Guia de Practicas Bacteriologia

3B-2
GUIA DE PRÁCTICA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MÉDICA

LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA
BACTERIOLOGIA
AUTOR:
Lic. María del Carmen Quispe Manco
2018 - 1
F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

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INDICE
Introducción
Reglas de bioseguridad en el laboratorio 02
Práctica I: Preparación de material para microbiología, 04
Coloraciones simples y compuestas. 11
Preparación de medios de cultivo. 17
Práctica II: Métodos de siembra 23
Observación de colonias 26
Práctica III: Aislamiento e identificación de Staphylococcus 28
Práctica IV: Aislamiento e identificación de Streptococcus (S. pyogenes, S. 30
agalactiae, S. pneumoniae). Enterococcus.
Práctica V: Aislamiento e identificación de Bacillus 32
Práctica VI: Aislamiento e identificación de Listeria. 34
Práctica VII: Baciloscopia. 36
Práctica VIII: Aislamiento e identificación de Neisserias 40
Práctica IX: Aislamiento e identificación de Enterobacterias.I 42
Práctica X: Aislamiento e identificación de Enterobacterias II 44
Práctica XI: Aislamiento e identificación de Bacilos no fermentadores. 46
Práctica XII: Aislamiento e identificación de V.cholerae, V.parahaemolyticus. 48
Aeromoinas
Práctica XIII: Aislamiento e identificación de Haemophilus . Campylobacter. 50
Práctica XIV: Aislamiento e identificación de Clostridium

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INTRODUCCION
En el laboratorio de Microbiología el diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en la

demostración de la presencia del agente patógeno o de sus productos y en algunos casos de
la huella que éste ha dejado en su contacto con el sistema inmune del individuo. El
diagnóstico clínico es, en muchos casos, orientador luego de evaluar los datos que ofrecen la
historia clínica y la exploración pero la confirmación de un diagnóstico clínico requiere en
enfermedades infecciosas el diagnóstico etiológico que confiere el Laboratorio de
Microbiología Clínica.
Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar,

depende de la calidad de los procedimientos, ya que un posible fallo en la recuperación de
los agentes patógenos, puede inducir a errores diagnósticos, e incluso a un tratamiento
inadecuado del enfermo.
El objetivo de esta guía es dar al estudiante una ayuda para el trabajo que realizará a lo
largo de su preparación en el curso de Microbiología, así mismo mantener una estrecha
comunicación entre el estudiante con el profesor de prácticas.
REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS
Las medidas de bioseguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad,
para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior.
Las reglas básicas de bioseguridad que se tienen que cumplir en el laboratorio:
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales

como: extinguidores, salidas de emergencia, botiquín de primeros auxilios.
2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en los refrigeradores.
4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello

recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados,
evitando el uso de accesorios colgantes).
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de

la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de

laboratorio y antes de retirarse del mismo.

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7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o
material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá
tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceros, manijas de cajones o puertas,
cuadernos, etc.
8. No se permitirá pipetear con la boca.
9. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán
anteojos de seguridad. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o
puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
10. Las superficies de trabajo se descontaminan luego de finalizar el trabajo o al fin del día y
luego de cada derrame o salpicadura de material viable con desinfectantes efectivos contra
los agentes en cuestión.
11. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de

aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada
de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de
agitación, etc.
12. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender fuego. No se

operará con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca de las mismas.
13. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente
ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas.
14. Está prohibido descartar líquidos o material biológico por los desagües de las piletas. En
cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos.
15. Todos los cultivos, stocks y otros desechos biológicos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo,
mediante autoclave.
PRACTICA I
Equipos de laboratorio en microbiología. Preparación de material para
microbiología.
1.1 Marco Teórico

En un laboratorio de microbiología, es necesaria la utilización de ciertos instrumentos para
llevar a cabo su normal funcionamiento. Los instrumentos más comunes en un laboratorio de
microbiología son: microscopio, incubadora, autoclave, horno, refrigeradora, baño María,
centrífuga, balanza, potenciómetro, porta filtros.
LA INCUBADORA
Equipo que se caracteriza por tener temperaturas fijas o que fluctúan en un rango muy corto
+- 0.2°C, la cual esta regulada mediante un termostato, se utiliza para mantener los cultivos a
una temperatura adecuada según los requerimientos del germen con el cual se está
trabajando.

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LA REFRIGERADORA
Equipo para proporcionar ambientes de temperaturas bajas, se utiliza con fines de
conservación para el material biológico, medios de cultivo ya preparados, reactivos, etc.
EL BAÑO MARIA
Equipo que se utiliza para mantener temperaturas homogéneas que transmitirán calor en
forma indirecta. El rango de temperatura se puede graduar de acuerdo a la utilidad que se le
va a dar, para licuar medios de cultivo por ejemplo se utilizará entre 70°C y 90°C.
DESTILADOR DE AGUA / DESIONIZADOR
Sirve para obtener agua libre de impurezas para la preparación de los medios de cultivo y
reactivos, se puede utilizar cualquiera de los dos aparatos, pero se debe controlar el agua
obtenida.
LA CENTRIFUGA
Equipo que se caracteriza por proporcionar fuerzas centrífugas que permitirán al usuario
separar sustancias a diferentes velocidades y rangos de temperatura predeterminados, para
procesar una muestra de orina se requiere 3,000 r.p.m. x 5'
LA BALANZA
Instrumento de precisión que se utiliza para determinar el peso de diferentes sustancias,
existen diversos tipos de acuerdo a las necesidades, con diferente sensibilidad. Hay balanzas
mecánicas y electrónicas.
EL POTENCIOMETRO
Instrumento de precisión que sirve para determinar la concentración de iones (pH) en
diferentes soluciones, sustancias o medios de cultivo (líquidos o sólidos), dependiendo de la
sustancia que se quiera medir el pH se elige el tipo de electrodo a utilizar.
CONGELADORA
Sirven para mantener reactivos que son sensibles al calor o para mantener muestras o cepas.
Son de -20°C y -70°C.
CAMARA DE BIOSEGURIDAD
Equipo que se utiliza para manipular microorganismos altamente infecciosos. El sistema puede
ser cerrado (cabinas de bioseguridad I y II) o semicerrado (cabinas de bioseguridad III) que
permite trabajar con agentes infecciosos evitando la contaminación del material en trabajo,
asi como da protección al trabajador. En estos sistemas el aire que entra y sale pasa a través
de filtros de alta eficiencia (HEPA). Las cámaras de flujo laminar se utilizan en laboratorios de
producción preparación de medios de cultivo pues proporcionan una ambiente estéril, pero no
proporciona protección al personal de laboratorio.
AUTOCLAVE

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Sirve para esterilizar materiales y medios de cultivo que son sensible a las altas temperaturas
utilizadas en los hornos. Utilizan vapor de agua a presión durante tiempos variables de acuerdo
a la naturaleza del material a esterilizar.
EL HORNO
Se caracteriza por proporcionar temperaturas altas, se utiliza para esterilizar material de
vidrio e instrumental metálico mediante calor seco. La temperatura máxima generalmente es
de 200°C.
OTROS
Porta asa o mango de Kohle, para fijar la aguja o alambre de nicrón. Gradillas porta tubos.
Jarra de anaerobiosis. Mecheros, de alcohol o de gas.
EL MICROSCOPIO ÓPTICO: Sus partes:
Sistema óptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que
consigue el enfoque correcto.
Partes de un microscopio óptico
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

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En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los
microorganismos vivos en un objeto o material, incluida las endosporas bacterianas. La
esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad.
El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre
otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con
este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo.
CALOR SECO : destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren
temperaturas muy elevadas.
La esterilización por calor seco puede hacerse por flameado o en el horno.
I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas y agujas de siembra, pinzas, espátulas, etc.
Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen los utensilios
que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se
puede aplicar a objetos termolábiles.
II) Esterilización en el horno: consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar,
debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de un
horno.
Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: Pipetas, matraces, tubos,
placas, etc. u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten
estos materiales son muy elevadas (160-180ºC durante 2 horas).
CALOR HUMEDO: también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como
ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este
tratamiento las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares.
Además, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor
de calor al interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos:
Ebullición, vapor fluente y vapor saturado a presión. Ejemplo el autoclave.
I) Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10
minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas
bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño
María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no
se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto
para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan
esterilizarse en autoclave.
II) Vapor fluente (tindalización) Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar
medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que
pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se realiza el proceso
durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos
tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (<100ºC) durante 30-45 minutos
destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas
termorresistentes.Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del
calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos.
III) Vapor saturado a presión: La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua
saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica
normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y
consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos extremos) en
un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de

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las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden
sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde por
ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno que
se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica de esterilización requiere el
uso del autoclave.
FILTRACION
Para la esterilización de materiales líquidos sensibles al calor, como algunos medios de
cultivo, soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc., se utiliza la filtración.
En la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la
filtración
los retira de una forma mecánica, en lugar de destruirlos.
La filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo
suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Los filtros que se utilizan
en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y están integrados
por pequeñas piezas de material sintético, generalmente acetato de celulosa o policarbonato,
que pueden tener poros con tamaños de 0,22 y 0,45 um, diseñados para retener bacterias. La
acción combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza química del material
utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan
a través de la membrana con la ayuda del vacío generado, por ejemplo, con una bomba de
vacío. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtración con los que éstos se usan
deben ser esterilizados por otros métodos, generalmente vapor saturado a presión en el
autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo, los micoplasmas,
no son retenidos por los filtros habituales
1.2 Competencias
Conoce el funcionamiento de los equipos utilizados en el laboratorio de microbiología.
Conoce la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los
procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.
1.3 Materiales y equipos
Microscopio
Placas Petri 15 x 100
Tubos de prueba 13 x 100, 16 x 150
Pipetas serológicas 1, 5 y 10 mL
Pipetas Pasteur
Matraz 500 mL
Balón 250 mL
Tubos tapa rosca
Gradillas para tubos
Algodón
Detergente
Probeta 500 mL
Papel Kraft
Escobillas de tubos
Guantes domésticos
1.4 Procedimiento

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A) Manejo Del Microscopio Óptico
-Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería
estar en esas condiciones.
-Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10
aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
-Para realizar el enfoque:
-Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o
ambos.
-Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
-Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente
con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se
perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y
repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la
preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la
preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión
si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
-Empleo del objetivo de inmersión:

-Bajar totalmente la platina.
-Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona
que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
-Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de
x40.
-Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
-Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
-Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota
de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
-Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a
usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar
otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
-Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo
de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación
de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
-Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Comprobar También Que El Objetivo 40x Está Perfectamente Limpio.
Mantenimiento y Precauciones
Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.

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Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe
guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con
un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En
cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite
ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-
acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos
disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador).
El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo
agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del
ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,
secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al
acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.
B)Material De Vidrio
Preparación de material de laboratorio para esterilización
El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin
contaminar una vez esterilizado:
- El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc., se tapan con algodón o tapones
metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa
algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeable (Kraft). En el caso de las pipetas,
se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la
contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez
contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o
bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas.
Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno.
- El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo,
las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de
etileno o radiaciones.
- Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,

generalmente, en autoclave.
 Identificar el material y el uso al que esta destinado

 Lavar el material de vidrio
 Secar el material
 Poner tapones de algodón en la boca de las pipetas, tubos y matraces
 Envolver el material con papel kraft

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 Esterilice los materiales de vidrio en el horno a 180 °C por una hora.
Eliminación y Limpieza Del Material Contaminado
En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del

material.
Asimismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del
material desechable.
Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos
de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material
recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución desinfectante,
como por ejemplo una solución diluida de lejía, en la que permanecerá antes de su lavado
durante 24 horas.
Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de
materia orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos
de los agentes físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede
asegurarse la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por
ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos
de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material limpio.
Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos, equipos y
material que sean estables al calor, así como de material desechable. A tal objeto se coloca
este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometiéndolos a la
acción del vapor de agua a una atmósfera de sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados
de lo habitual (1 hora en lugar de 30 minutos).
Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia
extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla
crómica o cualquier otro procedimiento enérgico, tanto mecánico como químico. Se aclara
bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las
pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales,
el trozo de algodón que tienen en la boquilla.
Algunos de los objetos sucios y contaminados (portaobjetos, pipetas, etc), después de
lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las
cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un paño de hilo limpio,
procurando que no queden hilazas sobre la superficie.
El material que contiene colorantes se trata, según las condiciones del material, durante un
tiempo variable con una solución que puede ser de ácido clorhídrico, nítrico o mezcla
sulfocrómica. El resto del material (tubos de plástico, jeringas, etc.) se trata con distintas
soluciones desinfectantes como hipoclorito sódico, formol, etc., pero debe recordarse que se
utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.
1.5 Resultados
Realizar los esquemas y gráficos

1.6 Cuestionario
1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuántos niveles consta y qué características posee cada
uno de estos niveles? ¿Qué tipo de laboratorio realizamos las practicas de la
Universidad?

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2. ¿Realice un cuadro resumen con los Métodos físicos y químicos de esterilización?
3. ¿Cuál es la ventaja del uso del autoclave?
4. ¿Cómo realiza el control de calidad en calor seco y húmedo?
5. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo líquido bacteriano se derrama sobre una
superficie.
6. ¿Cuáles son los riesgos y problemáticas en el grupo que se tendrán al no seguir las
indicaciones recomendadas?
1.7 Fuentes de información
1 Guillen A., Guerrero C, Benites C. Manual de prácticas de Bacteriología. FTM UNFV, 2007.
2. Instituto Nacional de Salud – Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Manual de
Normas de bioseguridad. Serie de Normas Técnicas N° 18. Lima. 1997.
Procedimientos Laboratorios para la obtención y envío de muestra (I). Serie de Normas
Técnicas N° 4. Lima. 1997.
No. 2 Coloraciones simples y compuestas

2.1 Marco Teórico
La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando

microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas con
colorantes.
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus características
(morfología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos son casi
incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al microscopio óptico normal cuando se
encuentran suspendidos en agua, de ahí que se utilicen colorantes para incrementar su
contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles.
Los colorantes son compuestos aromáticos solubles en agua (generalmente en forma de sales),
que contienen un ión orgánico coloreado y otro ión inorgánico.
Pueden dividirse en dos grupos: Ácidos y básicos. El colorante es ácido si la porción coloreada
tiene carga negativa, es decir, si tiene un anión coloreado, siendo en este caso repelido por
estructuras de la célula que presenten la misma carga, como es el caso de la superficie
bacteriana. El colorante se denomina básico si la porción coloreada es el catión, cargado
positivamente y con afinidad por estructuras de la célula con carga negativa, como es la
superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul de
metileno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la nigrosina.
Existen distintos tipos de tinción:
1.-Tinción simple: Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente tiñe a los
microorganismos.
Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células, que
permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa.
La tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.

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2.-Tinción diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten
distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su estructura y composición
química. La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la
pared celular bacteriana, son las más utilizadas.
La TINCION DE GRAM es uno de los procedimientos de tinción más útiles en la identificación

de microorganismos, ya que divide a éstos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram
negativos.
En esta técnica es necesario utilizar varias soluciones:
1.- Un primer colorante básico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y
que reacciona con las células (cargadas negativamente), coloreándolas.
2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las células. Parece
ser que el mordiente (solución diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un
compuesto insoluble coloreado en el interior de la célula.
3.- Un agente decolorante, como la mezcla alcohol-acetona (1:1), que es un disolvente

orgánico capaz de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorándolas.
4.- Un colorante de contraste, igualmente de carácter básico pero de distinto color que el
primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta
con el color violeta del primer colorante, y que teñirá sólo a las bacterias decoloradas en el
paso anterior.
Los organismos que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo

aparecerán de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos
que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloración, se clasifican como Gram
negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina.
La tinción de Gram es más reproducible cuando se aplica a cultivos jóvenes de bacterias, ya
que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer
como Gram negativas.
Tinción ácido-alcohol-resistente (Ziehl-Neelsen)
Es otra importante tinción diferencial que permite distinguir aquellas bacterias que una vez
teñidas resisten a la decoloración por ácidos y alcoholes.
Estas bacterias pertenecen a los géneros Mycobacterium y Nocardia y se caracterizan porque

sus paredes celulares contienen un elevado porcentaje de lípidos (en su mayoría ácidos
micólicos). Siendo, por ello, impermeables a los colorantes y a otros compuestos químicos en
solución acuosa. Esta característica hace que estos microorganismos no se coloreen bien con
los reactivos de la tinción de Gram. Debido a esta gruesa capa de compuestos lipídicos en su
pared, se deben utilizar métodos especiales para forzar la entrada del primer colorante
utilizado (fucsina fenicada). De ahí, que se caliente la preparación cubierta con este
colorante durante un tiempo establecido (el fenol también facilita la entrada de la fucsina).
Una vez que el colorante ha penetrado en la pared celular, la decoloración con ácido y con
alcohol resulta tan difícil que dichos microorganismos permanecen coloreados de rosa,
mientras que el resto de las bacterias tomarán el colorante de contraste, azul de metileno.

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Esta tinción tiene una gran aplicación en clínica, ya que permite diferenciar microorganismos
patógenos como Mycobacterium tuberculosis, en muestras patológicas como esputos y
secreciones bronquiales.
3.-Tinción estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que

pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea
únicamente una parte de la célula. Se utilizan este de tinciones para poner en evidencia la
presencia de cápsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).
Tinción de esporas (endosporas)

Las endosporas son estructuras que se forman en el interior de ciertos tipos de bacterias,
entre los que destacan las pertenecientes a los géneros Clostridium y Bacillus. A diferencia
de la célula vegetativa de la que procede, la endospora es resistente a factores ambientales
adversos: Altas temperaturas, compuestos químicos tóxicos y también a los colorantes. Sin
embargo, existen colorantes como el verde malaquita que, con ayuda del calor, pueden
penetrar en ella. Una vez teñidas, no perderán el colorante en el lavado con agua y sí lo
harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el colorante de contraste.
La posición y morfología de las esporas en el interior de la bacteria tiene interés taxonómico,
ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Tinción de corpúsculos metacromáticos

Los corpúsculos metacromáticos, también denominados gránulos de volutina, son inclusiones
citoplasmáticas que aparecen en algunas bacterias y que, aunque su función no es conocida
en detalle, podrían considerarse una reserva de energía. Están constituidos principalmente
por polifosfatos y presentan una gran afinidad por colorantes básicos, de manera que cuando
éstos se utilizan para teñir las bacterias, los corpúsculos metacromáticos se tiñen más
intensamente que el resto de los componentes celulares.
Aunque estas inclusiones aparecen en muchos tipos de bacterias, su presencia resulta de
especial interés en microorganismos patógenos como es Corynebacterium diphteriae, siendo
una prueba más para su identificación.
Tinción de cápsulas TINCIÓN NEGATIVA

Las cápsulas son estructuras producidas por algunas bacterias bajo determinadas condiciones
ambientales que juegan un papel importante en la patogenicidad del microorganismo,
interfiriendo con la acción fagocítica de los leucocitos. Por su composición química no se
tiñen normalmente con colorantes básicos, como cristal violeta o safranina, de ahí que,
aunque existen varios métodos para su observación, el más simple consiste en hacer una
tinción negativa con tinta china o nigrosina. Las cápsulas, al estar constituidas por polímeros
coloidales muy hidratados, se distorsionan con facilidad y se contraen en los pasos de
desecación y fijación, por lo que es conveniente hacer un examen en fresco de las mismas
utilizando la técnica del montaje húmedo.
Técnica general
En la mayoría de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuación:
1- Realizar una extensión con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequeña
gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjetos limpio. Si el cultivo procede
de un medio sólido, se coloca una gota de agua en el portaobjetos y se mezcla con una
pequeña porción de la muestra hasta formar una suspensión homogénea, extendiéndola con el
fin de obtener una fina película. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la

14
llama del mechero, pero no se debe eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama
porque pueden distorsionarse las células.
2- Fijar la muestra. La fijación tiene como finalidad coagular el protoplasma de las células y
hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el método más utilizado para la
fijación, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros
compuestos químicos. La fijación con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de
un cultivo sólido; en muestras obtenidas de un cultivo líquido es mejor hacer la fijación con
metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor número de células. Es necesario que
la extensión se haya secado antes de proceder a la fijación, por ello se debe esperar hasta
que el líquido de la misma se evapore. La fijación por calor se lleva a cabo pasando varias
veces la preparación seca a través de la llama de un mechero, con la extensión hacia arriba.
El calor desnaturaliza las proteínas y suele matar al microorganismo.
Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se
rompan, siendo suficiente que el portaobjetos se note caliente sobre el dorso de la mano,
pero no demasiado.
3- Realizar la tinción. Para ello es necesario cubrir la preparación con abundante colorante y
dejarlo actuar durante algún tiempo.
4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teñidas para eliminar el exceso de
colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjetos, que se
mantendrá inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el agua con demasiada fuerza
sobre la preparación para no arrastrar la muestra.
5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos golpeándolo ligeramente con cuidado por el
canto.
Permitir que se seque la preparación, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien
dejándola secar al aire, aunque lleva más tiempo.
6- Examinar la preparación al microscopio, con el objetivo de inmersión (100x), colocando,

previamente, una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
2.2 Competencias
Estudia las características microscópicas de las bacterias, forma y agrupación de las células.
Aprende una técnica de coloración diferencial e interpreta los resultados obtenidos en la
misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas, estudia la morfología y las
propiedades de los microorganismos ácido-alcohol-resistentes y diferencia estos
microorganismos de otros que no lo son.
Aprende una técnica de tinción estructural e interpreta los resultados obtenidos, reconoce las
esporas teñidas y observa su forma y su localización en las bacterias.
Demuestra la presencia de corpúsculos metacromáticos en algunas bacterias.
Pone de manifiesto la presencia de cápsulas bacterianas y observa su morfología.

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Cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis y Neisseria spp. )
Muestras de esputo positivas a Mycobacterium tuberculosis
Muestra de yogur, Lactobacillus delbrueckii sub. Bulgaricus y Streptococcus thermophilus
Cultivo bacteriano de microorganismos (Klebsiella pneumoniae)
Nigrosina al 10% o tinta china
Papel de filtro,
Colorantes azul de metileno
Solución de lugol
Alcohol- acetona
Violeta de Genciana o cristal violeta
Safranina o Fucsina
Fucsina básica fenicada
Verde de malaquita
Solución Albert I
Asa de siembra en aro
Láminas portaobjetos
Microscopio
Alcohol ácido al 3%
2.4 Procedimiento
Técnica Tinción simple
1- Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su
fijación.
2- Realizar la tinción cubriendo la preparación con abundante colorante y dejarlo actuar
durante un minuto.
3- Lavar con agua las preparaciones teñidas y continuar con la técnica tal y como se indica
previamente.
4- Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión. Observar la forma y
disposición de los microorganismos teñidos con el colorante.
Técnica de Gram
Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que deberán encontrase en fase
exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijación,
siguiendo la técnica ya descrita.
Para la coloración se seguirá el siguiente protocolo (modificación de Hucker):

1- Teñir durante un minuto con la solución cristal violeta.
2- Lavar el exceso de colorante con agua.
3- Cubrir la extensión con una solución diluida de yodo (lugol), que actuará como mordiente,
durante un minuto.
4- Lavar con agua el exceso de lugol.
5- Decolorar con alcohol-acetona, cubriendo la preparación y dejando actuar durante 30
segundos.
6- Lavar con agua abundante para eliminar el resto del disolvente.
7- Colorear con safranina durante un minuto (coloración de contraste).
8- Lavar con agua y dejar que la preparación se seque.
9- Examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo de inmersión.
Técnica de Ziehl- Neelsen

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1- Preparar una extensión con las muestra de esputo, seguir las indicaciones del profesor,
secar y fijar como ya se ha descrito.
2- Cubrir la preparación completamente con fucsina fenicada y calentar cuidadosamente a la
llama de un mechero hasta emisión de vapores, evitando la ebullición. Se realiza invirtiendo
el mechero y pasando la llama bajo la preparación periódicamente.
Esta operación se repite durante 3 veces, añadiendo colorante conforme éste se evapora. La
preparación no debe quedar seca en ningún momento.
3- Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4- decolorar con alcohol ácido hasta que la muestra tome un ligero color rosa (unos 30
segundos).
6- Lavar nuevamente con agua y hacer la coloración de contraste aplicando azul de metileno
durante un minuto.
7- Lavar con agua el exceso de colorante y secar la preparación como ya se ha indicado.
8- Examinar la muestra teñida al microscopio con el objetivo de inmersión.
Técnica (Método de Wirtz-Conklin)

Los cultivos bacterianos deberán encontrarse en fase estacionaria, para que se favorezca la
esporulación.
Con ellos se preparan extensiones en láminas portaobjetos y tras secar al aire se fija con calor
según ya ha sido indicado.
1- Se cubre la preparación con solución de verde de malaquita, calentando con el mechero
hasta la emisión de vapores. Se realiza invirtiendo el mechero y pasando la llama bajo la
preparación periódicamente. Esta operación se repite durante 5 minutos, evitando que la
muestra hierva y que se evapore completamente el colorante, añadiendo más colorante en
caso necesario.
2- Lavar con agua el exceso de colorante.
3- Aplicar la solución de safranina, como colorante de contraste, durante 30 segundos.
4- Lavar con agua y secar la preparación
5- Examinar con objetivo de inmersión, anotando la morfología y disposición de las
endosporas en la especie de Bacillus.
Técnica de Gránulos metacromáticos

La muestra de yogur, Lactobacillus delbrueckii sub. Bulgaricus y Streptococcus thermophilus
forman parte de la biota específica del yogur, presentando la primera especie corpúsculos
metacromáticos.
Hacer las preparaciones usuales con las bacterias, evitando un exceso de calor en la fijación y
en el secado.
Se pueden seguir dos procedimientos:
A. Método de Löeffler
1- Aplicar sobre la muestra, seca y fijada suavemente a la llama del mechero, la solución de
azul de metileno alcalina de Loëffler. Se deja actuar de 3 a 5 minutos.
2- Eliminar el colorante con agua y secar al aire o con ayuda de un papel secante.
3- Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión.
B. Método de Albert
1- Aplicar sobre la muestra seca y fijada suavemente al calor, el colorante de Albert y teñir
durante 5 minutos. Lavar con agua el exceso de colorante y aplicar una solución de lugol
dejando actuar durante 5 minutos.
2- Lavar con agua y dejar secar.
3- Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión.
Tinción negativa

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1- Colocar un asa de solución de nigrosina o de tinta china en un portaobjetos y mezclar con
un asa de cultivo bacteriano.
2- Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la muestra evitando que se formen burbujas y
presionar el mismo con un papel de filtro hasta obtener una capa fina del material que se va
a observar, absorbiendo el papel secante el exceso de la muestra. Tirar el papel en un
contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabón desinfectante.
3- La observación de la muestra se hace con objetivo de 40 aumentos o con objetivo de
inmersión, utilizando en este caso, una gota de aceite de inmersión. Conviene cerrar el
diafragma del condensador para incrementar el contraste de las células. Para retrasar la
evaporación de la muestra deben sellarse los bordes del cubreobjetos con parafina.
2.5 Resultados
Técnica de Gram
Las bacterias Gram positivas aparecerán coloreadas de violeta, mientras que las Gram
negativas se observan de color rosa.
Técnica de Ziehl Neelsen
Los bacilos ácido-alcohol-resistentes son largos y finos y aparecerán en grupos, teñidos de
color rojo, mientras que las células que no son ácido-alcohol-resistentes aparecerán de color
azul, tras la tinción del contraste.
Técnica de Wirtz Conklin
Las esporas de B.subtilis son ovaladas y aparecen en posición subterminal no deformante,
coloreadas de verde, en el interior de las formas vegetativas, con forma bacilar y que están
teñidas de rosa.
Método de Löeffler
Observe los gránulos metacromáticos coloreados de azul intenso, mientras que el citoplasma
celular aparece de color azul más claro.
Método de Albert
En este caso los corpúsculos metacromáticos se observan como puntos verde oscuro o negros
dentro de una célula de color verde pálido.
Tinción negativa
Las cápsulas aparecerán como zonas claras, transparentes, alrededor del microorganismo, que
aparecerá refráctil sobre un fondo oscuro.
Grafique sus observaciones:

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2.6 Cuestionario
1. Cuál es la diferencia entre bacterias gram positivas y gram negativas, cuál es el
fundamento de la coloración Gram?
2. Qué es un mordiente para qué se utiliza?
3. Cómo realizaría el control de calidad de las tinciones?
4. Mencione ejemplos de tinciones estructurales

1. Ausina Ruíz, V. y Moreno Guillén, S. Tratado Seimc De Enfermedades Infecciosas Y
Microbiología Clínica. Buenos aires. Editorial Médica Panamericana. 2006
2. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. Bailey Scott. Diagnóstico Microbiológico. 11
Ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2004.
3. Guillen A., Guerrero C, Benites C. Manual de prácticas de Bacteriología. FTM UNFV,
2007.
4. Instituto Nacional de Salud – Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Manual
de Procedimientos Laboratorios para la obtención y envío de muestra (I). Serie de
Normas Técnicas N° 4. Lima. 1997.
5. Koneman E.W., Allen S.D., Dowell S.R.Jr., Sommers H.M. Diagnóstico Microbiológico,
Texto Y Atlas Color. 6 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana: 2008.
6. Mac Faddin J. Pruebas Bioquímicas Para La Identificación De Bacterias De Importancia
Médica. E ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 2003.
No. 3 Preparación De Medios De Cultivo

3.1 Marco teórico
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para
el desarrollo de los microorganismos.

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Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras
bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de
los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las
necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los
siguientes requisitos:
- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se
siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías:
Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica;
entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno,
las sustancias minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones
adecuadas.
Tipos de medios de cultivo
Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio,
la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de
agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por su consistencia:
1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente
solidificante.
El agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen marino cuyas
propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No es
degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos
microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en
estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC. Además, una vez
solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe.
Generalmente el agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración del
1,5%. Los medios con agar se envasan en tubo o en placa de Petri.
3.-Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente
solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen
una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los
microorganismos.
B) Por su composición
1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de

muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman
parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus
componentes proceden de la degradación parcial de tejidos o productos animales, de plantas
o de microorganismos que son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y
minerales.

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Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (proteínas animales digeridas
enzimáticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha
mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares pero en muchos casos los medios
complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el
caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne.
2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de
productos químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio
definido que permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como
E. coli, debería contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2,
Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se
encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos químicos antes
citados, en cantidades suficientes para el crecimiento.
C) Por su utilización:
Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se
pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos
nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra
un microorganismo que se encuentre en un bajo número y que pueda ser enmascarado por
otros microorganismos presentes en un número más elevado. En esos casos es recomendable
utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que,
de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:
1.-Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de

microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen
un agente selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc. Entre los agentes
selectivos podemos citar el cloruro sódico, que en concentración elevada inhibe la mayoría de
los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos,
o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro
de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen
de este sistema, así como otros Gram positivos. De la misma manera, la bilis y sales biliares
convierten los medios de cultivo a los que se añaden en selectivos para Salmonella ya que,
además de inhibir a los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben
también a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde
brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo también inhibidor para
la mayoría de las bacterias intestinales excepto para Salmonella. Este colorante es la base del
medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a partir de muestras
fecales.
Los medios selectivos pueden serlo también por su pH, así el agar glucosado de Sabouraud
ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las
bacterias.
2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de

otros, a partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias.
Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de
microorganismo posee.

21
Por ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de
manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio
de color que se origina cuando éste es metabolizado, como en el caso del medio CLED.
Los medios diferenciales pueden ser además selectivos, si se añaden agentes que inhiben el
crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir
diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden
crecer.
El medio EMB de Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos
colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas. Es también un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la
lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. La formación de ácidos a partir de
lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen
de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. coli, las colonias
presentan además un brillo metálico.
El agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales
biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas; la fermentación de
lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el
medio.
Preparación de los medios de cultivo

La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la
comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran
ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad
correcta de agua destilada para disolver sus componentes.
Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en
agua destilada. A continuación el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o
tubos), tapando los mismos y esterilizándolos.
La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir
agar al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma
elegida para hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos
especiales, ya que el agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe
calentar la mezcla hasta 100ºC, para permitir que el agar se funda y quede incorporado al
resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se
tapan y se esterilizan. Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en
posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al
solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie
de siembra.
Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado
en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico,
como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo
laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse

estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas.
Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en
autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las
instrucciones del fabricante.
3.2 Competencias
Aprende a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo.

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Balón de 500 ml
Probeta graduada de 500 ml
Trípode
Rejilla de asbesto
Espátula
Agar tripticasa de soya
Caldo tripticasa de soya
Sangre de carnero
Placas petri 15 x 100.
Baño Maria a 80ºC.
Tiras indicadoras de pH
Pipeta pasteur
NaOH 1N
HCl 1N
Pinza
Balanza
3.4 Procedimiento
Pesado de los ingredientes

El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias detergentes.
Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se deberán pesar
exactamente uno a uno y colocarlos en un balón que tenga el doble de volumen de la cantidad
a prepararse.
Para preparar utilizando un medio deshidratado, se debe leer cuidadosamente las
instrucciones del fabricante y tomar exactamente la cantidad indicada, teniendo cuidado de
cerrar herméticamente el frasco inmediatamente después de haberlo utilizado.
Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria, preferentemente en dos
partes, primero la mitad del volumen y se agita suficientemente para conseguir una suspensión
homogénea. Después se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta para desprender
las partículas de medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la pared interna del
recipiente.
Disolución
Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda del calor. Este
calentamiento se puede realizar en un baño María, en un mechero con ayuda de una rejilla o
utilizando un horno microondas, hasta que se alcance su completa disolución, esto se reconoce
cuando al agitar no se adhiere ninguna partícula de agar a la pared interna del recipiente. No
debe olvidarse que todos los medios de cultivo son sensibles al calentamiento, por este motivo
no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Los medios de cultivo que no contienen
agar o gelatina son solubles en agua fría.
Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado, con los medios comerciales y
utilizando agua destilada neutra no es necesario, pero cuando se prepara por componentes es
necesario realizar la medición, para lo cual se utiliza un potenciómetro o papel indicador de
pH que tenga un rango útil de 4.0 a 8.0. El valor de pH se ajusta a los intervalos previstos con
la adición de gotas de ácido clorhídrico 1N o hidróxido de sodio 1N.
Preparación de medios en tubos

23
Si se utilizan medios semisólidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que se van a utilizar
antes de esterilizarlos, después de ella dejarlo enfriar en posición vertical.
Cuando se quieren colocar medios sólidos en tubos igualmente se les debe distribuir en sus
envases finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en posición inclinada o semi inclinada.
Esterilización
Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en el
autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Vertido en placas
Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio se encuentre
a una temperatura de 45 °C a 55°C para evitar que se formen gotas de agua de condensación
en la tapa de las placas. En la práctica a esta temperatura es posible sostener el frasco con el
medio con la mano desnuda sin quemarse.
Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para asegurar que
halla una mezcla uniforme y flameando previamente la boca del recipiente se agregar el medio
de cultivo a las placas Petri que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente 16 a 18
mL a cada una.
Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar flameando
rápidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.
Se debe dejar que se enfríe el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la superficie del
medio quedara húmeda, puede colocarse las placas en estufa a 37°C, dejando las tapas
ligeramente abiertas y con el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.
Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a usar de
inmediato. Una placa de cada lote preparado deberá colocarse en la estufa a 37°C para
verificar su esterilidad.
Guardar las placas en posición invertida en el refrigerador hasta el momento de usar.
Agar Tripticasa de soya
Pesar 8 g de TSA y colocarlo en un matraz.
Añadir 200 mL de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta ebullición, agitando constantemente.
Autoclavar a 121°C (15 lb de presión) por 15 minutos.

Sacar de la autoclave y dejar enfriar a 50°C.
Preparar 3 placas y tubos en plano inclinado y semi-inclinado.
Agar sangre
Preparar el medio según se ha descrito y esterilizarlo.
Al frasco con TSA y enfriado a 45°C, se le añade 5 % de sangre de carnero desfibrinada y
fresca, mezclar bien evitando se formen burbujas.
Verter en placas Petri estériles y dejar enfriar.
Controlar en la incubadora a 37°C por 24 horas.

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Agar chocolate
Una vez preparado el agar sangre calentarlo en baño María a 80°C, agitando suave y
constantemente hasta que el medio tome un color chocolate. Dejar enfriar a 50°C antes de
plaquear.
3.5 Resultados
Los medios repartidos en placa petri se observan con una superficie uniforme. Deben pasar
control de esterilidad. Realizar gráfica de sus resultados
3.6 Cuestionario
1.¿Cuáles son las recomendaciones para preparar agar sangre y agar chocolate?
2. Realizar un cuadro de 10 medios de cultivo: tipo de medio, pH e indicador .

MEDIO DE TIPO DE INDICADOR PERFORMANCE pH
CULTIVO MEDIO
3. ¿Cómo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo?

2. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. Bailey Scott. Diagnóstico Microbiológico.
11ª Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana. 2004.
2007.

Texto Y Atlas Color. Buenos Aires, Ed. Panamericana, 6ta edición 2008.
Médica. 3 ed. Buenos Aires, Ed. Panamericana; 2003.
PRÁCTICA II
Métodos de Siembra
4.1Marco teórico

25
Las muestras clínicas pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razón se
utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y obtenerlos en cultivo puro,
para luego identificarlos estudiando sus características de cultivo, bioquímicas, susceptibilidad
a antibióticos, etc. La siembra por estrías si se ejecuta correctamente es el método más útil
para obtener colonias aisladas y cultivos puros.
Definiciones
Siembra.- Es la acción de poner en contacto bacterias con un medio de cultivo; en el cual
luego de un período de incubación se van a desarrollar colonias. Los fines de la siembra son los
de aislamiento de la bacteria, su enriquecimiento, recuento poblacional y estudios
bioquímicos.
Inóculo.- Es la porción de muestra que se siembra.
Resiembra y repicaje.- Es cuando se extrae con el asa de siembra una fracción de las colonias
a partir de un medio sólido o de un medio líquido y se lleva este inóculo a otro medio líquido o
sólido en el cual se evidencia el desarrollo de colonias por gérmenes de una sola especie,
obteniéndose el aislamiento bacteriano.
Cultivo puro.- Es aquel que consta de una sola especie bacteriana.
Cepa.- Es una especie bacteriana plenamente identificada por sus características morfológicas,
fisiológicas, bioquímicas y serológicas.
4.2Competencias
Utiliza las técnicas de siembra de muestras y aislamiento para la obtención de cultivos puros
de bacterias.
4.3Materiales y equipos
Placas petri con agar tripticasa de soya
Tubos con agar tripticasa de soya en plano inclinado
Tubos con caldo tripticasa de soya en tubo de 13 x 100
Tubos con caldo tripticasa de soya en tubos de 16x150

Hisopos estériles
Frasco con agar tripticasa de soya 50mL a 45ºC
Pipeta de 5mL estéril
Propipeta
Asa de siembra en aro
Asa de siembra en punta
Agar TSI
Agar MIO
4.4 Procedimiento
Siembra por estrías

Consiste en repartir el inóculo por la superficie del medio sólido con el asa de Kolle, en forma
de líneas zigzagueantes.
Flamee hasta la incandescencia el asa de siembra con cultivo bacteriano sobre la llama del
mechero. Deje que enfríe el asa.

26
Usando el dedo meñique de la mano derecha, retire el tapón de algodón del tubo que contiene
la muestra. Flamee ligeramente la boca del tubo con la muestra. Introduzca el asa de siembra
dentro del tubo y tome una asada de la muestra. La medida del inóculo utilizado depende del
estimado del número de bacterias que podría contener la muestra. Flamee la boca del tubo y
coloque el tapón sobre la boca del tubo.
Coloque el inóculo sobre un extremo de la superficie de la placa petri con agar y estríe toda la
placa, procurando que el espacio entre estría y estría sea el mínimo posible.
Flamee el asa de cultivo.
Siembra por agotamiento
Consiste en repartir el inóculo sobre la superficie del medio sólido produciendo líneas
zigzagueantes en tres o cuatro campos de la placa Petri, rotando sucesivamente la placa. Sirve
para aislar bacterias a partir de muestras muy contaminadas.
Flamee hasta la incandescencia el asa de siembra en el mechero. Deje que enfríe el asa.
Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo con la
muestra. Tome una asada de la muestra, flamee la boca del tubo y coloque nuevamente el
tapón sobre la boca del tubo.
Coloque el inóculo sobre un extremo de la superficie de la placa de agar y estríe la cuarta
parte de la superficie de la placa.
Rote la placa en un ángulo de 90° y estríe tomando como punto de inicio la parte final de lo
estriado con anterioridad.
Repita el paso anterior y luego en este momento estríe toda la superficie de la placa que falte.
Placa vertida
En esta modalidad de siembra el inóculo se mezcla con el medio sólido licuado (45°C
aproximadamente). Se utiliza en el recuento de población bacteriana.
Siembra por diseminación
Consiste en sembrar sobre la superficie del medio sólido a manera de monocapa obteniéndose
un desarrollo homogéneo. Sirve para pruebas de sensibilidad, estudios bacteriológicos y
desarrollo masivo de cepas (recolección para vacunas).
Sumerja un hisopo con punta de algodón en un tubo con caldo con un cultivo bacteriano.
Exprima el exceso de líquido en la pared del tubo.
Estríe sobre la superficie del medio
Siembra por puntura
Los medios de cultivo que se utilizan en tubos pueden estar en forma sólida o semisólida y es
necesario la utilización de la aguja de cultivo. Sirve para estudiar las características
bioquímicas o morfológicas.

27
 Flamee el asa o aguja de cultivo sobre la llama del mechero, deje que se enfríe.
 Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo. Tome una
asada de la muestra y tape nuevamente el tubo que contiene la muestra. Destape el tubo
que va a ser inoculado.
 En un medio semisólido inocule con la aguja de puntura hasta antes de tocar el fondo del
tubo.
 En medios que tienen una parte inclinada y fondo, toque con la punta de la aguja de
cultivo una colonia y luego inocule primero el fondo del tubo y luego estríe la superficie
del medio.
Siembra por inoculación

Los medios de cultivo que se utilizan en tubos pueden estar en forma líquida y es necesario la
utilización de una asa de siembra en aro. Sirve para estudiar las características culturales.
 Flamee el asa siembra en aro sobre la llama del mechero, deje que se enfríe.
 Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo. Tome una
asada de la muestra y tape nuevamente el tubo que contiene la muestra. Destape el tubo
que va a ser inoculado.
 En Siembre por inoculación es decir forme un ángulo de 15 grados entre el aro del asa de
siembra y el medio líquido, realizar movimientos cortos que toque las paredes del tubo.
 Flamee el borde del tubo que contiene la cepa , tape, flamee el asa siembra en aro sobre
la llama del mechero, deje que se enfríe.
4.5Resultados
Observe el desarrollo microbiano en forma de zigzag.(Técnica de estria).
Observe el desarrollo microbiano abundante al inicio y en los demás cuadrantes observe las
colonia
separadas (Técnica de dispersión agotamiento).
Observe el desarrollo en todo la superficie del medio en forma homogénea (Placa vertida).
Observe el desarrollo en todo la superficie del medio en forma homogénea (Siembre por
diseminación).
Observe el desarrollo bacteriano en el trazo de siembra ( puntura)y el metabolismo en todo el
medio.
Observe el desarrollo de la bacteria en medio líquido:
a) Turbidez total

28
b) Formación de película en la superficie
c) Desarrollo en el fondo
4.6Cuestionario
1. Cite un ejemplo del uso de cada técnica de siembra

Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana. 2004.
2007.
Texto Y Atlas Color. 6 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana;2008.
Médica. 3 ed. Buenos Aires, Ed. Panamericana; 2003.
Observación de colonias
5.1 Marco teórico
Las placas de Petri y los tubos sembrados e incubados a 37°C por 18 a 24 horas, son retiradas
de la incubadora para realizar la "lectura" de las colonias anotando sus características de
crecimiento en los diferentes medios de cultivo.
Colonia.- Es el desarrollo masivo de microorganismos de una especie. Es una agrupación de
células bacterianas que comparten las mismas características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas cuando se hallan en un medio sólido o semisólido y se han originado
probablemente de una sola célula progenitora. Las colonias elegidas para ser estudiadas
deberán estar separadas una de otra y adecuadamente conservadas.
5.2 Competencias
Diferencia las características de las colonias bacterianas.

Conoce las características de crecimiento de la colonia su forma, su tamaño.

Cultivo bacteriano en medio líquido
Agar sangre
Agar Mac Conkey
Agar DNasa
Medio semisólido con rojo de fenol y carbohidratos ( glucosa, sacarosa, lactosa)
Caldo trpticasa de soya

29
Caldo tioglicolato de sodio
5.4 Procedimiento
Sembrar las diferentes cepas en medio sólido por el método de dispersión agotamiento.
Sembrar las cepas a estudiar en los diferentes medios de estudio bioquímico por la técnica de
puntura.
Sembrar las cepas en los medios líquidos por la técnica de inoculación.
Incubar los medios a 37ºC por 24 horas.
5.5 Resultados
Estudio de las colonias en medio sólido

Observar las características de los distintos tipos de colonias, se enumeran y describen cada
una por separado. Teniendo en cuenta lo siguiente:
 Cantidad: Hacer un recuento si es posible o dar una apreciación (poco, regular,
abundante) de las colonias que son iguales.
 Tamaño: Se mide el diámetro de cada tipo diferente de colonia y se expresa en
milímetros. Serán: grandes: > de 4 mm, medianos: 2 a 4 mm, pequeños: 1 a < 2 mm o
puntiformes: < 1 mm.
 Forma: Redondeada, ovalada e irregular.

 Borde: Enteros, ondulados, dentados, festoneados y filamentosos.
 Elevación: Plana, elevada, convexa, umbilicada, papilar o crateriforme.
 Superficie o aspecto: Puede ser: Mucoide, Lisa, Rugosa, Brillante u opaca
 Color: Puede verse si la colonia es incolora o pigmentada; indicar el color y el medio de
cultivo.
 Olor: Proteico, ácido láctico, a heces, a frutas (agradable o desagradable).
Características debidas al medio de cultivo:
 La hemólisis en Agar Sangre que puede ser Beta - hemolíticas (halo claro que indica
hemólisis completa), alfa - hemolíticas (halo verdoso que indica hemólisis parcial) o
gamma - hemolíticas (ausencia de halo que indica no hemólisis).
 Demostración de la acción enzimática sobre el sustrato del medio: Acción de proteasas,
lipasas, DNAsas entre otras
 Fermentación de carbohidratos: observar el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo
debido a la acidéz producida por la bacteria en el medio.
Estudio de las colonias en medio líquido

 El desarrollo bacteriano en medio líquido se evidencia por la presencia de: sedimento,
turbidez o película.
5.6 Cuestionario
1. Describa las características macroscópicas de las cepas estudiadas. Realizar esquemas de sus
observaciones

30
Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana. 2004.
2007.
Médica. 3 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 2003.
PRÁCTICA III
Aislamiento e identificación de Staphylococcus

6.1 Marco teórico
El género Staphylococcus son un grupo de cocos gram positivos que se agrupan en forma
irregular (racimos), son habitantes comunes de la piel y membrana mucosas del hombre y de
muchos animales, razón por la cual frecuentemente están involucrados en una serie de
infecciones en el ser humano.
6.2 Competencias
Conoce las características morfológicas, culturales y bioquímicas de las principales especies de

Staphylococcus que producen infección humana.
Cepas de Staphylococcus aureus

Cepas de Staphylococcus epidermidis
Cepas de Staphylococcus saprophyticus
Placas de agar sangre
Placas de agar manitol sal

31
Placas de agar DNAsa
Placas de agar Muller Hinton
Peróxido de hidrógeno al 3%,
Acido clorhídrico 1N
Discos de Novobiocina
Tubos de 13 x 100 con caldo plasma
Hisopos de algodón estériles.
Set de coloración Gram
Soporte para coloración
Microscopio
Láminas portaobjeto
Solución de cloruro de sodio estéril
6.4 Procedimiento
Recibidas las cepas proceda a realizar un extendido y coloréelo por el método de Gram.
Observe y grafique la morfología, disposición y coloración.
Inocular un tercio de la placa de Agar Sangre para cada cepa, de manera que se obtengan
colonias aisladas.
Sembrar en un tercio de la placa de Agar Manitol salado para cada cepa, no olvidar que este
medio posee alta selectividad y el inóculo debe ser mayor.
Sembrar una placa de DNAsa agar, realizando pequeños inóculos de acuerdo al esquema
indicado por el profesor.
Rotule sus placas e incúbelas a 37°C por 24 horas.
Siembre un tercio de la placa de agar Mueller Hinton con cada cepa utilizando un hisopo y
ponga un disco de novobiocina en el centro de la siembra.
6.5 Resultados
Examine las placas de agar sangre: Observe el color, tamaño y actividad hemolítica de las
colonias.
Prepare y examine un extendido coloreado por el método de Gram de una de estas colonias,
anote sus observaciones.
Examine la placa de agar manitol salado, recuerde que en este medio crece casi
exclusivamente estafilococo. Observe si se produce cambio en las colonias y en la coloración
del medio debido a la fermentación del manitol, anote e interprete los resultados.
Con una aguja de cultivo o con un mondadientes tome una porción de una de las colonias bien
aisladas y transfiéralo a la superficie de una lámina portaobjetos, añada una o dos gotas de
peróxido de hidrógeno al 3%, la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas
indica una reacción de catalasa positiva. Observe y grafique su resultado.

32
Examine la placa de agar DNAsa, bañe la placa con ácido clorhídrico 1N, se revelaran zonas
claras alrededor de las colonias que son desoxiribonucleasas positivas, observe e interprete los
resultados.
Coloque una gota de suero fisiológico estéril sobre una lámina porta-objeto, emulsione
suavemente una porción de una de las colonias en estudio. Coloque una gota de plasma junto a
la gota de suspensión bacteriana, mezcle bien. Rote el portaobjetos suavemente observando si
se produce la formación de grumos lo cual indicaría una prueba positiva para la coagulasa en
lámina.
Tome 2 a 3 colonias de la placa de agar sangre e inocule un tubo de caldo plasma, agite e
incube a 37°C, observando cada medía hora durante las primeras cuatro horas para ver si se
produce la formación de un coagulo visible dentro del tubo. Las pruebas que sean negativas a
las cuatro horas deben observarse después de 24 horas de incubación.
Mida el halo de inhibición con el disco de novobiocina para cada cultivo de Staphylococcus.
Recordando las características de los diferentes tipos de estafilococos, realice la identificación
de las cepas reportando sus resultados.
Haga esquemas y dibujos de sus observaciones

GRAM AGAR SANGRE AGAR MANITOL SALADO
6.6 Cuestionario
1. ¿Cuáles son las pruebas que diferencian a Staphylococcus aureus de S. saprophyticus?
2. Prueba para identificar el Staphylococcus epidermidis
3. ¿El Medio Agar Manitol porqué es selecctivo?
4 ¿Cuál es el fundamento de la hemólisis en agar sangre del Staphylococcus aureus ?

2007.

33
PRÁCTICA IV
Aislamiento e identificación de Streptococcus y Enterococcus

7.1 Marco teórico
Los estreptocococos están involucrados en una serie de infecciones, desde cuadros leves como
una faringitis estreptococica, pasando por cuadros moderados a bastante severos que pueden
llevar a la muerte. En estos procesos infecciosos es importante la correcta identificación de las
especies que puedan estar involucradas
7.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a los
géneros Streptococcus y Enterococcus..
Streptococcus pyogenes grupo A

Streptococcus pneumoniae
Streptococcus agalactiae grupo B
Enterococcus faecalis (enterococos)
Staphylococcus aureus ATCC
Placas de agar bilis esculina
Placas de agar con 6.5% de NaCl
Discos de optoquina 5ug
Discos de Trimethoprim- sulfamethoxazole 1.25
Discos de bacitracina 0,04 U
Desoxicolato de sodio al 10%
Peróxido de hidrógeno 3%

34
Suero fisiológico estéril.
Hisopos estériles.
Pinza metálica
Jarra de Gaspack
7.4 Procedimiento
 Siembre las cepas de Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae en mitades de

placas de agar sangre
 En la cepa de Streptococcus del grupo A, coloque sobre el inóculo un disco de Bacitracina
de 0.04 U y Discos de Trimethoprim- sulfamethoxazole , con la ayuda de una pinza
previamente flameada.
 En la cepa de Streptococcus pneumoniae colocar un disco de Optoquina sobre el

inóculo. Incube la placa a 37°C, por 24 horas en atmósfera de CO2.
 Prueba CAMP :Sobre una placa de agar sangre trace una estría de la cepa de
Streptococcus del grupo B en forma perpendicular a una estría de Staphylococcus aureus
(beta hemolítico). Ambas líneas no deben tocarse. Incubar la placa a 37°C por 24 horas.
Sembrar el Enterococcus en una placa con agar bilis esculina, una placa de TSA con cloruro de
sodio al 6,5% Incube a 37°C por 24 horas.
7.5 Resultados
 Observe el crecimiento de los cultivos en los diferentes medios, anote las características
de la colonia, el tamaño y la presencia de hemólisis.
 Realice una coloración de Gram de cada una de las colonias.
 Realice la prueba de la catalasa con cada una de las colonias.
 Examine la placa de agar sangre en la cual se colocó el disco de Bacitracina y Discos de
Trimethoprim- sulfamethoxazole, verifique la sensibilidad:
Amplia zona de inhibición alrededor del disco = Sensible
Crecimiento alrededor del disco = Resistente
 Observe lo sucedido alrededor del disco de Optoquina:
Sensible = Zona de inhibición alrededor del disco > 14 mm
Resistente = Sin crecimiento alrededor del disco o halo menor de 14 mm.
 Haga una suspensión con las colonias de S. pneumoniae y Enterococcus en suero
fisiológico y añada unas gotas de desoxicolato de sodio al 10% y observe:
Positivo = Lisis total de la colonia con aclaración del tubo con suero fisiológico.
Negativo = No ocurre nada o se aclara muy ligeramente
 Examine la placa en la que sembró la cepa de Streptococcus del grupo B. Una prueba de
CAMP positiva estará dada por una intensificación de la hemólisis, que en la zona de
intersección con la cepa de Staphylococcus, asumirá la forma de una cabeza de flecha.

35
 Examine la placa con agar Bilis esculina. Una prueba positiva (hidrólisis de la esculina)
estará dada por la aparición de un halo marrón o negro alrededor de la colonia.
Anote sus resultados
7.6 Cuestionario
1. Cual es el fundamento de las pruebas realizadas en la práctica?

2. Cómo identificaría las especies de estreptococos del grupo viridans?
3. Explique las diferentes hemólisis

Microbiología Clínica. Buenos aires: Editorial Médica Panamericana; 2006
2007.
PRÁCTICA V
Aislamiento e identificación de Bacillus
8.1 Marco teórico
Las bacterias del género Bacillus son en su mayor parte saprofitos de vida libre, pero, ciertas
especies están involucradas en enfermedades que afectan tanto al hombre como a animales,
en estos procesos infecciosos es importante la correcta identificación de las especies que
puedan estar involucradas
8.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen al género
Bacillus.

Cepas de Bacillus anthracis y Bacillus subtilis
Placas de agar almidón

36
Tubos con medio de SIM
Tubos con gelatina nutritiva
Tubos con caldo nutritivo
Batería para coloración de Gram y coloración de esporas (Wirtz Conklin)
Lugol
8.4 Procedimiento
Una vez recibida las muestras, siembre ambas cepas en agar sangre. Incube a 37°C por 24
horas.
Del mismo modo siembre en las placas de agar almidón. Incube a 37°C por 24 horas
Siembre por puntura en el medio SIM y en los tubos con gelatina nutritiva, incube a 37°C por 24
horas.
Siembre las cepas en los tubos con caldo nutritivo, incube a 37°C por 24 horas.
8.5 Resultados
Revise las placas de agar sangre y observe las colonias de Bacillus que son grandes, blanco
grisáceas, de borde irregulares y que tienden a expandirse. Verifique la producción de
hemólisis. Es una característica útil para diferenciar al B. anthracis, que no produce hemólisis,
de los saprófitos que provocan beta hemólisis.
Tome una porción de las colonias en agar sangre y realice un extendido en dos láminas
portaobjetos; coloree una por el método de Gram y las otras para coloración de esporas con
Wirtz Conklin.
Observe: En la lámina coloreada con Gram se observan los bacilos Gram positivos, en cadenas,
en los cuales las esporas se observan como áreas sin colorear dentro de la célula.
En la lámina coloreada con Wirtz Conklin, las esporas se observan de color verde sobre un fondo
rojo tomado por la bacteria.
Sobre el desarrollo en la placa de agar almidón vierta unas gotas de lugol hasta bañar la placa,
observe. La aparición de un halo claro alrededor de las colonias indicaría que el almidón del
medio ha sido hidrolizado.
Revise sus tubos con gelatina nutritiva y verifique la licuefacción de esta.
B. anthracis no licúa la gelatina y desarrolla en este medio dando un aspecto de pino invertido.
Verifique la movilidad en el medio SIM, la cual se ve como un halo difuso alrededor de la zona
de la puntura.
Realice dibujos y esquemas de sus observaciones
GRAM AGAR SANGRE

37
8.6 Cuestionario
1. Describa las características microscópicas del género Bacillus.


2007.
PRÁCTICA VI
Aislamiento e identificación de Listeria
9.1 Marco teórico
Está ampliamente distribuida en la naturaleza, en vegetales en descomposición, en el suelo,

en las heces y tracto gastrointestinal de los portadores sanos animales y hombre. La especie
patógena para el hombre y los animales es Listeria monocytogenes. Es habitante normal de
tracto gastrointestinal y heces de animales. Ha participado como causante de intoxicación
alimentaria. El grupo de riesgo incluye recién nacidos, mujeres embarazadas y sus fetos,
personas que carecen de un sistema inmune saludable.
9.2 Competencias
Conoce los métodos de aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes
Cepa Listeria monocytogenes
Cepa Staphylococcus aureus
Placa de Agar sangre

38
Medio selectivo de Listeria
Tubos con Citrato de Simons
Tubos con caldo glucosado (MR-VP)
Tubos con medio SIM
Tubos con agar urea
Reactivo de kovacs
Alfa naftol 5%
KOH 40%
Solución de rojo de metilo
Cloruro de sodio
Lámina portaobjeto
Reactivo de oxidasa
Reactivo de peróxido de hidrógeno al 3%
Agar Esculina
9.4 Procedimiento
Día 1
Siembre la cepa en las placas de agar sangre y de medio selectivo tratando de obtener colonias
aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura el medio SIM.
Siembre las cepas en los medio de diferenciación bioquímica. Incubar por 24 horas a 37°C.
Hacer frotises a partir del agar utilizando solución salina y colorear por gram
Día 2
Observe el desarrollo obtenido en los medios en placa y en los medios diferenciales, realizar la
prueba de oxidasa y catalasa.
Para la reacción de catalasa verter una gota de peróxido de hidrógeno al 10% sobre la colonia en
una lámina portaobjeto.
Realizar la prueba de oxidasa.
9.5 Resultados
Prueba de catalasa : se observa la presencia de burbuja , resultado positivo.
Observe la ausencia de color para la prueba de oxidasa dando un resultado negativo.

Se observan bacilo Gram positivo no formador de espora, pueden estar aislados o en grupos
de dos semejando diplococos, en empalizada, en forma de V o Y.
En el agar sangre presenta colonias pequeñas con beta hemólisis circunscrita.
En el medio selectivo se observa colonias amarillo verdosas.
En el medio semisólido incubado a 22 ºC se ve el desarrollo característico en paraguas.

Agar Urea= negativo
Agar Citrato de Simmons= Negativo

39
Caldo Rojo de fenol con glucosa y salicina = positivo (color amarillo)( ácidez sin gas).
Caldo Rojo de fenol con manita, lactosa, sacarosa = negativo (color rojo)
Caldo MRVP=Positivo
Esculina= hidrólisis positiva (precipitado negro )
Anote sus observaciones.
GRAM AGAR SANGRE SIM
9.6 Cuestionario
1. ¿Cómo es el desarrollo de Listeria a temperatura ambiente y a 37ºC?

2007.
Texto Y Atlas Color. 6 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 2008.
PRÁCTICA VII
Baciloscopía
10.1 Marco teórico
La tuberculosis es una enfermedad que continúa siendo un problema serio de salud pública
para el mundo y que causa millones de casos nuevos cada año, a pesar de que se puede
prevenir y curar.
La baciloscopia, es la técnica fundamental en toda investigación bacteriológica de la
tuberculosis, en la detección de casos y control de tratamiento. Con un costo bajo y de rápida
ejecución, la baciloscopia es una técnica que permite identificar al 70-80% de los casos
pulmonares positivos.

40
10.2 Competencias
Realiza correctamente el procedimiento de preparación y coloración de láminas para la
investigación de bacilos alcohol ácido resistentes, realizar correctamente la lectura de las
baciloscopías.
Muestras de esputo positivo
Bajalenguas de madera
Fenol al 5%
Batería para coloración de Ziehl Neelsen
Mascarillas descartables N95
Mechero de alcohol
Frasco con arena y fenol
Cábina de flujo laminar

Hoja de papel periódico
Lápiz de cera
Aplicador
10.4 Procedimiento
Preparación del extendido

Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel periódico, humedecido con fenol al
5%.
Tomar la lámina portaobjetos y con un lápiz de cera trazar una línea que divida su superficie en
una tercera parte destinada a la numeración y dos terceras partes para hacer el extendido.
Destapar cuidadosamente el envase colocándolo cerca al mechero.
Seleccionar la partícula útil, que es la porción mucopurulenta de color amarillo verdoso,
enrrollándola en el aplicador y colocarla sobre el portaobjeto, extender haciendo movimientos
de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni muy fino ni muy grueso), que no
llegue a los bordes de la lámina.
Incinerar los aplicadores o colocarlos en un envase para luego esterilizarlos.
Dejar secar la lámina, y luego fijar al calor con la ayuda de la llama de un mechero.
Coloración
Cubrir el extendido con el fucsina básica fenicada, previamente filtrado. Calentar suavemente
con la llama de un mechero hasta la emisión de vapores, dejar enfriar. Repetir el proceso 3
veces, no debe hervir la preparación. El tiempo de coloración debe ser de 5 minutos.
Eliminar la fucsina y lavar con agua corriente para eliminar el colorante.
Cubrir la superficie del extendido con la solución de alcohol ácido y decolorar hasta que el
extendido tenga una coloración clara o rosa pálido.
Lavar nuevamente la lámina con agua.
Cubrir la superficie con azul de metileno, previamente filtrado, durante 30 segundos a un
minuto.

41
Eliminar el azul de metileno y lavar la lámina con agua. Dejar secar. Observar con objetivo de
100X y aceite de inmersión.
Observación de las laminas
Determinar si hay bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) y establecer su número aproximado.
Observar al microscopio con lente de inmersión (1000 x).
Los bacilos aparecen como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo, aislados,
en parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.
Seguir una pauta uniforme de observación, leyendo de izquierda a derecha del extendido un mí-
nimo de 100 campos útiles, equivalentes a 5 minutos.
Se considera campo microscópico útil aquel en el cual se observa elementos celulares de origen
bronquial (leucocitos, fibras mucosas o células ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos
elementos no deben contabilizarse en la lectura.
Las muestras de esputo deben autoclavarse o incinerarse antes de ser descartadas.
10.5 Resultados
Informe de resultados
Se utiliza la siguiente escala semicuantitativa:
Negativo No se encuentran bacilos ácidos alcohol resistentes (BAAR) en 100
campos microscópicos observados
Positivo 1+ Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados (de 10-99
BAAR).
Positivo 2+ 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados.
Positivo 3+ Más de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.
Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100

campos más. Si persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar
lo encontrado (Ej. 5 BAAR en 100 campos) y solicitar nueva muestra.
Al término de la lectura retirar la lámina de la platina del microscopio, limpiar el aceite de
inmersión con tolueno y guardar la lámina. Limpiar con papel lente humedecido con tolueno el
exceso de aceite del objetivo de inmersión del microscopio.
Grafique e informe sus resultados

BACILOSCOPIA INFORME

42
10.6 Cuestionario
1.¿A qué se debe la propiedad ácido resistente de las mycobacterias?

2.Busque otras alternativas de coloración
3. Fundamento de la Coloración Ziehl Neelsen
4 Desinfectante que se debe usar al procesar muestras con Mycobacterias

2007.
Normas Técnicas N° 4. Lima. 199
PRACTICA VIII
Aislamiento e identificación de Neisserias

12.1 Marco teórico
Dos especies del género Neisseria son de mayor importancia médica N. gonorrhoeae y N.
meningitidis, que producen infecciones a nivel del tracto urogenital y meningitis
respectivamente.
El hombre es el único reservorio conocido de las dos especies mencionadas.
12.3 Competencias
Neisseria.

Placas de agar chocolate
Tubos con medio de Stuart o Amies
Hisopos estériles
Reactivo para oxidasa
Papel de filtro

43
Batería para Gram
Cloruro de sodio
Asa de siembra
Jarra anaeróbica
Vela
Algodón
13.4 Procedimiento
Los alumnos se dirigirán a un dispensario antivenéreo portando medios de transporte de Stuart o

Amies, laminas portaobjetos e hisopos estériles.
Tomar una muestra de secreción vaginal o uretral purulenta con un hisopo estéril, colocar el
hisopo en el medio de transporte. Con otro hisopo tomar una segunda muestra y realizar un
extendido en varias láminas portaobjetos rotando el hisopo sobre la superficie de la lámina. Este
material se llevará al laboratorio para la práctica.
Sacar el hisopo del medio de transporte y sembrar con el una placa de agar chocolate trazando
con el hisopo impregnado de la secreción una "Z" a lo largo de la placa, luego con el asa de
siembra proceda a realizar estrías sobre el trazo realizado con el hisopo.
Coloque la placa en una campana de vidrio, coloque también un trozo de algodón humedecido,
prenda una vela blanca pequeña dentro de la campana, cierre esta y coloque en la estufa a 37°C
por 24 horas.
Con la lámina traída del dispensario, hacer una coloración de Gram, observe la morfología,
coloración y disposición de las Neisserias.
13.5 Resultados
Examine la placa de agar chocolate a las 24 horas.

Si no hay desarrollo, retorne la placa inmediatamente a la campana de CO2 e incube 24 horas
más.
Si hay desarrollo observe el tipo, color y tamaño de las colonias.
Recoger el desarrollo de cada cepa de la placa de agar chocolate en aproximadamente 0.5 mL de
suero fisiológico.
Tome unas colonias y realice un extendido, coloree con Gram y observe.
Agregue una gota de reactivo de oxidasa sobre algunas de las colonias y observe:
La colonia se colorea de azul oscuro = Oxidasa positivo
No hay cambio de color = oxidasa negativo
El color puede variar de acuerdo al tipo de reactivo pudiendo ser de color rojizo.
Alternativamente se puede sacar una colonia con un palito mondadientes y estriarlo en papel

44
filtro, luego se añade una gota del reactivo de oxidasa. No usar asas de nicrón porque pueden
dar falsos positivos.
Realice la identificación.
GRAM AGAR CHOCOLATE
13.6 Cuestionario
1. Cite dos recomendaciones en la toma de muestra para el aislamiento de Neisseria
2. Medios Selectivos para Neisseria
3. Fundamento de la Oxidasa

2007.
PRÁCTICA IX
Aislamiento e identificación de Enterobacterias
14.1 Marco teórico
Las enterobacterias son un grupo de bacilos gram negativos no esporulados, anaerobios
facultativos, fermentan la glucosa, son oxidasa negativos y reducen nitratos a nitritos. Son
parte de la flora normal del tracto gastrointestinal del hombre y de muchos animales. Algunos
géneros de esta familia son patógenos para el hombre y la mayoría de comportamiento
saprófito, pero dependiendo del habitat en que se establezcan pueden ser potencialmente
patógenos.

45
14.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a la familia
de las enterobacterias.

Cepas de Escherichia coli, Enterobacter cloacae,Serratia marcenses, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Morganella morgani, Citrobacter freundii.
Placas de agar mac conkey

Placas de agar eosina azul de metileno (EMB)
Placas con agar nutritivo
Tubos con caldo peptonado
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubos con Citrato de Simmons
Tubos con caldo glucosado (MR-VP)
Tubos con medio SIM
Tubos con agar urea
Reactivo de kovacs
Alfa naftol 5%
KOH 40%
Solución de rojo de metilo
Cloruro de sodio
Lámina portaobjeto
Set de Gram
Reactivo de oxidasa
14.4 Procedimiento
Recibida las cepas proceda a hacer una emulsión de cada una en caldo nutritivo.
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey y agar Eosina Azul de metileno
(EMB) tratando de obtener colonias aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA, el profesor de prácticas le indicará la
forma correcta de hacerlo.
Prueba de IMVIC: Siembre cada una de las cepas en caldo peptonado, un tubo con caldo
glucosado y un tubo con Citrato de Simmons, incubar por 24 horas a 37°C.
14.5 Resultados
Observe el desarrollo obtenido en el agar Mac Conkey y EMB, identifique las colonias lactosa
positivas en el agar Mac Conkey y la presencia de brillo metálico en el EMB.
TSI: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que fermentan la glucosa dan una reacción alcalina en el plano inclinado y
ácida en el fondo (K/A).
Si además fermenta glucosa y/o sacarosa se produce acidez suficiente para acidificar tanto el
fondo como el plano inclinado (A/A).

46
La producción de gas se verifica por la aparición de cavidades en el medio y la producción de
hidrogeno sulfurado (H2S) como un precipitado de color negro (que pueden ir de 1 a 4+).
LIA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que descarboxilan la lisina originan una reacción alcalina (color púrpura) en
todo el medio (K/K).
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina producen un plano inclinado alcalino y un
fondo ácido (K/A).
Los cultivos de Proteus, Providencia y Morganella producen un plano inclinado de color rojo y
un fondo ácido (R/A).
PRUEBA DE ROJO DE METILO: A tubo con caldo glucosado separar la mitad en otro tubo, y
agregar 5 gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%.
Positivo: El medio cambia a un color rojo magenta.
Negativo: El medio queda de color amarillo o ligeramente rosado.
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER: Al tubo que se había separado caldo glucosado, se debe añadir
0.2 mL de alfa naftol al 5% y 0.2 mL de Hidróxido de potasio al 40%. agitar bien el tubo y dejarlo
en reposo
Positivo: Presencia de color rosa.
Negativo: No hay cambio de color.
UTILIZACION DE CITRATO: Observar la presencia de crecimiento en el plano inclinado y cambio
en el color del medio frente a un tubo no inoculado.
Positivo: Presencia de color azul brillante y crecimiento en el medio de cultivo.
Negativo: No se observa crecimiento ni cambio de color.
CALDO UREA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, las bacterias productoras de ureasa
hidrolizan la urea para formar amoniaco:
Positivo: Medio de color rojo
Negativo: El medio no cambia de color.
MEDIO SIM PRUEBA DE INDOL: Añadir 0.2 mL de reactivo de Kovacs al tubo con caldo peptonado
inoculado, agitar y dejar reposar, observar el resultado.
Positivo: Se forma un anillo color rojo cereza en la parte superior del medio.
Negativo: No se observan cambios en el color del medio.
MEDIO SIM PRUEBA DE MOVILIDAD: Observar el crecimiento de la bacteria en el medio semisólido
Positivo: Turbidez en el medio
Negativo: Solo se observa crecimiento en la línea de puntura.
Observe y grafique sus resultados
HAGA ESQUEMA DE TODAS SUS OBSERVACIONES
Enterobacteria Gram
Medios de cultivo /Pruebas

47
Bioquímicas
E. coli
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Serratia marcenses
Enterobacter cloacae

48
Proteus vulgaris
Morganella morgani
Citrobacter freundii
1.6 Cuestionario
1. ¿Cuáles son las pruebas que comparten todas las especies pertenecientes a la
Familia Enterobacteriaceae?
2. Explique reacciones en TSI
3. Explique reacciones en LIA
4. Explique reacciones en Citrato
5. Explique reacciones en SIM
6. Explique reacciones en RM-VP

2007.
Médica. 3 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 200

49
PRÁCTICA IX
Aislamiento e identificación de Enterobacterias
14.1 Marco teórico
Las enterobacterias son un grupo de bacilos gram negativos no esporulados, anaerobios
facultativos, fermentan la glucosa, son oxidasa negativos y reducen nitratos a nitritos. Son
parte de la flora normal del tracto gastrointestinal del hombre y de muchos animales. Algunos
géneros de esta familia son patógenos para el hombre causando enfermedad diarreica aguda
(EDA).
14.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen a la familia
de las enterobacterias.

Cepas de Salmonella typhi, Shigella flexneri, Salmonella S. paratyphi B. E. coli
enterohemorragica, Yersinia enterocolítica, Plesiomona shigelloides
Placas de agar SS
Placas de agar XLD
Placas de agar Mac Conkey con sorbitol
Placas de agar Mac conkey
Placas con agar nutritivo
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubos con Citrato de Simons
Tubos con medio SIM
Tubos con agar urea
Reactivo de kovacs
Cloruro de sodio
Lámina portaobjeto
Set de Gram
Reactivo de oxidasa
14.4 Procedimiento

50
Recibida las cepas proceda a hacer una emulsión de cada una en caldo nutritivo.
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey Sorbitol. Agar SS, Agar XLD
tratando de obtener colonias aisladas. Incubar a 37°C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA, el profesor de prácticas le indicará la
forma correcta de hacerlo.
Prueba de IMVIC: Siembre cada una de las cepas en caldo peptonado, un tubo con caldo
glucosado y un tubo con Citrato de Simmons, incubar por 24 horas a 37°C.
14.5 Resultados
Observe el desarrollo obtenido en los medios de aislamiento primario.
Observe y grafique sus resultados
HAGA ESQUEMA DE TODAS SUS OBSERVACIONES
Medios de cultivo /Pruebas

Enterobacteria Gram
Bioquímicas
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi B

51
Shigella flexneri
E. coli enterohemorragica
Yersinia enterocolítica
14.6 Cuestionario
1. ¿Cómo realiza la identificación definitiva de los enteropatógenos propuestos en la práctica:

2007.
Médica. 3 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 200

52
PRÁCTICA XI
Aislamiento e identificación de Bacilos gram negativos no

fermentadores
15.1 Marco teórico
La identificación de los bacilos gram negativos no fermentadores es en muchos casos complicada,

pero el reconocer ciertas características básicas es de mucha ayuda en el laboratorio de
microbiología.
15.2 Competencias
Conoce las características morfológicas y culturales de las especies que pertenecen Al grupo de
bacilos gram negativos no fermentadores.

Cepas:
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii
Placas de agar Mac Conkey
Tubos con Citrato
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubos con medio O/F con glucosa
Tubos con medio SIM
Tubos con medio diferencial de Sellers
Vaselina líquida estéril
Solución de glucosa al 50% estéril
Papel de filtro
Mondadientes
15.4 Procedimiento
Siembre una placa de agar sangre y otra de Mac Conkey con las cepas proporcionadas.
Incubar a 37°C por 24 horas.
Por cada cepa inocule tubos de TSI, LIA, SIM y 2 tubos de medio O/F con glucosa. El OF debe
inocularse con una aguja de punción que atraviese el medio hasta llegar casi al fondo del tubo y
cubrir uno de los tubos con una capa de 1 mL de vaselina líquida estéril, dejando el otro tubo
expuesto al aire. Incubar a 37°C por 48 horas.
Inocule por cada cepa un tubo de agar Citrato de Simmons.

53
15.5 Resultados
Observe y anote las características de las colonias que desarrollaron tanto en las placas de agar
sangre como en las de agar Mac Conkey.
Sobre una de las colonias que desarrolla en la placa de agar sangre agregue una gota de reactivo
para la prueba de oxidasa. Observe si se produce el cambio de color de la colonia a azul oscuro,
lo que indicaría una prueba positiva.
Observe las reacciones bioquímicas, compare los resultados obtenidos de las bacterias
sembradas.
Observe las reacciones obtenidas en el medio O/F. La aparición de un color amarillo en el
medio indicaría la producción de ácido.
Los microorganismos fermentadores producen un cambio de color en ambos tubos.
Los microorganismos oxidadores solo producen una reacción de acidez en el tubo que esta
expuesto al aire (oxidación) que se nota primero cerca de la superficie del medio y luego se
extiende en todo el tubo.
Los microorganismos no fermentadores (no sacarolíticos) no cambian el color de los tubos.
Anote sus resultados.
15.6 Cuestionario
1. ¿Cuáles son las pruebas preliminares en la identificación de Bacilos gran negativos no

fermentadores?

2007.

54
PRÁCTICA XII
Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus, Aeromonas
16.1 Marco teórico
El género Vibrio comprende varias especies de importancia médica, relacionadas muchas de

ellas con enfermedad gastrointestinal y en particular con enfermedades trasmitidas por
alimentos de origen marino. De todas ellas merece especial atención Vibrio cholerae
responsable del Cólera epidémico, una enfermedad infecciosa con un cuadro clínico
caracterizado por vómitos y diarrea intensa, que puede llevar a la deshidratación grave.
16.2 Competencias
Vibrio.
Cepas:
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
Aeromona caviae
Aeromona hydrophila
Agar sangre con ampicilina

Placas de agar TCBS
Placas de agar SS, XLD, Mac Conkey Sorbitol
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubos con agar Tripticasa de soya en plano inclinado
Tubos con caldo glucosado MR-VP
Tubos con agar citrato de Simons
Tubos con caldo nutritivo con 0%, 1%, 3%,7% y 10% de cloruro de sodio
Reactivo de Kovacs
Desoxicolato de sodio 0,5%
Papel de filtro
Antisueros para Vibrio cholerae
Mondadiente
Lámina portaobjeto

55
16.4 Procedimiento
Haga un extendido del cultivo recibido y colorearlo por el método de Gram. Observe y grafique.
Prepare una suspensión de la bacteria e inocule en los medios de cultivo e incube a 37°C por 24
horas.
Con una aguja de puntura tome una de las colonias e inocule los tubos con medios diferenciales y
la batería de tubos para evaluar el crecimiento en presencia de sal. Coloque una tira de papel de
filtro impregnado en reactivo de Kovacs en la boca del tubo de LIA. Asimismo inocule el tubo de
TSA.
Incube a 37°C por 18 a 24 horas.
16.5 Resultados
Examine las placas de agar TCBS, dibuje el color y tamaño de las colonias, interprete sus
resultados.
Observe las reacciones obtenidas en los medios inoculados, anote e interprete los resultados.
Verifique la producción de indol por el cambio de coloración a rosado del papel impregnado con
el reactivo de Kovacs
Impregne una tira de papel de filtro con reactivo de oxidasa y con ayuda de un mondadientes
tome una porción del desarrollo en TSA y tope con esta el papel impregnado, verifique el cambio
de coloración a azul del papel lo que indica una reacción positiva.
Coloque una gota de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lámina portaobjetos, luego tome
una porción del desarrollo en TSA y haga una emulsión en el desoxicolato, con cuidado levante
suavemente el asa y observe la formación de un filamento que asemeja un collar de perlas.
Cepa Gram Medios de cultivo /Pruebas

Bioquímicas
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
Aeromona caviae
Aeromona hydrophila

56
16.6 Cuestionario
1. ¿Cuáles son las pruebas preliminares en la identificación de V. cholerae?

Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana; 2004.
2007.
PRÁCTICA XIII
Aislamiento e identificación de Campylobacter
17.1 Marco teórico

La Campylobacteriosis es una zoonosis producida por miembros del género Campylobacter y es
una de las principales causas de gastroenteritis en el mundo entero, los principales reservorios:
animales de granja, que se infectan en los primeros años de vida y la mayoría de ellos
permanecen como portadores.
Principales vías de infección: Ingestión de carnes mal cocidas (principalmente aves de corral,
pero también cerdo, ganado bovino, etc.), leche no pasteurizada, agua u otros alimentos
contaminados con excretas de animales infectados contacto con mascotas
17.2 Competencias
Campylobacter

Muestras de heces de pollo (tomadas por los alumnos)
Medio de transporte de Cary Blair
Placas de agar sangre con antibióticos (BUTZLER)
Reactivo de oxidasa
Reactivo de catalasa: Peróxido de hidrógeno al 3%
Mercurio cromo
Batería para Coloración de Gram

57
Campana de vidrio para microaerofilia
Sobre de microaerofília
Mondadientes
17.4 Procedimiento
Los alumnos obtendrán muestras de heces de pollo, con un hisopo estéril, el cual colocaran en el
medio de transporte de Cary y Blair. A la vez realizarán dos extendidos de la muestra en láminas
portaobjetos para luego colorearlo por el método de Gram y el de Vago. El medio de transporte
se debe conservar a temperatura de refrigeración (2-8°C).
En el laboratorio sembrar las muestras en una placa de agar sangre con suplemento antibiótico
de Butzler según las indicaciones del profesor y colocar en una campana con atmósfera de
microaerofília incubando a 42°C por 48 horas.
17.5 Resultados
Las placas son examinadas a las 48 horas para observar las colonias características que son
planas, no hemolíticas, grises y que pueden seguir la línea de siembra.
Realizar un extendido de una de las colonias y colorearlo por el método de Gram. Observe la
morfología de Campylobacter que puede ser en forma de S o curvados (ala de gaviota). Grafique
los resultados.
Tome una porción de una colonia con un mondadientes y colóquelo sobre una tira de papel de
filtro impregnado con reactivo de oxidasa, observe si se produce el cambio de coloración a azul
lo que indicaría una prueba positiva.
Tome asi mismo una porción de la misma colonia y realice la prueba de la catalasa colocándola
sobre una lámina portaobjetos y agregando peróxido de hidrógeno al 3%, verifique si se produce
el burbujeo.
Registre sus resultados.
GRAM AGAR SANGRE
17.6 Cuestionario
1.¿Qué cuidados se debe tener para su aislamiento?
2. ¿Qué otro método se puede usar para aislar Campylobacter?

58

2007.
Aislamiento e identificación de Haemophilus influenzae

18.1 Marco teórico
El Haemophilus influenzae (Hi) es un cocobacilo Gram negativo, habitualmente aerobio, pero
puede ser un anaerobio facultativo.
Es un huésped habitual del árbol respiratorio del ser humano únicamente. Hay varios tipos,
definidos por el tipo capsular (a, b, c d, e y f) y cepas no tipificables ni encapsuladas (estas
últimas pueden ser las causantes de la septicemia neonatal).
El tipo "b" es el más virulento y responsable de las enfermedades invasivas: cuando la

cantidad de gérmenes que circulan en sangre alcanza altísimos niveles, es capaz de penetrar
en las meninges, articulaciones, pleura, pulmón y pericardio.
18.2 Competencias
Conoce los métodos de aislamiento e identificación de Haemophilus influenzae

Cepas de Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus
Discos con factores X y V
Placas de agar tripticasa soya
Hisopos con punta de algodón
Placas de agar sangre de carnero
Placas con agar chocolate
Tubos con Caldo tripticasa soya x 2 mL
18.4 Procedimiento

59
Una vez recibida las muestras siembre la cepa de Haemophilus en agar chocolate y agar
sangre, siembre en forma perpendicular la cepa de S. aureus en la placa de agar sangre.
Incube a 37°C por 24 horas.
Requerimiento de factor V y X: prepare una suspensión en caldo tripticasa soya. Teniendo
cuidado de no transferir medio al caldo. Remoje un hisopo de algodón estéril en la suspensión
y siembre por diseminación en una placa de agar tripticasa soya, y colocar discos conteniendo
factores V y X a una distancia de 2 cm. Incube a 37°C por 24 horas
18.5 Resultados
Revise las placas y observe las colonias en agar sangre (fenómeno de satelitismo). En agar
chocolate, H. influenzae aparece como colonias opacas grandes, planas, de incoloras a grises.
No hay hemólisis o decoloración aparente del medio. Las cepas encapsuladas son más
mucoides (acuosas) que las no encapsuladas, que aparecen como colonias compactas
grisáceas.
Revise la placa con los discos de papel conteniendo factores X y V; H. influenzae crecerá
entre los dos discos.
Tome una porción de las colonias y realice un extendido en láminas portaobjetos; coloree
por el método de Gram. Observe la presencia de cocobacilos Gram negativos.
Haga esquemas y dibujos de sus observaciones.
AGAR SANGRE AGAR CHOCOLATE
18.6 Cuestionario
1. Describa el fenómeno de satelitismo

2007.

60
PRÁCTICA XIV
Aislamiento e identificación de Clostridium
19.1 Marco teórico
Se puede definir a las bacterias anaerobias como aquellas que para crecer en la superficie de
un medio de cultivo necesitan una atmósfera sin oxígeno, ya que este elemento es tóxico para
ellas. Con estos dos conceptos se puede inferir que existe un amplio abanico de
microorganismos, desde los muy tolerantes y resistentes hasta los extremadamente lábiles a
este gas.
El género Clostridium pueden encontrarse algunas especies en el suelo, agua, vegetales y
animales en descomposición, juegan un importante rol en los procesos de putrefacción.
Algunas especies son patógenos oportunistas y pueden producir enfermedad en el hombre
entre ellos está: C. perfringens (gangrena gaseosa), C. tetani, (tétano), C. botulinum,
(botulismo) y C. difficile, (colitis pseudomembranosa). En su forma activa segregan una
exotoxina poderosa responsable de las enfermedades que produce.
- Clostridium botulinum
Es móvil, con espora no terminal relativamente resistente al calor; produce una de las
más potentes toxinas y causa envenenamiento alimentario mortal. Debido a que las
esporas pueden transportarse vía aérea, pueden contaminar alimentos cárnicos,
vegetales y frutas antes de ser enlatados en condiciones anaeróbicas. Luego del sellado
de las latas, las esporas germinan y la bacteria libera su potente toxina. Las personas
afectadas experimentarán parálisis muscular y visión borrosa.
- Clostridium perfringens
No es móvil, puede infectar al hombre por traumatismo o cortes con material

contaminado con las esporas. La toxina causa necrosis del tejido circundante. La bacteria
produce gas que conduce a la deformación globosa del tejido infectado. Es capaz de
necrozar tejido intestinal liberar una enterotoxina y producir una diarrea severa.
- Clostridium tetani
Son móviles, con espora terminal. Las esporas pueden adquirirse por trauma en piel y si
existen condiciones anaeróbicas las células germinarán a su forma activa. En tejido
liberan una exotoxina, la tetanoespasmina que causa irregularidades en el sistema
nervioso, y contracción del músculo esquelético. La infección prolongada conduce a falla
respiratoria y finalmente la muerte. La inmunización es la mejor forma de prevenir la
infección a C. tetani en niños y adultos.
19.2 Competencias

61
Conoce el mecanismo de aislamiento e identificación de especies de Clostridium.
CEPAS
Clostridium sp.
Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae
Placa de agar Mac Conkey
Placas de agar Brucella con sangre,vitamina K y hemina
Placa de Agar Brucella con sangre, Vitamina K, Hemina, vancomicina y kanamicina
Tubos con Caldo tioglicolato con indicador
Jarra de anerobiosis
Indicador de anaerobiosis
Catalizador de paladio
Sobre de anaerobiosis Gas Pak
Sobre de anaerobiosis Anaerocult P
Agua destilada
Alcohol al 50%
Muestra de heces
Tubos 16 x 100 estériles
Pipeta de 10 Ml
Set de Coloración Gram
Tripode
Beacker
Tubo de ensayo estéril
Suero fisiológico
Baño María
Agua destilada
Pipeta estéril 5 mL
Láminas portaobjeto
Coloración de Wirtz Conklin
Mechero de alcohol
Aceite de inmersión
19.4 Procedimiento
Día 1
Haga una suspensión de heces en alcohol al 50% y déjelo una hora a temperatura ambiente o
realice la suspensión en suero fisiológico y pongalo en baño maría durante 10 minutos.
Siembre dos placas de agar sangre anaerobio, una de las placas colóquela en la incubadora
en atmósfera normal.
La otra placa colóquela en la jarra de anaerobiosis, ponga el indicador, el catalizador y el
sobre de anaerobiosis; añadir el agua destilada al sobre y cerrar la jarra. Observar la
presencia de vapor de agua y el cambio del indicador de anaerobiosis. Incube a 37°C por 48
horas.
Día 2
Revise las placas y observe las colonias. Descríbalas

62
Tome una porción de las colonias y realice un extendido en láminas portaobjetos; coloree por
el método de Gram.
Realice una coloración para ver la presencia de esporas.
19.5 Resultados
a) Se observan bacilos Gram positivos formadores de esporas, típicamente largos, rectos o
ligeramente curvos con extremos ligeramente redondeados. Las esporas pueden ser
terminales o subterminales y deforman el soma bacteriano.
b)Se observan esporas de color verdes, terminales o subterminales que deforman el soma
bacteriano, el bacilo se observa de color rosado.
c) Se observa en el Caldo tioglicolato de sodio el desarrollo anaeróbico muy por debajo de la

superficie.
Grafique sus resultados

IDENTIFICACIÓN RESULTADOS
COLORACIÓN GRAM
COLORACIÓN WIRTZ CONKLIN
AGAR SANGRE
CALDO TIOGLICOLATO DE
SODIO

63
19.6 Cuestionario
1.¿Cómo funciona la jarra de anaerobiosis?
2. ¿Cómo se prepara un indicador de anaerobiosis?
3.¿Cómo desarrolla Clostridium en un medio líquido?

2007.
Fuentes De Información Complementaria
1. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. BAILEY SCOTT. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO.
12 Ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2009.
2. Guillén A., Arrelucé M., Sánchez L, Llamoga A. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO Y SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS. Lima,
Instituto Nacional de Salud, 2 Ed. 1995.
3. Guillen A., Guerrero C, Benites C. MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA. FTM UNFV,
2010.
4. Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JY, Williams ST. Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology. 9 ed. Baltimore: Library of Congress Cataloging.in Publication Data; 1994.
Normas de bioseguridad. Serie de Normas Técnicas N° 18. Lima. 1997.
Procedimientos Laboratorios para la obtención y envío de muestra (I). Serie de Normas
Técnicas N° 15. Lima. 1997.
7. Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos de laboratorio para el diagnóstico
de infecciones respiratorias agudas. Curso Teórico Práctico. En: Diagnóstico de laboratorio de
infecciones respiratorias aguas y enterovirus. Lima 1999.
8. Isenberg HD. Vol 2: Clinical Microbiology Procedures handbook Washington DC: American
Society for Microbiology; 1999.
9. Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnóstico microbiológico. 6 ed. Buenos aires:
Editorial Médica Panamericana; 2009.
10. Mc Faddin J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3 ed. México DF: Editorial Médica Panamericana; 2007.
11. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H. (Ed.) MANUAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY. 9 ed. Washington D.C: ASM Press; 2007

64
12. Ministerio de salud. Protocolo: Estudio de prevalencia de infecciones intrahospitalarias.
Documento técnico (OGE – RENACE / VIG. HOSP. DT 001-99V.1) 1999/ Lima Perú.
13. Ministerio de Saúde. Vigilancia Epidemiológica por componentes NNIS. Título original:
National Nosocomial Infection Surveillace System (NNIS) Information packet. 1994. Brazil.
14. NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk Susceptibility Test: Approved
Standard. 10 ed M2-A8.17(1) 2009.
15. Miller J.M. A guide for specimen management in clinical microbiology. American Society
for Microbiology: USA 1999.
16. Tenover F, Mc Gowan J. Antibacterial resistance. Inf Dis Clin N Am. 2006, Vol 119 (4): S3 –
S10.

65

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3B-2

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MÉDICA

F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

En el laboratorio de Microbiología el diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en la

Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar,

REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS

Las medidas de bioseguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

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1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales

2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.

3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en los refrigeradores.

4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello

5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de

6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de

F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

8. No se permitirá pipetear con la boca.

11. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de

12. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender fuego. No se

1.1 Marco Teórico

F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

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Partes de un microscopio óptico

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

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F-CV3-3B-2 Rev. Marzo 2013

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Comprobar También Que El Objetivo 40x Está Perfectamente Limpio.

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La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando

Existen distintos tipos de tinción:

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La TINCION DE GRAM es uno de los procedimientos de tinción más útiles en la identificación

En esta técnica es necesario utilizar varias soluciones:

3.- Un agente decolorante, como la mezcla alcohol-acetona (1:1), que es un disolvente

Los organismos que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo

Tinción ácido-alcohol-resistente (Ziehl-Neelsen)

Estas bacterias pertenecen a los géneros Mycobacterium y Nocardia y se caracterizan porque

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3.-Tinción estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que

Tinción de esporas (endosporas)

Tinción de corpúsculos metacromáticos

Tinción de cápsulas TINCIÓN NEGATIVA

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6- Examinar la preparación al microscopio, con el objetivo de inmersión (100x), colocando,