. Landes Bioscience. 1(2):111-114. https://
un periodo de latencia corto y un tamaño de explosión alto, doi.org/10.4161/bact.1.2.14590.
presenta características potenciales para su utilización en pruebas Lomelí C. 2011. La fagoterapia como estrategia para reducir la mortali-
dad por Vibriosis en larvas de camaron blanco Litopenaeus
de fagoterapia cuya técnica representa una alternativa al trata- vannamei. Memoria, Magister en Ciencias en manejo de
miento con antibióticos para el tratamiento de enfermedades Recursos Marinos. IPN-CICIMAR. La Paz B.C.S. Acceso
bacterianas en el campo de la acuicultura. online 18/04/2015.
Luo G., L. Huang, Y. Sun, Y. Qin, X. Xu, L. Zhao, Q. Yan. 2016. flrA,
Agradecimientos flrB and flrC regulate adhesion by controlling the expression
of critical virulence genes in Vibrio alginolyticus. Emerg-
Los autores desean agradecer al Dr. Toshihiro Nakai, Profesor ing Microbes & Infections. 5. https://doi.org/10.1038/
de la Universidad de Hiroshima, Japón, por su ayuda en la toma emi.2016.82
de fotografías electrónicas. Al laboratorio de Cultivo de Peces Martins M., J. Mouriño, G. Fezer, et al. 2010. Isolation and experimen-
Marinos del Instituto del Mar del Perú. tal infection with Vibrio alginolyticus in the sea horse, Hip-
pocampus reidi Ginsburg, 1933 (Osteichthyes: Syngnathi-
Literatura citada dae) in Brazil. Brazilian Journal of Biology 70(1):205-209.
http://dx.doi.org/10.1590/S1519-69842010000100028
Abedon S., T. Herschler, D. Stopar. 2001. Bacteriophage Latent- Middelboe M., A. Chan & S. Bertelsen. 2010. Isolation and life cycle
Period Evolution as a Response. Applied Environmental characterization of lytic viruses infecting heterotrophic bac-
Microbiology. 67(9):4233-4241. https://doi.org/10.1128/ teria and cyanobacteria. MAVE. 13:118–133. https://doi.
AEM.67.9.4233-4241. org/10.4319/mave.2010.978-0-9845591-0-7.118
Ackermann H. 2001. Frequency of morphological phage descriptions Moebus K., & H. Nattkemper. 1981. Bacteriophage sensitivity patterns
in the year 2000. Archives of Virology 146: 843–857 among bacteria isolated from marine waters. Helgolän-
Bradley D. 1967. Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins. der Meeresuntersuchungen 34:375– 385.Doi: 10.1007/
Bacteriological Reviews. 31(4):230–314. BF02074130.
Clark J., & J. March. 2004. Bacterial virases as human vaccines. Nakai T., & S. Park.2002. Bacteriophage therapy of infectious diseases
Expert Review of Vaccines 3(4):463-476. https://doi. in aquaculture. Research in Microbiology. 153(1):13-18.
org/10.1586/14760584.3.4.463 https://doi.org/10.1016/S0923-2508(01)01280-3
Defoirdt T., N. Boon, P. Sorgeloos, et al. 2007.Alternatives to Osorio C., & K. Klose. 2000. A region of the transmembrane regula-
antibiotics to control bacterial infections: luminescent tory protein toxR that tethers the transcriptional activa-
vibriosis in aquaculture as an example. Trends Bio- tion domain to the cytoplasmic membrane displays wide
technology. 25(1):472–479. https://doi.org/10.1016/j. divergence among Vibrio species. Journal of Bacteriology.
tibtech.2007.08.001 182(2):526–528. https://doi.org/10.1128/JB.182.2.526-
Flegel T. 2006. Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, 528.2000
a historical perspective with emphasis on Thailand. Aqua- Paperna I. 1984. Review of diseases affecting cultured Sparus aurata
culture. 258(1):1-33. https://doi.org/10.1016/j.aquacul-

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (April 2017)

99
Fernández Espinel et al.

and Dicentrarchus labrax. París. 465-482. 016-0490-x.

Phumkhachorn P. & P. Rattanachaikunsopon. 2010. Isolation and par- Sulakvelidze A., Z. Alavidze & G. Morris. (2001). Minireview- Bacte-
tial characterization of a bacteriophage infecting the shrimp riophage Therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
pathogen Vibrio harveyi. African Journal of Microbiology 45(3):649-659. https://doi.org/10.1128/AAC.45.3.649-
Research 4(16):1794-1800. 659.2001
Ronda C., M. Vázquez, R. López.2003. Los bacteriófagos como her- Sung Lee H., S. Choi, H. Shin, et al. 2014. Vibrio vulnificus Bacte-
ramienta para combatir infecciones en acuicultura. Revista riophage SSP002 as a Possible Biocontrol Agent. Applied
AquaTIC. 18:3-10. and Environmental Microbiology. 80(2):515-524. https://
Segundo N., E. Hernández, O. López, O. Torres. 2010. Los bacteriófa- doi.org/10.1128/AEM.02675-13.
gos como una alternativa en el tratamiento de enfermedades Thompson F., B. Austin. 2006. The biology of vibrios. Wallingford,
infecciosas Bacterianas (Fagoterapia). Revista Mexicana de D.C. pp. 357–411.
Ciencias Farmacéuticas. 41(3):17-26 Wong A. 1994. Purificación y caracterización biológica del bacteriófago
Sillankorva S., P. Neubauer & J. Azeredo. 2008. Isolation and uB-19 especifico de Bacillus thuringiensis Memoria, Magis-
characterization of a T7-like lytic phage for Pseudomonas ter en Ciencias con especialidad en Microbiología. México.
fluorescens. BMC Biotechnology. 8:80–91. https://doi. Acceso online 18/04/2015.
org/10.1186/1472-6750-8-80 Zorrilla I., S. Arijo, M. Chabrillon, et al. 2003. Vibrio species isolated
Solís A., U. Hernández, A. Navarro, et al. 2016. Genetic charac- from diseased farmed sole (Solea senegalensis, Kaup) and
terization of ØVC8 lytic phage for Vibrio cholerae O1. evaluation of the potential virulence role of their extracel-
Virology Journal. 13-47. https://doi.org/10.1186/s12985- lular products. Journal Fish Disease. 26(2):103-108. DOI:
10.1046/j.1365-2761.2003.00437.x.

Rev. peru. biol. 24(1): 093 - 100 (Abril 2017)

100