Informe Ureasa

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCION

Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Bioquímica I
Carrera Bioquímica – Plan 2008

PRÁCTICA: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA UREASA.

RESUMEN.

Se procedió al aislamiento de la ureasa en semillas de melón (cucumis melo) secas, las


cuales han sido molinadas y filtradas. Para la caracterización de la enzima se realizó
pruebas de cuantificación, actividad enzimática, desnaturalización de la enzima por
calor e inhibición de la enzima con sales de mercurio, dando una concentración de 39,0
mg/ml, una reacción negativa en el test de actividad enzimática y en la prueba de
desnaturalización y un resultado positivo para la inhibición enzimática. Además los
resultados fueron comparados con otro grupo que realizó la misma experiencia para
semillas de melón (cucumis melo) tratadas1 para cultivo.

INRODUCCIÓN.

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el principal


producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los ácidos nucleicos,
el cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno (como el amoniaco)
debido a su solubilidad en agua y baja toxicidad. En la reacción, la urea se rompe para
formar dióxido de carbono y amonio:

H2NCONH2 + H2O 2NH3 + CO2

La ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados.


En las plantas, es un hexámero (consiste en seis cadenas idénticas) y se encuentra en el
citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o tres subunidades diferentes.

1
El tratamiento convencional de semillas usa productos químicos para proteger a las semillas y a las
plántulas contra organismos causantes de enfermedades, insectos y otras plagas.
Muchos animales excretan urea en la orina. Los microorganismos del suelo se alimentan
de la orina del animal, produciendo ureasa para transformar la urea en amoniaco de esta
manera, esta enzima participa en ciclo del nitrógeno, el proceso por el cual el nitrógeno
de las proteínas y otro compuestos se recicla constantemente.

En la práctica de laboratorio se además de aislar la enzima ureasa se procedió a


cuantificarla mediante el método de Biuret, también a determinar cualitativamente su
actividad también a desnaturalizarla por calor y demostrar su inhibición por sales de
mercurio.

MATERIALES Y MÉTODOS.

- Barra magnética
- Baño de hielo
- Agitadores
- Erlenmeyer de 500mL
- Recipiente de vidrio de 0,5 l de capacidad
- 15 g de semilla de melón (cucumis melo).
- Papel de filtro

Reactivos:

- Reactivo de Biuret
- Buffer fosfato 1mM pH 7,00 1% urea
- Buffer fosfato 1 mM pH 7,00 sin urea
- Glicerol 75% v/vSolución de rojo fenol

Procedimiento:

1. Procesar las semillas de melón (cucumis melo), hasta conseguir una muestra
finamente dividida y homogénea
2. Adicionar lentamente con agitación constante durante 15 min, 100ml de glicerol
a la muestra pulverizada. Refrigerar la solución a 4 °C.
3. Filtrar la suspensión con ayuda de la gasa y luego realizar la filtración con el
papel de filtro, transvasando el filtrado a un recipiente limpio y seco,
manteniendo la solución en baño de hielo.
4. Luego de obtener la solución previamente filtrada se llevan a cabo 4 análisis
distintos.
Parte I: Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Se procede a la preparación de tres tubos; el primero conteniendo la muestra en estudio


junto con agua y el reactivo de Biuret; el segundo, utilizado como blanco, contiene agua
destilada y el reactivo de Biuret; el tercer tubo que se utiliza como patrón, lleva agua
destilada, reactivo de Biuret y BSA. Se miden las absorbancias de estas 2 muestras a
550nm y se realiza el cálculo de cuantificación.

Parte II: Test de actividad enzimática.

Se preparan dos tubos; en ambos se colocan la solución de ureasa y el indicador (rojo


fenol), en una se coloca tampón fosfato 1mM con 1% de urea y en el otro sin urea. Se
anotan los cambios luego de 5 minutos.

Parte III: Desnaturalización de la enzima por calor.

Se preparan 2 tubos; en uno se coloca la muestra con ureasa y agua destilada y se lleva a
hervir por 2 minutos; en el siguiente tubo se adiciona tampón fosfato 1mM pH 7 con
1% de urea, indicador rojo fenol y 1ml del primer tubo (previamente hervida); mezclar
y esperar 5 minutos y anotar los resultados observados.

Parte IV: Parte Inhibición de la enzima por sales de mercurio.

En un tubo agregar agua destilada y solución de ureasa, agitar y agregar solución de


cloruro mercúrico. Agitar y luego agregar Tampón fosfato 1mM con 1% de urea y 1
gota de rojo fenol. Mezclar y esperar 5min. Observar si hubo cambio de color.
RESULTADOS.

Parte I: Cuantificación de proteínas.

Tabla N°1: Cuantificación de la proteína con el reactivo de Biuret.

Reactivos contenido Absorbancia a 550 nm de


Nº de Tubos
en cada tubo longitud de onda.
Reactivo de Biuret.
1 Solución de ureasa. 0,897
H2O destilada.
H2O destilada.
2 0,008
Reactivo de Biuret.
H2O destilada.
3 0,023
Reactivo de BSA 1mg/ml.

Cálculo de la concentración de proteínas:

C BSA
Cmuestra= X A muestra
A BSA
1
C muestra= X 0,897
0,023
Cmuestra=39 ,0 mg/ml

Parte II: Test de actividad enzimática.

Tabla Nº2: Registro de observaciones para test de actividad enzimática.

Nº de Tubos Reactivos contenidos en cada tubo Cambio de color

Solución ureasa.
Tampón fosfato 1mM
1 Negativo
1% Urea.
Rojo Fenol.
Solución ureasa.
Negativo
2 Tampón fosfato 1mM sin Urea.
Rojo Fenol.

Luego de 5 minutos no se observó ningún cambio de color en los tubos números 1 y 2.


Parte III: Desnaturalización de la enzima por calor.

Tabla Nº 3: Registro de observaciones para test de desnaturalización.

Nº de Tubos Reactivos contenidos en cada tubo Cambio de color

Tampón fosfato 1mM


1% Urea.
Negativo
1 Solución de ureasa.
(Previamente hervido).
Rojo Fenol.

Luego de 5 minutos no se observó ningún cambio de color, a reacción quedo con un,
comparando así con el tubo 1 del experimento II, que dieron características semejantes,
color naranja oscuro.

Parte IV: Inhibición de enzimas por sales de mercurio.

Tabla Nº 4: Registro de observaciones para inhibición de enzimas por sales de mercurio.

Nº de Tubos Reactivos contenidos en cada tubo Observación

H2O destilada.
Solución de ureasa.
Precipitado
Cloruro Mercúrico.
1 blanco.
Tampón fosfato 1mM
1% Urea.
Rojo Fenol.
Tabla Nº 5: Registro de las observaciones de para las semillas de melón (cucumis melo)
tratadas.

Parte Experimental Observaciones

Parte I: Cuantificación de proteínas. No se pudo medir la


absorbancia.

Parte II: Test de actividad enzimática. No hubo cambios en ninguno de


los sistemas.

Parte III: Desnaturalización de la enzima por calor. Cambio leve de color amarillo
en la superficie.
Parte IV: Inhibición de enzimas por sales de
Se observa un cambio de color
mercurio.
de rojo a amarillo.

Los datos fueron proveídos por el grupo que realizó la misma experiencia con las
semillas de melón tratadas.
DISCUSIÓN.

La proteína ureasa se pudo aislar a partir de semillas de melón (cucumis melo) por
filtración, luego se cuantificó por el método de Biuret, obteniéndose una concentración
de 39,0 mg/ml. No se pudo comprar éste valor con el grupo de semillas tratadas debido
a que no se midió la absorbancia por interferencia causada por el color de la muestra.

En la parte correspondiente a la actividad enzimática con el indicador rojo fenol, tanto


para las semillas tratadas como las no tratadas, no se observó viraje de color del
indicador pudiendo deberse a la baja actividad de la ureasa en la muestra.

En cuanto a la desnaturalización por calor, para las semillas no tratadas, no se observó


viraje del color del indicador, debido a la poca cantidad de calor suministrado para
desnaturalizar la proteína, pudiendo inferirse eso al comparar con el tubo 1 del
experimento 2 ambos presentaban las mismas características en cuanto al color. Para
las semillas tratadas si observó un cambio leve de color amarillo en la superficie del
tubo, dando positiva a ésta prueba.

En la última parte correspondiente a la inhibición de enzimas en presencia de sales de


mercurio, se pudo apreciar un precipitado de color blanco, pudo deberse a la falta de
actividad enzimática sobre la urea. Esto sucede debido a que el sitio catalítico de la
ureasa presenta grupos –SH (sulfhidrilo) proveniente del aminoácido cisteína que forma
parte de su cadena peptídica. El HgCl2 se une irreversiblemente a los grupos –SH los
inactiva, deteniendo así la actividad enzimática de la ureasa. Lo mismo puede concluirse
de las semillas que fueron tratadas.

Se presume que las semillas de melón para cultivo fueron tratadas con químicos anti
fúngicos y conservantes. Al compararlas con las no tratadas, no se observan diferencias
notables en cuanto a los resultados obtenidos.
REFERENCIAS.

BIOQUIMICA. Mathews, Chistopher; Van Hode, K.E; Ahern, Kevin. Editorial


Addison Wesley. Sexta Edición. Madrid, España. 2003

[en línea] UREASA DE CUCURBITÁCEAS Y SU LOCALIZACIÓN CITOLÓGICA


C. VICENTE, N. VILLALOBOS; A. J. HERNÁNDEZ. Consultado el 8 de noviembre.
Disponible en: http://www.rjb.csic.es/jardinbotanico/ficheros/documentos/pdf/anales/
1975

[en línea] TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN


SUELOS. Marisol Montejo Martínez, Cinthya Paulina Torres López, Ángeles Martínez
Toledo…..Consultado el 8 de noviembre. Disponible en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/665/tecnicas.pdf

[en línea] Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Quesada Mora,


Silvia Consultado el: 08 de noviembre. Disponible en: books.google.com.py/books?
isbn=9968316164

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