INMUNOLOGÍA (301EG)

GUÍAS DE LABORATORIO
Por: David J. Pérez C., MyB, Msc.

INTRODUCCIÓN
TÓPICOS BÁSICOS SOBRE EL INMUNOENSAYO

Las técnicas de análisis para el diagnóstico y la investigación biológica que se derivaron del estudio del sistema
inmunológico son comúnmente conocidas como inmunoensayos. Más estrictamente, bajo este concepto se
categorizan un gran conjunto de variantes tecnológicas que tienen como característica esencial la inducción de
complejos inmunes (i.e. inmunocomplejos) para su ulterior detección. Dichas estructuras se forman tras la
interacción de anticuerpos, antígenos y, en ocasiones, componentes del sistema del complemento. En contraste,
la inmunología ha diseñado técnicas que se valen del componente celular del sistema inmune (i.e. gl óbulos
blancos o leucocitos), y que no están basadas en inmunocomplejos, por lo cual son incorrectamente nombradas
“inmunoensayos”. La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es el proceso de formación de inmunocomplejos.
Antes de desarrollar los aspectos teóricos que explican este último fenómeno, es preciso introducir algunos
conceptos iniciales, mismos que deben ser memorizados, entendidos y aprehendidos por el estudiante.

1. Anticuerpo

Los anticuerpos (Acs) son macromoléculas de naturaleza glucoproteica sintetizadas por los plasmocitos o células
plasmáticas (i.e. linfocito B maduro, funcional y activo). Es común referirse a los Acs con otros nombres según la
condición en la que sean considerados, a saber, precipitinas (pruebas de precipitación), aglutininas (pruebas de
aglutinación), crioaglutininas (Acs que aglutinan a bajas temperaturas, normalmente son del tipo IgM), opsoninas
(en reacciones de interacción y cobertura de un blanco molecular dado), entre otros. Quizá el descriptor más
adecuado se deriva de los resultados de movilidad de las proteínas del suero en una electroforesis. La serología
estudia la reactividad y las propiedades de dichas proteínas. El patrón electroforético de las proteínas del suero
humano, revelado por densitometría, queda resumido en el siguiente electroferograma:
Cuadro 1.
Albúmina (60-70%): Principal proteína del suero.

α 1 (1.4-2.9%): Antitripsina, proteína de unión al retinol (RBP), globulina

fijadora de tiroxina (TBG), fetoproteína α1 (AFP), inhibidor de proteasa
α1 , glucoproteína ácida α1 (AAG), lipoproteína de alta densidad (HDL),
protrombina.

α 2 (7-11%): Ceruloplasmina, transcortina (CBG), haptoglobina,

macroglobulina α2 .

β (8-13%): Hemopexina, transferrina, β 2 microglobulina (BMG), proteína

C reactiva (PCR), lipoproteína de baja densidad (LDL).

γ (9-16%): Anticuerpos (i.e. IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

Como se ve, la separación de los componentes proteicos de la fracción sérica de la sangre humana muestra una
clara agrupación por carga y tamaño molecular. Los hallazgos cristalográficos posteriores sugirieron que la unidad
estructural cuaternaria de todas las proteínas presentes en las cuatro primeras fracciones (i.e. α 1, α 2, β, γ) asumía
una conformación globular, de ahí el calificativo de globulinas. Asimismo, el examen funcional de la fracción
gamma (i.e. γ, gammaglobulinas) concluyó que este grupo de proteínas desempeñaba un papel inmune en el
organismo, derivando en el concepto de inmunoglobulinas (Ig). En consecuencia, gammaglobulina e
inmunoglobulina son palabras sinónimas de anticuerpo.

Desde el punto de vista estructural, las inmunoglobulinas son heterotetrámeros compuestos por dos cadenas
pesadas idénticas (i.e. cinco isotipos: α, δ, ε, γ, µ) y dos cadenas livianas idénticas (i.e. dos isotipos: λ, κ), que,
partiendo de los isotipos existentes para cada una, pueden formar hasta diez combinaciones diferentes (v.gr. α 2λ2,
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α 2κ2 , γ2λ2, γ2κ2, etc.). Los Acs toman su nombre de la cadena pesada, así: IgA (α), IgD (δ), IgE (ε), IgG (γ), IgM (µ).
Partiendo del heterotetrámero como unidad, estas moléculas se caracterizan por tener una forma en “Y” y, en los
fluidos corporales, desarrollan una tendencia a permanecer como monómeros (i.e. IgD, IgE e IgG) o a agruparse
en dímeros (i.e. IgA) y pentámeros (i.e. IgM). Los puntos de unión o parátopos se ubican en cada extremo de la
“Y” por lo que, en su estado monomérico, los anticuerpos poseen una valencia de 2 (i.e. IgD, IgE e IgG), los dímeros
de 4 (i.e. IgA) y los pentámeros de 10 (i.e. IgM). En el siguiente cuadro se resumen las generalidades “anatómicas”
de los anticuerpos y algunas de sus propiedades de unión:
Cuadro 2.
Complementariedad: Coincidencia tridimensional topológica entre el punto de unión
del Ac (i.e. parátopo) y el sitio blanco en el Ag (i.e. epítopo). El modelo llave-cerradura
se usa para dar una idea de la situación natural. La estabilidad de la unión depende
de las interacciones moleculares no covalentes: puentes de H (O-H-O, N-H-N y O-H-
N), interacciones electrostáticas (i.e. -NH3 + y –COO-), Van der Waals e interacciones
hidrofóbicas (i.e. las más abundantes). La complementariedad es principalmente
afectada por el pH, la temperatura y la presencia de agentes caotrópicos.

Especificidad: Nivel de coincidencia entre un parátopo y un epítopo dado . Determina

la capacidad para distinguir un Ag inmunógeno de uno no inmunógeno . Está en
función directa al grado de complementariedad. Según la especificidad, los Acs son:

a) Monoclonales: Reconocen y se unen a un solo tipo de epítopo de un Ag dado.

Son normalmente obtenidos por la técnica del hibridoma.

b) Policlonales: Reconocen y se unen a varios tipos de epítopos de un Ag dado. Se

obtienen del suero de animales axénicos gnotobióticos que han sido retados con
el Ag de interés.

Afinidad: Suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre los puntos de
interacción de un parátopo (Ac) y un epítopo (Ag) dado. Normalmente se expresa
como una constante de disociación siguiendo la ley de acción de masas, así:
[𝐴𝑐𝐴𝑔]
𝐴𝑐 + 𝐴𝑔 ↔ 𝐴𝑐𝐴𝑔 , 𝐾𝑎 =
[𝐴𝑐][𝐴𝑔]

Donde [Ac] y [Ag] son las fracciones no unidas (i.e. sitios de unión libres o disponibles)
y [AcAg] es la fracción unida (i.e. sitios ocupados). K a es un valor empírico que se
obtiene por medio de experimentos de diálisis, los cuales conducen a la ecuación de
Scatchard. Como se ve, la afinidad solo caracteriza lo que ocurre con cada pareja
concreta, Ac-Ag.

Valencia: Número de puntos de unión funcionales en los Acs y en los Ags. Considera
el número de epítopos o de parátopos de una sola molécula a la vez. Según la valencia,
los Acs y los Ags pueden ser:

a) Monovalentes: Poseen solo un punto de unión. Los Acs monovalentes,

asimétricos o incompletos tienen solo un extremo de la “Y” que se une con
suficiente fuerza al antígeno.

b) Polivalentes: Poseen varios puntos de unión. La mayoría de los Ags son de esta
naturaleza. Comúnmente, se considera que los Acs pueden ser bivalentes (i.e.
IgD, IgE, IgG), tetravalentes (i.e. IgA) o decavalentes (i.e. IgM).

Avidez: Energía de unión entre los puntos de interacción de todos los parátopos y La región Fab, el parátopo y la región determinante de
todos los epítopos presentes en una reacción Ag-Ac. Depende directamente de la complementariedad (CDR, sigla en inglés) se solapan en el
valencia (i.e. avidez de IgM>IgA>IgD/E/G), pero es mayor que la suma de las Ka espacio. Aquí se limitará a indicar que cada uno de dichos
individuales. Dado que los Ags suelen tener más de un tipo de epítopo (i.e. conceptos se refiere a regiones que se diferencian entre sí
polivalentes), el sistema inmune produce un antisuero con varios tipos de solo en el tamaño que abarcan; de este modo, las CDRs
anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un epítopo diferente del mismo Ag. La están contenidas en los parátopos y éstos, a su vez, están
avidez del antisuero es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de un antisuero contenidos en las regiones Fab (i.e. Fab>Parátopos>CDRs).
capaz de reconocer un antígeno multivalente. La avidez del anti-suero refleja mejor Una discusión más detallada al respecto será abordada en
la circunstancia fisiológica. el curso teórico regular.
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De los conceptos desarrollados en el Cuadro 2 se puede concluir que todos los inmunoensayos, marcados o no
(véase mapa conceptual al final), dependen de la afinidad y la avidez con que el anticuerpo se une al antígeno.
Adicionalmente, dado que la avidez es un concepto referido a la unión 1:1 entre un parátopo y un epítopo,
entonces una manera sencilla de relacionarlo con la avidez, es que esta última corresponde aproximadamente al
doble de la afinidad, aunque no exactamente. Luego, la IgG tiene, teóricamente, 2 veces la energía de unión de
un parátopo hacia un epítopo dado, la IgA 4 veces y la IgM 10 veces. Otra manera de verlo es por medio de una
escala interdependinte: complementariedad<especificidad<afinidad<valencia<avidez, esto es, según la
complementariedad, la especificidad, la afinidad y la valencia, será la avidez de un anticuerpo dado. En parte esto
es lo que explica el hecho de que, si bien la afinidad de los parátopos de IgG son más afines (i.e. y más
complementarios y específico, por tanto) que los de IgM, esta última es mucho más ávida (i.e. mayor valencia y
mayor tamaño) que la IgG. Finalmente, luego de interactuar y rodear su blanco molecular (i.e. opsonización), los
anticuerpos pueden ejercer un efecto de neutralización, aglutinación, precipitación y activación del sistema
inmune (v.gr. activación del sistema del complemento e/o inducción de la fagocitosis).

2. Antígeno

Un antígeno es toda molécula capaz de interactuar con un anticuerpo o un receptor de células T (TCR). Epítopo es
la región del Ag que hace contacto con el Ac/TCR (para efectos prácticos, en adelante se hará referencia solo al
Ac) y, dado que sus propiedades estructurales y electromagnéticas restringen su capacidad de unión, también se
le suele llamar determinante antigénico. Los epítopos lineales son aquellos epítopos que se unen a los parátopos
sin importar las características tridimensionales que adquieran durante su plegamiento, dependiendo únicamente
de la estructura primaria (v.gr. una secuencia de aminoácidos dada). En contraste, un epítopo conformacional solo
se une al parátopo como consecuencia del plegamiento tridimensional (i.e. estructura secundaria y terciaria). La
unión Ac-Ag puede desencadenar, o no, una respuesta inmune, de ahí que no todos los antígenos sean
inmunógenos. Los Ags suelen ser de naturaleza orgánica (v.gr. proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos)
y se clasifican según la distancia filogenética que tengan respecto de un huésped dado (v.gr. humano), así:

a) Autoantígeno: Antígeno proveniente del mismo individuo. Aunque puede unirse con anticuerpos y TCRs,
no desencadena ninguna respuesta inmune (i.e. no es inmunógeno).

b) Aloantígeno: Antígeno proveniente de un individuo de la misma especie. Suele desencadenar una

respuesta inmune (i.e. inmunógeno) tras su unión con anticuerpos y TCRs. Su análisis es fundamental en
los procesos regulares de trasplante y transfusión.

c) Heteroantígeno: Antígeno proveniente de un individuo de una especie diferente a la del hospedero (v.gr.
microorganismos, plantas, animales no humanos). Suele desencadenar una respuesta inmune (i.e.
inmunógeno) tras su unión con anticuerpos y TCRs. Se estudian con frecuencia en las investigaciones de
trasplantes xenogénicos. Algunos heteroantígenos pueden compartir determinantes antigénicos entre sí
y con antígenos humanos, dando lugar a reactividad cruzada, de ahí el calificativo de antígenos heterófilos.
Estos últimos son especialmente relevantes en los procesos de transfusión cuando tienen semejanzas
estructurales con los grupos sanguíneos (v.gr. sistema ABO).

La capacidad de un Ag para desencadenar una respuesta inmune depende de algunas propiedades físicas y
químicas. El tamaño es crítico y normalmente se relaciona con la complejidad estructural, de este modo y por lo
general, antígenos <1 KDa no son inmunógenos, entre 1-6 KDa pueden serlo (algunos son haptenos) y >6 KDa se
comportan como inmunógenos.
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3. Reacción Antígeno-Anticuerpo

Durante la reacción antígeno-anticuerpo se pueden producir varias etapas o, más concretamente, dos tipos de
interacciones:

1. Primera Interacción: Se refiere a la unión antígeno-anticuerpo propiamente dicha (epítopo-parátopo) y a la

formación del inmunocomplejo inicial. Está fundamentalmente determinada por la carga eléctrica del
disolvente (i.e. pH y fuerza iónica) y la energía de unión Ag-Ac (i.e. complementariedad y demás propiedades
derivadas, véase cuadro 2). El pH puede afectar significativamente las tasas de des-protonación de los grupos
químicos de unión y este depende, a su vez, de la concentración salina o fuerza iónica y de la presencia de
agentes caotrópicos. Por otro lado, la afinidad y la avidez del anticuerpo son cruciales, puesto que a más
afinidad y avidez, menor es la cantidad necesaria de anticuerpo que debe estar presente para que se dé la
reacción Ag-Ac. Los productos de las interacciones primarias o inmunocomplejos no son macroscópicos,
luego, las técnicas basadas en estas necesitan una estrategia de revelado (i.e. inmunoensayos marcados), a
saber, el ELISA, la inmunofluorescencia (IF) y el radioinmunoensayo (RIA). Todas estas técnicas pueden ser
directas (i.e. uso de anticuerpo primario) o indirectas (i.e. uso de anticuerpo secundario) (véase el mapa
conceptual al final de este documento).

2. Segunda Interacción: Los inmunocomplejos iniciales se agregan a través de puentes de unión inmunoglobulina
que ligan varios antígenos (i.e. entrecruzamiento), formando una estructura similar a una malla que es
macroscópica (i.e. visible). Este desenlace dependerá principalmente de la naturaleza del antígeno y del
anticuerpo, es decir, de su tamaño y valencia (i.e. cantidad de determinantes antigénicos y de parátopos,
respectivamente). Así, a mayor tamaño, mayor será la distancia abarcada por los puentes inmunoglobulina;
es por eso que la IgM, el anticuerpo más grande, en tambi én el más potente en la acreción de material
particulado, comparado con las demás inmunoglobulinas. Por otro lado a mayor valencia, mayor es la cantidad
de parátopos y epítopos disponibles para la formación de interacciones secundarias . La IgM también es el
anticuerpo con más valencia (i.e. 10). Las interacciones secundarias se aceleran con la temperatura, la
agitación o la centrifugación. Las técnicas de interacción secundaria no necesitan estrategias de revelado
adicionales (i.e. no marcadas), a saber, la aglutinación (i.e. antígeno insoluble de gran tamaño) y la
precipitación (i.e. antígeno soluble de bajo peso molecular) (véase el mapa conceptual al final de este
documento).

El número de partículas en la reacción Ag-Ac es crítico para el establecimiento de ambas interacciones. Para que
se dé la acreción de cantidades importantes de inmunocomplejos, la relación [Ag]:[Ac] debe ser tal que el número
de parátopos sea aproximadamente igual al número de epítopos en suspensión. Cuando se genera una curva de
precipitación/aglutinación (i.e. curva de precipitina) a una [Ac] constante, incrementando la [Ag], la relación
óptima comentada aparece como un pico máximo de precipitación/aglutinación conocida como zona de
equivalencia (véase Cuadro 3., tubo central). Nótese que el punto Epítopo≈Parátopo no coincide necesariamente
con la igualdad entre las concentraciones de Ag y Ac (i.e. [Ag]=[Ac]). Justo antes de alcanzar la equivalencia, los
parátopos son más abundantes que los epítopos, la disponibilidad de estos últimos se agota (i.e. saturación) y no
se forman cantidades detectables de precipitados/aglutinados. Estos hechos quedan abstraídos por la parte inicial
de la curva, se los llama fenómeno de prozona y empíricamente corresponde con la ausencia de aglutinación en
muestras no diluidas (i.e. falso negativo) o presencia de aglutinación completa en muestras altamente diluidas
(véase Cuadro 3., tubos iniciales). Si bien la causa más común del fenómeno de prozona es un exceso de anticuerpo
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en la muestra, también se puede dar por la presencia de anticuerpos monovalentes, incompletos o asimétricos
(véase Cuadro 2, valencia). Este problema se resuelve por medio de diluciones seriadas en la prueba de tubos
múltiples (Cuadro 3). Continuando en la curva de precipitación/aglutinación, el punto máximo empieza a decaer
a medida que la concentración de antígeno aumenta; así, la cantidad de epítopos disponibles sobrepasa los
parátopos en suspensión, saturándolos. Cuando epítopos>parátopos aparece el fenómeno de postzona (véase
Cuadro 3., tubos finales). En el proceso, cada parátopo del anticuerpo es ocupado por un antígeno, evitando la
formación de los puentes inmunoglobulina inter-antigénicos. Desde el punto de vista clínico, la postzona puede
darse cuando el paciente no ha sintetizado anticuerpos suficientes para inducir una cantidad observable de
interacciones secundarias en relación con la concentración de antígeno adicionado durante la prueba. Por tanto,
una medida razonable para el escenario referido, es volver a realizar la prueba dos a tres semanas después con el
fin de que el paciente genere un título adecuado (i.e. equivalente) de anticuerpos.
Cuadro 3.
En la práctica clínica el efecto de prozona es la causa más común de
un falso negativo tras la adquisición de la muestra de suero para el
análisis inmunológico. La solución experimental que puede “corregir”
dicha condición biológica, son las diluciones seriadas. En este caso el
procedimiento es el contrario al que se muestra en la gráfica, puesto
que la [Ag] se mantiene constante y la [Ac] (i.e. analito) se disminuye
con cada dilución, así:

Los precipitados/aglutinados toman diversas conformaciones

geométricas gracias a la flexibilidad conferida por la región en bisagra
del anticuerpo (véase Cuadro 2.)

Finalmente, en el siguiente mapa conceptual se muestra un panorama que engloba la tecnología diagnóstica y de
investigación que se ha desarrollado a partir del entendimiento de la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Cada
división será estudiada al nivel molecular y de correlación clínica. Es recomendable remitirse a este documento y,
en particular, al mapa conceptual referido, para ganar en la comprensión teórico-experimental de las técnicas
discutidas durante los encuentros académicos en el laboratorio.
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Nota Aclaratoria: Todas las imágenes fueron tomadas y modificadas de las referencias citadas a
continuación.

REFERENCIAS

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Gruliow R (Director). Cellular and Molecular Immunology. 7a ed. Filadelfia, PA: Saunders/Elsevier; 2012.
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