Tema 1 y 2
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Actualmente la exploración clínica proporciona datos que son completados o confirmados por
el laboratorio. Por ejemplo: un paciente que presente síntomas como fatiga, palidez, etc. se
puede pensar que padece un proceso anémico, lo cual será confirmado o no mediante un
análisis de sangre.
Por tanto, para sacar una conclusión adecuada debe existir una relación entre los datos
obtenidos en clínica y los obtenidos en el laboratorio. Las técnicas analíticas cumplen
básicamente 3 objetivos:
1º·- Aportan información, para que un médico diagnostique adecuadamente
2º·- Pueden ser utilizadas como medidas preventivas para conocer el estado de salud de un
individuo y detectar precozmente alguna alteración.
3º·- Permiten seguir la evolución de una enfermedad durante el tratamiento.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Par el buen funcionamiento de un laboratorio es necesario seguir unas normas; esto es
doblemente importante si se tiene en cuenta que en él hay varias personas trabajando.
1º·- Es necesario antes de empezar cualquier prueba saber qué es lo que vamos a hacer para
tener preparado el material y reactivos que se necesitan.
2º·- Es esencial la limpieza tanto durante el trabajo como al finalizarlo.
3º·- En el laboratorio existen riesgos potenciales, como, por ejemplo: quemaduras por calor o
agentes químicos, cortes, pinchazos, que requieren una atención especial.
Es importante evitar los accidentes que en gran manera se deben al descuido y excesiva
rapidez en el trabajo, más que a la ignorancia. Las causas más frecuentes de accidentes son:
1º·- Las prisas por llevar a término el trabajo.
2º·- La falta de cuidado y la fatiga.
3º·- La falta de concentración en el trabajo.
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8º No pipetear por boca líquidos cáusticos o tóxicos o líquidos potencialmente contaminantes,
sino utilizar peras de goma.
9º El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes.
NOTA: En el caso de quemaduras producidas generalmente por calor se pondrá sobre la zona
una gasa empapada en alcohol. En las quemaduras abiertas se aplicará una pomada atingente
y se le pondrá una gasa estéril.
Este equipamiento varía según sus características, necesidades, etc., pero en general se
disponen de unas mesas en las que se desarrolla en trabajo y sobre las que están colocados los
aparatos. En ellas hay conexiones para: gas, luz, etc. Las mesas serán cómodas y de material
impermeable y fácilmente lavable.
Además, habrá taburetes, para evitar la fatiga en unos casos y siendo necesario en otros, como
en el caso de las observaciones al microscopio. También habrá armarios en los que se
guardarán reactivos y materiales. No se puede dar una norma general en cuanto al material
que se va a encontrar en el laboratorio, ya que esto depende de sus necesidades así como de
las posibilidades económicas. De forma general el material no instrumenta se puede clasificar
en material de vidrio, de plástico, de porcelana, etc.
Material de vidrio: el vidrio se caracteriza por una gran resistencia química frente al agua,
ácidos, bases, etc. mayor a la de la mayoría de los plásticos, así como por su gran estabilidad
resistencia al calor y transparencia.
Sin embargo no todo tipo de vidrio es adecuado para su uso en el laboratorio, por el contrario
es necesario emplear vidrios que se caracterizan por su resistencia química, mecánica y
térmica.
Actualmente existen diferentes tipos de vidrios para laboratorios; la mayoría están fabricados
en vidrio de boro silicato que se caracteriza por su gran resistencia al calor; por ejemplo: el
vidrio pirex... Al trabajar con el vidrio son necesarias unas precauciones como:
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Probetas: son vasos altos graduados de diferentes tamaños. Todos ellos llevan la
correspondiente división fraccionada de su capacidad total. Sirven para medir volúmenes sin
demasiada precisión. Los volúmenes más usados son: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 y
5000 ml
Buretas: son tubos cilíndricos estrechos con la parte inferior acabada en punta y la
superior como un embudo (exagerado. Son precisos. En la parte inferior tiene una llave de
paso. Están graduadas y permiten medir volúmenes pequeños. El cero de la escala se
encuentra en la parte superior. Las buretas se mantienen en posición vertical, mediante un
soporte. Su tamaño es variable en 50 a 100 cm3. Antes de utilizarlas se deben purgar y para
ello se llena con un poco más de líquido de lo que está medido y se deja caer hasta enrasar
en cero, así se elimina el aire. Para manejarla se sujeta la bureta con la mano izquierda y se
abre o cierra la llave con el pulgar o índice. El líquido caerá sobre un Erlenmeyer que se
sujeta con la derecha.
Pipetas: son tubos cilíndricos estrechos cuya parte inferior acaba en punta, también
sirven par medir volúmenes con precisiones generalmente volúmenes pequeños (inferiores a
20ml) Son tubos estrechos de poco diámetro abiertos a ambos lados, terminando en punta el
inferior, la salida del líquido se regula con el dedo índice que tapa el orificio de la parte
superior. Existen 2 tipos de pipetas las graduadas que miden fracciones de líquidos y las
aforadas que miden un volumen fijo de líquido y también las hay de doble.
Embudos: se utilizan para realizar operaciones de filtro con ayuda de un papel de fil
Tubos de ensayo: son tubos cilíndricos de aproximadamente 2 cm3 de diámetro y con
fondo cónico. Sus aplicaciones son múltiples. Por ejemplo: se utilizan para realizar pruebas
bioquímicas cualitativas.
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Tubos de centrífuga: son tubos cilíndricos en los que se colocan el material que va a ser
centrifugado; pueden acabar en forma cónica o cilíndrica y pueden estar graduados o sin
graduar.
Cubreobjetos: es una fina lámina de vidrio con los que se cubren las muestras a examinar a
microscopio.
Otros: varillas de vidrio, vidrio de reloj, embudos de decantación, kitasato, placas de
petri (son recipientes usados para el cultivo de microorganismos).
Normalmente el material de vidrio se limpia con agua y jabón con el uso de escobillas
adecuadas. En ocasiones pueden quedar restos siendo entonces necesario un lavado en mayor
profundidad mediante la mezcla crómica formada por dicromático potásico 60 gr, agua
(primero el agua siempre) 200ml y ácido sulfúrico, suficiente para 1 litro. Con esto se deja unos
días u horas. Una vez limpio se debe aclarar varias veces con agua del grifo acabando con un
último enjuague con agua destilada.
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Las pipetas se cargan apretando el émbolo hasta la posición intermedia y soltándola para
llenar la punta y se descargan una vez en la posición normal apretando el émbolo hasta el
fondo.
Dispensadores: son sistemas que proporcionan repetidamente un volumen seleccionado. Se
utilizan normalmente para la adición de reactivos a lotes de muestras reaccionantes.
Hay una amplia gama de dispensadores con varios volúmenes de utilización.
Cubetas: son recipientes usados como contenedores de muestras generalmente en disolución
en las técnicas de espectrometrías. Deben ser transparentes para la longitud de onda en la que
se realiza la determinación. Las más usadas son de forma prismática y son de cuarzo o sílice
fundido para el ultravioleta y visible; y de cloruro sódico (NaCl) o de fluoruro cálcico (F2Ca)
para el infrarrojo.
Otros materiales
Estufas: es una caja rectangular provista de una serie de calor regulado por un mando
situado en el exterior. Se utiliza a diario en el laboratorio de microbiología para incubar
cultivos de gérmenes.
Mechero: el más utilizado es de tipo Bunsen que consta de un pie sobre el que descansa un
tubo por donde sale el gas. En la parte inferior llevan un orificio para la entrada de aire. Sirve
para calentar reactivos, flamear asas de siembra,...
Gradillas: son soportes para tubos de ensayo, probetas,...
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TEMA II: EL MICROSCOPIO
La palabra microscopio deriva de 2 vocablos griegos ‘micros’ pequeño y ‘Scopein’ ver. En
términos generales un microscopio es todo instrumento que permite amplificar la imagen de
un objeto o de un ser pequeño. El estudio de los microorganismos, células sanguíneas, cristales
en un sedimento orinario,... precisan de instrumentos que amplíen el tamaño de los
microorganismos, hasta hacerlos visibles.
Según el principio que se funda cada microscopio para ampliar las imágenes se pueden
clasificar en 2 tipos: microscopio de luz u ópticos y electrónicos.
Entre los primeros se distinguen varios tipos pero todos tienen en común que utilizan lentes
ópticas. Tipos: microscopio de campo claro, oscuro, de fluorescencia y de cambio de fase. Los
segundos no incluyen lentes ópticas si no que para ampliar las imágenes utilizan un haz de
electrones. Podemos hacer otra clasificación:
Microscopio simple: son aquellos que utilizan una sola lente (lupas)
Microscopio compuesto: son aquellos que están formados por 2 sistemas de lentes una
situada cerca del ojo (ocular) y otra cercana al objeto (objetivo).
Sin embargo por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto,
este no se ve con claridad. Este límite se debe a que se supera la capacidad máxima de
deformación del cristalino. Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de
aumentar el ángulo visual se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad.
El AUMENTO HABITUAL de la lupa oscila entre 4 y 60 aumentos (la relación existente entre el
tamaño del objeto percibido a simple vista y el apreciado).
Por el microscopio, es decir, es el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por
encima de su valor real. En el microscopio compuesto el aumento se calcula multiplicando el
aumento individual del objetivo o del ocular. Se reseña por un número seguido del signo por
(x). Existen muchos modelos de lupas pero se utilizan normalmente para la disección de
animales y observación de colonias.
En este momento nuestros ojos tienen un máximo de agudeza visual sobre el objetivo. El límite
ó poder de resolución se puede definir también como la distancia mínima entre 2 puntos que
pueden distinguirse entre el microscopio.
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Si queremos que la resolución de un microscopio sea alta el límite o poder de resolución
deberá ser lo más pequeño posible. El límite de resolución se calcula mediante la siguiente
ecuación:
AN = apertura numérica
IR = índice de refracción del medio que hay entre la muestra y la lente
D = límite de resolución
= longitud de onda de la luz.
PARTE MECÁNICA: dentro de ella tenemos un sistema de soporte y uno de ajuste Sistema de
soporte: consta de:
Pie: sirve como base al microscopio y tiene el suficiente peso como para sostener el aparato.
Antiguamente tenía forma de herradura y ahora rectangular.
Brazo: une el pie con el tubo en caso de transporte se debe coger al microscopio por esa pieza.
Tubo: es la parte del microscopio que sujeta el objetivo y los oculares; manteniéndolos en la
distancia correcta de trabajo.
Platina: es una placa horizontal que sostiene las preparaciones para realizar la observación. El
porta debe quedar sobre la perforación que hay en el centro de la platina que deja pasar la luz
que viene del condensador. Hay una pinza que sujeta el porta.
Sistema de ajuste: Manilla de ajuste de los oculares.
Tornillo: que permite al aflojarlo girar la pieza del tubo donde están los oculares y observar
fácilmente la preparación desde otra posición.
Tornillos reguladores de la platina: sirve para desplazar el porta a lo largo y ancho de la
platina. Su movimiento queda reajustado en dos escalas móviles lo que permite establecer la
posición exacta de cualquier punto de la preparación.
1º·- Se observa el valor más bajo de la escala en mm; está más cercano al 0 que la escala en dm
(34)
2º·- Observar el valor de la escala en dm que coincide con uno de los valores de la escala en ml
(34’9) Tornillo de elevación del condensador: se utiliza para elevar el condensador y disminuir
la iluminación o viceversa.
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Tornillo de centrado del condensador: se utiliza para centrar el condensador respecto al
objetivo.
Palanca de cierre del diafragma Tornillo de enfoque: muevan la platina hacia arriba y hacia
abajo y son 2 el macromético o de avance rápido y otro es el micrométro o de avance lento.
Llevan incorporados un mando del bloqueo que fija la platina a una determinada altura.
Regulador de la intensidad de la lámpara.
Diafragma o iris: sirve para ajustar la apertura numérica. Cuanto más se cierra, más empeora
la resolución y mejora el contraste. Está situada en el interior del condensador.
Lentes: Objetivos: genera una imagen real invertida y aumentada del objeto. Están colocados
en la parte inferior del tubo a nivel de una pieza mecánica que permite cambiarlos fácilmente y
que recibe el nombre de revólver. Los de mayor aumento poseen un sistema de amortiguación
que dificulta su ruptura al chocar con la preparación.
Tiene dibujado un anillo coloreado que indica su número de aumentos: 4X (anillo rojo), 10X
(anillo amarillo), 40X (anillo azul), 100X (anillo blanco, inmersión negro). El objetivo de 100 es
el de inmersión porque precisa del uso de aceite de cedro sobre la preparación.
Oculares: capta la imagen formada por el objetivo y la amplia. Los actuales microscopios son
binoculares y están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia
interpupilar. Los más usados son de 10X aumentos.
3º·- Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media para evitar que se funda
rápidamente la lámpara.
4º·- Situar el condensador: bajo si se utiliza un objetivo de bajo poder de bajo aumento
(10X).En la mitad de su recorrido si se utiliza un objetivo de gran poder de ampliación (40X) y
alto si se usa un objetivo de inmersión (100X). También conviene ascender el condensador si
se observa una muestra teñida y descenderlo si se estudia una muestra en fresco.
5º·- Mirando por fuera de los oculares hacen ascender la platina con el tornillo macromético
hasta que el objetivo esté muy cerca de la preparación. Cuando se utiliza un objetivo de poco
poder de ampliación el microscopio tiene un tope que impide un acercamiento excesivo. Sin
embargo si se emplea un objetivo de inmersión previamente hay que depositar una pequeña
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gota de aceite sobre la preparación y posteriormente hacer ascender la platina hasta que
aquel (objetivo de inmersión) toque el aceite pero no la preparación.
7º·- Moviendo el tornillo macrométrico hacer descender lentamente la platina hasta que se
vea mirando por los oculares la imagen de la muestra. Con el objetivo de inmersión nunca
debe separarse tanto de la preparación como para perder el contacto con el aceite.
10º·- Durante la observación mover continuamente el tornillo micrométrico para enfocar los
planos de la muestra.
11º·- Una vez finalizada la observación hacer descender totalmente la platina y se retira la
preparación. Si se ha utilizado aceite de inmersión se debe limpiar con una pequeña cantidad
de xilol impregnado en una tela suave. Los objetivos secos pueden limpiarse con agua
destilada el exterior del aparato con un paño húmedo.
AJUSTE DE LOS OCULARES Se realiza una vez enfocada la muestra y se lleva a cabo de la
siguiente forma: 1º·- Cerrar el ojo izquierdo y ajustar el enfoque del ojo derecho con el tornillo
cm 2º·- Cerrar el ojo derecho y ajustar el enfoque del ojo izquierdo con el anillo de ajuste del
ocular.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
En el microscopio compuesto el campo está intensamente iluminado y los objetos se ven más
oscuros que él. Este microscopio permite el estudio de las estructuras externas de las
muestras para la cual esta debe dispuesta en una fina capa que puede ser atravesado por la
luz.
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El microscopio de fluorescencia: es un microscopio en el cual la fuente luminosa es luz
ultravioleta de modo que la estructura solo se hará visible si es fluorescente. Podemos
encontrarnos con sustancias que son fluorescentes por sí mismas o sustancias o estructuras
que captan colorantes fluorescentes. Así sucede por ejemplo cuando se utiliza auramina para
demostrar la presencia de bacilos de Koch. En esputos o cuando se emplea naranja de acridina
se une a la Earduerella Vaginales en exudados vaginales.
Este microscopio se utiliza en inmunofluorescencia de modo que la fijación del colorante
fluorescencia al que se le llama también fluorocromo que pueden ser fluoresterina, rodaminas
y la ficoeritrina. La fijación de colorante fluorescente a elemento investigado se realiza con un
anticuerpo marcado. Por lo tanto, el objeto fluorescente se ve como un cuerpo brillante que
resalta sobre un fondo oscuro.
El microscopio electrónico: está formado por un tubo en cuyo interior se ha hecho el vacío y a
través del cual se propagan los electrones que inciden sobre el objeto. Después estos
electrones son refractados y se recogen sobre una pantalla en la cual se dibuja la imagen del
objeto.
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