Tejada Pe

Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú. Decana de América

Facultad de Farmacia y Bioquímica
Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica
«Actividad antimicrobiana y antioxidante del

hidrolizado de gelatina obtenido de las pieles de Sarda
chiliensis chiliensis “Bonito” como residuos de la
actividad pesquera en el Perú»
TESIS
Para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico
AUTOR
Eder Eduardo TEJADA PERICHE
ASESORES
Dra. Yadira FERNÁNDEZ JERÍ
Dra. María Elena SALAZAR SALVATIERRA(Co-asesora)
Lima, Perú
2019
DEDICATORIA
A mis padres, María Elsa y Bartolomé,

quienes me muestran amor y sacrificio a cada
día y representan mi motivación para avanzar
cada peldaño en la vida.
A mis hermanos, Germán, Erick, Roxana,

Cintia y a cada integrante de su familia, por
inculcarme y ser los mejores ejemplos de
superación y valores que se forjan en familia.
A mis padrinos, Leonie y Eduardo, por la

consideración hacia nuestra familia y el rol
ejemplar que han transmitido a cada uno de
sus ahijados.
AGRADECIMIENTOS
A mi querida Alma Máter, la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por

abrirme las puertas del conocimiento en la prestigiosa Facultad de Farmacia y
Bioquímica, que me ha proporcionado las herramientas necesarias
para afrontar los retos y desafíos de la vida.
A mis asesoras de tesis, Dra. Yadira Fernández Jerí y Dra. María Elena Salazar
Salvatierra, quienes me han brindado su apoyo, motivación y paciencia para la
realización del presente trabajo, así como también, su admirable compromiso del
día a día en las aulas y laboratorios del cual soy fiel testigo.
A la Dra. Elizabeth Carranza Alva, quién estuvo siempre presta a absolver

cualquier inquietud, y cuyas recomendaciones están presentes en las diferentes
fases del presente trabajo de tesis.
A los miembros del Jurado Examinador y Calificador, (Presidente: Dr. Américo

Castro, Miembros: Mg. Carmen Peña, Mg. Teresa Gallardo y Mg. Nelson Bautista)
por su período en la revisión y sus recomendaciones para un buen resultado del
presente trabajo.
A los Laboratorios de Bioquímica y Microbiología que me facilitaron sus

instalaciones para materializar mi trabajo de tesis.
A mis amigos quienes estuvieron presentes en esta interesante travesía, Paola,

Wesly, Guadalupe y Giannina siempre con el aliento de seguir adelante, por su
apoyo, y su compañía hasta las últimas en esas interminables horas de ensayos en
el laboratorio.
A mis amigos, Estela, Giancarlos, Rousbel, Luis, Irving, Pablo, Litta y Neydis,
con quienes la etapa universitaria se llena de experiencias imborrables para la
frágil memoria humana.
ÍNDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN ...................................................................................................... XIII
ABSTRACT ..................................................................................................... XIV
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................1
1.1. Objetivo general ....................................................................................3
1.2. Objetivos específicos .............................................................................3
1.3. Hipótesis ................................................................................................3
II. ANTECEDENTES .....................................................................................4
III. MARCO TEÓRICO ...................................................................................9
3.1. Actividad pesquera y subproductos generados .....................................9
3.2. Descripción de la especie marina ........................................................ 11
3.3. Colágeno ............................................................................................. 12
3.4. Gelatina ............................................................................................... 14
3.5. Hidrólisis .............................................................................................. 16
3.6. Grado de hidrólisis ............................................................................... 20
3.7. Enzimas proteolíticas........................................................................... 22
3.8. Actividad biológica de hidrolizados enzimáticos de proteínas ............. 25
IV. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................... 32
4.1. Materiales, equipos y reactivos ........................................................... 32
4.2. Métodos y técnicas .............................................................................. 35
4.2.1. Diagrama del procedimiento general de métodos de

experimentación para hidrolizados de gelatina ....................................... 35
4.2.2. Recolección, transporte y almacenamiento de la muestra ............ 36
4.2.3. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno .............. 37
4.2.4. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford . 41

4.2.5. Hidrólisis enzimática y análisis de los factores que influyen en el
proceso ................................................................................................... 42
4.2.6. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de proteína

soluble mediante el método de Biuret ..................................................... 43
4.2.7. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del

nitrógeno soluble mediante el método de micro-Kjeldahl ........................ 44
4.2.8. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

radical (DPPH●) ....................................................................................... 46
4.2.9. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

radical catiónico (ABTS●+) ....................................................................... 48
4.2.10. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el método

de difusión en agar-pozo ......................................................................... 50
4.2.11. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria mediante el

método de microdilución/colorimétrico .................................................... 54
4.3. Análisis estadístico .............................................................................. 57
V. RESULTADOS........................................................................................ 58
5.1. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno .................... 58
5.2. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford ....... 58
5.3. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de proteína

soluble mediante el método de Biuret ........................................................ 58
5.4. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del nitrógeno

soluble mediante el método de micro-Kjeldahl ........................................... 61
5.5. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

radical (DPPH●) .......................................................................................... 63
5.6. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

radical catiónico (ABTS●+) .......................................................................... 71
5.7. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el método de

difusión en agar-pozo ................................................................................. 77
5.8. Determinación de la concentración mínima inhibitoria mediante el
método de microdilución/colorimétrico ....................................................... 81
VI. DISCUSIÓN ............................................................................................ 86
VII. CONCLUSIONES ................................................................................. 101
VIII. RECOMENDACIONES ......................................................................... 102
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 103
X. ANEXOS ............................................................................................... 120

LISTA DE ABREVIATURAS
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
ABTS: 2,2-Azino-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic
IC50: Concentración inhibitoria 50.
TEAC: Capacidad antioxidante equivalente al Trolox
ECA: Enzima convertidora de la angiotensina
DPP-IV: Dipeptidil peptidasa-4
FRAP: Ferric Reducing Ability of Plasma (capacidad reductora férrica del

plasma)
BHT: Butil hidroxitolueno
GH: Grado de hidrólisis.
ATC: Ácido tricloroacético
E/S: Enzima/Sustrato.
E.C: Comisión Enzimática
EROs: Especies reactivas de oxígeno
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ARN: Ácido ribonucleico
BSA: Estándar de albúmina sérica bovina
AOAC: Asociación de Químicos Analíticos Oficiales
CMI: Concentración mínima inhibitoria
TSA: Tripticasa soya agar
DMSO: Dimetilsulfóxido
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Caracterización aproximada de las especies intermedias producidas en

la hidrólisis enzimática de proteínas
Tabla 2. Enzimas proteolíticas clasificadas de acuerdo a su sitio de acción
Tabla 3. Especies reactivas de oxígeno
Tabla 4. Factores de hidrólisis enzimática de acuerdo al diseño factorial tipo
Plackett-Burman con punto central por triplicado
Tabla 5. Esquema del protocolo de trabajo para la determinación de la
actividad antioxidante mediante el método DPPH●
Tabla 6. Esquema del protocolo de trabajo para la determinación de la
actividad antioxidante mediante el método de decoloración del ABTS ●+
Tabla 7. Criterio de evaluación de actividad antimicrobiana por ensayo de difusión
Tabla 8. Disposición para la incorporación de muestras e inóculos en la microplaca
Tabla 9. Niveles de actividad antimicrobiana
Tabla 10. %GH de las muestras determinado mediante el método de Biuret
Tabla 11. Análisis del diseño factorial: %GH (Biuret) VS Temperatura, pH, tiempo
y [E/S]
Tabla 12. %GH de las muestras determinado mediante el método de micro-
Kjeldahl
Tabla 13. Análisis del diseño factorial: %GH (Micro-Kjeldahl) VS Temperatura, pH,
tiempo y [E/S]
Tabla 14. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones de las
sustancias estándares con actividad antioxidante positiva
Tabla 15. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones del total
de los hidrolizados enzimáticos de proteína colagenosa
Tabla 16. Análisis del diseño factorial: actividad antioxidante (DPPH●) VS pH,
tiempo y [E/S]
Tabla 17. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones del Trolox
Tabla 18. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones de los
hidrolizados enzimáticos de proteína colagenosa
Tabla 19. Análisis del diseño factorial: actividad antioxidante (ABTS●+) VS pH,
tiempo y [E/S]
Tabla 20. Valores de los halos de inhibición (mm)
Tabla 21. Análisis del diseño factorial: actividad antimicrobiana (difusión en
poso) contra Staphylococcus aureus VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]
Tabla 22. Análisis del diseño factorial: actividad antimicrobiana (difusión en poso)
contra Bacillus subtilis VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]
Tabla 23. Valores de CMI de hidrolizados contra Staphylococcus aureus y Bacillus
subtilis
Tabla 24. Análisis del diseño factorial: actividad antimicrobiana (CMI)
contra Staphylococcus aureus VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]
Tabla 25. Análisis del diseño factorial: actividad antimicrobiana (CMI) contra
Bacillus subtilis VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Subproductos del pescado y sus diversos usos potenciales

Figura 2. Descripción general de la triple hélice de colágeno
Figura 3. Diagrama que representa la hidrólisis de tipo enzimática
Figura 4. Esquema que representa el proceso de hidrólisis enzimática
Figura 5. Secuencia de la obtención de productos en la hidrólisis enzimática
Figura 6. Clases de enzimas proteolíticas de acuerdo al sitio de acción
Figura 7. Actividades biológicas de los péptidos
Figura 8. Clasificación del sistema antioxidante
Figura 9. Diagrama general de métodos de experimentación
Figura 10. Diagrama de flujo de los procesos de recolección,
transporte y almacenamiento de la muestra problema
Figura 11. Esquema para la obtención de gelatina de la piel de pescado
Figura 12. Esquema para la obtención del grado de hidrólisis (%GH)
Figura 13. Esquema para la obtención del nitrógeno soluble en ATC al 10%
Figura 14. Esquema para la cuantificación de nitrógeno total
Figura 15. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados
Figura 16. Gráfica de efectos principales
Figura 19. IC50 de las sustancias antioxidantes analizadas mediante el
método del radical DPPH●
Figura 22. IC50 de las sustancias antioxidantes analizadas con el método
del radical (ABTS●+)
Figura 23. Valores TEAC de los hidrolizados enzimáticos
Figura 33. Gráfica de efectos principales (CMI)
RESUMEN
El presente trabajo de investigación aprovechó las pieles de la especie Sarda chiliensis

chiliensis como producto de la actividad pesquera, y tuvo como objetivo determinar la
actividad antimicrobiana y antioxidante del hidrolizado de gelatina, la cual fue obtenida
a partir del colágeno presente en los residuos generados por dicha actividad. La
metodología utilizada se basa en que fracciones equivalentes y homogéneas de la
proteína colagenosa extraída de las pieles fueron hidrolizadas con la enzima alcalasa
a diferentes condiciones de pH:7, 8 y 9, temperatura: 50, 60 y 70 °C, tiempo: 2, 3 y 4
horas, y relación [enzima/sustrato]: [1/20], [1/35] y [1/50], obteniendo bajo el diseño
factorial tipo Plackett-Burman con punto central por triplicado un total de 15
hidrolizados, con cada uno de ellos se procedió a determinar la actividad antimicrobiana
mediante los métodos de difusión en agar y microdilución en placa para CMI, también
se determinó la actividad antioxidante a través de los métodos del radical 2,2-difenil-1-
picrilhidracilo (DPPH●) y del radical catiónico 2,2-Azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-
sulfonico (ABTS●+). Como resultados al evaluar la actividad antimicrobiana se
obtuvieron halos de inhibición para los hidrolizados H601, H602, H603, H504, H508,
H509, H7010 y H7014 a concentración de 1,0 mg/mL mediante el método de difusión
en agar, por microdilución en placa se obtuvo CMI mayores a 0,5 mg/mL, ambos
métodos contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis. La concentración de los
hidrolizados necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH● al 50% (IC50)
fue entre 458,73 y 1830,46 µg/mL. Así mismo las concentraciones de los hidrolizados,
necesarias para disminuir la concentración inicial de ABTS●+ al 50% (IC50) variaron
entre 74,86 y 200,45 µg/mL, obteniendo como TEAC: 61,76 mol Trolox/g de
hidrolizado proteico, el más bajo que correspondiente al hidrolizado H7011 y el TEAC:
165,38 mol Trolox/g de hidrolizado proteico, el más alto que corresponde al
hidrolizado H7012. Conclusiones, la proteína colagenosa, extraída como gelatina de
las pieles de los residuos de la pesca, sometida a hidrólisis enzimática a diferentes
condiciones demostró actividad antioxidante y antimicrobiana, bajo el modelo
experimental trabajado, por tal razón, manifiesta el interés y provecho de la
investigación.
Palabras clave: Sarda chiliensis chiliensis, antioxidante, antimicrobiana, pieles,

colágeno, gelatina, hidrolizado, alcalasa.
ABSTRACT
The present research work took advantage of the skins of the species Sarda chiliensis
chiliensis as a product of fishing activity, and had as objective to determine the
antimicrobial and antioxidant activity of the gelatin hydrolyzate, which was obtained from
the collagen present in the waste generated by said activity. The methodology used is
based on which equivalent and homogeneous fractions of the collagenous protein
extracted from the skins were hydrolysed with the enzyme alcalase at different
conditions pH: 7, 8 and 9, temperature: 50, 60 and 70 °C, time: 2, 3 and 4 hours, and
relation [enzyme / substrate]: [1/20], [1/35] and [1/50], obtaining under the factorial
design type Plackett-Burman with central point in triplicate a total of 15 hydrolysed, with
each one of them we proceeded to determine the antimicrobial activity by means of
diffusion methods in agar and microdilution in plate for CMI, also the antioxidant activity
was determined through the methods of the radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH●) and the cationic radical 2,2-Azino-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic
(ABTS●+). As results when evaluating the antimicrobial activity, haloes of inhibition were
obtained for the hydrolysates H601, H602, H603, H504, H508, H509, H7010 and H7014
at a concentration of 1,0 mg / mL by the agar diffusion method, by microdilution in plate
was obtained CMI greater than 0,5 mg / mL, both methods against Staphylococcus
aureus and Bacillus subtilis. The concentration of the hydrolysates necessary to reduce
the initial concentration of DPPH● to 50% (IC50) was between 458,73 and 1830,46
g/mL. Likewise, the concentrations of the hydrolysates, necessary to reduce the initial
concentration of ABTS●+ to 50% (IC50) varied between 74,86 and 200,45 g/mL,
obtaining as TEAC: 61,76 mol Trolox/g of protein hydrolyzate, the lowest
corresponding to the H7011 hydrolyzate and the TEAC: 165,38 mol Trolox/g of protein
hydrolyzate, the highest corresponding to the H7012 hydrolyzate. Conclusions, the
collagenous protein, extracted as gelatin from the skins of fishing waste, subjected to
enzymatic hydrolysis at different conditions, showed antioxidant and antimicrobial
activity, under the experimental model worked, for this reason, it shows the interest and
benefit of the research.
Key words: Sarda chiliensis chiliensis, antioxidant, antimicrobial, skins,

collagen, gelatin, hydrolyzate, alcalase.
I. INTRODUCCIÓN
Debido a la actividad pesquera, a nivel mundial se distinguen tres categorías

de subproductos generados por esta actividad: los desperdicios generados en
tierra, los descartes de especies por flotas pesqueras y los desperdicios a bordo,
en esta última categoría podemos encontrar vísceras, pieles, cabezas, aletas, entre
otras que se generan al procesar las capturas a bordo de la flota pesquera1. Dado
este escenario se origina la problemática en la que los subproductos son devueltos
nuevamente a mar abierto, produciendo contaminación y el desaprovechamiento
de los residuos generados1.
El reflejo de esta situación a nivel nacional lo podemos observar de forma
sencilla al visitar los mercados y centros de abasto, donde claramente notamos que
la mayor cantidad de residuos de la actividad pesquera se genera como
consecuencia de la venta directa de diferentes especies de pescado que provee el
litoral peruano para el consumo humano2.
En los últimos años, debido al aumento de investigaciones ante tal
problemática, la tendencia es hacia el aprovechamiento de dichos residuos a todo
nivel, por ejemplo la industria pesquera utiliza estos subproductos para la
alimentación animal mediante la transformación con procesos biológicos,
obteniendo de esta manera un producto con altas propiedades nutritivas, que se
perfila como sustituto de la harina de pescado como alimento animal, pero, no solo
se ha logrado el beneficio con este empleo, sino las investigaciones actuales
inciden en la aplicación tecnológica en la producción de colágeno, diferentes
pigmentos, aprovechamiento de enzimas, elaboración de fertilizantes y el más
importante entre ellos la producción de hidrolizados enzimáticos con propiedades
biológicas, entre otros1,3,4. Por consiguiente se ha demostrado que, en los diversos
componentes de los residuos de la pesquería, que entre ellos podemos encontrar
espinas, escamas, pieles, entre otros, contienen en su estructura potenciales
cantidades de proteína colagenosa, la cual ha despertado el gran interés de las
industrias farmacéutica y cosmética en la implementación tecnológica para el
empleo de los residuos de la actividad pesquera, como fuente de colágeno, el cual
es necesario como materia prima en el proceso de manufactura de diferentes
productos 4,5.
1
Estudios recientes consideran a los subproductos de la pesca como fuente
extensiva tanto de colágeno como de gelatina y es a partir de estas fuentes
proteicas que se someten a procesos de hidrólisis con enzimas proteolíticas
comerciales como tripsina, quimiotripsina, pepsina, alcalasa, pronasa, colagenasa,
papaína, entre otras o en combinación de estas, consiguiendo como producto final
del proceso, hidrolizados que contienen péptidos y aminoácidos liberados con
actividad en el organismo humano6. Así mismo, se ha demostrado diversas
propiedades biológicas (antihipertensiva, antioxidante, inmunomoduladora,
antimicrobiana, antitrombótica, entre otras) que cumplen los péptidos o
aminoácidos resultantes de la hidrólisis enzimática de proteína colagenosa extraída
de pescados marinos como el atún, bacalao, sardina y otras especies como
camarones y cefalópodos7, 8.
Tal como se ha señalado anteriormente, los residuos de la actividad pesquera
representan un recurso de mucha utilidad como fuente de proteína colagenosa, por
tal razón, tomaremos como muestra de residuos, las pieles de la variedad del
pescado Sarda chiliensis chiliensis, comúnmente llamado “Bonito”, que
generalmente se desecha y que en muchos casos su destino final es el relleno
sanitario o en el mejor de los casos acopiado para la elaboración de alimento de
animales, de esta manera corroboramos que en la actualidad no se le da un
aprovechamiento adecuado como refieren diversas investigaciones en el tema7,8,9.
En la presente investigación se resalta la importancia en plantear la obtención
del hidrolizado enzimático de la proteína colagenosa de la piel de pescado, a la vez
evidenciar que este posee dos potenciales bioactividades como son la
antimicrobiana y la antioxidante, las cuales son de mucho beneficio para el
organismo humano y que en actualidad se colocan entre las más investigadas como
resultado fructuoso en este campo, para ello, tenemos como punto de partida la
proteína a hidrolizar proveniente de la fuente como son las pieles de residuos de la
actividad pesquera6-9. De esta manera nuestro trabajo aporta a los estudios
científicos y a la población, revalorizando la extraordinaria riqueza de los recursos
marinos que posee nuestro país, sirviéndose de materia que pudiendo ser
aprovechada se desecha por desconocimiento de la comunidad.
2
1.1. Objetivo general
Determinar la actividad antimicrobiana y antioxidante del hidrolizado enzimático

de gelatina, que es obtenida a partir del colágeno presente en los residuos
(pieles) de la actividad pesquera.
1.2. Objetivos específicos
1. Extraer la gelatina como producto de la hidrólisis química parcial del

colágeno, a partir de las pieles de pescado como residuos de la actividad
pesquera.
2. Evaluar la influencia de los factores de hidrólisis enzimática empleando la
proteasa (alcalasa) sobre el sustrato de gelatina.
3. Evaluar la actividad antimicrobiana del hidrolizado enzimático de la
gelatina obtenida a partir de las pieles de pescado.
4. Evaluar la actividad antioxidante del hidrolizado enzimático de la gelatina
obtenida a partir de las pieles de pescado.
1.3. Hipótesis
El hidrolizado de gelatina extraída de las pieles de pescado como residuos de la

actividad pesquera, posee propiedades antimicrobianas y antioxidantes.
3
II. ANTECEDENTES
La extracción de la proteína colagenosa como gelatina tiene una novedosa

fuente de origen animal, tal como ha sido materia de investigación en un estudio
donde se logró obtener esta proteína a partir de la piel, así como también de los
huesos de la especie de pescado de río Lates niloticus, conocida como La perca
del Nilo, también se hace referencia a que existen diferencias significativas, entre
las extracciones a partir de la piel y del hueso, en cuanto a sus propiedades
químicas, extractabilidad, rendimiento y sobre todo en su funcionamiento, en
tanto, los consideran como potenciales fuentes de esta proteína como resultado
de la explotación del recurso animal marino y su procesos derivados9.
Nuestro país no ha sido ajeno a estas investigaciones, Miano A. et al., 20142,

demostraron cómo influye la temperatura (60 – 95 °C) y el tiempo (220 – 240
min) en el proceso de extracción de la proteína colagenosa presente en la piel
del Tollo (Mustelus mento), por tal razón, con el control de estas variables se
pueden obtener gelatinas de mayor calidad en cuanto a la fuerza de gel a 60°C
y 135 min., y de la misma manera un alto rendimiento de extracción a las
condiciones de 77.5°C y 240 min.; sin embargo, es preciso aclarar que otras
variables como el origen de la materia prima y entre otras condiciones de
extracción influyen en la calidad de la proteína de interés.
En los hidrolizados enzimáticos de proteína podemos encontrar péptidos de

diferentes tamaños y aminoácidos liberados, cuyas estructuras y funcionabilidad
dependerá sobre todo de la proteína original, factores del proceso hidrolítico y
de la enzima empleada, de esta manera se les atribuye a estos componentes
presentes en los hidrolizados, múltiples bioactividades para el organismo
humano5,9,10. Con el empleo de una o más enzimas proteolíticas se logra obtener
los hidrolizados cuya actividad biológica demostrada puede ser la mejor solución
a un trastorno a la salud o quizá no, en comparación con las sustancias
conocidas5,9,10. A la fecha se han reportado variadas investigaciones sobre los
hidrolizados de gelatina obtenida de fuente marina, que demuestran actividades
4
biológicas antimicrobiana, antioxidante, antihipertensiva, inmunomoduladora,
entre otras, de los cuales se describen a continuación5,6,11-16:
En el estudio llevado a cabo por Mendis E. et al., 200511, lograron determinar la

actividad antioxidante de los péptidos bioactivos, los cuales fueron aislados de
la modificación inicial de la gelatina por hidrólisis enzimática por separado con
proteasas como tripsina, α-quimotripsina y pepsina. La gelatina fue obtenida a
partir de las pieles de la especie Johnius belengerii, conocida como Hoki, en este
trabajo de investigación también se determinaron las potencias de captación de
radicales por parte de los péptidos obtenidos, demostrada a través del método
del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH●) obteniendo un IC50 aproximado
de 156,8 µM, dentro de todos los valores reportados se obtuvo una actividad muy
aproximada a del antioxidante sintético BHT (hidroxitolueno butilado).
Así mismo, Wu H. et al., 200312, investigaron sobre los péptidos y aminoácidos

liberados por la hidrólisis de Caballa con la enzima comercial proteasa N, donde
se llegó a demostrar su efecto antioxidante, luego de la identificación y
aislamiento de péptidos se evidenció cambios en la composición y niveles
aumentados de péptidos (1400, 900 y 200 Da) y aminoácidos (anserina,
carnosina, entre otros) luego del proceso hidrolítico de 10 horas, la actividad
biológica antioxidante relativa fue analizada mediante la inhibición de la
autooxidación del ácido linoleico según el método del tiocianato férrico, y también
con el método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH●), logrando
actividades antioxidantes relativas de 1,5 – 6,8 y 0,1 – 15,4 con el primer y
segundo método respectivamente, tomando como período de inducción de la
muestra blanco 1,4 días, de este modo se evidenció períodos de inducción más
elevados demostrando la propiedad en estudio.
En otro trabajo de investigación realizado por Fan J. et al., 2012 13, se evidenció
la actividad antioxidante de los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de la
proteína del marco de Tilapia (Oreochromis niloticus), en este trabajo la proteína
se hidrolizó con diferentes proteasas como pepsina, neutrasa, tripsina, papaína,
5
entre otras, entre todos los hidrolizados obtenidos con cada una de las enzimas,
se exhibió un mayor grado de hidrólisis y consecuentemente una mayor actividad
antioxidante del hidrolizado con la enzima tripsina, así mismo se identificaron dos
péptidos con actividad de captación de radicales hidroxilo con IC50 de 27,6 y
38,4 g/mL.
Gómez-Guillén M. C. et al., 20106, demostraron las actividades biológicas

antioxidante y antimicrobiana de los péptidos presentes en el hidrolizado proteico
obtenido a partir de la gelatina de la piel de pescado (atún) y de la túnica de
calamar gigante. El proceso hidrolítico se llevó a cabo a 50 °C, por un tiempo de
3 horas, empleando una enzima comercial denominada alcalasa. En cuanto a la
bioactividad antioxidante se llevó a cabo con el ensayo de poder antioxidante
reductor férrico (FRAP) y con el método del radical catiónico (ABTS●+), en ambos
casos resultó positiva, y con mayor actividad con los péptidos de bajo peso
molecular. Para demostrar la propiedad antimicrobiana contra microorganismos
grampositivos y gramnegativos se realizó mediante la prueba de difusión en
disco, en la que se obtuvo como resultado positivo para todas las fracciones
peptídicas; sin embargo, una mayor actividad con la fracción de más bajo peso
molecular.
Del mismo modo, Mosquera J., 20145 logró obtener hidrolizados con proteasas
comerciales alcalasa, esperasa y pepsina, a partir de los residuos de la pesca
como son la túnica de calamar, las espinas y escamas de dorada y también de
langostinos sin valor comercial, cada uno de los hidrolizados contenían péptidos
bioactivos, los cuales fueron separados en relación a su peso molecular entre
750 y 1000 Da, esta investigación demuestra que las propiedades biológicas
están relacionadas en función al tamaño molecular de los péptidos obtenidos de
la hidrólisis, consecuentemente la mayor actividad se concentra en la fracción de
menor tamaño. De esta manera se demostró la bioactividad inhibidora de la ECA-
I y la actividad antioxidante como secuestrante de radicales libres ABTS●+ que
posee el hidrolizado peptídico de la gelatina extraída de las escamas de dorada
tratadas con la enzima esperasa y alcalasa, de la misma forma se demostró la
6
propiedad antimicrobiana en las fracciones peptídicas obtenidas por hidrólisis
enzimática de la gelatina extraída de la túnica de calamar tratada con alcalasa y
esperasa, otra actividad biológica que manifiestan los péptidos (<1KDa)
liberados de la hidrólisis enzimática con alcalasa y esperasa, previa extracción
de gelatina de las escamas de dorada, langostinos y túnica de calamar
desecada, es la hipoglucemiante mediante la inhibición de la DPP-IV.
Podemos considerar el estudio llevado a cabo por García Moreno P. et al.,

201410, en el que se determinó la propiedad antioxidante del hidrolizado proteico,
utilizando para el proceso de hidrólisis dos enzimas endoproteasas, la subtilisina
y tripsina. La materia prima proteica para hidrolizar se obtuvo a partir del
prensado de 5 especies marinas (sardina, jurel, besugo axilar, biga y felino
pequeño) descartadas en el mar Mediterráneo. Para la evaluación de la actividad
antioxidante se basó en el método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
(DPPH●), resultando el mayor IC50 de 0,91 mg de proteína/mL., este resultado
se logró al hidrolizar el prensado de sardina con tripsina más un tratamiento
enzimático con subtilisina.
Por otro lado Q. Zhong-Ji et al., 200714 investigaron sobre el hidrolizado

enzimático del músculo oscuro del atún, empleando las enzimas alcalasa,
neutrasa, pepsina, papaína, R-quimiotripsina y tripsina, las cuales dieron como
productos hidrolizados conteniendo péptidos con bioactividad antihipertensiva,
donde cada hidrolizado posee la propiedad biológica con diferencias
significativas, para demostrar dicha actividad se aisló el péptido (peso molecular
1581Da) inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina I (ECA) a partir
de los hidrolizados, concluyendo que el hidrolizado obtenido con la enzima
pepsina fue la que demostró mayor actividad antihipertensiva por inhibición de la
enzima convertidora de angiotensina I, comparado con los hidrolizados
conseguidos con las demás enzimas mencionadas en el presente estudio.
En una investigación previa realizada por Choonpicharn S. et al., 201515 utilizan

a la fuente de material rica en proteína gelatinosa, la piel de la tilapia del Nilo
7
(Oreochromis niloticus), ésta se logró hidrolizar con diferentes tipos de proteasas
entre las que se reportan como bromelina, papaína, tripsina, flavourzima,
alcalasa y neutrasa, cabe resaltar que cada proceso hidrolítico se llevó a cabo
por separado. De esta manera se reporta que el hidrolizado cuya enzima
utilizada fue la flavourzima tiene una potente actividad de eliminación de
radicales ABTS●+, confirmando de esta manera la propiedad biológica
antioxidante medida como Capacidad Antioxidante en Equivalentes Trolox (1
413,61 ± 88,74 g de trolox / mg de proteína); sin embargo, fue el hidrolizado
con la enzima alcalasa el que tuvo un mayor poder antioxidante (4,951 ± 1,577
mM de trolox / mg de proteína). No siendo de menor interés en este trabajo de
investigación que también se haya evidenciado la bioactividad antihipertensiva a
través del método de evaluación de la actividad inhibidora de la enzima
convertidora de angiotensina I cuyos valores obtenidos variaron entre 89,02–
92,55%.
Por último, Alemán A. et al., 201116, han reportado en una investigación

preliminar la evidencia en cuanto a la actividad antioxidante que poseen los
hidrolizados obtenidos a partir de la gelatina de las pieles de las especies
marinas: atún (Thunnus spp.) y halibut (Hypoglossus spp.), así como también de
la túnica de calamar gigante (Dosidicus gigas), en este estudio la hidrólisis
enzimática se llevó a cabo con múltiples enzimas, por ejemplo: colagenasa,
tripsina, pepsina, alcalasa y pepsina, en las cuales se obtuvieron diferentes
grados de actividad antioxidante, siendo la más alta del hidrolizado de calamar
gigante, dicha propiedad biológica fue evaluada bajo dos métodos: capacidad de
reducción de Fe (FRAP) y capacidad de eliminación de radicales ABTS ●+, por
tanto, el tratamiento de hidrólisis tipo enzimático es efectivo para producir
hidrolizados con función biológica antioxidante a partir de fuentes marinas.
8
III. MARCO TEÓRICO
3.1. Actividad pesquera y subproductos generados
Esta ocupación que ha evolucionado a lo largo del tiempo comprende dos

actividades básicas, como son la de extracción (actividad primaria) y la de
transformación (actividad secundaria) de recursos hidrobiológicos que son
destinados tanto para el consumo humano directo (enlatado, fresco o
congelado), e industrial (principalmente a través de la harina y aceite de
pescado)17,18.
En tiempos recientes, las diferentes instituciones nacionales y privadas de

diferentes países, impulsan la investigación y de la misma manera a las
empresas del sector pesquero a iniciar el aprovechamiento de los subproductos
generados en la actividad pesquera, de esta forma se le otorga valor agregado
y por consiguiente, aumentar la rentabilidad de las mismas, ya que a través de
los diferentes procesos de producción se generan grandes cantidades de
subproductos, los cuales son idóneos para aprovechamiento con un adecuado
tratamiento. Algunos de estos subproductos generados, pueden ser las cabezas
de pescado que se desechan cuando se desea sólo el músculo, también como
resultado del fileteo se desechan las colas, pieles, espinas y vísceras 19,27.
Una de las primeras formas de revalorizar los subproductos de la pesca fue

mediante la elaboración de harina de pescado, pero en la actualidad existen
novedosas y potenciales formas, en la cual el producto final derivado de los
subproductos tiene un alto valor bioactivo, es decir, tiene una actividad biológica,
que ejerce un beneficio al organismo, como por ejemplo los hidrolizados
proteicos, así mismo tenemos otros usos como la obtención de colágeno, ácidos
grasos, quitosano, condroitín sulfato, ácido hialurónico y escualeno, todos los
usos que se han propuestos hasta ahora, derivan del conocimiento científico
actual que aportan con investigaciones en esta área con la finalidad de reducir
los desperdicios y contaminación generada por éstos19,27.
9
Figura 1. Subproductos del pescado y sus diversos usos potenciales27.
3.1.1. Situación de la actividad pesquera a nivel mundial y

generación de subproductos
Podemos resaltar un aumento de la producción de las capturas en aguas
marinas, ya que en el 2014 fue de 81,5 millones de toneladas, lo que refiere un
incremento ligeramente notable contrastando con los dos últimos años previos
al 2017 19,20. En cuanto al uso, la mayor cantidad va dirigida al consumo humano
directo, seguido por la transformación a harina de pescado que va aumentando
debido a la obtención a partir de subproductos de pescado, que anteriormente
se desechaba, de esta manera, en los últimos años varios países están
aprovechando de forma más eficiente, inocua e higiénica los subproductos para
la elaboración de hamburguesas, gelatina, salsas, biodiesel o biogás, productos
dietéticos (quitosano), productos farmacéuticos (incluidos los aceites),
pigmentos naturales (tras la extracción) y cosméticos (colágeno) y en otros
procesos industriales19,20.
Sin embargo, no todo es beneficioso para la población, dado que existen

desventajas en cuanto a la extracción de las especies marinas por sobre captura
de recursos, destrucción del hábitat y los descartes de la actividad pesquera,
referida a los residuos y peces que vuelven a arrojarse al agua 19,20. Existe
estimaciones de 1994 que el descarte marino anual era de 27 millones de
toneladas, sin embargo, se evidencia una reducción al 2014 de los descartes
10
como subproductos a nivel mundial ascendían a 7.3 millones de toneladas, cifra
que nos incita a mejorar la utilización del recurso marino, como se está
realizando en los últimos años gracias a la implementación de la tecnología19,20.
3.1.2. Situación de la actividad pesquera en Perú y subproductos

generados
En años recientes se ha reportado que aproximadamente el 50% de la cantidad

de peces extraídos y también de producción de harina proviene de la región del
norte (de Piura a Ancash), así mismo, en la región del centro que comprende
Lima e Ica se produce el 35%, por último, en la región sur entre Arequipa y
Moquegua se produce el 15%18,21.
La labor pesquera en nuestro país está sustentada en la extracción de los

recursos marinos más comerciales nacionales e internacionales, las especies
que principalmente sostienen esta actividad son la anchoveta (Engraulis
ringens), el jurel (Trachurus murphyi) y la caballa (Scomber japonicus), pero
también en los últimos años ha despertado el gran interés por la extracción de
otras especies marinas las cuales se exportan en grandes cantidades y
aceptadas a nivel internacional como es la pota (Dosidicus gigas), y en menor
escala el dorado o perico (Coryphaena hippurus), entre otros18,21,22,23.
Así mismo, hace algunos años en el Perú, los residuos generados por las
industrias pesqueras son tratados para el aprovechamiento en la alimentación
animal mediante la fermentación con bacterias lácticas, obteniendo así un
producto con altas propiedades nutritivas, llamados los ensilados biológicos,
éstos se caracterizan por su cualidad antimicrobiana ejerciendo su acción contra
bacterias patógenas y putrefactiva, por lo que se considera un sustituto de la
harina de pescado reduciendo el costo de la alimentación en los animales 21,22.
3.2. Descripción de la especie marina
La especie Sarda chiliensis chiliensis a la que conocemos comúnmente como

“Bonito” se ha logrado mantener como uno de los principales recursos
ictiológicos de nuestro país. Las características resaltantes se deben a su cuerpo
11
de forma alargada, cabeza de gran dimensión de forma puntiaguda y su tronco
cubierto de forma parcial por escamas muy pequeñas. En cuanto a su coloración
es azul acero degradándose hasta llegar a una coloración gris plateada en las
partes inferiores de su cuerpo24,25,26. Esta especie está clasificada como un
pescado azul por contener gran cantidad de grasas sobre todo poliinsaturadas:
Omega 3, ácido oleico y ácido linoleico. Los lugares de pesca donde se extrae
la mayor cantidad de bonito son Piura, Lambayeque, Lima, Ica y Arequipa. Se
estiman datos del año 2014 donde se reporta que en la capital se desembarcó
7600 toneladas métricas (TM) de esta especie, así mismo en Ica 6400 TM,
siguiendo Piura con 6200 TM desembarcadas, en Lambayeque 3900 TM y
Arequipa con 3400 TM, entre otras ciudades24,25,26.
3.3. Colágeno
Es una de las proteínas estructurales más abundantes en el organismo de los

animales vertebrados, así por ejemplo en el ser humano esta proteína constituye
un tercio de la proteína total, ello debido a que es un componente comúnmente
encontrado en la matriz extracelular, siendo así la principal proteína de los
diferentes tipos de tejido conectivo y está presente en diferentes partes del
organismo vivo, como en la piel, huesos, tendones, cartílagos, vasos
sanguíneos, dientes, cornea, entre otras27,28 .
Esta proteína es sintetizada por los fibroblastos, que son células de tejido
conectivo propiamente dicho, además se caracteriza por ser una proteína
insoluble en agua y por poseer una estructura fibrosa. Además, muchas
investigaciones en vertebrados nos reportan la identificación de hasta veintiocho
tipos de colágeno, con variaciones entre estos tipos debido a la diferencia en la
composición de por lo menos 46 cadenas polipeptídicas desiguales 28,29.
3.3.1. Estructura del colágeno
Esta proteína está compuesta por tres cadenas polipeptídicas levógiras,

dispuestas en forma paralela, en una conformación tipo helicoidal a las que se
les denomina cadenas α, estas cadenas se enrollan una sobre otra, unidas por
el enlace puente de hidrógeno de tal manera que forman una triple superhélice
12
de orientación dextrógira que tiene una alta resistencia a algunas proteasas
(pepsina, tripsina y quimotripsina), pero puede ser degradada por enzimas
colagenasas específicas28,29,30.
Un análisis más detallado de cada una de las tres cadenas polipeptídicas que
conforman la triple superhélice (tropocolágeno), nos sugiere que en su estructura
el tercer residuo es el aminoácido glicina (Gly), de acuerdo a la representación
X-Y-Gly, ya que esta secuencia es regular y periódica en cada una de dichas
cadenas, en la cual X y Y aluden a cualquier aminoácido; sin embargo, las
investigaciones reportan que el triplete más encontrado en la proteína
colagenosa es Pro-Hyp-Gly, cabe señalar que esta disposición es frecuente en
todos los tipos de colágeno, lo que resulta en la composición de aminoácidos de
la proteína colagenosa sea singular: glicina (33%), prolina (12-20%) e
hidroxiprolina(10%) entre otros aminoácidos en menor porcentaje28,29,30.
Figura 2. Descripción general de la

triple hélice de colágeno. (A) la
primera estructura de alta resolución
cristalina de una triple hélice de
colágeno, formado a partir de
(ProHypGly)4-(ProHypAla)-
(ProHypGly)5. (B) Observe el eje de
una hélice triple (ProProGly)10. (C)
segmento de triple hélice de colágeno
que destaca el escalonamiento de
enlaces de hidrógeno entre hebras.
(D) Escalonamiento de las tres hebras
en el segmento en el panel C 28.
3.3.2. Tipos de colágeno

Tres cadenas polipeptídicas que, entre sus diferentes tipos, se unen para
conformar el tropocolágeno, definirán el tipo de colágeno que se origina por
combinación de las ya mencionadas 46 cadenas variables, por lo tanto, los hasta
ahora 28 tipos de colágeno, pueden constituirse por la unión triple de 1 o más
tipos de cadenas polipeptídicas, así pues, debido a la variedad de cadenas
13
polipeptídicas, los tipos de colágenos pueden llegar a ser muy complejos y de
estructura diversa, debido a sus variantes de empalme, la posibilidad de que
hayan dominios adicionales de tipo no helicoidal, por su ensamblado, entre
otras27,28. El colágeno tipo I se conforma por dos cadenas α1(I) y la tercera
cadena viene a ser α2(I), por otro lado, el colágeno tipo II tiene tres cadenas
α1(II) iguales, caso similar es el del colágeno tipo III con tres cadenas α1(III)
iguales, pero el colágeno tipo IV está conformado por dos cadenas iguales α1(IV)
más una cadena α2(IV). De este modo, la familia de la proteína colagenosa se
subdivide en diferentes tipos según la función que adopta: así tenemos a los
colágenos fibrilares o formadores de fibrillas (tipos I,II,III,V,XI,XXIV y XXVII) que
son los más abundantes por estar presente en las estructuras óseas y en la
matriz fibrilar de los cartílagos articulares, los colágenos de membrana basal (tipo
IV) cuya triple hélice se caracteriza por ser muy flexible, los colágenos asociados
a fibrillas con triple hélices interrumpidas (colágenos FACIT, tipos IX, XII, XIV,
XVI, XIX, XX y XXI) que se asocian como moléculas individuales con fibrillas de
colágeno grande, los colágenos de cadena corta (tipos VIII y X) forman redes
hexagonales, los de anclaje de colágeno fibrilar o fibrillas de anclaje (tipo VII),
multiplexos (tipos XV y XVIII), los colágenos asociados a la membrana con triple
hélice interrumpidas (colágenos MACIT, tipos XIII,XVII,XXIII y XXV), el colágeno
tipo VI microfibrilar con enlaces cruzados altamente disulfuros, entre otros de
función única27,28,29. Cuando las 3 cadenas que forman el tropocolágeno son
semejantes darán origen a un colágeno homotrímero como los tipos: II, III, VII,
VIII, X; sin embargo, si la triple hélice está formada por dos o más cadenas
diferentes, dará lugar al colágeno heterotrímero, como son los tipos I, IV, V, VI,
IX y XI. Por otra parte, el colágeno tipo I se erige como el de mayor demanda por
las diferentes industrias, que, en los últimos tiempos la fuente que presenta gran
expectativa se ha enfocado en los peces27,28,29,30.
3.4. Gelatina
La gelatina es un polipéptido que se obtiene por desintegración (hidrólisis) parcial

del colágeno extraído principalmente de pieles de ganado vacuno y cerdo, es
decir, se obtiene la gelatina mediante la ruptura de los enlaces que unen las
14
cadenas polipeptídicas de la súper hélice del colágeno, de esta manera se logra
el desenredo y disociación de dichas cadenas, tornando soluble a la gelatina que
en un primer momento era insoluble en agua en forma de colágeno29,31.
Es importante señalar que este biopolímero, obtenido por descomposición del

colágeno tiene innumerables aplicaciones industriales, en la industria alimentaria
es materia prima principal para la producción de golosinas (gelificadas) como
gomitas y jaleas. La ventaja que ofrece el uso de gelatina es por ser inodora,
insípida, fácilmente dispersable y se hidrata de manera rápida, entre otras. Otra
de sus aplicaciones industriales es en el área farmacéutica, donde se aprovecha
la propiedad de formación de películas, además es la materia prima principal
para la elaboración de las cápsulas duras y blandas31,32,33.
3.4.1. Gelatina obtenida de pescado
Durante muchos años se ha tenido como fuente de colágeno a las pieles de

ganado vacuno, huesos de ganado ovino y piel de porcino, pero no siempre es
aceptada, por ejemplo, la población musulmana y judía no acepta la gelatina
proveniente del ganado vacuno por motivos religiosos, además de estar
asociadas a enfermedades propias de los animales terrestres de los que se
obtiene comúnmente, por ejemplo, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).
Ante tal problemática, en los últimos años se ha tratado de encontrar fuentes
alternativas de gelatina, hallando que los subproductos (pieles, espinas y
escamas) del pescado son una fuente rica en proteína colagenosa31,32,33.
Esta alternativa, representa un excelente aprovechamiento de los subproductos

de la actividad pesquera, puesto que se utilizan los desechos como: piel, cabeza,
cola, entre otros, formados, por ejemplo, luego del fileteo del pescado u otra
aplicación que, al no ser aprovechados, se desechan y generan contaminación,
dado que representan un alto porcentaje del peso inicial del pescado27,31. Entre
las ventajas de la utilización de la gelatina de pescado tenemos que se extrae de
una fuente altamente renovable, libre de enfermedades propias de animales
terrestres y tiene el olor y sabor menos desagradable en comparación con la
gelatina extraída de las pieles de cerdo; sin embargo, la gran desventaja está en
15
que tiene la fuerza de gel ligeramente menor en comparación con las gelatinas
de origen vacuno, ovino y porcino27,31,32.
Se ha logrado recopilar trabajos actualizados de investigación a nivel mundial

donde se evidencia la importancia de la novedosa fuente de gelatina, la cual
deriva de la proteína colagenosa, por ejemplo en Brasil, De Souza R. et al.,
201132 lograron extraer gelatina a partir de las pieles de la cabeza de la especie
Cyprinus carpio, en EE.UU se pudo optimizar la extracción de gelatina a partir
de la piel de la especie de pescado Ictalurus punctatus Yang H. et al., 200731, un
estudio en India reporta la extracción de gelatina a partir de desechos (pieles y
huesos) de Oolithes ruber y Nemipterus japonicus Koli J. et al., 201333, en
Malasia se logró extraer gelatina a partir de los residuos (escamas y huesos) de
la especie Oreochromis niloticus Zakaria S. y Abu N., 201534, del mismo modo
un estudio publicado en Turquía obtuvo la extracción y posterior caracterización
fisicoquímica de la gelatina extraída de las pieles de dos especies de pescado
Perca fluviatilis y Sander volgensis por Thi C. et al., 201735, y Perú no ha sido
ajeno en esta área de investigación, así tenemos un estudio que logró extraer
colágeno a partir de los residuos del procesamiento industrial de la especie
Engraulis ringens Solari A. y Córdova J., 201536, así como también reportan que
la temperatura y el tiempo de extracción influyen en las propiedades de la
gelatina extraída a partir de la piel de Mustelus mento, Miano A. et al., 20142.
3.5. Hidrólisis
Dentro de las muchas definiciones que se tiene por este cambio químico,
podemos detallar que el proceso de hidrólisis se trata de una de las más grandes
reacciones químicas, en la cual el principal gestor de dicha reacción es la
molécula de agua. En esta transformación interviene una molécula inicial con
enlace covalente, que bajo la presencia de agua, reacciona con ésta, y como
resultado del proceso se obtiene la formación de un nuevo enlace covalente
entre el radical (OH-) del agua con un grupo que se forma de la ruptura del enlace
covalente de la molécula inicial, de esta manera podemos señalar a la hidrólisis
como reacción de desplazamiento de tipo nucleofílico, donde un nucleófilo (rico
en electrones) ataca a un átomo electrofílico (necesitado en electrones)37,38.
16
3.5.1. Hidrólisis enzimática
Este tipo de hidrólisis se diferencia de los demás debido a que implica la acción
de una proteína enzimática en el proceso hidrolítico. Una peculiaridad de la
hidrólisis enzimática es la formación del complejo enzima-sustrato [E-S] que está
referida a un estado de transición del proceso hidrolítico, luego de la formación
de este complejo, se lleva a cabo la reacción de hidrólisis, que al concluir se
obtiene un producto diferente al sustrato inicial además de recuperar la enzima
inalterada39,40.
La hidrólisis enzimática se aprovecha en la investigación, alimentación y

diversidad de industrias para transformar el sustrato inicial, y como resultado del
proceso hidrolítico se modifican las propiedades funcionales y nutritivas del
sustrato48. Debido a lo señalado la hidrólisis de tipo enzimática presenta ciertas
ventajas ante la hidrólisis química, por ejemplo, la selectividad por el centro de
reacción de su sustrato específico, acción hidrolítica con las condiciones
moderadas en cuanto a pH y temperatura del medio de reacción, no adición de
sustancias inherentes a la reacción (extrañas) y el sostenimiento del valor
nutritivo durante y posterior a la reacción de hidrólisis41.
Figura 3. Diagrama que representa la hidrólisis de tipo enzimática, nótese

la formación del complejo enzima-sustrato [E-S]42.
17
3.5.1.1. Hidrólisis enzimática de proteínas
Este subtipo de hidrólisis tiene como sustrato inicial una macromolécula proteica,
y como producto del proceso se logra conseguir la ruptura de los enlaces
peptídicos que presenta la proteína, por ende, se obtiene al final del proceso
péptidos de diferentes tamaños y aminoácidos libres en el medio de reacción;
sin embargo, es posible obtener estos productos a través de la hidrólisis química
ácida o alcalina de proteínas, pero con ciertas desventajas comparada con la
hidrólisis enzimática, ya que son muy dificultosas en el control del proceso,
además, simultáneamente con los productos de interés del proceso hidrolítico de
proteínas se generan toxinas, destrucción de aminoácidos libres, o de lo
contrario productos con valor nutricional nulo o exiguo 43,44. La hidrólisis
enzimática es el método más beneficioso para la obtención de péptidos de
cadena corta de composición definida y aminoácidos deseables, proyectados a
una medida ideal, productos de altísima calidad, por el control que se puede
ejercer en el proceso43,44,45.
Figura 4. Esquema que representa el proceso de hidrólisis enzimática 46.
18
El proceso hidrolítico enzimático de proteínas se lleva a cabo a través de una
serie de etapas secuenciadas de reacciones que involucran rupturas de enlaces.
Los productos se grafican como se muestra en la figura 5:
Proteínas Peptonas Aminoácidos
Proteosas Péptidos
Figura 5. Secuencia de la obtención de productos en la hidrólisis enzimática 42.
Podemos observar las especies intermedias de formación en el proceso,

diferenciándose una de otra en la propiedad de solubilidad, además de su
tamaño molecular medio (TM) aproximado para las especies intermedias, así
como de la relación nitrógeno amino/nitrógeno total (NA/NT) de las mismas,
caracterizadas en la tabla 1.
Tabla 1. Caracterización aproximada de las especies intermedias producidas en

la hidrólisis enzimática de proteínas41.
TM NA/NT
proteínas > 20000 < 0,01
proteosas 5000 - 10000 < 0,01
peptonas 1000 - 6000 0,1 - 0,5
péptidos 200 - 500 0,5 - 0,8
aminoácidos 75 - 200 0,8 - 0,9
3.5.1.1.1. Hidrolizados enzimáticos de colágeno o gelatina de

pescado
Cuando hacemos referencia a la hidrólisis de colágeno y gelatina, se pretende

dar a entender acerca de la descomposición o ruptura de los enlaces de la
proteína colagenosa integral o parcialmente hidrolizada (gelatina), consiguiendo
como resultado una cantidad considerable de péptidos de desigual tamaño. Para
la hidrólisis tanto de la gelatina como del colágeno, en los últimos tiempos,
19
diferentes investigaciones y empresas han dirigido su atención hacia una
hidrólisis de tipo enzimática a fin de lograr un proceso controlado, y de esta forma
obtener aminoácidos y péptidos de tamaño o peso molecular determinados y
deseados, pero a la vez se consigue péptidos de variado tamaño, tornando de
esta manera al producto de la hidrólisis con muchas ventajas respecto a la
proteína inicial, como por ejemplo, mejoras en cuanto a las propiedades
funcionales de viscosidad y solubilidad, así como también su biodisponibilidad,
que son considerablemente mejores comparados con la proteína sin hidrolizar.
No está de más aclarar que este tipo de reacción hidrolítica se caracteriza por
ser un proceso controlado en cuanto a las condiciones de pH, temperatura,
enzima sustrato, tiempo, entre otras, y que, sin el empleo de una enzima, el
proceso sería considerablemente lento o no factible. No obstante, no podemos
dejar de lado la especificidad de la enzima por el sustrato, para lo cual, el
colágeno como sustrato puede ser hidrolizado por numerosas enzimas (pepsina,
tripsina, quimotripsina y papaína)47,48,49,50.
Se ha notificado en numerosas investigaciones que la hidroxiprolina es un

aminoácido específico de la proteína colagenosa, además siendo el dipéptido
más común de encontrar tras su hidrólisis el conformado por Prolina-
Hidroxiprolina (Pro-Hpro)48.
3.6. Grado de hidrólisis
Es fundamental determinar el valor de (GH) en un proceso hidrolítico, debido a

que es un indicador confiable y muy definitivo del nivel de la reacción que se
lleva a cabo, puesto que se precisa la cuantificación de las rupturas de los
enlaces peptídicos de la proteína originaria. Este parámetro es muy importante
de determinar porque nos mide el grado o estado de la reacción química de
hidrólisis, ya que como resultado de este, se obtendrá cadenas peptídicas de
diferente tamaño o aminoácidos libres, los cuales influyen directamente en las
propiedades funcionales y nutricionales del producto, que tendrá un determinado
uso de acuerdo a lo obtenido; sin embargo, también se reporta que el %GH final
depende de las variables controladas en el proceso, entre las que más influyen
podemos citar al tiempo de reacción, temperatura, pH, entre otros factores
20
fisicoquímicos, además de la relación enzima-sustrato y del tipo de enzima a
emplear45,51,52.
Para el cálculo de este indicador, se utiliza la ecuación:
ℎ
GH = x %
ℎ� �
Donde GH: Grado de Hidrólisis, h: cantidad de enlaces peptídicos hidrolizados y
h total: cantidad de enlaces peptídicos totales en la muestra original55.
Si bien es cierto, a la fecha se ha desarrollado numerosos métodos para

cuantificar y determinar el GH, la elección del método depende de muchas
variables, por ejemplo, de la muestra hidrolizada, sensibilidad del método con la
muestra y equipos por emplear. De acuerdo con los diferentes estudios
realizados, las técnicas que frecuentemente podemos distinguir en las
investigaciones para determinar el %GH se justifican en tres principales razones
como la determinación de los grupos α-amino liberados, determinación del
nitrógeno soluble posterior a la precipitación de la proteína con ácido
tricloroacético (ATC), y, por último, valoración mediante potenciometría del
protón liberado por la escisión del enlace peptídico45,51,52,53,54.
3.6.1. Factores que afectan la hidrólisis enzimática.
En la actualidad, muchas investigaciones reportan información específica sobre

los factores que afectan las reacciones donde intervienen los catalizadores
enzimáticos, entre los que tenemos: pH, temperatura, tiempo, concentración
enzima/sustrato, entre otras; sin embargo, por la mayor influencia que generan,
dos se han estudiado a la fecha55,56:
- Temperatura, la mayoría de los catalizadores biológicos cumplen su óptimo

trabajo a temperatura ambiente o a temperatura fisiológica (37 °C) y de manera
constante, no obstante, existen excepciones y a la vez, evidencia científica in
vitro, los cuales reportan que a mayor temperatura (40 °C) mejora
considerablemente la actividad enzimática, pero al sobrepasar los niveles de
temperatura, la actividad enzimática disminuye debido a la desnaturalización55,57.
21
- pH, este factor es muy variable para cada enzima, puesto que depende del
medio donde se lleva a cabo la reacción enzimática, por ejemplo, las de tipo
citosólicas soportan una variación de pH entre 7-8, las de tipo lisosomal, ejercen
su acción a pH óptimo ácido, y enzimas como la pepsina, necesita de un pH
entre 1,5 – 2 para optimizar su actividad55,56.
3.7. Enzimas proteolíticas.
Estas enzimas pertenecen a la clase de las hidrolasas, consiguientemente, van

a ejercer su acción en el proceso de hidrólisis proteica, específicamente en los
enlaces de naturaleza peptídica. Como producto de su actividad en una reacción
catalítica va a liberar al medio, aminoácidos o péptidos de cadena más corta,
respecto a la molécula proteica inicial (sustrato). En cuanto a la clasificación de
las enzimas proteolíticas, podemos agruparlas según su especificidad por el sitio
de acción en dos clases, las primeras corresponden a las exopeptidasas, que
actúan sobre C- o N- terminal denominadas carboxipeptidasas y
aminopeptidasas respectivamente; sin embargo, algunos autores las agrupan
según el número de aminoácidos liberados como aminopeptidasas si libera un
aminoácido, dipeptidilpeptidasa o dipeptidasa si libera un dipéptido y
tripeptidilpeptidasa si libera un tripéptido58,59,60.
Figura 6. Clases de enzimas proteolíticas de acuerdo al sitio de acción58.
22
La segunda son las endopeptidasas, ejerce su acción de hidrólisis en el enlace
peptídico que está contenido dentro de la estructura de las cadenas proteicas
pudiendo ser serinproteinasas, cisteinilproteinasas, aspartilproteinasas y
metaloproteinasas, según el residuo catalítico primario 58,59,60. Se han logrado
aislar del ser humano, animales, bacterias y de seres no vivos como los virus.
Además, se han aprovechado en procesos industriales de alimentos,
detergentes, cuero, fotográfica, así como también en la investigación y en la
salud a través de la industria farmacéutica61,62.
Tabla 2. Enzimas proteolíticas, clasificadas de acuerdo a su sitio de acción. Las

flechas señalan los sitios de escisión61.
Enzima Fuente Sitio de escisión
principal
Endopeptidasas
Serin proteasas
Tripsina bovino -Arg o Lys↓no específico-
Quimotripsina bovino -Trp (or Phe, Leu, Tyr) ↓ no específico-
Enteroquinasa bovino Asp-Asp-Asp-Lys↓ no específico-
Elastasa porcino -Ala (or Gly or Val) ↓ no específico-
Subtilisina microbiano -Trp (or Tyr, Phe, Leu) ↓ no específico-
Cistein proteasas
Bromelina planta - no específico↓ no específico-
Papaína planta -Arg (o Lys) ↓ no específico-
Ficina planta - no específico↓ no específico-
TEV protease E. coli específico para -Gln-Asn-Leu-Tyr-Phe-
Gln↓Gly-
TVMV protease E. coli específico para -Glu-Thr-Val-Arg-Phe-
Gln↓Ser-
Metaloproteasas
Termolisina microbiano -Leu (o Phe) ↓Leu (o Phe, Val, Met, Ala,
Ile)-
Colagenasa microbiano -Pro-neutro↓Gly-Pro-
Aspartil proteasas
Pepsina porcino -Phe (o Tyr, Leu, Trp) ↓Trp (o Phe, Tyr,
Leu)-
Catepsina D bovino -Phe (o Leu) ↓ no específico (no Val, Ala)-
23
Exopeptidasas
Serin proteasas
Carboxipeptidasa Y levadura - no específico ↓ no específico
Cistein proteasas
Catepsina C bovino retira N-terminal dipéptido
Metaloproteasas
Carboxipeptidasa A bovino -no específico↓aromático o ramificado
preferido
Carboxipeptidasa B porcino específico para C-terminal Arg o Lys
3.7.1. Enzima alcalasa
Aislada de la bacteria Bacillus subtilis, de donde viene su denominación como

Subtilisina Carlsberg, pertenece a la clase de las endoproteasas,
específicamente se trata de una serinproteasa con clasificación E.C 3.4.21.62, y
en la actualidad la preparación de esta enzima se obtiene en cantidades
industriales a partir de la bacteria Bacillus licheniformis, cuya producción está a
cargo de la empresa Novozymes®63.
Está conformada con un intervalo de 268 – 275 residuos aminoacídicos y la

característica principal es que posee una estructura de nivel terciario, compuesta
por siete hojas β plegadas dispuestas en forma paralela, las mimas que están
envueltas por nueve α hélices y, por último, dos hojas tipo β plegada en dirección
antiparalela63,64.
Esta enzima tiene un mecanismo de acción muy similar entre las de su categoría,
cuyos residuos catalíticos son Asp, His y Ser, las cuales varían en su posición.
Se ha logrado conocer por investigaciones que tolera variaciones de pH entre 6
– 12, por lo que se trata de una enzima que tiene actividad en medios alcalinos,
y en cuanto a la temperatura, tolera variaciones entre 30 – 80 °C, reportando
diferencias en su actividad, por lo que hace que esta enzima sea utilizada en
diversos procesos debido a su gran adaptabilidad al medio de reacción 62-66.
Además, se ha conseguido el beneficio en campos de mayor utilidad como en la
industria alimentaria de los lácteos, cárnicos y vegetales como, mejorando
24
propiedades funcionales como la solubilidad, mejora del sabor, viscosidad y
también propiedades nutricionales, a la vez la industria del medio ambiente
obtuvo beneficio al ser empleada para el tratamiento de aguas residuales,
también es empleada en la industria textil, además del ya conocido empleo en
las diversas investigaciones62-66.
3.8. Actividad biológica de hidrolizados enzimáticos de proteínas
Se ha puesto en evidencia, gracias a las investigaciones, sobre la actividad

biológica que cumplen los hidrolizados que derivan de moléculas proteicas de
fuente animal y vegetal. A través de la hidrólisis química o enzimática y también
por fermentación microbiana, se logra obtener como resultado del proceso
hidrolítico péptidos de cadena más corta, hasta incluso algunos aminoácidos
libres en el medio de reacción, esto depende de muchos factores como por
ejemplo la enzima utilizada, el tiempo de reacción y entre otras condiciones
fisicoquímicas; sin embargo, con la hidrólisis enzimática de proteínas se ha
logrado obtener productos que demuestran propiedades biológicas que
prometen un gran beneficio para la salud67,68.
Se ha logrado agrupar e identificar los hidrolizados según el %GH y sus

respectivas propiedades69:
a. Hidrolizados con bajo grado de hidrólisis (1-10%). A través de este

tipo de hidrolizados se logra mejorar las propiedades funcionales de la
proteína inicial, como por ejemplo aumento de la solubilidad y de los
poderes emulsificante y espumante, utilizados cada uno de ellos según
las necesidades debido a los beneficios que ofrece al aumentar dichas
propiedades mencionadas69.
b. Hidrolizados con alto grado de hidrólisis (mayor al 10%). Con la
obtención de este tipo de hidrolizados se busca que el producto del
proceso hidrolítico obtenga mejoras en las propiedades nutricionales,
respecto a la proteína inicial. La característica principal es que los
péptidos logran mejor absorción gastrointestinal69.
25
Dentro de todas las propiedades biológicas reportadas a la fecha podemos
destacar la actividad antioxidante Bkhairia I. et al., 201670, antimicrobiana
Demers-Mathieu V. et al., 201371, inhibidora de la Enzima Convertidora de
Angiotensina-ECA Mirzaei M. et al., 201672, hipoglucémica Hsieh C. et al.,
201573, antitrombótica Yang W. et al., 200774 y la más visionaria entre todas que
corresponde a la actividad antitumoral Xue Z. et al., 201275, donde todas estas
se relacionan directamente con los péptidos y aminoácidos contenidos en el
hidrolizado proteico67,69.
PROTEÍNA HIDROLIZADA:
Mezcla de péptidos activos o inactivos y aminoácidos
Ingestión oral
Tracto gastrointestinal:
Modificación del perfil de péptidos
Absorción intestinal
Sistema Sistema Sistema Sistema

cardiovascular nervioso gastrointestinal inmunológico
Hipotensivo Agonista opioide Antimicrobiano

Antimicrobiano
Antioxidante Antagonista Inmunomodulador
Quelante de
Anticoagulante/ opioide minerales Citomodulador
Antitrombótico Antiapetitoso
Hipolipidémico Hipocolesterolémico
Figura 7. Actividades biológicas de los péptidos obtenidos como producto de la

hidrólisis enzimática de proteínas alimentarias67.
3.8.1. Actividad antioxidante
El organismo humano es de naturaleza aerobia, es decir, requiere al oxígeno

como una molécula indispensable para los procesos de reacción que se dan en
el organismo, conocidos como procesos metabólicos y necesario también para
la respiración, no obstante, luego de las reacciones en las que interviene, da
paso a la formación de sustancias intermedias de alta toxicidad para el
26
organismo, debido a que son muy reactivos con las moléculas orgánicas
estables, razón por la cual son denominados Especies Reactivas de Oxígeno
(EROs), entre ellas podemos destacar primero a los radicales libres como el ion
superóxido (O2.-), radical hidroxilo (.OH), alcoxilo (ROO.) y el óxido de nitrógeno,
y en segundo lugar, tenemos a los no radicales, conformados por peróxido de
hidrógeno (H2O2), oxígeno singlete (1O2) y peroxinitrito (ONOO-), que al
reaccionar con el hierro, cobre u otras EROs, dan lugar a los radicales libres67,76.
Tabla 3. Especies reactivas de oxígeno, donde se señalan en paréntesis los

radicales libres y no radicales77.
Compuestos (EROs) Características
–2
O (anión superóxido) Se forma en reacciones de autooxidación
HO2 (radical perhidroxi) Forma hidrogenada del anterior. Más liposoluble
No es un radical libre, pero tiene una acción
H2O2 (peróxido de hidrógeno)
oxidante
-
OH (radical hidroxilo) Es el radical libre más reactivo que se conoce
ROO- (radical peroxilo)
Si bien cierto, se ha citado que el organismo necesita a la molécula de oxígeno

como una sustancia vital, pero no todos los EROs se generan al interior del
organismo, específicamente en las células, es decir, de forma endógena, sino
también de manera exógena. Del primer origen se puede mencionar la formación
a través de los procesos bioquímicos como en la respiración celular, fagocitosis,
autooxidación de lípidos, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, ácidos
nucleicos y por la actividad enzimática76,77. En cuanto a la vía de formación
exógena tenemos por intoxicaciones en general, medicamentos, consumo de
tabaco, radiaciones, xenobióticos y el ozono, en síntesis, a través de todas estas
especies antes mencionadas son las vías para el origen de los radicales libres a
los cuales se les ha responsabilizado de desencadenar patologías degenerativas
como arterioesclerosis, artritis reumatoide, úlcera péptica, hipertensión,
Parkinson, Alzheimer, diabetes, en el peor de los casos dañar el ADN de las
células y por último, con mayor relación a los radicales libres, el
envejecimiento76,77.
27
Los antioxidantes son sustancias tanto de origen natural como sintetizadas
artificialmente que, en pequeñas concentraciones cumplen la acción de impedir
la transferencia de los electrones entre el radical libre y la molécula de fácil
oxidación. Los organismos vivos poseen diferentes mecanismos de defensa ante
los radicales libres clasificados de diferentes aspectos, según su función pueden
ser primarios o secundarios, la otra clasificación es según su síntesis, pudiendo
ser enzimático, producidos endógenamente o los no enzimático que,
generalmente son adquiridos mediante la alimentación como son los grupos de
los polifenoles, vitaminas, carotenoides, minerales, entre otros11,78,79.
Figura 8. Clasificación del sistema antioxidante79.
Se ha buscado a través de muchas investigaciones la inclusión de compuestos

generados por la hidrólisis de proteínas tanto de origen animal como vegetal, es
decir, de fuentes naturales, con el objetivo de inhibir la oxidación de estos tipos
de alimentos, previniendo de esta manera que los radicales libres, responsables
de la oxidación de las moléculas orgánicas y del estrés oxidativo, puedan ejercer
28
su acción degenerativa de las moléculas orgánicas. Ante esta situación, además
de la necesidad en la elaboración de alimentos y de los radicales libres presentes
en el organismo, hoy en día, cobra mayor valor e interés la identificación de
péptidos y aminoácidos presentes en los hidrolizados enzimáticos de proteínas,
tal y como se menciona en la investigación relacionada a la actividad antioxidante
de los hidrolizados de gelatina de pescado realizado por Kim S. et al., 200180.
Graszkiewicz A. et al., 201081 demostraron que el hidrolizado del huevo de donde
se separaron péptidos de pequeño tamaño presentaron actividad antioxidante,
así mismo, el estudio llevado a cabo por Peng X. et al., 200982 referente al
hidrolizado del suero leche en el cual se purificaron según el peso molecular los
péptidos obtenidos, los cuales demostraron tener propiedad antioxidante. Los
mecanismos por los cuales los hidrolizados de proteína de diversas fuentes
naturales demuestran actividad antioxidante, se debe a un conjunto de acciones,
por ejemplo, eliminando los radicales libres, quelando iones e incluso impidiendo
la peroxidación lipídica10,11,67,83.
3.8.2. Actividad antimicrobiana
En las últimas décadas las investigaciones van dirigidas, en su mayoría, a

descubrir nuevas fuentes de antibióticos, sobre todo de origen natural debido a
la resistencia microbiana que hoy en día se atraviesa con los antibióticos de
síntesis química, considerando que los antimicrobianos naturales no generan
toxicidad en el organismo. De todas las posibilidades de acuerdo a las
investigaciones recientes y que a la fecha aún continúan, resalta un área de
investigación que nos señala precisamente que, a partir de las proteínas de
fuente animal y vegetal, sometidas al proceso de hidrólisis enzimática, se pueden
obtener péptidos y aminoácidos con efecto antimicrobiano 71,84,85.
Jovanović J. et al., 201586 lograron demostrar que los péptidos obtenidos por
hidrólisis de la clara de huevo, aislados por ultrafiltración, tuvieron bioactividad
antimicrobiana contra algunos microrganismos gram-positivos, gram negativos e
incluso contra la levadura Candida albicans, también Beaulieu L. et al., 201387
en su estudio de investigación pudieron demostrar la actividad inhibidora del
crecimiento de bacterias gram-positivas y negativas a partir de fracciones
29
peptídicas del hidrolizados de subproductos de cangrejo, Ennaas N. et al., 201588
lograron aislar y caracterizar cuatro péptidos con propiedad antimicrobiana gram-
positiva y gram negativa, que fueron obtenidos a partir del hidrolizado de los
subproductos del pescado Scomber scombrus. Esta área de estudio se sitúa
como uno de las más recurridas por la necesidad de descubrir alternativas tanto
para la industria alimentaria como para la salud de la población 67,89,90.
Matsuzaki K., 199991 señala que los péptidos aumentan la permeabilidad de la

membrana plasmática bilipídica del organismo procariota debido a una
interacción muy dinámica, que logra desestabilizar dicho componente celular.
Por otro lado, en un estudio de revisión Mulero J. et al., 201189 señala también
otros posibles mecanismos de acción como es la provocación de la fagocitosis
al interactuar el péptido con la membrana, además al entrar en contacto con las
moléculas de ADN o ARN alterando la división celular y síntesis proteica
respectivamente67,89.
3.8.3. Otras actividades biológicas
Numerosas investigaciones hoy en día muestran gran interés por la búsqueda

de nuevos agentes con actividad biológica, direccionado hacia fuentes de origen
natural, en ese sentido, numerosos estudios lograron reportar otras actividades
biológicas, que poseen un gran avance y prospectiva, tal es caso de Wang Z. et
al., 201692 quienes demostraron la bioactividad antitumoral en células MCF-7
(células de cáncer de mama) y Hep G-2 (células de cáncer de hígado) con el
hidrolizado proteico del alga Arthrospira platensis, aislando fracciones peptídicas
y su posterior identificación, por su parte Kongo J. et al., 201193 pudieron
demostrar in vitro la actividad hipocolesterolémica con el hidrolizado enzimático
de la proteína desgrasada de maíz, por último, Kumrungsee T. et al., 201694
demostraron que los péptidos obtenidos del hidrolizado enzimáticos del germen
de trigo inhibieron indirectamente la calmodulina II dependiente de Ca 2+, por
inhibición de la proteína quinasa II, que interviene en la regulación de funciones
vasculares.
30
No podemos negar que en el campo de la investigación en cuanto a los
hidrolizados proteicos tornan un futuro de muchos retos promisorios en el área
farmacéutica y de los nutracéuticos por los amplios beneficios que ofrecen al
organismo, puesto que en la actualidad ya se incluyen en dietas y se
comercializan en diferentes países, siendo aceptadas por la población, tal es el
caso de Ameal® en Japón, Evolus® en Finlandia y Bio Zate® en USA, todos ellos,
integran a sus productos péptidos aislados de la hidrólisis enzimática que poseen
actividad biológica con la finalidad de mejorar o mantener la salud67,92,95.
31
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Materiales, equipos y reactivos
4.1.1. Materiales biológicos
• Muestra de pieles de pescado Bonito (Sarda chiliensis

chiliensis)
• Enzima alcalasa (proteasa de Bacillus licheniformis, Sigma-
Aldrich)
• Estándar de albúmina de suero bovino (BSA)
• Pseudomonas aeruginosa cepa clínica
• Bacillus subtilis cepa clínica
• Staphylococcus aureus cepa clínica
• Candida albicans cepa clínica
• Escherichia coli cepa clínica
4.1.2. Materiales
• Tubos de ensayo
• Beackers
• Matraces
• Bureta
• Pipetas.
• Pipetas Pasteur
• Aparato Microkjeldahl – Pirex (USA)
• Microplacas de poliestireno estériles
• Tubos ependorff
• Piceta
• Micropipeta multicanal de 10 – 100 µL – Eppendorf research
• Micropipeta 10 – 100 µL – Boeco
• Micropipeta 100 – 1000 µL – Boeco
• Placas petri
32
4.1.3. Equipos
• Espectrofotómetro UV-VIS - Agilent cary 8454

• Balanza analítica – Mettler (precisión de ± 0,0001g)
• Estufa universal UN30– MEMMERT
• Potenciómetro – SI Analytics – Lab. 850 (precisión ± 0,01 pH)
• Baño maría – Trade Raypa
• Congelador vertical
• Cabina de flujo laminar – Telstar (Clase II – EN12469-2000)
• Cocinilla eléctrica doble placa
4.1.4. Reactivos
• Sol. de NaCl al 5%
• Sol. NaOH 0,5N
• Sol. CH3COOH 0,5M
• Colorante azul brillante de Coomasie G-250
• Etanol al 95%
• Ácido fosfórico al 85% (w/v)
• Buffer fosfato de sodio pH=8, 10mM
• Buffer fosfato de sodio pH=7, 10mM
• Buffer Tris-Base / HCl pH=9, 10mM
• CuSO4·5H2O
• C4H4KNaO6·4H2O
• Agua destilada
• NaOH
• Na2S2O3.5H2O
• H3BO3 sol.sat.
• HCl 0.01N Estand.
• C6H4COOHCOOK
• H2SO4 Conc. (gravedad específica 1,84 libre de nitrógeno)
• K2SO4
• HgO
33
• Indicador: Sol. 2% rojo de metilo + Sol.2% verde de
bromocresol (1:5)
• Ácido tricloroacético (ATC) Sol. 20%
• 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH- Sigma-Aldrich®)
• CH4O (G.R.)
• Vitamina C (L-Ácido Ascórbico – Sigma-Aldrich®)
• 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt (ABTS- Sigma-Aldrich®)
• K2S2O8
• C2H5OH (Abs.)
• Caldo Mueller-Hinton (Merck)
• Resazurina (Sigma Aldrich®, USA)
• Agar Tripticasa de Soya
• Agua para Inyección
• Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico
(Trolox- Sigma Aldrich®)
34
4.2. Métodos y técnicas
4.2.1. Diagrama del procedimiento general de métodos de

experimentación para hidrolizados de gelatina
Recolección, transporte y almacenamiento de muestra:

residuos de pescado (pieles)
Colágeno parcialmente hidrolizado: gelatina
Obtención de hidrolizados enzimáticos de

gelatina
Ensayos fisicoquímicos Ensayos biológicos
Determinación del Ensayo de actividad Ensayos de actividad

grado de hidrólisis - antioxidante antimicrobiana
método de Biuret
Determinación del mediante el

grado de hidrólisis - mediante el método método de
método de micro- del radical (DPPH●) difusión en
Kjeldhal agar-pozo
mediante el
mediante el método
método de
del radical catiónico
microdilución /
(ABTS●+)
colorimétrico
Figura 9. Diagrama general de métodos de experimentación llevados a cabo con

los hidrolizados enzimáticos de la gelatina extraída de la piel de pescado.
35
4.2.2. Recolección, transporte y almacenamiento de la muestra
Consideraciones en la recolección de muestras:
- Se recolectaron los residuos de la actividad pesquera correspondiente a las

pieles de la especie Sarda Chiliensis Chiliensis (Bonito), el peso total de
muestra fue 1,820 Kg., cabe señalar que las pieles tenían adheridas restos de
tejido muscular, propias de la especie en referencia, luego de retirar los restos
el peso neto de la muestra colectada fue de 1,150 Kg.
- Lugar y fecha de recolección: la recolección se llevó a cabo en el Terminal

Pesquero de Ventanilla, ubicado en la Av. Nestor Gambetta 6311, Provincia
Constitucional del Callao, durante el mes de diciembre del año 2016 y en el
horario de 4:30 am – 7:00 am.
- Almacenamiento y transporte: las muestras colectadas se almacenaron en un
cooler, provisto de gel refrigerante, con la finalidad de mantener la temperatura
entre (-2 a 8°C). La cantidad de muestra total se transportó en las mismas
condiciones señaladas, hasta llegar al laboratorio de Bioquímica en el 3er piso
del Departamento de Bioquímica, donde finalmente se almacenó la muestra a
-20°C hasta su uso.
Transporte
•Muestra (pieles de •Temperatura de
pescado "bonito") almacenamento
•Temperatura en el (-20°C)
•Peso aprox. (> transporte (-2 a
1Kg.) 8°C)
Recolección Almacenamiento
Figura 10. Diagrama de flujo de los procesos de recolección, transporte y

almacenamiento de la muestra problema.
36
4.2.3. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno
La metodología de referencia para obtener gelatina a partir del colágeno de las

pieles de pescado de la especie ya mencionada anteriormente fue la descrita en
la patente desarrollada por Gómez-Guillén y Montero, 200196, con algunas
modificaciones en adaptación a nuestra investigación, detallada en las etapas
siguientes:
4.2.3.1. Descongelación, limpieza y pesaje de la muestra
La muestra recolectada, almacenada a (-20°C), se descongeló a temperatura

ambiente hasta lograr el estado natural de la muestra de consistencia blanda, de
inmediato se retiró manualmente y con ayuda de agua destilada los restos de
músculos flotantes y otras sobras, el peso final de la muestra limpia fue de
1,150Kg.
4.2.3.2. Reducción de tamaño y lavado
Las muestras obtenidas del paso anterior se cortaron en trozos de

aproximadamente 1 x 1 cm., posteriormente los trozos se lavaron con solución
de cloruro de sodio al 5%, con una fuerte agitación durante un tiempo de 30
minutos a una temperatura de 10°C., considerando la relación de peso de la piel:
volumen de solución de 1:10 (p:v).
4.2.3.3. Hidrólisis en medio básico
La muestra previamente lavada en la etapa anterior se trató con una solución de

NaOH 0,5N con las condiciones de temperatura de 30 °C, por un tiempo continuo
de 10 horas, con una relación de peso de la piel:volumen de solución de NaOH
0,5N de 1:10 (p:v), con agitación moderada, la finalidad de esta etapa es
conseguir eliminar la mayor cantidad de proteínas distintas al colágeno y grasa
que está adherida a la piel del pescado, dicha eliminación se extiende como
semisólidos en el sobrenadante.
37
4.2.3.4. Lavado
Con la finalidad de eliminar todo el sobrenadante por hidrólisis de la etapa

anterior, se lavaron los trozos de piel con abundante agua destilada a
condiciones de temperatura ambiente y tiempo 10 minutos.
4.2.3.5. Solubilización de colágeno y tratamiento térmico para la

obtención de gelatina
En esta etapa el colágeno presente en la matriz de la piel trozada del pescado

se solubilizó en medio ácido y a la vez por acción de la temperatura pasó a
gelatina, para obtener lo señalado los trozos de 1 x 1 cm. se trataron con agua
destilada ajustando a pH=5 con ácido acético 0,5M en baño maría a una
temperatura entre 60-70 °C por un tiempo de 4 – 6 horas, con una relación peso
piel:volumen de agua destilada pH=5 de 1:10 (p:v) y con agitación moderada.
Trabajar bajo estas condiciones, garantizó una alta solubilidad del colágeno y
luego del tiempo señalado, obtener la gelatina disuelta en la solución en baño
maría.
4.2.3.6. Filtración
La solución obtenida del paso anterior se filtró con la ayuda de un tamiz, a la

vez se colecta la solución en beackers de gran volumen (3L), la finalidad de esta
etapa fue lograr la aclaración de la solución y retener las partículas generadas
en la agitación anterior.
4.2.3.7. Congelación
En esta etapa se congeló la solución obtenida del paso 6 en bandejas de gran

extensión a condiciones de -20 °C por un tiempo continuo de 24 horas, la
finalidad de este paso es eliminar el exceso de agua.
4.2.3.8. Descongelación y secado
El producto que se obtuvo del proceso anterior se descongeló a temperatura

ambiente, formándose de esta manera bloques de gelatina coagulada y exceso
38
de agua líquida que se eliminó por decantación, inmediatamente se colocaron
los bloques en placas petri de gran tamaño y bandejas extensas para el secado
en la estufa de circulación de aire forzado a temperatura de 50 °C y por un tiempo
de 12 horas.
4.2.3.9. Raspado y almacenamiento
Como producto del paso anterior se generó láminas secas de color amarillento
adheridas a la superficie de las placas petri de gran tamaño y bandejas, dichas
láminas fueron raspadas y almacenadas inmediatamente en tubos de polietileno
a temperatura ambiente y de forma hermética, de esta forma se logró extraer la
gelatina, con la cual se realizó los ensayos posteriores, siendo conservada hasta
su posterior uso.
Al término del proceso de extracción de gelatina a partir de los residuos

correspondientes a las pieles de pescado, se calculó el rendimiento de la
extracción haciendo uso de la ecuación propuesta por Thi C. et al., 201735:
Peso seco de la gelatina g

� � � � % = x %
Peso de la muestra inicial piel g
En la figura 11 se representa el proceso para obtención de gelatina por hidrólisis

parcial del colágeno presente en los residuos de la actividad pesquera,
correspondiente a las pieles del pescado “Bonito”.
39
• T° ambiente.
DESCONGELACIÓN, LIMPIEZA Y • Pesar 1 Kg. de
PESAJE DE LA MUESTRA muestra.
• Cortar las pieles en

• Tiempo 30 min
trozos de 1 x 1 cm., y REDUCCIÓN DE TAMAÑO Y • T°= 10°C
lavar con Sol. NaCl al
5%.
LAVADO • Relación 1:10 (p:v)
• Tratamiento de la • T°= 30°C

muestra con NaOH HIDRÓLISIS EN MEDIO BÁSICO • Tiempo 10 horas.
0.5N. • Relación 1:10 (p:v)
•
• Lavar con agua • T° ambiente.

destilada. LAVADO • Tiempo 10 min.
• Baño María a T°= (60-

• Tratamiento con agua SOLUBILIZACIÓN DEL 70 °C)
destilada, ajustando el COLÁGENO Y TRATAMIENTO • Tiempo 4-6 horas
pH=5 con ácido TÉRMICO PARA EXTRACCIÓN • Relación 1:10 (p:v)
acético 0.5M.
DE GELATINA •
FILTRACIÓN
• T°= -20°C
CONGELACIÓN • Tiempo 24 horas.
• Descongelación= T° • Secado a T°= 50°C.

ambiente.
DESCONGELACIÓN Y SECADO
• Tiempo 12 horas.
• Registrar el peso del

• Raspar las láminar RASPADO Y raspado.
secas y almacenar ALMACENAMIENTO • Calcular el
herméticamente. rendimiento.
Figura 11. Esquema para la obtención de gelatina de la piel de pescado.
40
4.2.4. Cuantificación de proteína total mediante el método de
Bradford
El componente básico del reactivo de Bradford, el colorante Azul Brillante de

Coomassie-G250, se une a las proteínas, este reactivo en solución es de pH
ácido, con una máxima absorbancia a 465 nm., al producirse la unión entre el
colorante del reactivo en solución con la proteína, ocurre un cambio de
coloración, por ende, un cambio máximo en la absorbancia a 595 nm., longitud
de onda a la cual nos proporcionará la cantidad de proteína total en nuestra
muestra97,98.
Para la cuantificación de proteína total de la muestra que corresponde a la

gelatina extraída de la piel de pescado, se realizó una curva de calibración, en
la que se utilizó como estándar a la proteína albúmina sérica bovina (BSA). Para
ello se mezcló en tubos de ensayo 10 µL de las diluciones del estándar o muestra
problema resuspendida (2,5 %) (w/w) o diluciones, con 500 µL del reactivo de
Bradford, así mismo detallamos que se utilizó como blanco la lectura del agua
destilada, empleada para las diluciones del estándar y de la muestra. Luego de
una agitación moderada por 1 min. a cada tubo de reacción se dejó reposar en
una zona oscura, protegida de la luz a temperatura ambiente por 4 minutos,
pasado el tiempo se procedió a la lectura al espectrofotómetro a 595 nm. Es
importante señalar que la curva de calibración fue elaborada con el rango de
concentraciones de BSA entre 250-750 µg/mL, tal como se demuestra en el
anexo 297,98.
Luego de la elaboración de la curva de calibración y lectura de la muestra por

triplicado, se procede a calcular la cantidad de proteína por interpolación de la
lectura de la muestra en la curva correspondiente (Anexo 2), obteniendo la
ecuación97,98:
Proteína (µg BSA/mL) = (Abs 5λ5 nm – 0,004) / 0,0006

R2 = 0,9966
41
4.2.5. Hidrólisis enzimática y análisis de los factores que influyen en
el proceso
El procedimiento a seguir para el proceso de hidrólisis de tipo enzimático de la

gelatina obtenida a partir de las pieles de Sarda Chiliensis Chiliensis (Bonito),
fue de acuerdo al método propuesto por Gómez-Guillén, 20106, para lo cual se
empleó la enzima comercial alcalasa (proteasa de Bacillus licheniformis, Sigma-
Aldrich) y se planteó las condiciones para la realizar el análisis de los factores
que influyen en el proceso hidrolítico enzimático, las condiciones a las que se
experimentó el proceso hidrolítico fueron pH, temperatura, tiempo y relación
[enzima]:[sustrato]. Para evaluar la significancia de dichos factores se analizó
bajo el diseño factorial tipo Plackett-Burman con punto central por triplicado, un
nivel de significancia de p<0,05, logrando un total de 15 ensayos en combinación
de las variables.
De esta manera, primero se determinó la cantidad (g/mL) de enzima contenida

en la solución de alcalasa, utilizando la curva de calibración del estándar de
proteína albúmina sérica bovina (BSA) con la que se cuantificó la proteína total
de la muestra. Luego se disolvió la gelatina en los buffer correspondientes al
tampón fosfato pH=7 (10mM), tampón fosfato pH=8 (10mM) y tampón Tris-
Base/HCl pH=9 (10mM) en relación (2,5% w/w), seguidamente se añade la
enzima alcalasa en la relación [enzima]:[sustrato] [1:20], [1:35] y [1:50],
inmediatamente cada muestra de hidrolisis se somete a temperaturas de 50, 60
y 70°C, por último, los tiempos de hidrólisis fueron 2, 3 y 4 horas, las condiciones
señaladas para las muestra a hidrolizar están de acuerdo al diseño factorial
señalado. Cabe señalar que el pH inicial de cada muestra se mantuvo constante
durante todo el proceso de hidrólisis con la adición de gotas de ácido cítrico 0,1N
o hidróxido de sodio 0,1N. Concluido el tiempo, la enzima se inactivó por
calentamiento de la mezcla a 90 ºC durante 10 min y centrifugación a 3800 rpm
durante 15 min a 4 ºC, almacenando el sobrenadante a -20°C, hasta su posterior
análisis. En tabla 4 se detallan condiciones de hidrólisis para cada muestra.
42
Tabla 4. Factores de hidrólisis enzimática de acuerdo al diseño factorial tipo
Plackett-Burman con punto central por triplicado.
ALCALASA
CONDICIONES Relación
Temperatura Tiempo de
pH [enzima]:[sustrato]
(°C) hidrólisis (h)
MUESTRA [w:w]
H601 60 8 3 [1/35]
H602 60 8 3 [1/35]
H603 60 8 3 [1/35]
H504 50 7 2 [1/50]
H505 50 9 2 [1/20]
H506 50 9 4 [1/50]
H507 50 9 4 [1/20]
H508 50 7 2 [1/20]
H509 50 7 4 [1/50]
H7010 70 7 4 [1/50]
H7011 70 9 2 [1/50]
H7012 70 7 2 [1/20]
H7013 70 9 4 [1/20]
H7014 70 7 4 [1/20]
H7015 70 9 2 [1/50]
4.2.6. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de

proteína soluble mediante el método de Biuret
Se determinó el GH por cuantificación de proteína soluble con el reactivo de

Biuret, de acuerdo al procedimiento descrito por Betty M. et al. 201499 con ligeras
modificaciones señaladas por Wangtueai S. et al. 2016100, según las cuales se
logra el %GH en relación a la proteína soluble presente en la muestra luego del
proceso hidrolítico tratada con ATC al 10% en proporción con la proteína total de
la muestra. Para el referido procedimiento se mezclaron volúmenes iguales de
cada hidrolizado con ATC al 20%, con agitación moderada por 5 min,
posteriormente y se centrifugó a 10 000 rpm por un tiempo de 15 minutos. Se
43
analizó el sobrenadante traslúcido para determinar el contenido de proteína
soluble empleando el método de Biuret. Del mismo modo se determinó mediante
este método, la cantidad de proteína total en cada hidrolizado y en las tres
muestras sin hidrolizar en sus tampones correspondientes, previamente se
elaboró una curva de calibración con el estándar BSA (Anexo 3).
Se calculó el grado de hidrólisis de cada muestra de acuerdo a la fórmula99:
Proteína soluble en ATC al % en la muestra hidrolizada mg

% = x %
Proteína total en la muestra mg
• Mezclar 1 mL de
• Cuantificar la
muestra + 1 mL ATC Obtención del proteína soluble
al 20 % sobrenadante mediante el método
• Agitar de Biuret al
moderadamente por espectrofotómetro.
5 min. • Meticulosamente
almacenar el • Cálculo del Grado de
• Centrifugar a 10 000 Hidrólisis de cada
rpm por 15 min. sobrenadante en
tubos limpios. muestra.
Tratamiento de las Cuantificación de
muestras con ATC proteína soluble y
al 20 % cáculo del %GH
Figura 12. Esquema para la obtención del grado de hidrólisis (%GH).
4.2.7. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del

nitrógeno soluble mediante el método de micro-Kjeldahl
Para esta determinación se procedió según las metodologías empleadas en las

investigaciones de Kim S. et al., 1990101 y Hoyle N. and Merritt J., 1994102 las
cuales hacen uso del método de obtención del nitrógeno soluble en ATC al 10%
seguido por la técnica de micro-Kjeldahl o Kjeldahl AOAC, 1980103 para la
cuantificación de nitrógeno soluble tanto en las muestras hidrolizadas como en
las muestras sin hidrolizar. Relacionando de esta manera el grado de hidrólisis
parcial obtenido, a las que se adiciona algunas modificaciones señaladas por Qi
M. et al., 1997104.
44
• Mezclar 2 mL de
muestra + 2 mL Obtención del
ATC al 20 % sobrenadante • Tomar el volumen
• Agitar equivalente a 25 mg
moderadamente por de muestra seca
5 min. contenida en cada
• Meticulosamente sobrenadante, para
• Centrifugar a 10 almacenar el
000 rpm por 15 min. cuantificar el
sobrenadante en nitrógeno soluble por
tubos limpios. micro-Kjeldhal.
Tratamiento de las
muestras con ATC
al 20 % Cuantificación de
nitrógeno soluble
Figura 13. Esquema para la obtención del nitrógeno soluble en ATC al 10%, en
las muestras hidrolizadas.
• Preparar las muestras Cálculo de la

de gelatina sin cantidad de muestra • Tomar el volumen
hidrolizar en sus calculado para
respectivos tampones • Calcular en volumen cuantificar el
de pH=7, pH=8 y la cantidad nitrógeno total por el
pH=9 en relación de equivalente a 25mg método de micro-
2.5% (w/w) de muestra seca Kjeldhal.
diluida en el buffer
Preparación de las correspondiente.
Cuantificación de
muestras sin
nitrógeno total
hidrolisis
Figura 14. Esquema para la cuantificación de nitrógeno total presente en las

muestras no hidrolizadas.
La metodología de micro-Kjeldahl empleada fue de acuerdo a la AOAC, 1980103,

con ligeras modificaciones, desarrollada en tres etapas: digestión, destilación y
titulación en el laboratorio de Bioquímica del 3er piso del Departamento de
Bioquímica de la UNMSM103.
➢ Digestión: se tomó en un matraz micro-Kjeldahl cantidad en volumen

equivalente a 25 mg de muestra seca contenida en cada sobrenadante de las
muestras hidrolizadas con ATC al 10% o de la muestra sin hidrolizar, según
45
se cuantifique el nitrógeno soluble en ATC o nitrógeno total sin hidrolizar, se
agregó con precaución los reactivos necesarios K2SO4 (2g), HgO (40mg) y
H2SO4 (2,15mL) con peso específico 1,84, libre de nitrógeno, posteriormente
se llevó a temperatura de ebullición por 1,5 horas, hasta obtener una solución
traslúcida incolora sin trazas de materia orgánica carbonizada103.
➢ Destilación: previo enfriamiento, se trasvasó la solución obtenida a un balón
de pequeño volumen, recuperando los restos de la solución con un mínimo de
agua destilada, se agregó 8 -10 mL de la solución de hidróxido de sodio con
tiosulfato de sodio, y se sometió a calentamiento. Se acumuló
aproximadamente 15 mL del destilado en un matraz a través de una manguera
sumergida en la solución que contiene 5 mL de solución saturada de H3BO3 y
II-IV gotas de indicador de rojo de metilo+verde de bromocresol, finalmente se
observó un viraje de color del indicador, pasando de color verde esmeralda a
amarillo claro103.
➢ Titulación: Se tituló la solución con HCl 0,01N estandarizado y se registró el
volumen correspondiente al gasto del ácido clorhídrico 0,01N. Se recomienda
titular un blanco para realizar los cálculos correspondientes103.
Para realizar el cálculo tanto del nitrógeno soluble de las muestras hidrolizadas,
como del nitrógeno total presente en las muestras sin hidrólisis se procedió a
utilizar la fórmula103:
[ gasto mL HCl de la muestra − gasto mL del blanco x normalidad de HCl]

%� = x %
mg muestra seca
4.2.8. Determinación de la actividad antioxidante mediante el

método del radical (DPPH●)
Para la determinación de la actividad antioxidante in vitro se consideró la

metodología de Ortega E. et al, 2015105, la cual corresponde a una modificación
del método original de barrido entre los radicales libres de 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH●) y el antioxidante descrita por Brand-Williams W. et
al.,1995106.
46
El método de decoloración se evidencia cuando la solución del DPPH● se mezcla
con una solución antioxidante (sustancia a prueba), la cual dona protones, de tal
forma que la absorbancia inicial a 517 ƞm disminuye, en tanto, el color púrpura
de la solución del radical se decolora a un color amarillo pálido, esta pérdida de
la intensidad de color es directamente proporcional a la actividad antioxidante
que demuestra la sustancia a prueba107-110.
El procedimiento incluyó la preparación de cantidad suficiente de solución stock,

2 mg del reactivo DPPH (Sigma-Aldrich®) se disolvió con 100 mL de metanol, la
solución resultante se dejó reaccionar a T° ambiente por 24 horas en oscuridad.
Luego se preparó la solución de trabajo en el espectrofotómetro Agilent Cary
8454, previa calibración, obteniendo una absorbancia inicial estable de
0,75±0.050 a una longitud de onda de 517 ƞm 106,107.
Los hidrolizados se diluyeron a las concentraciones de 25, 50, 125, 250, 500,
750, 1000, 1250, 1750, 2250 y 2750 g/mL, y se evaluó la actividad triplicado,
también, se realizó la lectura del blanco propio del método debido a que la
muestra es ligeramente coloreada, la absorbancia final se leyó en el
espectrofotómetro a 517 ƞm luego de 30 minutos de reposo iniciada la reacción
entre la solución del radical DPPH● y la muestra, que, por diferencia de
absorbancias, se obtiene el porcentaje de captación de radicales libres106-110.
Como estándares de actividad antioxidante positiva se utilizó vitamina C y Trolox

a concentraciones entre 0,8 – 2,8 g/mL y 1,2 – 6,0 g/mL, preparados bajo las
mismas condiciones que las diluciones de los hidrolizados.
Tabla 5. Esquema del protocolo de trabajo para la determinación de la actividad

antioxidante mediante el método DPPH● y procedimiento con las muestras,
blanco y estándares106,107.
Patrón de Muestra Problema o
Blanco
Solución referencia estándar
Muestra 20 L --- 20 L
Metanol 980 L 20 L ---
DPPH● --- 980 L 980 L
47
Luego de 30 min. de reposo de reacción, se midió la absorbancia a 517 ƞm.
Proceder a la lectura de cada una de las diluciones de las muestras problema,
blanco y estándar por triplicado.
Se halló el porcentaje de inhibición o captación de radicales libres, mediante la

ecuación106,107:
Abs. inicial − [Abs. final − Abs. blanco]

% � ℎ� � �ó = x %
Abs. inicial
Para el cálculo del (IC50) se procedió a realizar las gráficas de las curvas entre
la concentración de las muestras y estándares versus el % de inhibición111.
Se obtuvo la ecuación general para cada gráfica de las muestras evaluadas:
y = mx±b
50−b
Al reemplazar valores se obtuvo IC5 =
m
Donde:
m: valor de la pendiente de la curva
b: valor de intercepto en y.
4.2.9. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método

del radical catiónico (ABTS●+)
La propiedad antioxidante de los hidrolizados enzimáticos fue evaluada in vitro

de acuerdo a la metodología propuesta por Re R. et al.,1998112 con ligeras
variaciones en adaptación a nuestra muestra. Esta metodología se justifica en la
decoloración del radical catiónico (ABTS●+) y se ajusta a una mayor cantidad de
sustancias con actividad antioxidante, debido a que puede ser aplicada para
sustancias lipófilas e hidrófilas112-115.
Se preparó cantidad suficiente de solución stock del radical ABTS●+, para lo cual,
19,4 mg del reactivo (ABTS-Sigma-Aldrich®) se disolvió con 2 mL de agua
destilada, protegida de la luz, luego se adicionó a la solución 3,3 mg de persulfato
de potasio (K2S2O8) y agua destilada hasta un volumen total de 5 mL, se dejó
reaccionar en reposo a temperatura ambiente por un tiempo de 16 horas en
48
frasco ámbar. Por último, se preparó la solución de trabajo, diluyendo la solución
stock con volumen necesario de etanol absoluto hasta obtener una absorbancia
estable de 0,700±0,02 (absorbancia inicial), previa calibración del equipo. Las
absorbancias se midieron en el espectrofotómetro Agilent Cary 8454 a una
longitud de onda de 734 ƞm112-115.
Los hidrolizados se diluyeron a las concentraciones de 15, 37.5, 75, 150, 225 y
300 g/mL, posteriormente se ensayó la actividad antioxidante de las diluciones
por triplicado. Asimismo, se realizó la lectura previa del blanco, midiendo las
absorbancias en el espectrofotómetro a 734 ƞm a partir de los 6 minutos de
reposo, de esta manera se logró obtener el porcentaje de captación de radicales
libres. Se utilizó al estándar de actividad antioxidante positiva al reactivo trolox
(Sigma-Aldrich®) entre las concentraciones de 2,5 – 25 Mol/L, preparadas en
las mismas condiciones que las muestras problema.
Tabla 6. Esquema del protocolo de trabajo para la determinación de la actividad

antioxidante mediante el método de decoloración del ABTS ●+ y procedimiento
con las muestras, blanco y estándares113,114.
Muestra Problema o
Blanco Patrón de referencia
Solución estándar
Muestra 50 L --- 50 L
Etanol absoluto 950 L 50 L ---
ABTS●+ --- 950 L 950 L
Luego de 6 min de reposo de reacción, se midió la absorbancia a 734 ƞm.
Proceder a la lectura de cada una de las diluciones de las muestras problema,
blanco y estándar por triplicado.
Se halló el porcentaje de inhibición, mediante el uso de la ecuación:
Abs. inicial − [Abs. final − Abs. blanco]

% � ℎ� � �ó = x %
Abs. inicial
Se calculó el IC50 y se procedió a realizar las gráficas de las curvas entre la

concentración de las muestras y estándares versus el % de inhibición,
empleando la ecuación general de la recta:
y = mx±b
49
50−b
Reemplazando valores obtenemos IC5 = m
Donde:
m: valor de la pendiente de la curva
b: valor de intercepto en y.
Los resultados se expresaron en valores TEAC (Capacidad Antioxidante en

Equivalentes Trolox), valor correspondiente a la concentración de la solución del
estándar trolox (µMol) que tiene la capacidad antioxidante equivalente a la
muestra para inhibir los radicales catiónicos (ABTS●+) en un tiempo
determinado112,116. Se llevó a cabo el cálculo de la Capacidad Antioxidante en
Equivalentes Trolox a un tiempo definido de 6 minutos.
Para expresar los resultados en valores TEAC se emplea la ecuación propuesta

por Marquez et. al, 2014117:
IC5 del estándar trolox

�� =
IC5 de la muestra problema
Donde:
- IC50 del estándar (trolox) = concentración (mmMoles de trolox/litro de solvente)
a la cual, el estándar de actividad antioxidante positiva (trolox), inhibe el 50%
de los radicales libres en la solución del radical catiónico (ABTS●+).
- IC50 de la muestra problema = concentración del hidrolizado (g de
hidrolizado/litro de solvente) a la cual inhibe el 50% de los radicales libres en la
solución del radical catiónico (ABTS●+).
4.2.10. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el

método de difusión en agar-pozo
Respecto a la propiedad antimicrobiana de los hidrolizados de gelatina, se llevó

a cabo in vitro de acuerdo a la metodología propuesta por Hufford C. et al.,
1975118; considerando ligeras variaciones en adaptación con la muestra a
evaluar140.
50
Selección de microorganismos utilizados
Para el ensayo de actividad antimicrobiana se seleccionó y posteriormente se

utilizó los microorganismos: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Candida albicans todas ellas
pertenecientes a cepas clínicas de procedencia hospitalaria, proporcionadas por
el laboratorio de Microbiología del Instituto de Química Biológica, Microbiología
y Biotecnología “Marco Antonio Garrido Malo” de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UNMSM.
Identificación de microorganismos
Para la identificación de cada microorganismo se procedió de acuerdo a los

ensayos descritos en el Manual de Procedimientos Bacteriológicos en
Infecciones Intrahospitalarias del Instituto Nacional de Salud – INS120 y en el
Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los
principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas119.
La identificación de la especie Staphylococcus aureus se dio mediante la

observación de la morfología celular por tinción Gram, crecimiento en agar
sangre, crecimiento en agar manitol salado, prueba de la catalasa y presencia
de desoxirribonucleasa. Para identificar Pseudomonas aeruginosa se dio por el
ensayo de observación de morfología celular por tinción Gram, crecimiento en
agar cetrimide, prueba de oxidasa, agar TSI, crecimiento en TSA a 42°C,
crecimiento en agar TSI y por la prueba de utilización del citrato. Escherichia coli
identificada por observación de morfología de colonias en agar Mac Conkey,
crecimiento en agar TSI, crecimiento en el medio lisina hierro, prueba de rojo de
metilo, prueba de indol, prueba de motilidad y prueba de β-galactosidasa
(ONPG). Bacillus subtilis se identificó por la morfología celular por tinción Gram,
prueba de motilidad, prueba de la catalasa y lecitinasa. Por último, para la
levadura Candida albicans, se aplicó la observación de la morfología de las
colonias en agar sabouraud dextrosa, examen microscópico y prueba del tubo
germinativo119,120.
51
Preparación del inóculo de los microorganismos
Se procedió con la preparación del inóculo de la cepa clínica del hongo Candida
albicans, la cual se inició a partir de los microorganismos de la misma especie
cultivados 48 horas previas en agar dextrosa Sabouraud. Cantidad suficiente de
dichos microorganismos se suspendieron en una solución salina al 0,90% estéril,
posteriormente la suspensión se ajustó al nivel de turbidez de un tubo 0,5 de la
escala Mc Farland, equivalente a una concentración aproximada de 1 – 1,5x108
ufc/mL118-121.
En cuanto a la preparación de los inóculos se inició a partir del cultivo de cada

bacteria en agar TSA, el cual se realizó 24 horas antes, se aisló cada bacteria
del agar TSA y se suspendió cantidad suficiente de cada bacteria en solución
salina al 0,90% estéril, por último, cada suspensión se ajustó a la escala de
turbidez de 0,5 McFarland, que corresponde a la concentración aproximada de
1 – 1,5x108 ufc/mL118-121.
Preparación de las muestras
Las muestras evaluadas corresponden a todos los hidrolizados obtenidos, los

cuales se diluyeron a 2 concentraciones diferentes de 1,0 mg/mL y 0,50 mg/mL.
Se utilizó como medio diluyente agua estéril para inyección.
Preparación e inoculación de las placas
Se utilizó el medio sólido no selectivo reconstituido de agar dextrosa Sabouraud

para el microorganismo fúngico Candida albicans. Se adicionó el inóculo,
preparado en el paso anterior en volúmenes de 1mL de inóculo y 100 mL de
medio reconstituido. La nueva suspensión obtenida del inóculo incorporado al
medio se homogenizó y luego se distribuyó una cantidad aproximada de 25 mL
en placas Petri de vidrio con diámetros de 90 mm, previamente esterilizadas. Se
dejó solidificar el medio a temperatura ambiente. Solidificado el medio, se
formaron los pozos equidistantes en cada placa con el uso de un sacabocado
con diámetro externo de 9 mm118,140.
52
Para los microorganismos bacterianos se utilizó el medio sólido no selectivo
reconstituido de agar Mueller Hinton. Se adicionó el inóculo de la bacteria
respectiva, a volumen de 1 mL de inóculo por cada 100 mL del medio
reconstituido. La suspensión obtenida del inóculo incorporado al medio se
homogenizó y luego se distribuyó una cantidad aproximada de 25 mL en placas
Petri de vidrio con diámetros de 90 mm, previamente esterilizadas, una vez
concluida la preparación se dejó solidificar el medio a temperatura ambiente,
rotulando la placa con el microorganismo que corresponde. Por último, una vez
solidificado el medio, se formaron de los pozos equidistantes en cada placa con
el uso de un sacabocado con diámetro externo de 9 mm118,140.
Incorporación de muestras e incubación de placas
A cada pozo de las placas, se agregó 100 µL de la muestra de cada hidrolizado

a concentraciones de 1,0 mg/mL y 0,50 mg/mL y se dejó en reposo por 60
minutos, con la finalidad de que muestra difunda en el agar, luego del tiempo
señalado se llevaron a incubación a las condiciones de 37°C por 24 horas tanto
para los microrganismos fúngicos como bacterianos. Los ensayos se realizaron
por triplicado y se utilizó agua estéril para inyección como blanco para corroborar
su efecto de inhibición en el crecimiento de los microorganismos en estudio,
debido a su empleo como diluyente en la preparación de las muestras a evaluar.
Así mismo se usaron los controles positivos de actividad antimicrobiana al
fluconazol (0,2 mg/mL) y ciprofloxacino (0,2mg/mL) en comparación con los
microorganismos fúngicos y bacterianos respectivamente 118,140.
Lectura e interpretación de resultados
Se observaron las zonas de inhibición del crecimiento de microorganismos y se

procede con la medición, las cuales se manifiestan en forma de halos claros
alrededor del pozo, la medición es por diámetro total, incluyendo el diámetro del
pozo y del halo formado en milímetros (mm), se considera una actividad
antimicrobiana significativa a los diámetros mayores a 18mm., de acuerdo a la
metodología propuesta por Rojas R. et al., 2003140.
53
Tabla 7. Criterio de evaluación de actividad antimicrobiana por ensayo de
difusión122.
Actividad antimicrobiana Diámetro del halo (mm)
SUSCEPTIBLE (Alta) ≥20
INTERMEDIA (Moderada) 15-19
RESISTENTE (Baja) ≤14
4.2.11. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

mediante el método de microdilución/colorimétrico
Se evaluó la propiedad antimicrobiana de los hidrolizados mediante el método

de microdilución/colorimétrico de acuerdo a los protocolos desarrollados por
CLSI M07-A9, 2012122 y Wiegand I. et al., 2008123 con ligeras modificaciones,
estas se justifican en la determinación de la concentración mínima inhibitoria
(CMI) del agente antimicrobiano en diluciones de agar o caldo a la cual es
susceptible el crecimiento in vitro de un aislado de bacteria aeróbica en
condiciones estandarizadas de preparación de inóculos, tiempo y temperatura
de incubación. En una microplaca con pocillos, se agregan cantidades iguales
de las concentraciones geométricamente ascendentes de la sustancia
antimicrobiana, además de un número fijo de la bacteria aerobia inmersa en un
medio de crecimiento líquido, como el caldo Mueller Hinton. Por último, el
indicador del crecimiento bacteriano, que luego de un tiempo (16-20 horas) se
evalúa si hubo o no crecimiento bacteriano por cambio de la coloración o
sedimento en los pocillos de incubación en comparación con los controles
respectivos y estableciendo el valor de la CMI122,123.
Selección de microorganismos utilizados
Se seleccionó a los microorganismos que, de acuerdo a los resultados,

mostraron mejor actividad por el método de difusión en agar, por lo tanto, se
seleccionó las cepas clínicas hospitalarias de Staphylococcus aureus y Bacillus
subtilis, ambas cepas identificadas en el método antimicrobiano por difusión en
agar.
54
Preparación del inóculo de los microorganismos
Se inició 24 horas antes a partir del cultivo de cada bacteria en agar TSA, luego
se aisló y suspendió algunas colonias en solución salina al 0,90% estéril, luego
cada suspensión se ajustó a la escala de turbidez de 0,5 McFarland
correspondiente a la concentración aproximada de 1 – 1,5x108 ufc/mL. Se realizó
doble dilución del inóculo en caldo Mueller Hinton, la primera se realizó a la
proporción de 1:30 (inóculo: caldo), la segunda dilución se realizó a proporción
de 1:5 (primera dilución: caldo) obteniendo la concentración de 1x106 ufc/mL. Se
procedió con la preparación del indicador de resazurina a la concentración de
20mg/mL, luego se calculó el volumen de resazurina a agregar al inóculo a razón
de 50µL por 10 mL de inóculo122,123,124.
Preparación de las muestras
Se emplearon los hidrolizados H601, H602, H603, H504, H508, H509, H7010 y
H7014 para esta evaluación, los cuales se diluyeron en 8 concentraciones
seriadas doblemente concentradas entre 1000 – 7,81 µg/mL de acuerdo al
protocolo CLSI M07-A9. Se utilizó como medio diluyente al DMSO y caldo
Mueller Hinton122.
Preparación del control de esterilidad
Se utilizó el caldo Mueller Hinton con el indicador de resazurina, las proporciones

a añadir fueron por cada 20mL de caldo Mueller Hinton corresponde agregar 100
µL de resazurina de acuerdo a los protocolos de referencia antes descritos122,123.
Incorporación de muestras e inóculos en las microplacas
Se llevó a cabo en microplacas estériles de 96 pocillos, en una cabina de flujo

laminar.
La incorporación de las muestras e inóculos se realizó por triplicado por cada

muestra y bacteria en orientación horizontal de la microplaca como se detalla en
la tabla 8, se utilizó 6 filas y 10 columnas por cada muestra, espaciadas por 2
filas y 2 columnas sin utilidad.
55
La disposición horizontal para la incorporación de muestras e inóculos fue la
siguiente122,123:
- A la 1° y 12° columna no se les dio utilidad (vacías).
- En la segunda columna (A1-C1 y F1-H1), 200 µL del control de esterilidad.
- En las columnas (A3 – A10, B3 – B10, C3 – C10, F3 – F10, G3 – G10, H3 –

H10), 100 µL de las diluciones doblemente seriadas de las muestras con 100 µL
del inóculo correspondiente a cada bacteria que contiene el indicador resazurina.
- En la columna 11, 200 µL de inóculo que corresponde al control de crecimiento

bacteriano, denominado también control positivo.
Al finalizar la incorporación de las muestras e inóculos en las microplacas, se

procedió a la incubación en la estufa a condiciones de 37 °C por un tiempo de
24 horas122,123.
Tabla 8. Disposición para la incorporación de muestras e inóculos en la

microplaca.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP S.a.
S.a.
B CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP
S.a.
C CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP
B.s.
F CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP
G CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP B.s.
H CE 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,63 7,81 CP B.s.
Leyenda:
- CE: control de esterilidad
- CP: Control positivo
- S.a.: Staphylococcus aureus cepa clínica
- B.s.: Bacillus subtilis cepa clínica
- : pocillo vacío
56
Lectura de los resultados
Se inspeccionó de forma visual notificando cualquier variación de color azul-

púrpura hacia rosado rojizo como crecimiento bacteriano positivo, así mismo, se
consideró como CMI, la concentración más baja a la cual se mantuvo la
coloración azul-púrpura, sin variación del color inicial, así mismo se calculó el
valor promedio de las tres diluciones a la cual no hubo variación de color y se
reportó como CMI; sin embargo, es necesario seguir el modelo de reporte de
resultados de acuerdo a los protocolos citados anteriormente 122,123.
Interpretación de resultados
Los resultados obtenidos se interpretaron de acuerdo a los niveles establecidos

por Holetz F. et al., 2002125, quienes lograron establecer criterios para determinar
según la concentración de muestra a evaluar si posee una débil, moderada o
buena actividad antimicrobiana y si la CMI sobre pasa los 1000 µg/mL,
consideran que la muestra no posee propiedad antimicrobiana. Se tomó en
consideración la tabla 9 para considerar los niveles de actividad antimicrobiana
según la CMI125.
Tabla 9. Niveles de actividad antimicrobiana125.

Nivel de actividad antimicrobiana CMI
INACTIVO o sin actividad > 1000 µg/mL
DÉBIL o BAJA 500 a 1000 g/mL
MODERADA 100 a < 500 g/mL
BUENA < 100 g/mL
4.3. Análisis estadístico
Se utilizó un diseño factorial para poder estimar la significancia de los efectos

principales, el tipo de diseño factorial que se empleó para nuestro estudio fue de
tipo Plackett-Burman, en el referido diseño se consideró un nivel de significancia
de p<0,05. Se recurrió al uso del programa informático-estadístico Minitab®
versión 17.1.0 para el procedimiento de análisis estadístico de acuerdo a los
datos generados en nuestro estudio.
57
V. RESULTADOS
5.1. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno
Se observó la formación de láminas delgadas de coloración parda amarillenta

adheridas en toda la superficie de las placas de secado, se dio paso al proceso
de raspado de las láminas, tal como se observan en el anexo 1. Se registró el
peso total del raspado, obtenido que fue de 182,43 g., el cual fue almacenado en
tubos de polietileno.
Se calculó el rendimiento haciendo uso de la ecuación propuesta en punto

4.2.3.9. Raspado y almacenamiento, de esta manera el rendimiento calculado
fue de 15,86%, es decir, por cada 100g de residuos correspondientes a las pieles
del pescado “Bonito” se obtuvo 15,86g de gelatina.
5.2. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford
Como resultado de la interpolación de la absorbancia en la lectura de la muestra

en la curva de calibración con el estándar BSA señalada en el anexo 2, se obtuvo
que la proteína total en la muestra problema fue de 439,5mg proteína BSA/mL,
lo que corresponde al 70,32% del porcentaje total de la gelatina extraída.
5.3. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de

proteína soluble mediante el método de Biuret
Los resultados del %GH se muestran en la tabla 10, estos valores nos relacionan
la cuantificación de proteína soluble contenida en la muestra hidrolizada tratada
con ATC al 10%, así como también la cuantificación de proteína total en las
muestras hidrolizadas y sin sometimiento a hidrólisis. Los mayores (%GH), lo
presentan los hidrolizados H601, H602, H603 y H509 con 33,21%, 32,67%,
33,04% y 25,80% respectivamente.
58
Tabla 10. Grado de hidrólisis (%GH) de las muestras determinado mediante el
método de Biuret.
GRADO DE
ALCALASA
HIDRÓLISIS
CONDICIONES
Tiempo de Relación
Temperatura
pH hidrólisis [enzima:sustrato] (%GH)
(°C)
MUESTRA (h) [w:w]
H601 60 8 3 [1/35] 33,21

H602 60 8 3 [1/35] 32,67
H603 60 8 3 [1/35] 33,04
H504 50 7 2 [1/50] 16,42
H505 50 9 2 [1/20] 11,24
H506 50 9 4 [1/50] 15,31
H507 50 9 4 [1/20] 11,99
H508 50 7 2 [1/20] 13,24
H509 50 7 4 [1/50] 25,80
H7010 70 7 4 [1/50] 16,29
H7011 70 9 2 [1/50] 16,96
H7012 70 7 2 [1/20] 11,49
H7013 70 9 4 [1/20] 17,17
H7014 70 7 4 [1/20] 16,67
H7015 70 9 2 [1/50] 20,99
De acuerdo a la tabla 10, se puede apreciar que la mayoría de los hidrolizados

llegan a obtener un alto porcentaje de grado de hidrólisis, llegando a ser todos
los valores de GH superiores al 10%.
Tabla 11. Análisis del diseño factorial: %GH (Biuret) VS Temperatura, pH, tiempo
y [E/S]
Factores Grados de libertad (DF) Valor F Valor p
Temperatura 1 0,24 0,635
pH 1 0,30 0,595
Tiempo 1 1,29 0,285
[E/S] 1 6,98 0,027*
α = 0,05
59
p < 0,05
* El factor [E/S] tiene influye estadísticamente significativa en el grado de
hidrólisis, empleando un diseño factorial tipo Plackett-Burman.
De acuerdo al análisis estadístico se observó que las diferentes condiciones de

hidrólisis influyen en la obtención del %GH; sin embargo, el factor [E/S] tiene una
influencia estadísticamente significativa en la obtención del resultado. Así
mismo, se realizó un análisis respecto a la influencia de las diferentes
combinaciones de las condiciones hidrolíticas a las que fueron sometidas las
muestras y el correspondiente %GH obtenido, tal como se observa en las
gráficas mostradas en las figuras 15 y 16.
Figura 15. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados, donde se

compara la magnitud absoluta de cada uno de los factores en los resultados del
%GH. Así mismo, se señala en el gráfico que el factor [E/S] en la hidrólisis es
estadísticamente significativo.
60
Figura 16. Gráfica de efectos principales, en la cual se puede observar que a
diferentes grados de los factores se obtienen efectos mayores y menores, de tal
forma que, a condiciones de 60° C, pH 8, 3 horas y relación de [E/S]:[1/35], se
obtienen mayores efectos en el %GH.
5.4. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del
nitrógeno soluble mediante el método de micro-Kjeldahl
Los resultados del porcentaje del grado de hidrólisis mediante la cuantificación

del nitrógeno soluble por el método de micro-Kjeldahl se expresan en la tabla 12.
Notamos que al igual que los resultados con el método anterior, los mayores
grados de hidrólisis corresponden a los hidrolizados H601, H602, H603 y H509,
con una ligera variación.
Tabla 12. Grado de hidrólisis (%GH) de las muestras determinado mediante el

método de micro-Kjeldahl.
GRADO DE
ALCALASA
HIDRÓLISIS
CONDICIONES Tiempo de Relación
Temperatura
pH hidrólisis [enzima]:[sustra (%GH)
(°C)
MUESTRA (h) to] [w:w]
H601 60 8 3 [1/35] 33,33
H602 60 8 3 [1/35] 29,52
H603 60 8 3 [1/35] 31,42
H504 50 7 2 [1/50] 17,69
61
H505 50 9 2 [1/20] 10,05
H506 50 9 4 [1/50] 16,29
H507 50 9 4 [1/20] 10,28
H508 50 7 2 [1/20] 14,61
H509 50 7 4 [1/50] 26,92
H7010 70 7 4 [1/50] 15,85
H7011 70 9 2 [1/50] 17,41
H7012 70 7 2 [1/20] 10,46
H7013 70 9 4 [1/20] 18,80
H7014 70 7 4 [1/20] 17,98
H7015 70 9 2 [1/50] 22,88
De los valores hallados se puede apreciar que los hidrolizados logran un %GH
mayor al 10%, hasta un 33,33% que corresponde a la muestra H601, los cuales
son valores altos pese a que las muestras fueron sometidas a diferentes
condiciones de hidrólisis.
Tabla 13. Análisis del diseño factorial: %GH (Micro-Kjeldahl) VS Temperatura,

pH, tiempo y [E/S]

pH 1 0,28 0,608
Tiempo 1 0,79 0,398
[E/S] 1 5,63 0,042*
α = 0,05
p < 0,05
* El factor [E/S] tiene influencia estadísticamente significativa en el grado de
hidrólisis, empleando un diseño factorial tipo Plackett-Burman.
Se evidenció que los diferentes efectos de las condiciones hidrolíticas a las que
fue sometido el sustrato influyen en el resultado de %GH, pese a ello, se
corroboró que el efecto [E/S] es estadísticamente significativo. Las gráficas de
las figuras 17 y 18 señalan cómo las configuraciones experimentales afectan al
resultado obtenido.
62
Figura 17. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados, nos da la
comparación de la magnitud absoluta de los efectos como resultados del %GH.
El factor [E/S] es estadísticamente significativo en el %GH.
Figura 18. Gráfica de efectos principales, a diferentes grados de los factores de

hidrólisis enzimática se obtienen efectos mayores y menores, de acuerdo con la
gráfica, a las condiciones de 60° C, pH 8, 3 horas y relación de [E/S]:[1/35], se
obtienen valores más altos en el %GH.
5.5. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método
del radical (DPPH●)
En la tabla 14 se señalan los resultados de la actividad antioxidante a diferentes

concentraciones de las sustancias estándares (vitamina C y Trolox), los
63
resultados se reportan como porcentaje de inhibición del radical (DPPH●), así
como también el IC50 correspondiente a cada sustancia.
Tabla 14. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones de las sustancias

estándares con actividad antioxidante positiva.
Sustancia estándar
Concentración % inhibición del
con actividad IC50
(µg/mL) radical (DPPH●)
antioxidante
2,8 83,61
2,4 75,80
2,0 62,78
Vitamina C 1,68 µg/mL
1,6 48,32
1,2 34,52
0,8 18,20
6,0 80,00
4,8 68,67
Trolox 3,6 52,86 3,53 µg/mL
2,4 34,58
1,2 18,45
Se obtuvo como resultado el porcentaje de inhibición de acuerdo a las diferentes

concentraciones de cada uno de los hidrolizados enzimáticos, además de los
IC50 respectivos para cada muestra. Así mismo, podemos observar en estos
resultados una relación directamente proporcional entre la concentración de las
muestras a evaluar y la capacidad antioxidante de las mismas. Podemos notar
que el menor IC50 le corresponde al hidrolizado H7012 con 458,73 µg/mL; sin
embargo, el mayor IC50 hallado le pertenece al hidrolizado H7011 con 1830,46
µg/mL.
Tabla 15. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones del total de los

hidrolizados enzimáticos de proteína colagenosa.
Muestra problema IC50
(µg/mL) radical (DPPH●)
Hidrolizado 500,00 18,99 1240,97 µg/mL
64
H601 750,00 28,93
1000,00 40,37
1250,00 51,01
1750,00 75,93
2250,00 86,93
500,00 19,00
750,00 29,13
Hidrolizado 1000,00 39,54
1236,52 µg/mL
H602 1250,00 50,52
1750,00 77,29
2250,00 87,83
500,00 18,38
750,00 28,28
1246,86 µg/mL
H603 1250,00 49,73
1750,00 77,74
2250,00 86,95
50,00 28,51
125,00 33,34
250,00 41,21
Hidrolizado
750,00 60,76 539,39 µg/mL
H504
1000,00 67,28
1250,00 77,84
1750,00 94,34
750,00 24,21
1000,00 30,66
1250,00 36,85
H505 2250,00 59,06 1827,36 µg/mL
2750,00 73,08
125,00 16,63
250,00 20,88 1610,76 µg/mL
65
H506 750,00 32,80
1000,00 37,11
1250,00 41,23
1750,00 50,89
2250,00 62,78
2750,00 77,09
125,00 16,86
250,00 21,63
500,00 26,62
750,00 30,83
Hidrolizado
1000,00 34,02 1702,02 µg/mL
H507
1250,00 38,87
1750,00 48,07
2250,00 59,40
2750.00 75,94
25,00 24,41
50,00 26,65
250,00 36,32
Hidrolizado
500,00 50,45 533,44 µg/mL
H508
750,00 63,52
1000,00 71,88
1250,00 81,05
50,00 17,74
125,00 24,54
250,00 32,02
500,00 38,54
Hidrolizado
750,00 45,88 958,83 µg/mL
H509
1000,00 52,75
1250,00 60,38
1750,00 74,59
2250,00 83,17
1226,28 µg/mL
H7010 125,00 23,42
66
250,00 28,00
500,00 33,16
750,00 40,65
1000,00 46,78
1250,00 53,74
1750,00 61,42
2250,00 71,27
500,00 20,25
750,00 25,11
1830,46 µg/mL
H7011 1250,00 34,62
2250,00 58,99
2750,00 72,63
25,00 27,05
50,00 32,56
250,00 40,61
Hidrolizado
500,00 54,64 458,73 µg/mL
H7012
750,00 65,62
1000,00 74,59
1250,00 82,34
500,00 21,64
750,00 26,30
1706,43 µg/mL
H7013 1250,00 37,43
2250,00 60,83
2750,00 78,18
50,00 21,75
125,00 27,84
250,00 34,89
Hidrolizado
500,00 40,96 1005,89 µg/mL
H7014
750,00 46,00
1000,00 50,46
1250,00 55,26
67
1750,00 66,87
2250,00 79,02
250,00 18,97
500,00 23,97
750,00 31,95
1392,99 µg/mL
H7015 1250,00 46,89
1750,00 61,04
2250,00 73,91
2750,00 86,18
En las tablas 14 y 15 se puede evidenciar la relación directa entre la actividad

antioxidante y la concentración de cada sustancia, es decir, a mayor
concentración de la muestra a evaluar, mayor capacidad antioxidante, nótese así
mismo que, las concentraciones del estándar de vitamina C están entre los
valores de 0,8 – 2,8 µg/mL, del estándar Trolox entre 1,20 – 6,00 µg/mL y
finalmente de las muestras problema, es decir, de los hidrolizados entre 25,00 –
2750,00 µg/mL.
El IC50, que viene a ser concentración de la sustancia antioxidante necesaria

para obtener 50% de inhibición del radical libre DPPH●, hallado como resultado
del cálculo para cada sustancia analizada se reporta en la figura 19, donde se
puede verificar las diferencias de los valores para cada hidrolizado respecto a
las sustancias estándares que poseen un IC50 muy reducido, debido a su alta
actividad antioxidante.
68
2000
1827.36 1830.46
1800 1702.02 1706.43

1610.76
1600
1392.99
1400 1240.97 1236.52 1246.86 1226.28
IC50 µg/mL
1200
1005.89
958.83
1000
800
539.39
600 533.44
458.73
400
200
1.68 3.53
Sustancias antioxidantes
Figura 19. IC50 de las sustancias antioxidantes analizadas mediante el método

del radical DPPH●.
Tabla 16. Análisis del diseño factorial: actividad antioxidante (DPPH●) VS pH,
tiempo y [E/S]

pH 1 58,56 0,000*
Tiempo 1 5,43 0,042*
[E/S] 1 0,22 0.652
α = 0,05
p < 0,05
* Los factores pH y tiempo influyen de forma estadísticamente significativa en la
obtención de hidrolizados con propiedad antioxidante, empleando el diseño
factorial tipo Plackett-Burman.
Considerando el análisis estadístico, las configuraciones experimentales a las

que se trabajó el proceso hidrolítico inciden en la obtención de hidrolizado con
actividad antioxidante evaluado mediante el método del DPPH ●, no obstante, los
factores de pH y tiempo influyen estadísticamente significativa en la obtención
de hidrolizados con propiedad antioxidante. De la misma forma, en las gráficas
69
20 y 21 se evidencia cómo las condiciones hidrolíticas influyen en la obtención
del resultado evaluado.
Figura 20. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados, compara la

magnitud absoluta de los efectos como resultados de la actividad antioxidante.
Los factores pH y tiempo son estadísticamente significativos para la obtención
de hidrolizados con actividad antioxidante.
Figura 21. Gráfica de efectos principales, de acuerdo con la gráfica, a las

condiciones de 50° C, pH 7, 2 horas y relación de [E/S]:[1/20], se obtienen bajos
valores de IC50 de actividad antioxidante con DPPH●. Cabe señalar que la
gráfica debe interpretarse de modo inverso, dado que a menor IC50 de la
muestra, refiere mayor actividad antioxidante.
70
5.6. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método
del radical catiónico (ABTS●+)
La determinación de la bioactividad antioxidante también se realizó mediante el

método del del radical catiónico (ABTS●+). En la tabla 17, se reportan los
resultados de la función biológica analizada a diferentes concentraciones de la
sustancia utilizada como estándar Trolox, de esta manera se halló el IC50, el
cual fue 12,38 µM.
Tabla 17. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones del Trolox,

sustancia estándar con actividad antioxidante positiva.
Sustancia estándar
con actividad IC50
(µM) radical (ABTS●+)
antioxidante
2,50 10,45
5,00 17,82
Trolox 10,00 46,32 12,38 µM
12,50 51,41
25,00 97,14
Los resultados se reportan como porcentaje de inhibición a diferentes

concentraciones, además se hallaron los IC50 respectivos para cada muestra.
Con los valores encontrados, se expresó el resultado final en valores TEAC
(Capacidad Antioxidante en Equivalentes Trolox), que corresponde a la
concentración de la solución del estándar Trolox (µM) que tiene la capacidad
antioxidante equivalente a la muestra problema, los resultados se indican en la
tabla 18.
Se indica así mismo que, las concentraciones utilizadas para evaluar la

capacidad antioxidante del estándar Trolox, variaron entre 2,50 – 25,00 µM y las
concentraciones consideradas para evaluar las muestras problema variaron
entre 15,00 – 300,00 µg/mL, con la finalidad de obtener el IC50 de cada
sustancia.
71
Tabla 18. Capacidad antioxidante a diferentes concentraciones de los
hidrolizados enzimáticos de proteína colagenosa.
% inhibición
Muestra Concentración
del radical IC50 TEAC
problema (µg/mL)
(ABTS●+)
37,50 17,35 89,28

Hidrolizado 75,00 28,16 138,67 ( mol Trolox/g
H601 150,00 53,70 µg/mL hidrolizado
225,00 78,64 proteico)
37,50 18,27 91,21
225,00 78,79 proteico)
37,50 19,73 90,67
225,00 80,26 proteico)
15,00 19,24
128,32
37,50 28,00
Hidrolizado ( mol Trolox/g
75,00 41,25 96,48 µg/mL
H504 hidrolizado
150,00 69,92
proteico)
225,00 99,24
37,50 12,68
79,45
75,00 24,90
Hidrolizado ( mol Trolox/g
150,00 44,98 161,10
H505 hidrolizado
225,00 67,67 µg/mL
proteico)
300,00 94,25
75,00 25,20 77,48
300,00 91,36 proteico)
Hidrolizado 75,00 23,30 162, 43

76,22
H507 150,00 47,40 µg/mL
72
225,00 69,67 ( mol Trolox/g
hidrolizado
300,00 88,89
proteico)
15,00 24,97 143,79
Hidrolizado 37,50 33,00 ( mol Trolox/g
86,10 µg/mL
H508 75,00 47,01 hidrolizado
150,00 71,80 proteico)
37,50 20,92 109,08
H509 150,00 63,88 ug/mL hidrolizado
225,00 92,00 proteico)
37,50 18,27 91,74
225,00 79,42 proteico)
75,00 19,89 61,76
300,00 75,00 proteico)
15,00 25,24 165,38
Hidrolizado 37,50 35,24 ( mol Trolox/g
74,86 µg/mL
H7012 75,00 49,22 hidrolizado
150,00 81,26 proteico)
75,00 24,78 72,12
300,00 85,45 proteico)
37,50 20,80 101,33
225,00 86,65 proteico)
Hidrolizado 37,50 21,64 113,66
108,92
H7015 75,00 34,79 µg/mL
73
150,00 65,45 ( mol Trolox/g
hidrolizado
225,00 90,31
proteico)
Se evidenció una relación directa entre la actividad antioxidante y la

concentración de cada sustancia en evaluación. El IC50 de cada sustancia
analizada se reporta en la figura 22, donde se verifica las diferencias entre los
valores de cada hidrolizado con la sustancia estándar, la cual posee un IC50 de
3,10 µg/mL debido a la alta actividad antioxidante; sin embargo, el menor IC50
entre los hidrolizados analizados, le corresponde al hidrolizado H7012 con 74,86
µg/mL, a la vez, muy por el contrario el IC más alto entre los hidrolizados
enzimáticos le corresponde al H7011 con 200,45 µg/mL.
250.00
200.45
200.00
171.66
161.10 159.79 162.43
150.00
IC50 µg/mL
138.67 135.73 136.54

134.95
122.18
113.50 113.66
96.48
100.00 86.10
74.86
50.00
3.10
0.00
Sustancias antioxidantes
Figura 22. IC50 de las sustancias antioxidantes analizadas con el método del
radical (ABTS●+)
Del mismo modo se grafica en la figura 23 los resultados respecto a los valores
TEAC para cada hidrolizado, entendido este como el valor corresponde a la
concentración de la solución del estándar Trolox (µM) que tiene la capacidad
74
antioxidante equivalente a la muestra problema individual, podemos notar que el
mayor valor del TEAC le corresponde al hidrolizado H7012 con 165,38 mol
Trolox/g hidrolizado proteico, y por el otro lado tenemos el hidrolizado H7011 con
el menor valor TEAC, con 61,76 mol Trolox/g hidrolizado proteico.
180
TEAC ( mol Trolox/g hidrolizado proteico)
165.38
160
143.79
140 128.32
120 109.08 108.92

101.33
100 89.28 91.21 90.67 91.74
79.45 77.48 76.22

80 72.12
61.76
60
40
20
Hidrolizados enzimáticos
Figura 23. Valores TEAC de los hidrolizados enzimáticos.
Tabla 19. Análisis del diseño factorial: actividad antioxidante (ABTS●+) VS pH,
tiempo y [E/S]

pH 1 21,33 0,001*
Tiempo 1 7,82 0,019*
[E/S] 1 1,14 0,311
α = 0,05
p < 0,05
75
* Los factores pH y tiempo influyen estadísticamente significativa en la obtención
de hidrolizados con propiedad antioxidante, empleando el diseño factorial tipo
Plackett-Burman.
De acuerdo con los resultados del análisis estadístico los factores de pH y tiempo
tienen una influencia estadísticamente significativa en la obtención de
hidrolizados con propiedad antioxidante, así mismo las gráficas 24 y 25 indican
cómo las configuraciones experimentales a las que se sometió la reacción de
hidrólisis afectan la actividad antioxidante determinada mediante el método del
radical ABTS●+.

magnitud absoluta de los efectos como resultados de la actividad antioxidante.
En el gráfico se visualiza que los factores pH y tiempo son estadísticamente
significativos para la obtención de hidrolizados con actividad antioxidante.
76
Figura 25. Gráfica de efectos principales, nos muestra que a diferentes grados
de los factores de hidrólisis enzimática se obtienen efectos diferentes, de
acuerdo con la gráfica, a las condiciones de 50° C, pH 7, 2 horas y relación de
[E/S]:[1/20], se obtienen los más altos valores TEAC de actividad antioxidante
con ABTS●+. Cabe señalar que la gráfica debe interpretarse de modo directo,
dado que a mayores valores TEAC de la muestra, refiere mayor actividad
antioxidante.
5.7. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el
método de difusión en agar-pozo
De acuerdo a los resultados obtenidos, se reporta como positivos para algunos
agentes bacterianos con actividad biológica baja a intermedia por formación de
un halo claro alrededor del pozo, que indica inhibición del crecimiento del
microorganismo, las medidas de estos halos se detallan en la tabla 20 y se
observan en el anexo 10.
Tabla 20. Valores de los halos de inhibición (mm) obtenidos de la actividad

antimicrobiana por el método de difusión en agar-pozo.
Microorganismo Candida Staphylococcus Pseudomonas Bacillus Escherichia
albicans aureus aeruginosa subtilis coli
Hidrolizado
[1000 µg/mL)
Medida de halos (mm)*
H601 - 15,5 - 14,5 -

H602 - 15,0 - 14,0 -
H603 - 15,5 - 14,0 -
77
H504 - 13,5 - 13,5 -
H505 - - - - -
H506 - - - - -
H507 - - - - -
H508 - 14,0 - - -
H509 - 13,0 - 13,5 -
H7010 - 14,0 - - -
H7011 - - - - -
H7012 - - - - -
H7013 - - - - -
H7014 - 14,5 - 13,5 -
H7015 - - - - -
*: Los valores en mm incluyen la medida del pozo.

-: No se reportó halo de actividad antimicrobiana

poso) contra Staphylococcus aureus VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]

pH 1 29,80 0,000*
Tiempo 1 1,23 0,297
[E/S] 1 0,90 0,367
α = 0,05
p < 0,05
* El factor pH influye estadísticamente significativa en la obtención de
hidrolizados con propiedad antimicrobiana, empleando un diseño factorial tipo
Plackett-Burman.

poso) contra Bacillus subtilis VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]

pH 1 5,40 0,045*
Tiempo 1 0,60 0,459
[E/S] 1 0,60 0,459
78
α = 0,05
p < 0,05
Plackett-Burman.
Respecto al análisis estadístico se confirma que los factores considerados

influyen en la obtención de hidrolizados con propiedad antimicrobiana contra el
microorganismo correspondiente; no obstante, el factor pH, tiene una influencia
estadísticamente significativa en la obtención del resultado previsto. Así mismo,
en las gráficas 26, 27, 28 y 29 se muestra el análisis respecto la influencia de las
diferentes combinaciones de las condiciones hidrolíticas sobre la propiedad
biológica en evaluación.

magnitud absoluta de los efectos como resultados de la actividad antimicrobiana
contra Staphylococcus aureus. Así mismo, se observa en el gráfico que el factor
pH es estadísticamente significativo para la obtención de hidrolizados con
actividad antimicrobiana.
79
[E/S]:[1/35], se obtienen los más altos valores de halos de inhibición de
crecimiento bacteriano.

contra Bacillus subtilis. El factor pH es estadísticamente significativo para la
obtención de hidrolizados con actividad antimicrobiana.
80
[E/S]:[1/35], se obtienen los más altos valores de halos de inhibición de
crecimiento bacteriano.
5.8. Determinación de la concentración mínima inhibitoria mediante

el método de microdilución/colorimétrico
En la tabla 23 se reportan los resultados del ensayo de determinación de

actividad antimicrobiana de los hidrolizados enzimáticos mediante el método de
microdilución/colorimétrico, que tiene por finalidad encontrar la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI). Así mismo, en las figuras del anexo 5 se pueden
observar las coloraciones en las microplacas correspondientes a la lectura de los
resultados.
Tabla 23. Valores de CMI de hidrolizados contra Staphylococcus aureus y

Bacillus subtilis.
Concentración Mínima Inhibitoria (µg/mL)
Microorganismo
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
Hidrolizado
H601 > 1000 1000

H602 > 1000 1000
H603 > 1000 1000
81
H504 500 500
H508 1000 1000
H509 1000 1000
H7010 1000 1000
H7014 1000 > 1000
Los resultados del CMI se justifican en la no variación en coloración en los

pocillos, por lo tanto, se mantiene la coloración inicial o se torna incoloro. Por el
contrario, se reporta como crecimiento bacteriano positivo ante un mínimo
cambio en el color del indicador.
Staphylococcus aureus VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]
Grados de
Factores Valor F Valor p
libertad (DF)
pH 1 23,52 0,001*
Tiempo 1 2,61 0,140
[E/S] 1 0,29 0,603
α = 0,05
p < 0,05
Plackett-Burman.
Bacillus subtilis VS temperatura, pH, tiempo y [E/S]

pH 1 18,75 0,002*
Tiempo 1 3,00 0,117
[E/S] 1 0,00 1,00
82
α = 0,05
p < 0,05
Plackett-Burman.
Conforme al estadístico se corroboró que los factores del proceso hidrolítico

influyen en la obtención de hidrolizados con propiedad antimicrobiana; sin
embargo, el factor pH, tiene una influencia estadísticamente significativa. En las
gráficas 30, 31, 32 y 33 se evidencia la influencia de las condiciones hidrolíticas
sobre la actividad biológica evaluada.

contra Staphylococcus aureus. El factor pH es estadísticamente significativo
para la obtención de hidrolizados con actividad antimicrobiana.
83
de los factores de hidrólisis enzimática se obtienen resultados diferentes, de
acuerdo con la gráfica de interpretación inversa, a las condiciones de 60° C, pH
8, 3 horas y relación de [E/S]:[1/35], se obtienen los más bajos valores de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).

contra Bacillus subtilis. El factor pH es estadísticamente significativo para la
obtención de hidrolizados con actividad antimicrobiana.
84
de los factores de hidrólisis enzimática se obtienen resultados diferentes, de
acuerdo con la gráfica de interpretación inversa, a las condiciones de 60° C, pH
8, 3 horas y relación de [E/S]:[1/35], se obtienen los más bajos valores de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).
85
VI. DISCUSIÓN
Se recolectaron los residuos de la actividad pesquera concernientes a las

pieles del pescado “Bonito”; sin embargo, es necesario en esta etapa la limpieza
minuciosa de los restos del organismo adheridos a las pieles, como son las
sobras musculares, grasa y entre otros cuerpos extraños, dado que en lo posible
tratamos de buscar la menor degradación de la proteína colagenosa presente en
las pieles por efecto de la contaminación microbiana y por lo tanto, expuesta a
enzimas propias del entorno, por este motivo, se trató de seleccionar las pieles
frescas y no contaminadas con residuos biológicos, consecuentemente para
mantenerlas y evitar de este modo la degradación proteica, se almacenó a bajas
temperaturas, tales consideraciones y recomendaciones fueron tomadas de
investigaciones anteriores relacionadas con la extracción de gelatina a partir de
diferentes partes de organismos acuáticos, tal es el caso de Miano A. et al.,
20142, Gómez-Guillén et al., 200196 y Yang et al., 200731, quienes propusieron
cuidados y consideraciones en el almacenamiento de las muestras recolectadas,
así como también mejoras en el pretratamiento para una óptima extracción de
gelatina de organismo acuáticos, y con la finalidad de obtener una gelatina de
alta calidad2,31,96.
De esta manera, teniendo en cuenta los argumentos antes descritos y a

su vez ostentando como referencia lo obtenido en nuestra investigación como
valor de rendimiento (15,86%) del producto en el proceso de extracción de
gelatina, es apropiada la comparación con estudios realizados que emplearon
otras especies de pescados, entre las cuales podemos encontrar especies
marinas y de río, o también es el caso de especies de agua frías o cálidas, pues
todas estas características influyen en el rendimiento de la extracción de la
proteína de interés, encontrando claramente diferencias en el contenido y calidad
del producto alcanzado, tal es el caso de un estudio realizado por Miano A. et
al., 20142 en el que lograron extraer gelatina a partir de la piel de tollo, así mismo,
demuestran que los rendimientos de gelatina de esta parte del organismo vivo
oscilan entre 16,7 a 29,8%, a su vez estos rendimientos no solo dependen del
86
método y de las condiciones del proceso de extracción como son la temperatura
y tiempo de extracción, sino también depende de la especie y de la parte del
organismo del cual se extrae la proteína parcialmente hidrolizada que es la
gelatina, por otra parte, también podemos contrastar el resultado del rendimiento
obtenido con la investigación llevada a cabo por Muyonga J. et al.,20049 en la
que reporta valores de rendimientos de extracción de gelatina a partir de las
pieles de la especie Lates niloticus entre 12,5 – 16% dependiendo en qué estadío
se encuentra el animal, joven o adulto respectivamente, quedando claro que el
rendimiento del proceso de extracción depende de muchos factores propias del
método de extracción proteica como también del organismo vivo 2,9.
Es de este modo que podemos encontrar variaciones en cuanto al rendimiento
del proceso de extracción de gelatina conseguidos en diferentes trabajos de
investigación con especies distintas, que al ser comparados en cuanto al
rendimiento alcanzado en nuestro trabajo se aproxima a los resultados de los
referidos estudios, tal es el caso de Mohtar N. et al., 2010126 quienes reportaron
un rendimiento de 17,4% empleando las pieles de la especie Macruronus
novaezelandiae, en cuanto a los resultados logrados por Koli J. et al., 201333
informaron un rendimiento de extracción de gelatina entre 3,55 – 7,46% de las
pieles de Otolithes ruber, lo cual corresponde a valores menores al nuestro, por
último, en el estudio desarrollado por Thi C. et al., 201735 reportaron valores del
rendimiento en la extracción de gelatina a partir de las pieles de las especies
Perca fluviatilis y Sander volgensis entre 10,2 – 13,8 %. Es necesario indicar que
el rendimiento de gelatina obtenido a través del método utilizado y comparado
con los trabajos citados anteriormente, coinciden y corresponde a un valor
intermedio a alto entre los reportados a la actualidad, por lo tanto es aceptable;
sin embargo, se pudo verificar que con el empleo del método de extracción se
genera ciertas pérdidas de gelatina en los continuos pasos de lavado,
transferencias de la solución de gelatina, así como la insuficiente solubilización
del colágeno presente en las pieles de la especie empleada 33,35,126.
En referencia a la cuantificación de proteína contenida en el producto de

la extracción de la gelatina se obtuvo como resultado un 70,32% respecto a la
87
proteína total, esta evaluación se determinó mediante el método de Bradford, la
selección de este método empleado se justifica por su alta sensibilidad en la
unión del colorante del reactivo con las proteínas, su rapidez de reacción con las
moléculas proteicas y sobre todo por la estabilidad de la reacción al mantener
una duración prolongada por casi 1 hora, tiempo necesario para la lectura de la
muestra y para la elaboración de la curva de calibración con el estándar de
proteína de albúmina sérica bovina, nuestro valor hallado en la investigación es
comparable con estudios previos que cuantificaron en porcentaje de proteína en
la gelatina extraída de la piel de diferentes especies de pescado, tal es el caso
del estudio publicado por Cheow C. et al., 2007127 en el que hallaron el porcentaje
de proteína en la gelatina extraída de las pieles de la especie de pescado Johnius
dussumieri, el cual asciende 69,2±0,13, el cual es un valor muy aproximado al
encontrado en nuestro trabajo de investigación, no podemos dejar de citar un
estudio reciéntemente publicado y llevado a cabo en Brasil por Costa da Silva E.
et al., 2017128 en el que reportan que el porcentaje de proteína hallado en la
gelatina extraída a partir de la piel de la especie Brachyplatystoma filamentosum
fue de 72,76±2,02, cifra superior, pero muy similar a la encontrada en nuestro
ensayo de cuantificación proteica. Por otro lado, Muyonga J. et al., 20049,
informan que el porcentaje de proteína en la gelatina extraída de la piel de la
especie Lates niloticus es muy alta, variando entre 87,4 – 88,8% en ejemplares
jóvenes o adultos, de la misma forma establecen que el porcentaje de proteína
presente en las gelatinas extraídas está influenciado por factores de extracción
como la temperatura, además de lo ya citado como el estadío, origen de los
ejemplares y finalmente de la especie de la que se extrae la proteína; sin
embargo, si es comparado con nuestro ensayo, ambas metodologías coinciden
en algunos factores de extracción, como la temperatura de 60-70°C, pero
diferenciándose en el tiempo y pH de extracción. Según la investigación
publicada por Aleman A. et al., 201116 la gelatina extraída de las pieles de la
especie Thunnus spp. contiene un 89,6±1% de proteína, lo cual corresponde a
un valor muy alto en comparación con lo cuantificado en nuestro estudio, no
obstante, cabe resaltar que se trata de otra especie a partir de la cual se extrae
la gelatina. En una reciente publicación realizada por Thi C. et al., 201735
88
encontraron que el porcentaje de proteína en la gelatina extraída de las pieles
de la especie Perca fluviatilis fue de 88±0,4%, un valor ligeramente superior al
hallado en nuestro estudio con el empleo una metodología de extracción similar
a la nuestra, de otro lado podemos mencionar que se tratan de especies
diferentes, así mismo, es importante señalar que los trabajos de investigación
citados para este resultado emplearon métodos de cuantificación proteica
diferentes al de Bradford9,16,35,127,128.
Se analizó un total de 15 hidrolizados, dado que la misma muestra

(gelatina extraída de la piel de pescado), fue sometida a diferentes condiciones
hidrolíticas como pH, tiempo, temperatura y relación [enzima]:[sustrato], según
el diseño factorial tipo Plackett-Burman con tres puntos centrales, de esta
manera se procedió con la determinación del %GH, considerado un excelente
indicador sobre estado del proceso de hidrólisis enzimática, dado que nos
precisa la cantidad de enlaces peptídicos escindidos de la proteína inicial, y que
de acuerdo a estudios anteriores está influenciado por diferentes factores en el
proceso hidrolítico como tipo de enzima a emplear, temperatura, tiempo de
hidrólisis, relación enzima:sustrato, entre otros no menos importantes 129. En
nuestro caso la proteína colagenosa extraída de la piel de pescado fue sometida
a hidrólisis con alcalasa, y resulta como producto de esta reacción numerosas
cadenas de péptidos de diferentes tamaños y a la vez aminoácidos, todos ellos
libres en el medio de reacción (hidrolizado). Se empleó la metodología de
acuerdo al estudio publicado por Gómez-Guillen et al., 20106, no obstante, se
planteó diferentes condiciones para el proceso hidrolítico de las muestras (15),
evidenciándose la variación en cuanto a la temperatura (50, 60 y 70°C), pH (7, 8
y 9), tiempo de reacción (2, 3 y 4 horas) y relación [enzima]:[sustrato] ([1:20],
[1:35] y [1:50]), posteriormente se determinó el %GH de cada hidrolizado, de esta
manera se procede al análisis de la influencia de los factores en el proceso
hidrolítico6,129.
Para una mayor precisión en el análisis sobre la influencia de los factores a los
que se expuso la hidrólisis de las muestras, se determinó el %GH mediante dos
métodos, el primero de ellos por cuantificación de proteína soluble tratada con
89
ATC al 10% mediante el método de Biuret, y el segundo por cuantificación de
nitrógeno soluble en ATC al 10% a través del método de micro-Kjeldahl, de esta
manera se resumen los resultados obtenidos en las tablas 10 y 12, así como
también, en los gráficos respectivos. De tal análisis se desprende que todas las
muestras sobrepasan el 10% de GH, hasta un máximo de 33,21% hallado con el
método de Biuret, si se compara con los resultados hallados con el método de
micro-Kjeldahl, notamos una ligera variación en los valores reportados para el
%GH; sin embargo, se confirma también mediante el segundo método que todas
las muestras logran un GH mayor al 10%, lo cual nos indica altos valores
conseguidos. Así mismo, con los métodos de Biuret y micro-Kjeldahl se pudo
evidenciar que el mayor grado de hidrólisis reportado corresponde cuando la
muestra es hidrolizada bajo las condiciones de 60°C, contenida en un medio de
reacción correspondiente a un buffer de pH 8, tiempo de hidrólisis de 3 horas y
por último la relación de [enzima]:[sustrato] oportuna de [1:35], tales resultados
son contrastados con el GH de 47,52% reportados por Gómez-Guillen et al.,
20106 a los 150 minutos de la hidrólisis con la enzima alcalasa cuyo sustrato fue
la gelatina extraída de la piel del atún a condiciones pH 8, 50°C y relación de
enzima:sustrato de 1:20 (w:w), es importante destacar que en este estudio se
señala gráficamente que a partir de los 120 minutos el %GH tiene pequeñas
variaciones, así mismo se empleó un método diferente para la cuantificación del
grado de hidrólisis. Cabe destacar además la aproximación con nuestros
resultados el %GH de 25,6±2,0% alcanzado por hidrólisis de la gelatina de la piel
de atún con la enzima alcalasa, proceso que fue llevado a cabo bajo las
condiciones de pH 8, 50°C (consideradas como óptimas), además la [relación
enzima: sustrato] fue de [1:20 p:p] y durante un tiempo total de 3 horas según lo
indicado por Alemán A. et al., 201116, otra publicación llevada a cabo por García-
Moreno P. et al., 201410 señalan que el grado de hidrólisis alcanzado a partir de
los descartes de sardina varió entre 13,2 - 14,9% tratados con la combinación de
las enzimas alcalasa y tripsina a las condiciones de pH 8 y 50 °C y relación de
enzima:sustrato de 3% (p/p). Conforme a los resultados obtenidos la muestra
H509 hidrolizada a 50°C, pH 7, tiempo de 4 horas y [relación enzima: sustrato]
de [1:50], alcanzó uno de los grados de hidrólisis más altos 25,80% y 26,92%
90
con cada método, lo que es contrastable con las condiciones óptimas de
hidrólisis (pH 7 y 50°C) para la enzima alcalasa reportado según Kim S. et al.,
20107, de igual modo podemos citar a la investigación de Alemán A. et al.,
2011130, en el que encontraron un grado de hidrólisis entre 27,1±0,9 – 30,9±0,9%
como resultado del proceso hidrolítico de gelatina extraída de piel del pescado
Catfish con la enzima alcalasa a condiciones de 50°C y pH 8; sin embargo, en
una publicación reciente realizada por N. Greyling, 201764 indica intervalos
óptimos de las condiciones hidrolíticas (pH de 6 – 10 y temperatura 55 – 70°C)
a las cuales la enzima alcalasa alcanza valores altos en cuanto al grado de
hidrólisis, aclarando que depende a la vez del sustrato a hidrolizar. Por último
nuestros resultados son comparables con la evidencia científica actual llevada a
cabo por Blanco M. et al., 201751 en la cual someten a hidrólisis con la enzima
alcalasa a las gelatinas extraídas de las pieles de las especies Prionace glauca,
Scyliorhinus canicula, Xiphias gladius y Thunnus albacares bajo las condiciones
de 55 °C (considerada como óptima), ajuste de pH 8 con NaOH, [relación
enzima: sustrato] de [1:20] y durante un tiempo total de 3 horas, obteniendo un
GH de 16,52±3,74%, 15,80±0,99%, 12,56±1,79% y 11,49±1,5% para cada
especie mencionada respectivamente. No está de más indicar que los %GH
reportados por los estudios citados han sido determinados con el empleo de
diferentes metodologías, e incluso en algunos de ellos similares a las nuestras.
Así mismo, los resultados mostrados del grado de hidrólisis, hallados tanto por
el método de Biuret como por micro-Kjeldahl, sugieren la influencia de los
factores en el proceso hidrolítico enzimático, la cual fue analizada
estadísticamente, donde según las gráficas que corresponden al diagrama de
Pareto muestran que los factores de temperatura, pH, tiempo de hidrólisis y
relación [enzima:sustrato] influyen de manera positiva en dicha reacción
química-enzimática, en la cual no hay interacción entre los factores; sin embargo,
entre todos los cuatro que se consideran en el trabajo la influencia de [E/S] es
estadísticamente significativa, no obstante, no implica que los demás factores no
influyan en el proceso hidrolítico, tal como se aprecia en la gráfica de efectos
principales, en la que involucra que el mayor grado de hidrólisis obtenido fue a
las condiciones de 60 °C, pH 8, un tiempo de 3 horas y la relación
91
[enzima:sustrato] de [1/35], tales resultados parecen correlacionarse con los
reportados en investigaciones anteriores, por ejemplo el desarrollado por
Márquez M. et al., 199366 donde resalta la importancia de la concentración del
sustrato y producto sobre la cinética de hidrólisis de proteínas con la enzima
alcalasa a condiciones de 50°C y pH 8, así mismo determina la influencia del
tiempo en el grado de hidrólisis sobre proteínas de fuente vegetal. También se
encontró un estudio llevado a cabo por Yang A. et al., 201665 en el que relaciona
el %GH de la proteína de huevo influenciado por el factor tiempo (0-180 minutos),
donde se observa una meseta poco variable a partir de los 120 minutos en
adelante, así mismo se determinó las condiciones óptimas para la reacción
hidrolítica con alcalasa (pH 8 y 60°C). Por último Gbogouri G. et al., 2004131,
evaluaron la influencia de los factores temperatura, relación [enzima/sustrato] y
pH en la hidrólisis enzimática de las cabezas de la especie Salmo salar, con la
enzima alcalasa, obteniendo %GH de 11,50 – 17,30%, este último a condiciones
de [E/S] 5,2%, 57°C y pH 8, así mismo en esta investigación consideran que no
hay interacción entre los factores estudiados, lo cual concuerda con las
consideraciones halladas en nuestro ensayo y respectivos resultados. Pese a
que nuestros valores del grado de hidrólisis alcanzados y la vez comparados con
los obtenidos por otros investigadores son aproximados, no se han encontrado
estudios bajo una matriz experimental semejante a la trabajada en nuestro
análisis6,7,10,16,51,65,131.
Entre todas las actividades biológicas que se pueden demostrar para un

hidrolizado enzimático de proteínas de fuente animal o vegetal, la actividad
antioxidante se perfila como la de mayor interés y de gran investigación a nivel
mundial, y sin duda alguna si se trata de la proteína colagenosa extraída de
pescado, ya que la gelatina muchas veces proviene de partes singulares como
escamas, músculo, cabezas, huesos y de la piel27,32,67-69. Ante esta posibilidad
se evaluó in vitro la capacidad antioxidante de los hidrolizados enzimáticos de
gelatina mediante dos métodos, el primero por decoloración de la solución del
radical (DPPH●) y el segundo justificado por la decoloración de la solución de los
radicales relativamente estables de (ABTS●+)106,112,115.
92
Los resultados mostrados en las tablas 14 y 15, así como en la figura 19
corresponden a la capacidad antioxidante que presenta cada una de las
muestras hidrolizadas con alcalasa a diferentes condiciones de T°, pH, tiempo
de hidrólisis y relación [E:S], con el empleo del método del radical (DPPH●), a la
vez estos resultados se reportan mediante el IC50, que viene a ser la
concentración de la sustancia en evaluación necesaria para inhibir el 50% de los
radicales DPPH● presentes en la solución, de esta manera debe entenderse que
a menor IC50, mayor es la capacidad antioxidante, debido a que necesita menor
concentración para alcanzar la inhibición señalada, una clara muestra de ello
recae sobre los IC50 muy reducidos hallados para las sustancias estándares con
actividad antioxidante positiva, las cuales fueron 1,68 y 3,53 µg/mL para la
vitamina C y el Trolox correspondientemente. Así mismo, en relación a nuestras
muestras problema (hidrolizados), cabe destacar que el menor IC50, traducido
como la muestra que posee mayor capacidad antioxidante, compete al H7012
con un IC50 de 458,73 µg/mL que al ser contrastado con los valores de los
estándares de vitamina C y Trolox es mucho mayor, por otro lado, tenemos a los
hidrolizados que reportaron valores mayores de IC50 como el H7011 y H505 con
1830,46 y 1827,36 µg/mL respectivamente, tratándose los hidrolizados de menor
capacidad antioxidante. De acuerdo con los resultados alcanzados, estos
pueden ser contrastados según lo informado a través del estudio realizado por
Weng W. et al., 201449 en Japón, en el cual los péptidos aislados del hidrolizado
de gelatina extraída de la piel de la especie marina Prionace glauca, muestran
una alta propiedad antioxidante con valores de IC50 que varían entre 0,57 – 2,04
mg/mL, dicha propiedad fue evaluada mediante el método del radical DPPH ●,
cabe destacar que en este estudio se empleó la enzima comercial Protamex; sin
embargo, bajo condiciones de hidrolisis parecidas. Por último Wang B. et al.,
2013132 reportan que lograron aislar tres péptidos provenientes de la hidrólisis de
colágeno de las escamas de Pseudosciaena crocea, a la vez señala que el
proceso enzimático fue seriado con dos enzimas, tripsina y pepsina, obteniendo
de esta manera el hidrolizado que contiene tres péptidos caracterizados con
propiedades antioxidantes con IC50 de 1,271, 0,675, y 0,283 mg/mL, evaluados
mediante el método de radical DPPH●, donde podemos notar que estos valores
93
son muy comparables a los hallados en el presente estudio. No es de menor
importancia el sustento hallado por Nakchum L. et al., 2015133 al obtener un
hidrolizado con alcalasa del colágeno de la piel de calamar que demuestra,
mediante el método in vitro del radical DPPH●, tener propiedad antioxidante con
un IC50 equivalente a 417,43 µg/mL49,132,133.
La propiedad antioxidante de las muestras problema también fue evaluada con
el método del radical (ABTS●+), la justificación radica en que a través de este
método puede evaluarse antioxidantes hidrofóbicos e hidrofílicos, ello sumado a
que la gelatina contiene ambos tipos de péptidos 135. Para este ensayo de
decoloración fue necesario hallar el IC50 (12,38µM) del estándar Trolox que
posee actividad antioxidante positiva, como también el IC50 de todas muestras
hidrolizadas bajo diferentes factores de hidrólisis (temperatura, tiempo, pH y
relación [enzima:sustrato], no obstante, los resultados fueron expresados como
valores TEAC (Capacidad Antioxidante en Equivalentes Trolox) en unidades de
(µmol Trolox/g de hidrolizado proteico), que nos indica la concentración de la
solución estándar Trolox en µmol, que posee la capacidad antioxidante
equivalente a los gramos de la muestra problema evaluada, precisamente los
valores más altos de TEAC conllevan a que la muestra evaluada posea mayor
actividad antioxidante, de esta manera en nuestros resultados las mayores
capacidades antioxidantes las presentaron H7012, H508, H504 y H509 con
valores TEAC de 165,38, 143,79, 128,32 y 109,08 µmol Trolox/g de hidrolizado
proteico respectivamente, muy por el contrario los menores valores TEAC fueron
mostrados por H7011 y H7013 con valores TEAC de 61,76 y 72,12 µmol Trolox/g
de hidrolizado proteico en el orden que corresponde. En comparación con lo
obtenido, resultados semejantes han sido hallados por Sai-Ut S. et al., 2014134
quienes hidrolizaron la gelatina extraída de la piel de la especie Unicorn
leatherjacket con dos enzimas, una de ellas siendo una proteasa de B.
amyloliquefaciens y la segunda concerniente a la alcalasa, logrando obtener en
los hidrolizados valores TEAC de 66 y 48 µmol Trolox/g de hidrolizado proteico,
respectivamente, es importante señalar que en esta investigación se relaciona
directamente el grado de hidrólisis con la actividad antioxidante, la cual es
valorada a través del método ABTS●+; sin embargo, el proceso hidrolítico se llevó
94
a cabo condiciones fijas de pH, temperatura y relación enzima: sustrato, variando
únicamente el tiempo de hidrólisis. En la investigación llevada a cabo por
Karnjanapratum S. et al., 2017135 demostraron la capacidad antioxidante,
mediante el método del radical ATBS, tanto del hidrolizado de gelatina extraída
de Aluterus monoceros como de dos fracciones peptídicas liberadas en la
hidrólisis enzimática con glicil endopeptidasa parcialmente purificada, reportando
valores los TEAC para el hidrolizado de 65,49 µmol Trolox/g de hidrolizado, para
la primera fracción peptídica 82,46 µmol Trolox/g de péptido y para segunda
fracción peptídica 9,31 µmol Trolox/g de péptido. Algunos de los valores
referenciados son considerados bajos de acuerdo a lo descrito por autores,
quienes señalan que hidrolizados tratados con la enzima proteolítica alcalasa
logran mejores propiedades antioxidantes a través de la inhibición de radicales
libres136. De acuerdo a los resultados expuestos en la tabla 18 podemos
evidenciar que las muestras que poseen mayor actividad antioxidante H7012,
H508, H504 y H509, no corresponden necesariamente a las que poseen mayor
%GH, sin embargo, por la presencia de las fracciones peptídicas liberadas
pueden estas aumentar la potencia de dicha propiedad, siendo necesario la
determinación de la secuencia peptídica, así como del tamaño molecular134,135.
Es importante indicar que en la figura 20 y la 21 (de interpretación inversa), así
como 24 y 25, muestran el análisis e interpretación estadística sobre las
condiciones hidrolíticas que afectan en la obtención de hidrolizados con
propiedad biológica antioxidante, tanto para la evaluación mediante el método
del radica DPPH●, como para el radical ABTS●+, dicho antecedente es
corroborado por P. García Moreno et al., 201410 donde indica que tanto el
sustrato, método de hidrólisis enzimático y las condiciones de temperatura, pH,
relación [E:S] y duración influyen en la ruptura proteica, por ende, en la obtención
de péptidos con propiedad antioxidante, y que al contrastar con la gráficas de
Pareto, efectos normales estandarizados y efectos principales resultantes, nos
indica que los factores tiempo, temperatura, pH y relación [enzima/sustrato]
influyen en la obtención de hidrolizados con actividad antioxidante; sin embargo,
los factores antes mencionados por no tener interacción entre ellos, se realiza el
análisis de las condiciones de tiempo, pH y relación [enzima/sustrato], hallando
95
de esta manera que los factores de pH y tiempo son estadísticamente
significativos, por tanto, según los antecedentes encontrados, y en adición a lo
hallado en nuestro trabajo, el hidrolizado de gelatina de piel de pescado se perfila
con un potencial efecto antioxidante, sin embargo, aunque los resultados se
aproximan a las referencias señaladas no se han hallado estudios con una matriz
experimental semejante a la considerada en nuestro trabajo 10.
Es de gran importancia indicar que pese a las frecuentes investigaciones no se
ha establecido el mecanismo de acción exacto de los péptidos con actividad
antioxidante, motivo por el cual se ha estudiado y reconocido que los péptidos
derivados de la hidrólisis de gelatina de pescado están conformados por
aminoácidos hidrofóbicos y, en el caso de nuestro estudio se demuestra la
propiedad antioxidante por inhibición de radicales libres in vitro47,80,135.
Si bien es cierto los estudios acerca de la propiedad antimicrobiana que

presentan los péptidos como resultado de la hidrólisis enzimática de especies
marinas son muy escasas, no obstante, en los últimos años ha aumentado
considerablemente el interés de parte de los investigadores por demostrar tal
actividad biológica, en relación con nuestro trabajo de investigación se determinó
dicha bioactividad atribuida a los hidrolizados enzimáticos de la gelatina extraída
de la piel del pescado “Bonito” con uso de la enzima alcalasa, es importante
señalar que como producto de la reacción hidrolítica a diferentes condiciones se
liberan péptidos y aminoácidos contenidos en cada uno de los hidrolizados, en
ese sentido se evaluó mediante dos métodos, siendo el primero por difusión en
agar, logrando los resultados descritos en la tabla 20, y el segundo por el método
de microdilución/colorimétrico, encontrando los resultados detallados en la tabla
23. Del total de 15 muestras que corresponden a los hidrolizados obtenidos, no
todos demostraron tener función bioactiva antimicrobiana, tal como se muestran
en la tabla de resultados para la prueba de difusión en pozo, de este modo en
H601, H602, H603, H504, H508, H509, H7010 y H7014 se evidenció actividad
antimicrobiana baja a intermedia con halos menores iguales a 15,5 mm
(considerando el diámetro del pozo), reportando sensibilidad solo las cepas
clínicas de Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis en algunos casos.
96
Consecuentemente, tales muestras que evidenciaron actividad por la prueba
anterior fueron consideradas para el ensayo de microdilución/colorimétrico,
hallando que gran parte de estas, muestran una concentración mínima inhibitoria
mayor o igual a 500 µg/mL, lo cual corresponde a una actividad baja, o sin
actividad en casos de CMI mayores a 1000 µg/mL; sin embargo, con la muestra
H504 las bacterias Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis mostraron
sensibilidad a una CMI de 500 µg/mL125. Si bien es cierto y conforme a los
resultados, se evidencia bioactividad antimicrobiana en algunas de muestras
hidrolizadas, a la vez, estas mismas muestras presentan variabilidad en cuanto
a las dos pruebas que fueron sometidas respectivamente, esta alteración puede
ser justificada inicialmente por las características propias de todos los
componentes del hidrolizado (proteínas no hidrolizadas de diferentes tamaños,
péptidos, aminoácidos, entre otros), entre ellas la solubilidad, peso molecular,
polaridad, estructura y composición que influyen directamente tanto en la
interacción con el microorganismo como en medio de crecimiento de los
mismos, basándonos en lo anteriormente descrito, no se espera una
correspondencia de resultados respecto al ensayo de microdilución
colorimétrica7,138.
En consideración con nuestros resultados hallados para el primer ensayo, estos
fueron comparados con el estudio realizado por Gómez-Guillen et al., 20106, en
el cual según lo reportado, guarda relación en cuanto a la propiedad
antimicrobiana que se le atribuye a los péptidos aislados del hidrolizado
enzimático de la gelatina extraída de la piel de Atún, cabe señalar que en este
estudio el ensayo de difusión en disco se realizó con 18 cepas diferentes en las
que se muestran variada sensibilidad en cada microorganismo, siendo baja para
Staphylococcus aureus, con un halo de inhibición menor a 2,5 mm; sin embargo,
en dicho estudio también se reporta una baja actividad contra P. aeruginosa y E.
coli, microorganismos que según nuestros resultados no son sensibles con las
muestras de hidrolizado de gelatina extraída de las piel de Bonito, lo que sugiere
una purificación de los péptidos obtenidos en nuestras muestras hidrolizadas
para una mayor seguridad contra los microrganismos que no tuvieron resultados
positivos. Asimismo, Vinoth L., 2013137 demostró la propiedad antimicrobiana de
97
los hidrolizados enzimáticos de la proteína de la piel de la especie Arothron
stellatus tratada con alcalasa, con el empleo del método de difusión en disco
logró obtener halos de inhibición de 9 mm y 6 mm contra Staphylococcus aureus
y E. coli respectivamente. En consideración con una investigación llevada a cabo
por Song R. et al., 2012138 optimizaron la actividad antimicrobiana de los
hidrolizados obtenidos con seis enzimas diferentes del músculo de la especie
Setipinna taty, de todas las enzimas, el hidrolizado de pepsina demostró mayor
actividad antimicrobiana que los demás, que al igual que en nuestro estudio se
analizó dicha propiedad biológica bajo dos ensayos, el primero de ellos por el
método de difusión en pozo de agar, obteniendo halos de inhibición de 17,7, 11,3
y < 6 mm contra E. coli, Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis
respectivamente, añadiendo a los pozos 25 µL de hidrolizado a una
concentración de 113,5 µg/mL, los resultados por aplicación de la segunda
metodología de concentración mínima inhibitoria (CMI) fueron de 28,38 µg/mL
contra E. coli y > 113,50 µg/mL contra Staphylococcus aureus, pero no fue
determinada para Bacillus subtilis, estos resultados demuestran una mayor
actividad antimicrobiana en comparación con lo reportado en nuestro estudio, lo
que sugiere una alta importancia en la selección de la enzima proteolítica a
emplear así como del sustrato y sus respectivas condiciones de hidrólisis que
son los factores diferenciales identificados, adicionalmente en este estudio se
evidencia el posible mecanismo de acción de los péptidos contenidos en los
hidrolizados enzimáticos, a través del daño en una macromolécula principal de
la célula bacteriana como es la membrana celular, que mediante microscopía
electrónica se observa la destrucción irreparable de dicha membrana. De igual
forma, una publicación reciente llevada a cabo por Jemil I. et al., 2017141
hidrolizan el músculo de Sardinella aurita con el crudo enzimático de Bacillus
subtilis A26, obteniendo de esta manera el respectivo hidrolizado que demuestra
actividad antimicrobiana, para ello se empleó el método de difusión en pozo
únicamente contra E. coli, obteniendo un diámetro de inhibición máximo de 17
mm, así mismo reportan la CMI contra Staphylococcus aureus y E. coli con 2,475
y 0,619 mg/mL, cabe destacar que en este estudio a diferencia del nuestro no
emplean como sustrato de hidrólisis a la gelatina extraída de piel de pescado, ni
98
la enzima alcalasa, que reportan que su uso en reacciones hidrolíticas favorece
la obtención de péptidos con alta actividad biológica136. Por último Sila A. et al.,
2013139 refiere que los hidrolizados de la proteína muscular de la especie B.
callensis, con %GH de 5,1, 6,6, 10,45 y 14,53% tratados con la enzima alcalasa,
poseen la propiedad biológica antimicrobiana contra E. coli y Staphylococcus
aureus, demostrada mediante el método de difusión en agar, en el que se añadió
20 µL a una concentración de 1mg/mL, logrando de esta manera halos de
inhibición de < 5 mm, hasta > de 15 mm; sin embargo, una de las fracciones
peptídicas purificadas del hidrolizado con GH de 10,45% mostró zonas de
inhibición mayores a 15 mm para los microorganismo E. coli, Staphylococcus
aureus, y otras medidas para Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae
y Micrococcus luteus, entre otros, lo que evidencia que con la purificación de
péptidos de acuerdo a su tamaño, que están contenidos en los hidrolizados, se
logra mayor actividad contra los microorganismos estudiados, entre ellos,
patógenos para la población humana. De acuerdo con los trabajos de
investigación citados, guardan cierta relación en cuanto a los resultados
hallados, lo que condice que los hidrolizados de la gelatina extraída de la piel del
pescado Bonito, probablemente contienen péptidos con actividad
antimicrobiana, no obstante, aunque los resultados reportados se aproximen a
los estudios señalados, no se han encontrado alguno con una matriz de
experimentación cercana a lo considerado en esta investigación. De los
resultados expuestos anteriormente se aduce que los hidrolizados que presentan
actividad antimicrobiana corresponden a aquellas muestras que lograron un alto
grado de hidrólisis, hallando una correlación directa entre el %GH con la
bioactividad antimicrobiana, además en concordancia con los resultados del
análisis factorial que indica que el factor de hidrólisis de pH tiene una influencia
estadísticamente significativa para la obtención de hidrolizados con actividad
antimicrobiana, sin embargo, los demás factores también influyen en la
generación de los mismos. Asimismo, es notable resaltar que en los trabajos
previos no se ha establecido de manera precisa sobre el mecanismo de acción
de los péptidos, liberados por hidrólisis de la proteína nativa, con la propiedad
biológica en discusión, empero, algunos autores señalan con limitadas
99
evidencias que los péptidos con actividad antimicrobiana, son de bajo peso
molecular, de tal manera que la composición por aminoácidos, carga y su
tamaño determina la propiedad del mismo, logrando interacción entre estos
péptidos y algunos componentes de la membrana celular 7, 138.
100
VII. CONCLUSIONES
• Se extrajo la gelatina a partir de los residuos correspondientes a las pieles
de la especie Sarda chiliensis chiliensis “Bonito” con un rendimiento de
15.86%.
• Las condiciones de hidrólisis de temperatura, pH, tiempo y relación

[enzima/sustrato], influyen en el %GH de gelatina con la enzima alcalasa,
logrando 33.21 – 11.24% y 33.33 – 10.05%, analizados mediante el
método de Biuret y Micro-Kjeldahl respectivamente.
• Los hidrolizados de la gelatina de piel de pescado tratados con alcalasa

presentan actividad antioxidante analizados por los métodos del radical
DPPH●, donde la muestra H7012 posee el menor IC50 458.73 µg/mL, y el
mayor IC50 1830.46 µg/mL corresponde a la muestra H7011, y del radical
ABTS●+, al lograr el mayor y menor TEAC de 165.38 – 61.76 mol Trolox/g
hidrolizado proteico, para las muestras H7012 y H7011 respectivamente.
• Los hidrolizados de gelatina de piel de pescado H601, H602, H603, H504,

H508, H509, H7010 y H7014 poseen actividad antimicrobiana al presentar
halos de inhibición de crecimiento (< 15.5mm) contra Staphylococcus
aureus, y Bacillus subtilis (excepto H508 y H7010). Así mismo, poseen
una CMI del crecimiento de Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis
mayores o iguales de 500 µg/mL, por lo cual presentan una baja actividad
antimicrobiana.
101
VIII. RECOMENDACIONES
• Rigurosa limpieza, lavado y tratamiento con NaOH para eliminación de la

grasa y proteína diferente a la gelatina presente en las pieles
recolectadas.
• Optimizar las condiciones del proceso de extracción de la gelatina de la

piel de pescado, en referencia al tiempo, temperatura y lavados
sucesivos, para lograr un mayor rendimiento.
• Optimizar las condiciones hidrolíticas para la enzima alcalasa, respecto a

la temperatura, tiempo, pH y relación [enzima/sustrato].
• Separar y establecer la composición aminoacídica de las fracciones

peptídicas presentes en los hidrolizados enzimáticos de gelatina de
pescado.
• Separar e identificar las fracciones peptídicas presentes en los

hidrolizados, responsables de la actividad antimicrobiana.
• Separar e identificar las fracciones peptídicas presentes en los

hidrolizados, responsables de la actividad antioxidante.
102
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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119
X. ANEXOS
Anexo 1. Proceso de obtención de gelatina de piel de pescado
120
Anexo 2. Curva de calibración con el estándar de la proteína albúmina
sérica bovina (BSA), para la cuantificación de proteína total mediante el
método de Bradford
[µg/mL] Abs. ( 5λ5 nm)

0 0
250 0.16221
350 0.19504
450 0.25788
550 0.32579
650 0.38317
750 0.43053
Diluciones y absorbancias correspondientes del estándar BSA para la

elaboración de la curva de calibración.
Curva de calibración BSA

0.5
0.45 y = 0.0006x + 0.004
Absorbancia ( 5λ5 nm)
0.4 R² = 0.9966
0.35
0.3
0.25
0.2 Lineal (Series1)
0.15
0.1
0.05
0
0 200 400 600 800
[µg/mL]
Curva de calibración con el estándar de proteína de albúmina sérica bovina

(BSA).
121
Anexo 3. Curva de calibración con el estándar de la proteína albúmina
sérica bovina (BSA), para la cuantificación de proteína total mediante el
método de Biuret
[mg/mL] Abs. ( 550 nm)

2 0.1238
2.5 0.14326
5 0.30008
7.5 0.44455
10 0.57419
12.5 0.74112
Diluciones y absorbancias correspondientes del estándar BSA para la

elaboración de la curva de calibración.
CURVA CALIBRACIÓN BSA

0.8
0.7 y = 0.0585x + 0.003

R² = 0.9989
Absorbancia ( 550 nm)
0.6
0.5
0.4
Lineal (Series1)
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15
[mg/mL]
Curva de calibración con el estándar de proteína de albúmina sérica bovina

(BSA).
122
Anexo 4. Evaluación del grado de hidrólisis mediante el método de micro-Kjeldahl.
DIGESTIÓN DESTILACIÓN TITULACIÓN

• Tomar en un matraz micro- • Trasvasar a un balón la solución • Homogenizar la solución
Kjeldhal el volumen equivalente obtenida de la etapa anterior. obtenida de 15 mL destilado.
a 25 mg de muestra seca. • Agregar 8 -10 mL de la solución • Titular la solución con HCl 0.01N
• Agregar los reactivos de hidróxido de sodio-tiosulfato estandarizado.
necesarios como K2SO4, HgO y de sodio, y someter a • Registrar el volumen del gasto
H2SO4 (peso específico 1.84, caletamiento. de HCl 0.01N en la titulación
libre de nitrógeno). • Recepcionar 15 mL del destilado hasta el viraje de color del
• Digerir a temperatura de en un matraz que contiene 5 mL indicador.
ebullición por 1.5 horas. de Sol. Sat. de H3BO3 y II-IV • Titular un blanco, y realizar los
gotas del indicador. cálculos correspondientes
Diagrama de flujo de la metodología de micro-Kjeldahl empleada para la cuantificación del nitrógeno en las muestras
123
Anexo 5. Coloración de las microplacas para evaluación de la actividad
antimicrobiana de los hidrolizados enzimáticos
Resultado en microplaca para el hidrolizado enzimático H601.

Leyenda: CE: Control de Esterilidad, CP: Control Positivo
Resultado en microplaca para el hidrolizado enzimático H7014.

Leyenda: CE: Control de Esterilidad, CP: Control Positivo
124
Anexo 6. Gráfica de análisis estadístico de la determinación del grado de
hidrólisis por cuantificación de proteína soluble mediante el método de
Biuret
Gráfica de probabilidad normal, donde la distribución acumulada de los residuos

se ajusta a recta obtenida como una normal, en tanto, la hipótesis de normalidad
no es vulnerada.
Anexo 7. Gráfica de análisis estadístico de la determinación del grado de

hidrólisis por cuantificación del nitrógeno soluble por el método de micro-
Kjeldahl
Gráfica de la normal de efectos estandarizados, los efectos más distantes de “0”

hacia ambas direcciones, son estadísticamente más significativos, la dirección
del efecto debido al factor [E/S] es negativo, es decir, disminuye el efecto al
cambiar del valor bajo al valor alto.
125
Anexo 8. Gráfica de interacción entre los factores pH VS [E/S] resultado del
análisis estadístico de la determinación del grado de hidrólisis por el
método de micro-Kjeldahl
Gráfica de interacción de factores pH y [E/S], en el diseño factorial experimental

tipo Plackett Burman, se considera que no existe interacción de los factores.
Anexo 9. Gráfica de análisis estadístico de la determinación de la actividad

antioxidante mediante el método del radical (DPPH●)
Gráfica de probabilidad normal, los puntos (residuos) se aproximan a la recta,

por consiguiente, la distribución es normal, en consecuencia, la hipótesis de
normalidad no se vulnera.
126
Anexo 10. Actividad antimicrobiana de los hidrolizados mediante el método
de difusión en agar-pozo
H7013
H506
H505
H508 H7014
H507
H7015
Actividad antimicrobiana de los hidrolizados mediante el método de difusión en

pozo contra Staphylococcus aureus.
H601
H509 H7010
H602
H603
H7012
H504 H7011
Actividad antimicrobiana de los hidrolizados mediante el método de difusión en

pozo contra Bacillus subtilis.
127

Tejada Pe

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América

«Actividad antimicrobiana y antioxidante del

A mis padres, María Elsa y Bartolomé,

A mis hermanos, Germán, Erick, Roxana,

A mis padrinos, Leonie y Eduardo, por la

A mi querida Alma Máter, la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por

A la Dra. Elizabeth Carranza Alva, quién estuvo siempre presta a absolver

A los miembros del Jurado Examinador y Calificador, (Presidente: Dr. Américo

A los Laboratorios de Bioquímica y Microbiología que me facilitaron sus

A mis amigos quienes estuvieron presentes en esta interesante travesía, Paola,

RESUMEN ...................................................................................................... XIII

ABSTRACT ..................................................................................................... XIV

1.1. Objetivo general ....................................................................................3

1.2. Objetivos específicos .............................................................................3

1.3. Hipótesis ................................................................................................3

II. ANTECEDENTES .....................................................................................4

III. MARCO TEÓRICO ...................................................................................9

3.1. Actividad pesquera y subproductos generados .....................................9

3.2. Descripción de la especie marina ........................................................ 11

3.3. Colágeno ............................................................................................. 12

3.4. Gelatina ............................................................................................... 14

3.5. Hidrólisis .............................................................................................. 16

3.6. Grado de hidrólisis ............................................................................... 20

3.7. Enzimas proteolíticas........................................................................... 22

3.8. Actividad biológica de hidrolizados enzimáticos de proteínas ............. 25

IV. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................... 32

4.1. Materiales, equipos y reactivos ........................................................... 32

4.2. Métodos y técnicas .............................................................................. 35

4.2.1. Diagrama del procedimiento general de métodos de

4.2.2. Recolección, transporte y almacenamiento de la muestra ............ 36

4.2.3. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno .............. 37

4.2.4. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford . 41

4.2.6. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de proteína

4.2.7. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del

4.2.8. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

4.2.9. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

4.2.10. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el método

4.2.11. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria mediante el

4.3. Análisis estadístico .............................................................................. 57

5.1. Obtención de gelatina por hidrólisis parcial del colágeno .................... 58

5.2. Cuantificación de proteína total mediante el método de Bradford ....... 58

5.3. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación de proteína

5.4. Determinación del grado de hidrólisis por cuantificación del nitrógeno

5.5. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

5.6. Determinación de la actividad antioxidante mediante el método del

5.7. Determinación de la actividad antimicrobiana mediante el método de

VI. DISCUSIÓN ............................................................................................ 86

VII. CONCLUSIONES ................................................................................. 101

VIII. RECOMENDACIONES ......................................................................... 102

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 103

X. ANEXOS ............................................................................................... 120

IC50: Concentración inhibitoria 50.

TEAC: Capacidad antioxidante equivalente al Trolox

ECA: Enzima convertidora de la angiotensina

DPP-IV: Dipeptidil peptidasa-4

FRAP: Ferric Reducing Ability of Plasma (capacidad reductora férrica del

BHT: Butil hidroxitolueno

GH: Grado de hidrólisis.