UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE AGRONOMIA
AREA DE CIENCIAS
SUBAREA DE CIENCIAS QUIMICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA “A”
AUX. CARMELINA XAJIL

“REPORTE DE LA PRACTICA 1, 2, 3, 4 Y 5”

INTEGRANTES:

MICHAEL EMANUEL YOS SICAJAN 201310609

JORGE RUBEN ZUMETA PORTILLO 201318207
JAVIER ROMEO RUIZ MORALES 201310603

GUATEMALA 26 DE JUNIO DE 2015

 PRACTICA No. 3 EXTRACCION Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEINAS
EN MUESTRAS VEGETALES

1. INTRODUCCION

El contenido proteico s un componente de los análisis bromatológicos que se

realizan en cultivos para evaluar su calidad nutricional o para evaluar el efecto, en
este aspecto, de algún tratamiento practicado.

2. OBJETIVOS

 Efectuar la prueba de Biuret para la detección de proteínas y/o péptidos n

los extractos.
 Efectuar la prueba de “Precipitación Proteica Por Metales Pesados” para la
detección de proteínas en los extractos.

3. MARCO TEORICO

3.1 PROTEINAS

Las proteínas son biomoléculas orgánicas formadas por C, H, O, N y en menor

medida P y S y otros elementos (Fe, Cu, Mg,…). Son polímeros no ramificados de
aminoácidos (aa) que se unen mediante enlaces peptídicos. Son las moléculas
orgánicas más abundantes en los seres vivos. Su importancia radica en la
variedad de funciones diferentes que pueden desempeñar. Según su composición
las proteínas pueden dividirse en dos clases principales: Simples y Conjugadas.

Las proteínas simples son aquellas que por hidrolisis producen solamente
aminoácidos sin ningún otro producto principal, orgánico o inorgánico.
Comprenden los siguientes grupos:
- Albuminas
- Globulinas
- Glutelinas
- Protaminas
- Albuminoides
- Histidias
- Proaminas

Las proteínas conjugadas son aquellas que por hidrolisis producen no solamente
aminoácidos sino también otros componentes orgánicos o inorgánicos. Pueden
dividirse de acuerdo a sus grupos prostéticos y se clasifican así:
- Nucleoproteínas
- Glucoproteinas
- Fosfoproteínas
- Cromoproteína
 - Lipoproteínas
- Metaloproteinas
- Flavoproteinmas

Las proteínas además de dividirse por su composición también pueden dividirse

según la forma o estructura tridimensional, estas pueden ser fibrosas y globulares.

Las proteínas fibrosas tienen formas moleculares muy alargadas y una de sus
principales funciones es de brindar soporte a las moléculas.

Las proteínas globulares son más compactas que las fibrosas y son mas solubles
en agua una de sus principales funciones es de transporte.

3.2 Extracción salina de las proteínas

El efecto salling in: el efecto salino se detecta por el aumento de la solubilidad de

una sal poco o muy soluble; cuanto más insoluble sea la sal primaria, más notable
será el efecto salino.

3.3 Prueba de Biuret

La reacción de Biuret es un método colorimétrico (ensayo cualitativo) que permite

detectar la presencia de péptidos de más de dos aminoácidos y proteínas. Los
dipéptidos y los aminoácidos, a excepción de histidina, serina y treonina, no dan
positiva esta reacción, porque hace falta un mínimo de dos enlaces peptídicos
para que ocurra. Se utiliza para determinar la presencia de proteínas en líquidos
biológicos como el suero sanguíneo y la sangre, aunque no en la orina, porque la
urea interfiere la reacción.

Esta prueba se basa en la reacción que se produce entre los nitrógenos de los
grupos animo que participan en los enlaces peptídicos y los iones cúprico (Cu2+)
del CuSO4, lo que da lugar a la formación de un compuesto, llamado Biuret, cuyo
color oscila entre azul, violeta y rosa, dependiendo de la naturaleza de la proteína
detectada.

3.4 Prueba de precipitación proteica con metales pesados

Esta prueba permite detectar la presencia de proteínas. La precipitación de las

proteínas se llama “desnaturalización” en ella hay perdida de la actividad biológica
de la molécula. La desnaturalización puede ser causada por agentes físicos o por
agentes químicos.

La prueba se basa en que no todas las proteínas son igualmemte sensibles a los
agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas
proteínas de una mezcla. A pH 7 o por encima del, las proteínas están usualmente
cargadas negativamente, así que la adición de metales cargados positivamente
neutraliza la carga y la proteína se precipita.
4. DISCUSION

4.1 Prueba de Biuret

La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe
a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los
aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado,
se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reacción fue
que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solución de
proteína precipito una coloración violeta.

Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva.
Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber
presencia de proteínas.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede

determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de
Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de
NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de
un compuesto de color violeta, debido a la formación de
un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los
pares de electrones no compartidos del nitrógeno que
forma parte de los enlaces peptídicos presentando un
máximo de absorción a 540 nm.

Da positiva esta reacción en todos los compuestos que tengan dos o más enlaces
4.2 Prueba de precipitación proteica

Las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados,
por combinación del ion metálico con la forma anionica de la proteína. Las sales
que se utilizan son (CH3 COO)2 Pb y Hg(No3 )2, también se puede realizar
precipitación por medio de adición de ciertos ácidos a las solución acuosa los
cuales forman sales insolubles con las proteínas. Esta prueba se debe realizar a
un pH neutro (7) o ligeramente alcalino, si es muy alcalino puede existir
.precipitación de hidróxidos de los metales.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente

disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrogeno facilitará
la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele
ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.

5. CONCLUSIONES

 La prueba de Biuret obtuvo un dictamen positivo (+) con los extractos

acuoso y salino de la muestra vegetal (semilla de lenteja), de igual manera
con las soluciones patrón: Peptona y Caseína. Se debe a la presencia del
enlace peptídico (- CO- NH -), quedando en el fondo del tubo una tonalidad
azul cielo reacción positiva.

 La prueba de Precipitación proteica obtuvo un dictamen positivo (+) con los

extractos acuoso y salino de la muestra vegetal (semilla de lenteja), de igual
manera con las soluciones patrón: Peptona y Caseína. Se debe a la
neutralización de la carga de la proteína, quedando en el fondo del tubo un
leve precipitado y un notable tono turbio en las muestras.
 PRACTICA No. 4 ESTUDIO DE AMINOACIDOS DE MUESTRAS VGETALES

1. INTRODUCCION

Dentro del curso de bioquímica es de suma importancia estudiar las

macromoléculas más importantes: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos
nucleicos. En esta práctica nos enfocaremos en las proteínas pero más
específicamente en los monómeros que las componen: los aminoácidos. Los
aminoácidos pueden obtenerse a partir de hidrolisis de proteínas; en las
posteriores prácticas a través del análisis de los hidrolizados se tratara de
determinar si la hidrolisis fue o no completa. La práctica se basa especialmente en
el análisis cualitativo de los hidrolizados obtenidos y en la determinación de la
presencia o ausencia de aminoácidos libres.

2. OBJETIVOS

 Efectuar la hidrolisis acida e hidrolisis alcalina de proteínas extraídas de la

muestra vegetal.
 Determinar la presencia o ausencia de aminoácidos, aminoácidos con
núcleo aromático, aminoácidos fenólicos, thioaminoacidos y aminoácidos
con el grupo imidazol en hidrolizados de proteínas.
 Utilizar soluciones patrón para obtener resultados positivos que actúen
como testigos de cada prueba realizada.

3. MARCO TEORICO

3.1 AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son los monómeros que conforman las proteínas. “Se sabe que
existen alrededor de 300 aminoácidos diferentes de origen natural. Muchos de
ellos se observan solo en determinadas formas de vida y algunos solo aparecen
en una especie. Sin embargo, todos los organismos utilizan 20 de ellos para la
biosíntesis de proteínas, lo que constituye un notable ejemplo de la unidad
bioquímica de la biosfera.” (BOHINSKI 1991)
Estos 20 aminoácidos son conocidos como alfa-aminoácidos y “son la base de
todo proceso vital ya que son absolutamente necesarios en todos los procesos
metabólicos. Sus funciones más importante son el transporte óptimo de nutrientes
y la optimización del almacenamiento de todos los nutrientes (es decir, agua,
grasas, carbohidratos, proteínas, minerales y vitaminas)” (AMINOÁCIDO 2015)
Los aminoácidos están conformados de un carbono central, de un hidrógeno, de
un grupo amino y de un grupo carboxilo.

3.2 Pruebas de caracterización cualitativas de aminoácidos

“Por la estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las
proteínas pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos
coloreados. Estas reacciones son la base para la determinación cuantitativa y
cualitativa de las proteínas. Por presentarse variaciones en la composición de los
aminoácidos de las diferentes proteínas, se manifiestan diferentes colores y
grados de intensidad para una misma reacción, íntimamente relacionado con la
naturaleza de la proteína analizada.” (BIOQUÍMICA 2015)

Existen muchas pruebas para la caracterización cualitativa de aminoácidos pero

durante esta práctica estudiaremos:

 Prueba de la Ninhidrina: “Esta es una reacción general para cualquier

aminoácido y es debido a la presencia del grupo amino (NH2), de manera
de que todos los alfa aminoácidos y por supuesto las proteínas dan positiva
a esta reacción. No obstante, cualquier sustancia proteica que contenga un
grupo alfa-NH2 también de positiva a esta reacción” (IDENTIFICACIÓN DE
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS 2015)

 Prueba Xantoproteica: “Con esta reacción podemos identificar la

presencia de los aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano). La reacción
se basa en la nitración del anillo bencénico con ácido nítrico, produciendo
derivados del nitrobenceno de color amarillo. Estos derivados amarillos se
tornan anaranjados a la alcalinidad de la solución con NH4OH o NaOH. En
las condiciones de la reacción la fenilalanina es difícil de nitrar por cuanto
se requiere la presencia de un catalizador.” (IDENTIFICACIÓN DE
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS 2015)

 Prueba de millón: “Esta reacción es específica para el grupo hidroxifenil.

Por lo que el aminoácido tirosina da positiva a esta reacción. Se cree que el
grupo hidroxifenil primero forma un derivado nitrato con el Ácido Nítrico
(HNO3), que luego reacciona con el mercurio y forma un complejo de color
rojo.” (IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS 2015)

 Prueba de sulfuro: Loa thioaminoacidos reaccionan en medio alcalino con

el acetato de plomo, precipitando sulfuro de plomo (de color negro) como
uno de los productos. (IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y
PROTEÍNAS 2015)

 Prueba de Bromo: El bromo actúa en medio alcalino con aminoácidos que

poseen el grupo imidazol, provocando una reacción de adición al eliminar
un doble enlace. El compuesto así formado posee una cloración azul-
violeta. Esto quiere decir, que cuando en esta prueba se produce un color
azul-violeta, se denota la presencia de Histidina. (IDENTIFICACIÓN DE
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS 2015)
4. DISCUSION DE RESULTADOS

En el cuadro observamos que los tres hidrolizados preparado en prácticas

anteriores (hidrolizado acuoso básico, hidrolizado acuoso ácido e hidrolizado
salino básico) han arrojado resultados negativos en las 5 pruebas realizadas; es
necesario recordar que “por la estructura peptídica  y la presencia de
determinados grupos las proteínas pueden reaccionar con una variedad de
agentes originándose productos coloreados.” (PREREPORTES DE BIOQUÍMICA
2011) y esto no ha ocurrido durante la realización de las pruebas a los
hidrolizados, que han mantenido su color original.

Podemos definir, de esta manera, que los hidrolizados carecen de aminoácidos en

su estructura, aunque existe la posibilidad de que los reactivos que hemos
utilizado para la realización de las pruebas presenten cierto grado de impureza
pues “las sustancias y reactivos químicos producidos por la industria química
pueden contener una cierta cantidad de impurezas, tales como metales pesados,
inertes y otros” (OSORIO 2010) que pueden modificar el resultado de una prueba.

En cuanto a las pruebas realizadas a la muestra desconocida; las pruebas de

Ninhidrina y Xantoproteica han resultado positivas. Para el caso de la adición de
Ninhidrina (hidrato de triceohidrindeno) se ha observado como la muestra ha
cambiado a un color azul-violeta. Podemos definir entonces que la muestra
desconocida “es positiva para aminoácidos y proteínas que tengan un grupo -NH2
libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con Ninhidrina, se forma un complejo azul-
violeta.” (VILLANUEVA 2009).

La prueba Xantoproteica también ha resultado positiva al tomar la muestra

desconocida un color amarillo-naranja definiendo la presencia de un grupo
aromático en la muestra, pues “los anillos fenilo que contengan un grupo activante
pueden ser nitrados produciendo un compuesto amarillo; la producción de un
producto coloreado amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia
de tirosina o triptófano en una proteína” (VILLANUEVA 2009)

Las pruebas aplicadas a las soluciones patrón servirán como “modelo” para
comprobar la veracidad de dichas pruebas. En el caso de la Lisina, a la que se le
aplicó únicamente la prueba de la Ninhidrina, tendría que obtener un resultado
positivo, pues la prueba de Ninhidrina es positiva para todos los aminoácidos, sin
embargo hemos obtenido un resultado negativo; por lo que podría dudarse de la
pureza, ya sea de la Lisina o bien del reactivo utilizado.

Al triptófano se le aplicaron las pruebas de Ninhidrina y Xantoproteica. La prueba

Xantoproteica ha resultado positiva lo que comprueba que esta prueba sirve para
determinar la presencia de triptófano en una proteína. La prueba de la Ninhidrina
ha resultado negativa lo que refuerza el supuesto de que la Ninhidrina utilizada no
era del todo confiable.
A la Tirosina se le han aplicado las pruebas de Ninhidrina, Xantoproteica y de
Millon. Únicamente ha resultado negativa la de la Ninhidrina por lo que casi
podríamos afirmar la impureza del reactivo en las pruebas realizadas. Los
resultados positivos en las pruebas Xantoproteica y de Millon demuestran la
presencia de un anillo aromático en el compuesto.

La Leucina e Histidina han resultado positivas en la prueba de Ninhidrina lo que

demuestra su carácter aminoácido. Asimismo la prueba del Bromo aplicada a la
Histidina demuestra que este compuesto posee un grupo imidazol en su estructura
y que siempre que resulte positiva la prueba del Bromo en el análisis de una
proteína, podemos concluir la presencia del grupo imidazol en ella.
La prueba de Sulfuro aplicada a la Cisteína ha resultado positiva demostrando que
la cisteína es un thioaminoacido; mientras que la prueba Xantoproteica de la
fenilalanina ha demostrado que las proteínas que contengan triptófano, tirosina o
fenilamina dan positivo en esta prueba.

5. CONCLUSIONES

 Los hidrolizados acuosos y salinos utilizados durante la práctica carecen de

aminoácidos.
 La muestra desconocida contiene aminoácidos y más específicamente un
núcleo aromático comprobado mediante la prueba Xantoproteica.
 Las pruebas de Ninhidrina aplicadas a las soluciones patrón no han
resultado todas positivas, por lo que la Ninhidrina puede poseer cierto grado
de impureza.

 Las pruebas Xantoproteica, de Millon, de Sulfuro y Bromo aplicadas a las

soluciones patrón han servido como “testigos” para comprobar la veracidad
de dichas pruebas.
 PRACTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOACIDOS, CROMATOGRAFIA DE
AMINOACIDOS Y ESPECTROFOTOMETRIA

1. INTRODUCCION

La cromatografía es una técnica que sirve para separar, identificar, y a veces

purificar una mezcla compleja de solutos solubles en un solvente común. En toda
separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra
estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto
íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra
se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil.

La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que

absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a
las mediciones a una determinada longitud de onda.

2. OBJETIVOS

 Utilizar la técnica de Cromatografía en capa fina como parte del análisis

cualitativo de aminoácido de la muestra vegetal.
 Utilizar la espectrofotometría en la cuantificación de proteínas extraídas de
la muestra vegetal

3. MARCO TEORICO

3.1 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que
los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos
sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase
estacionaria (disolvente A), y fase móvil o eluyente (disolvente B). Es una técnica
simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatográfico) y de
fácil desarrollo. El parámetro experimental asociado a la técnica es el Rf
(coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto
entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y
su hidrosolubilidad/liposolubilidad (Barcenas Ruiz, Jose).

Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado,

se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un
extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a
afectar a la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja),
y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la
muestra.
Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado
(tanque cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de
aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el
fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se
desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos
entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas
(coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto
próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las
manchas correspondientes a cada compuesto, si 3 no son visibles, se pueden
revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada
mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el
correspondiente valor de Rf.

3.2 ESPECTROFOTOMETRIA
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para
la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad
y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas,
etc.) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-
químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos.

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de

energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos,
entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias.

Las medidas de la radiación transmitida se realizan mediante aparatos muy

sensibles como el espectrofotómetro. El Espectrofotómetro es un instrumento que
tiene la capacidad de manejar un haz de radiación electromagnética comúnmente
denominándolo Luz, separándolo en facilitar la identificación y cuantificación de su
energía. Su eficiencia, resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerá de las
variables de diseño y de la selección de los compontes ópticos que lo conforman.
4. DISCUSION DE RESULTADOS

4.1 Espectrofotometría
 
Al realizar la espectrofotometría de los extractos (salino y acuoso), junto con la
albumina y una sustancia desconocida se procedió a sacar las concentraciones
utilizando la fórmula de la ley de beer que no es más que una relación empírica
que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado. Al
tener la concentración de ambos se toman los datos de absorbancia y
concentración y se procede a realizar la curva de calibración que es un método de
química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una
muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida.
Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter
medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la
variable a determinar (concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas
muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente
establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee
el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable
independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta.

 
4.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

En prueba se pudo observar que los aminoácidos de la muestra patrón que son
polares son la lisina, histidina, cisteína y los q no son polares se encuentra
triptófano, tirosina, leucina, fenilalanina. Los aminoácidos polares hay con carga y
sin carga los cuales en la figura 1 (ver anexo), se muestran que una sustancia
polar se movió lentamente con relación al frente del disolvente, mientras que una
sustancia no polar se moverá más. Lo que nos muestra en los hidrolizados es que
nuestras sustancias son polares, por eso hubo menor movimiento con el
disolvente, al comparar las muestras patrón con las muestras de hidrolizados se
ve que a pesar que el frijol contiene los aminoácidos utilizados en las muestras
patrones, pero pueda que la concentración de los hidrolizados sean polares.

5. CONCLUSIONES

 Los valores de Rf en los distintos hidrolizados fueron datos que se

mantuvieron cercanos a los encontrados en la teoría, con esto se pudieron
identificar los aminoácidos presentes para la muestra vegetal.

 Por medio de un espectrofotómetro se realizo obtención de las

concentraciones en los extractos acuoso y salino se utilizó una solución
patrón de albumina y con ello se pudo observar que el extracto acuoso
 reflejó una mayor concentración, puede decirse que existe mayor
degradación de la proteínas en medios salinos.

6. BIBLIOGRAFIA

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en: http://biokimik2011.blogspot.com/2011/09/objetivos-aplicar-pruebas-
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 Identificación de compuestos bioquímicos (en línea) 2015. Consultado el 19

de junio de 2015. Disponible en: http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtu
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 Pre reportes de bioquímica (en línea) 2011. Consultado el 19 de junio de

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 Identificación de aminoácidos y proteínas (PDF) 2015. Universidad

Experimental Rómulo Gallegos, Área de Ingeniería Agronómica. Consultado
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 ¿Por qué son tan importantes los aminoácidos? (en línea) Consultado el 22
de junio de 2015. Disponible en: http://www.aminoacido.eu/

 Pureza de Reactivos y productos (en línea) Osorio R. 2010. Consultado el

22de junio de 2015. Disponible en: http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/c
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junio 2015. Disponible en: http://www.growbiointensive.org/Precipotacion%
20de%20Prteica,%20Tercera%20Edicion_low%20resolution.pdf

 Lehninger, A. L. Bioquímica, las bases moleculares de la estructura y

función celular.