DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE LA BQ1L0

Código:
01
ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA ACIDA DE Vigencia: 2/2019
GERMEN DE TRIGO Rev.: 03
Bioquímica de los Alimentos I Facultad Tecnológica
Depto. de Ciencias y Tecnología de los Alimentos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Elaborado por: Bq. Myriam Pizarro, Dr. (c) Waldo Díaz

Laboratorio N°3

DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA ACIDA

DE GERMEN DE TRIGO

1. INTRODUCCIÓN

Funciones de las proteínas

Las proteínas pueden desempeñar distintas funciones, desde formar parte de

una estructura como la actina, funcionar como una canal selectiva de iones y también
funcionar como una molécula catalizadora.
En este sentido, las enzimas son proteínas capaces de catalizar una reacción
química, disminuyendo la energía de activación necesaria para que esta reacción
se lleve a cabo, esta reacción es específica y posee una velocidad determinada.
(Fig 1).

A B

Fig 1. Cinética de reacción enzimática, A, la curva indica la comparación entre la energía de activación de la reacción
no catalizada, y catalizada por una enzima, B, muestra el comportamiento de una cinética enzimática en el tiempo.
La pendiente de la curva corresponde a la velocidad de la reacción, se puede observar que durante cierto tiempo
(inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva es una recta) ya que posteriormente cae.

La reacción enzimática se lleva a cabo en el sitio activo de la enzima, que es

el lugar donde se une el(los) sustrato(s) para formar el(los) producto(s). Estas
reacciones enzimáticas pueden ser ayudadas por cofactores (moléculas
inorgánicas) o coenzimas (moléculas orgánicas). Algunas enzimas como la
hemoglobina poseen un grupo hemo que además contiene un átomo de Hierro
(grupo prostético) que se refiere a un cofactor unido covalentemente a la enzima.
Se dice que una enzima se comporta como apoenzima cuando carece de algún
cofactor/coenzima necesario para su funcionamiento y se denomina holoenzima al
complejo enzima-cofactor/coenzima necesario para llevar a cabo la catálisis.
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Tabla 1: Cofactores y coenzimas

La especificidad de la interacción enzima sustrato ha sido explicada por 2

modelos fundamentales:

Modelo de la "llave-cerradura"

Las enzimas son muy específicas, como sugirió Emil Fisher en 1894. Con
base a sus resultados dedujo que ambas moléculas, enzima y sustrato, poseen
complementariedad geométrica, es decir, sus estructuras encajan exactamente una
en la otra, por lo que ha sido denominado como modelo de la "llave-cerradura",
refiriéndose a la enzima como a una especie de cerradura y al sustrato como a una
llave que encaja de forma perfecta en dicha cerradura. Sin embargo, si bien este
modelo explica la especificidad de las enzimas, falla al intentar explicar la
estabilización del estado de transición que logran adquirir las enzimas. (Fig 2).

Fig 2. A, Modelo llave cerradura, B, Modelo de encaje inducido.

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Modelo del encaje inducido

En 1958 Daniel Koshland sugiere una modificación al modelo de la llave-

cerradura: las enzimas son estructuras bastante flexibles y así el sitio activo podría
cambiar su conformación estructural por la interacción con el sustrato.[28] Como
resultado de ello, la cadena aminoacídica que compone el sitio activo es moldeada
en posiciones precisas, lo que permite a la enzima llevar a cabo su función catalítica.
En algunos casos, como en las glicosidasas, el sustrato cambia ligeramente de forma
para entrar en el sitio activo. El sitio activo continua dicho cambio hasta que el
sustrato está completamente unido, momento en el cual queda determinada la forma
y la carga final.

Modulación alostérica

Los sitios alostéricos son zonas de la enzima con capacidad de reconocer y

unir determinadas moléculas en la célula. Las uniones a las que dan lugar son
débiles y no covalentes, y generan un cambio en la conformación estructural de la
enzima que repercute en el sitio activo, afectando así a la velocidad de reacción de la
enzima. Las interacciones alostéricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y
son una forma muy común de controlar las enzimas en las célula.

Fig 3. Regulación alostérica de algunas enzimas, puede ser modificada por la presencia de inhibidores (I) o por
presencia de sustrato/producto.

¿Cómo funciona una enzima?

El funcionamiento general de las enzimas responde a la siguiente ecuación:

E: Enzima
S: Sustrato
ES: Complejo
enzima/sustrato
P: Producto

Fig 4. Ecuación que define el comportamiento de la enzima, el estado de transición corresponde a la transformación
del complejo ES en EP.
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Si se analiza un diagrama de Hill de energía de activación se observa que una

reacción catalizada posee un estado de transición, que corresponde al momento en
donde el complejo enzima sustrato (ES) se transforma en el complejo (EP)

Cinética enzimática

La cinetica de reacción esta determinada por la velocidad, la concentración de

sustrato y una k constante que corresponde a una cinética de primer orden.

Para el estudio de las reacciones enzimáticas siempre se determinan velocidades

iniciales (Vo), se utilizan únicamente el intervalo de tiempo en el cual se mantiene la
velocidad constante (línea recta en la curva de la figura 1) utilizando
concentraciones saturantes de sustrato en relación a la cantidad enzima. La
velocidad inicial se define como:

Vo = Cantidad de sustrato consumido / tiempo (μmoles/min)

Si se mantiene la concentración de enzima constante se puede realizar una

determinación de la velocidad a distintas concentraciones de sustrajo Vo v/s S (Fig 4)

Fig 4. A, Gráfica de cinética enzimática a distintas concentraciones de sustrato, B, ecuación de Michaelis-Menten

En la figura 4 se muestra que a concentraciones bajas de sustrato, la velocidad de la

reacción es lineal, y a concentraciones mayores de sustrato la velocidad llega a un
“Plateau”, en donde la enzima ya no puede aumentar más su velocidad de reacción
(Vmax).

Los pasos se pueden explicar en dos pasos:

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Paso 1:

k1, corresponde a la constante de la formación del ES, k-1, corresponde a la

disociación del complejo ES, sin formación de productos.

Paso 2:

k2, corresponde a la disociación de ES para formar productos, y k-2, corresponde a

la formación de ES a partir de enzima y productos.

Ecuación de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk

Si k2 determina la velocidad de la reacción entonces:

[enzima libre (El)] = [enzima total (Et)] – [enzima sustrato (ES)]

Entonces la formación de [ES] = k1([Et] - [ES])[S]

La ruptura de [ES] = k-1[ES] + k2[ES]

Si estas dos velocidades son muy similares, se considera un estado estacionario

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Donde (k2 + k-1)/k1 se denomina constante de Michaelis Menten, representada por

Km, y explica la afinidad de la enzima por su sustrato. Un valor de Km elevado
indica baja afinidad de la enzima por su sustrato, una Km baja indica una alta
afinidad de la enzima por su sustrato.

Si, k2 << k-1, la Km corresponde a una constante de disociación del complejo ES,
por otro lado si k2 >> que k-1, la función es más compleja

y,

En condiciones de saturación ES = Et, por lo tanto se puede rearreglar:

Se puede obtener el Valor de Km, si conocemos 1/2 de la velocidad máxima

La constante catalítica (kcat), o tasa de recambio de la enzima, corresponde a k2,

cuando la enzima se encuentra en Vmax en concentraciones saturante de sustrato.

La eficiencia catalítica corresponde a la comparación de la relación Kcat/Km para

una enzima en particular.

La ecuación del doble recíproco:

Para realizar cálculos más precisos se utiliza la ecuación del doble recíproco que
transforma la ecuación de Michaelis-menten en una ecuación lineal que permite
calcular Km cuando el eje Y = 0 y Vmax cuando el eje X = 0, (Fig 5).
A B
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Fig 5. A, velocidad inicial y velocidad máxima, B, ecuación doble reciproca de Lineweaver- Burk
Para determinar este parámetro es necesario realizar ensayos enzimáticos, para lo
cual se realiza:

a) Ensayo a tiempo fijo: se detiene después de un tiempo determinado y se mide la

concentración del producto formado o sustrato consumido.

b) Ensayo cinético: se determina la concentración de sustrato o producto en forma

continua o en una serie de tiempos muy próximos entre sí.

En este trabajo de laboratorio se determinará la actividad enzimática de una

fosfatasa. En general, la fosfatasa son enzimas que catalizan la reacción de hidrólisis
de fosfatos monoesteres con la consecuente liberación de fosfato inorgánico (Figura
2)
2-
  O PO O H
3
Fosfatasa alcalina
3-
+ PO
HO 4
2

NO NO
2 2

Fig 6. Reacción de fosfatasa alcalina

Las fosfatasas en general presentan un amplio rango de especificidad de sustrato y

se clasifican como ácidas o alcalinas, basándose en su pH óptimo de reacción. La
fosfatasa alcalina está presente en el suero, y las hojas de las plantas son
particularmente ricas en fosfatasa ácidas y su actividad aumenta con la germinación.

La fosfatasa alcalina es una fosfomonoesterasa que cataliza la hidrólisis de

monoesteres orgánico de fosfatos, el pH óptimo de actividad alrededor de 9-10

En esta práctica de laboratorio se determinará la actividad enzimática de la fosfatasa

ácida, así como sus parámetros cinéticos (Vo, Vmax, Km).

Para ello, se usará un sustrato artificial como es el p-nitrofenil fosfato (NPP). El grado de
hidrólisis de éste se determinará fotometricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado.
En solución acida el ión p-nitrofenol absorbe la luz fuertemente en la región de 410 nm.
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2. OBJETIVOS

- Determinar la actividad de la Fosfatasa ácida

- Calcular parámetros cinéticos de la Fosfatasa ácida
- Reconocer factores que influyen en la actividad enzimática de la Fosfatasa ácida

3. MATERIALES, REACTIVOS, SOLUCIONES Y EQUIPOS

Baño termorregulador a 37 ºC y balsa para tubos de 1,5 ml de goma eva o plumavit

Espectrofotómetro (medir a 410 nm)
Micropipetas de 1000 μL, 200 ul y 20 ul
Puntas para micropipetas
Gradillas para tubos de 1,5 ml
Cronometro
Cubetas plásticas
Solución de sustrato de p-nitrofenil fosfato 15,2 mM (Preparar 40 ml por sección)
Tampón Citrato/Citrato de sodio 100 mM pH 5 (50 ml por sección)
Fosfatasa acida de germen de trigo 0,375 mg/ml (ε = 18,2 mM) (6 ml por sección)
Solución de detención de la reacción: Fosfato de potasio (KPi) 1 M (10 ml por
sección)
 
4. PROCEDIMIENTO

1. Efecto del tiempo en la aparición del producto

A 5 tubos de 1,5 ml se añaden los reactivos según la siguiente tabla

Tubo 1 2 3 4 5
Tampón (µl) 500 500 500 500 500
Sustrato (µl) 500 500 500 500 500
Enzima (µl) 100 100 100 100 100
KPi (µl) T=0 s 100 0 0 0 0

Al tubo blanco agregar 100 µl de KPi a tiempo 0 seg

Tapar el tubo mezclar por inversión e incubar a 37ºC utilizando un baño

termoregulado y flotadores.

Comience a retirar los tubos en el siguiente orden

Tubo 1 2 3 4 5
Tiempo (min) 5 5 10 20 30
KPi (µl) 0 100 100 100 100
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Una vez que se cumplen los tiempos retirar los tubos correspondientes del baño a
37° C y añadir 100 µL de KPi para detener la reacción e incubar en baño de agua fría

Medir la absorbancia a los distintos tubos a 410 nm use el tubo 1 como blanco

2. Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción

A una serie de 5 tubos añadir reactivos según el siguiente esquema

Tubo 1 2 3 4 5
Tampón (uL) 600 580 560 520 500

Sustrato (µl) 500 500 500 500 500

Enzima (µl) -- 20 40 80 100

KPi (µl)T=0 min 100 0 0 0 0
KPi (µl) T=10 min 0 100 100 100 100

Agregar 100 µl de solución de KPi al blanco

Agitar e incubar a 37ºC por 10 minutos

Pasado este tiempo retirar los tubos del baño y añadir 100 µl de solución de
detención de la reacción a cada tubo

Medir absorbancia a 410 nm. (Usar tubo 1 como blanco)

3. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción

A una serie de tubos añadir las cantidades de tampón sustrato y enzima de acuerdo
al siguiente esquema:

Tubo 1 2 3 4 5 6
Tampón (µl) 1000 900 750 500 250 --
Sustrato (µl) --- 100 250 500 750 1000
Enzima (µl) 100 100 100 100 100 100
KPi (ul)T=0 min 100 0 0 0 0 0
KPi (ul) T=10 min 0 100 100 100 100 100

Agregar 100 µl de solución de KPi al blanco

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Agitar e incubar a 37ºC por 10 min,

Retirar los tubos del baño y añadir 100 µl de solución de detención de la reacción.

Medir la absorbancia a los distintos tubos a 410 nm, use el tubo 1 como blanco.

Determine e informe la actividad enzimatica U/L de la fosfatas alcalina. Recuerde que

1 U/L de actividad enzimatica es la cantidad de enzima que cataliza la aparición de 1
μmol de producto por min.

Recuerde el cálculo de la concentración de producto se basa en la ley de Lambert-

Beer. El coeficiente de extinción milimolar es 18.5 mM-1cm-1.

Complete la tabla de progreso de la reacción. (tubo-tiempo-absorbancia-producto).

Calcule la velocidad inicial (Vo)

Complete una tabla de resultados velocidad de reacción frente a la concentración de

enzima (tubo- enzima-absorbancia-producto –velocidad).

Grafique velocidad de reacción y mL de enzima usados.

Analice el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción.

Complete la tabla de velocidad de reacción frente al V/S (tubo- sustrato mL –

concentración de sustrato-concentración de sustrato- absorbancia –producto –
velocidad- 1/Velocidad)

Grafique según la ecuación de Lineweaver-Burk y determine los valores de Km y

Vmáx.

Cuestionario

1.- Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y

presencia de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dad en función de la
concentración de sustrato en la siguiente tabla:
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a) ¿Qué tipo de inhibición (competitiva o no competitiva) se produce?

b) Determine Vmax y KM en ausencia y en presencia del inhibidor.

2.- El cianuro de potasio (KCN) es un inhibidor de la cadena transportadora de

electrones. ¿Cómo podría afectar este compuesto al ciclo de Krebs?. Haga una
descripción detallada.

5. BIBLIOGRAFÍA

Switzer R., Garrity L.1999. Theory and exercises in fundamental methods. 3th edition,
N.Y.WH Freemand and Co.

Bárcena J., García C., Padilla., Martínez E. Díez J. Caracterización cinética de la

fosfatas a alcalina. Dpto. de Bioquímica y Molecular. Campus Universitario de
Rabales, Córdova. Argentina. (www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol consultada el 01-06-08).