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    Examen Final 2020 I

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    Elian Herrera Leon
    El documento describe dos métodos para purificar una enzima bacteriana que degrada un antibiótico. El Método A involucra precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad y filtración por gel, mientras que el Método B usa precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de adsorción e intercambio iónico. El Método B produce una mayor actividad específica de la enzima y un factor de purificación más alto, por lo que es el método preferido. La actividad específica es una medida ú

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    El documento describe dos métodos para purificar una enzima bacteriana que degrada un antibiótico. El Método A involucra precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad y filtración por gel, mientras que el Método B usa precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de adsorción e intercambio iónico. El Método B produce una mayor actividad específica de la enzima y un factor de purificación más alto, por lo que es el método preferido. La actividad específica es una medida ú

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    Examen final 2020 I

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    El documento describe dos métodos para purificar una enzima bacteriana que degrada un antibiótico. El Método A involucra precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad y filtración por gel, mientras que el Método B usa precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de adsorción e intercambio iónico. El Método B produce una mayor actividad específica de la enzima y un factor de purificación más alto, por lo que es el método preferido. La actividad específica es una medida ú

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    El documento describe dos métodos para purificar una enzima bacteriana que degrada un antibiótico. El Método A involucra precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad y filtración por gel, mientras que el Método B usa precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de adsorción e intercambio iónico. El Método B produce una mayor actividad específica de la enzima y un factor de purificación más alto, por lo que es el método preferido. La actividad específica es una medida ú

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    Examen Final de Prácticas de Enzimología

    1. Una enzima bacteriana que metaboliza la destrucción de un antibiótico ha sido


    estudiada en vías de obtener un método de purificación de la misma. La enzima
    cataliza la destrucción del antibiótico según una reacción que puede seguirse
    espectrofotométricamente a 540 nm con un coeficiente de extinción de 10 mM-
    1cm-1. La actividad del extracto crudo se determinó empleando una alícuota de 10
    microlitros que produjo la aparición de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos.
    Luego se intentaron dos protocolos de purificación a partir de un extracto crudo que
    tenía una concentración de proteína de 2 mg/ml en un volumen de 5 litros. La
    primera etapa, común a los dos protocolos, fue una precipitación con sulfato de
    amonio, etapa en la que se obtuvo un 60% de rendimiento y una purificación de 5
    veces. El precipitado se redisolvió en 100 ml y con la mitad del material se realizó
    una cromatografía de afinidad seguida de una filtración por gel recogiéndose en esta
    última 25 ml con una actividad de 10 U/ml y una concentración de proteína de 2
    mg/ml (método A). La otra mitad se sometió a una cromatografía de adsorción-
    seguida de una de intercambio iónico obteniéndose un volumen de 5 ml con una
    actividad de 20 U/ml y una concentración de proteína de 1 mg/ml (método B).
    A) Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finales obtenidas
    con cada método de purificación.

    B) Indique cuál método (A o B) emplearía para purificar la proteína y por qué.


    Emplearía el método B, ya que su actividad especifica es alta (20U/mg) a
    comparación de la demás y su factor de purificación es 100, el cual 4 veces
    mayor al del método A.

    C) Explique por qué se utiliza la medida de actividad específica


    Nos ayuda a observar de manera cuantitativa la purificación de una enzima ya
    que es el coeficiente de la actividad de esa enzima con respecto a las proteínas
    totales. Cuando la actividad aumente y la cantidad de proteínas disminuya, la
    actividad especifica tendrá un mayor valor. Además, se usa para la fabricación
    de medicamentos, se debe saber cuánta será la cantidad de proteína necesaria
    para obtener la actividad enzimática requerida en ese medicamento.

    2. Suponga que usted necesitara purificar parcialmente a la enzima glutatión


    peroxidasa de hígado de rata. Explique con detalle qué debería conocer o averiguar
    acerca de la enzima para realizar el protocolo de purificación y cómo lo haría.

    Glutatión peroxidasa
    2GSH + ROOH GSSG + ROH + H20
    - Primero se debe conocer a la enzima de interés. Conocer bien su reacción sus
    propiedades (tamaño, pH, temperatura donde es estable, hidrofobicidad,
    punto isoeléctrico, etc). Esto para saber que métodos de purificación serán los
    más convenientes.
    - pH: Para conocer a que pH es estable la enzima se puede incubar con su
    sustrato a diferentes pH, en el rango donde la actividad enzimática sea mayor,
    será donde la enzima sea más estable.
    - Temperatura: la enzima y su sustrato se incuban en diferentes temperaturas y
    en donde la actividad enzimática sea mayor ahí será donde la enzima sea
    estable.
    - A la hora de la purificación, luego de cada método siempre separar una
    alícuota del sobrenadante o precipitado donde se crea que esta la mayor
    cantidad de enzima para medir su actividad; para luego colocar los datos en
    una tabla de purificación y verificar los procedimientos.

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