UD 5 – CULTIVOS CELULARES

Los cultivos son una serie de técnicas que permiten

el mantenimiento de las células pluricelulares in
vitro, manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Su objetivo es
obtener suficientes células en metafase para realizar
el análisis cromosómico.

CULTIVOS Marta Jimenez Peña

Anatomía Patológica 1º

CELULARES
Biología Molecular y Citogenética
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................3
CULTIVO CELULAR............................................................................................................................3
CULTIVOS EN ÓRGANOS .............................................................................................................3
CULTIVO DE EXPLANTES PRIMARIOS .......................................................................................4
CULTIVOS DE CÉLULAS ...............................................................................................................4
CULTIVOS ORGANOTÍPICOS ......................................................................................................4
TIPOS DE MUESTRAS ...................................................................................................................4
BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DE CULTIVO ....................................................................................5
CURVA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO ..................................................................................5
FORMAS DE CRECIMIENTO .........................................................................................................5
CRECIMIENTO EN MONOCAPA ..............................................................................................6
CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN.............................................................................................6
COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS PASES ...........................................................6
CULTIVO CELULAR PRIMARIO = LÍNEA CELULAR ..............................................................6
LÍNEAS CELULARES CONTINUAS ..........................................................................................7
FACTORES QUE INTERVIENEN........................................................................................................7
NATURALEZA DEL SUSTRATO....................................................................................................7
SOPORTE FÍSICO...........................................................................................................................7
MEDIO DE CULTIVO ......................................................................................................................8
SOLUCIÓN/GEL NUTRITIVO QUE SUSTITUYA AL MEDIO NATURAL DE LA CÉLULA ....8
SEGÚN SU COMPOSICIÓN ......................................................................................................8
COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO..............................................................................9
ATMÓSFERA GASEOSA DE INCUBACIÓN ................................................................................9
PROCEDIMIENTOS ......................................................................................................................... 10
DISGREGACIÓN CELULAR ........................................................................................................ 10
MÉTODO MECÁNICO ............................................................................................................. 10
MÉTODO ENZIMÁTICO .......................................................................................................... 10
MÉTODO QUÍMICO................................................................................................................. 10
SELECCIÓN DE CÉLULAS.......................................................................................................... 10
VIABILIDAD CELULAR Y RECUENTO....................................................................................... 11
DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS............................................................................................ 12
INICIO DEL CULTIVO (SIEMBRA) ............................................................................................. 12
MANTENIMIENTO DEL CULTIVO .............................................................................................. 12
PASE O SUBCULTIVO ................................................................................................................ 13
CONSERVACIÓN DE CÉLULAS................................................................................................. 13
CONTAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS CELULARES ................................................................. 14
CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA ................................................................................... 14
MICROPLASMAS .................................................................................................................... 14
 VIRUS........................................................................................................................................ 14
MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIÓN ........................................................... 14
APLICACIONES DE CULTIVOS CELULARES .............................................................................. 15
INVESTIGACIÓN.......................................................................................................................... 15
CULTIVOS .................................................................................................................................... 15
SISTEMA CELULAR .................................................................................................................... 15
 INTRODUCCIÓN
El análisis citogenético es la obtención del cariotipo con el fin de visualizar los cromosomas y
detectar alteraciones en su número o estructura.

Se necesitan los cromosomas en metafase, siendo solo posible en tejidos que se dividen
espontáneamente con proliferación rápida (gónadas, médula ósea, trofoblasto o tumores). En
los cultivos celulares, primero se realiza la extensión de cromosomas en el portaobjetos, luego
la tinción, y finalmente el bandeo.

CULTIVO CELULAR
Son una serie de técnicas que permiten el mantenimiento de las células pluricelulares in vitro,
manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Su objetivo
es obtener suficientes células en metafase para
realizar el análisis cromosómico.

Los materiales biológicos idóneos para el cultivo

son:

 Líquido amniótico
 Vellosidad corial
 Sangre periférica
 Médula ósea
 Piel

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

Según la forma que mantienen el pH del medio
Cultivos  Cerrados herméticamente
cerrados  Llevas HEPES para amortiguar cambios del pH
Cultivos abiertos  Recipientes entreabiertos dentro de una incubadora con atmósfera con un 95% de aire y
5% de CO2

CULTIVOS EN ÓRGANOS
o Se mantiene vivo durante un tiempo  Estudio de las relaciones celulares
limitado  Estudio de las respuestas a estímulos y a sustancias
o Diferenciación celular  No recomendado en citogenética ► Crecimiento celular
o Estructura histológica deficiente
o Arquitectura del órgano
o A ser posible la funcionalidad

o Sólo proliferan células en la periferia

del órgano
o No se pueden propagar
o Baja reproducibilidad
 CULTIVO DE EXPLANTES PRIMARIOS
Se hace a partir de una porción de tejido
vivo separado del órgano → Vellosidades
coriónicas y tejido epitelial (fibroblastos).
Se adhiere a una superficie (placa Petri), se
nutre con medio de cultivo, y las células
periféricas se multiplican y proliferan.

CULTIVOS DE CÉLULAS
Es la técnica más común, realizada a partir de suspensiones celulares (SC)
de cualquier material biológico. Proceden de disgregaciones de un tejido o
células de la periferia de un explante.

Se introduce el SC en un recipiente con un medio de cultivo, se incuba en

condiciones óptimas, finalmente se da la proliferación celular. Los cultivos de
células aumentan la masa celular del tejido a estudiar.

El inconveniente de este cultivo es que, si partimos de masas celulares

heterogéneas, esta heterogeneidad se puede perder debido a la alta tasa de
crecimiento de las poblaciones predominantes.

CULTIVO DE CÉLULAS PRIMARIO CULTIVO DE CÉLULAS SECUNDARIO

 Se obtiene disgregando un tejido por Se obtiene de:
medios mecánicos o enzimáticos  Un cultivo primario mediante un
 Se realiza con una mezcla de células o subcultivo
seleccionando un tipo concreto.  Línea celular congelada

CULTIVOS ORGANOTÍPICOS
En estos cultivos conviven varios tipos celulares para
reproducir al máximo la estructura del tejido. Su finalidad
es la de generar tejido y órganos completamente
funcionales para ser usados tanto en injertos como en
trasplantes.

TIPOS DE MUESTRAS
Células Tipo de cultivo Diagnóstico
obtenidas
LÍQUIDO Amniocitos  Cultivo directo  Ciertas
AMNIÓTICO  Largo plazo cromosomopatías
 Medio de cultivo:  Aberraciones
Aminiopan cromosómicas
 Células monocapa
SANGRE Linfocitos  Cultivo indirecto  Aberraciones
PERIFÉRICA (necesita estimulante cromosómicas
mitógeno) (ej. Síndrome de
 Corto plazo Down, de Patau,
 Células en suspensión de Turner,…)
 CONDICIONES
o Tª 37º
 o CO2 → 5%
o Humedad 95%
VELLOSIDAD Trofoblastos  Cultivo directo  Pronóstico
CORIAL  Corto plazo (24-48h) prenatal precoz
Se obtiene por  Células en suspensión (9 a 11 semanas
biopsia  Medio: Aminiopan de gestación)
transcervical o
transabdominal
del corion en la
placenta de la
madre
Se obtiene información genética de forma más precoz que con la
amniocentesis, pero tiene la limitación de la cantidad de muestra,
ya que puede ser insuficiente y estar contaminada con células de la
madre.

BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DE

CULTIVO
CURVA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO
Es la representación gráfica del crecimiento donde se
observa como varía día a día la concentración de células.

Adaptación celular (LAG): Supervivencia en corta

duración (<24h). Cambios metabólicos sin crecimiento.
Adhesión en monocapa
Crecimiento logarítmico (LOG): Intento crecimiento y
proliferación (≈7días). Colonias en monocapa.
Estacionaria (Plateau): Detención del crecimiento. Se
inhibe por contacto en monocapa y por densidad en
suspensión.
Envejecimiento: muerte celular.

FORMAS DE CRECIMIENTO
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
Según el estado en el que se encuentran las células
CULTIVOS EN SUSPENSIÓN  Células cultivadas en suspensión
 Cultivo de linfocitos de sangre periférica
o médula ósea
 Corta duración (24-72h)
CULTIVOS EN MONOCAPA  Células cultivadas pegadas al fondo del
recipiente de cultivo → forman colonias
 Cultivo de fibroblastos y células de
tejidos sólidos
 Larga duración (8-15 días)
 CRECIMIENTO EN MONOCAPA
Es el método más usado. Crecimiento
adherido a una superficie sólida, y las
células dependen del anclaje (no crecen
libres). Se obtiene por dispersión de
células disgregadas por métodos
enzimáticos y pasan a un frasco de cultivo.

Los materiales biológicos son cultivo de

queratinocitos (tejido epitelial), de
fibroblastos (tejido conjuntivo) y de células de tejidos sólidos. No se da
en células hematopoyéticas.

1. Adhesión a la superficie → Fase de latencia

2. Proliferación y formación de colonias → Fase exponencial
3. Inhibición por contacto → Dejan de dividirse (siguen vivas) → Fase estacionaria

CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN
Crecimiento disperso por el medio de cultivo ya que las células no necesitan adherirse
a una superficie para crecer. Se obtiene por dilución y posterior paso a un medio
fresco. Corta duración (24-72h) sin necesidad de cambio de medio.

Los materiales biológicos son células hematopoyéticas (linfocitos), células madre,

líneas celulares transformadas y células tumorales.

COMPORTAMIENTO VITAL TRAS SUCESIVOS

PASES
CULTIVO CELULAR PRIMARIO = LÍNEA CELULAR
Se obtienen a partir de un tejido u órgano, y se mantienen mediante pases seriados durante un
tiempo limitado.

 Primer y segundo pase → Aumenta la población

 Tercer pase → Estabilización → Línea celular
 Senescencia → Pérdida de capacidad de división
o Por acortamiento de telómeros y acumulación de anomalías
 LÍNEAS CELULARES CONTINUAS
Aparecen espontáneamente por transformación celular, y por la pérdida de mecanismos de
control se vuelven células inmortales. Tienen mantenimiento por tiempo ilimitado mediante
pases seriados.

 Crecen indefinidamente
 No dependen de anclaje → en suspensión
 Pierden inhibición por contacto
 Invaden y producen tumores
 Acumulan anomalías genéticas

FACTORES QUE INTERVIENEN

El cultivo de células implica tener controlado:

 Naturaleza del sustrato

 Soporte físico
 Medio de cultivo
 Atmósfera gaseosa
 Condiciones de incubación

El material de cultivo debe ser esterilizable y transparente.

NATURALEZA DEL SUSTRATO

Células sustrato dependientes:
o Necesitan adherirse al sustrato para proliferar
o Mayoría de líneas celulares
Células sustrato independientes:
o No necesitan adherirse al sustrato para
proliferar
o Células circulantes: sanguíneas y de tumores
ascíticos

SOPORTE FÍSICO
VIDRIO  Reutilizable
 Esterilizable
 Transparente
PLÁSTICO DESECHABLE  Más utilizado
 Esterilizable
 Transparente
 Bajo coste
MATRICES 3D POROSAS DE  Simulan entorno fisiológico
Colágeno, Celulosa, Poli-D-lisina,
AlgiMatrix 3D Geltrex (imagen)
 MICROESFERAS DE  Monocapa
Sephadex o Poliacrilamida  Se comportan como suspensión

PLACAS PETRI  Circulares con tapa no hermética

 Diámetro 3,5-10cm. Superficie 10-78cm2

PLACAS  Experimentos puntuales

MULTIPOCILLO  Tapa no hermética
 6-96 pocillos
 Diámetro 835mm. Superficie 0,5-10cm2
 No mantenimiento de líneas estables por
contaminación
FRASCOS ROUX  Frasco plano con tapón a rosca (la
membrana facilita el intercambio de
gases)
 Superficie 25-75cm2
 Mantenimiento de cultivos en Monocapa
o Suspensión
BOTELLAS ROLLER  Botellas sobre rodillos
 Al girar las células ocupan toda la
superficie interior

MEDIO DE CULTIVO
SOLUCIÓN/GEL NUTRITIVO QUE SUSTITUYA AL MEDIO
NATURAL DE LA CÉLULA
El medio debe Generar condiciones fisicoquímicas adecuadas
Aportar nutrientes (pH, Osmolaridad, Tª)
Aportar otras sustancias necesarias para Permitir acumular temporalmente productos de
el crecimiento y división celular desecho celular

SEGÚN SU COMPOSICIÓN
MEDIO DE CULTIVO MEDIO DE CULTIVO SINTÉTICO MEDIO DE CULTIVO NO
NATURAL DEFINIDO
 Son fluidos Medios suplementados con suero Medio basal Eagle (BME)
naturales  Suero Fetal Bovino (FBS)  Fibroblastos de ratón
 Gran adecuación  Solo aminoácidos esenciales
para el cultivo de Medios libres de suero Medio mínimo esencial de Eagle
células
 La presencia de FBS puede llevar a (MEM)
 Difícilmente
errores en estudios inmunológicos  Suplementación de
reproducibles
aminoácidos
 El más empleado
Medio químicamente definidos Medio MEM modificado de
 Ingredientes ultrapuros libres de Dualbeso
contaminación  4 veces más concentración
de aminoácidos
 Para hibridomas
Medios libres de proteínas RPMI-1640
 Promueven un crecimiento celular  Para linfoblastos, células
y expresión proteica superior linfoides estimuladas y
células leucémicas
 COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
 SALES MINERALES:
o La base es una solución salina equilibrada en la que estarán disueltos el resto
de componentes. Ej: Bicarbonato sódico (regula pH)
 GLUCOSA:
o Es fuente de energía, de forma única o junto a otros hidratos de carbono
 ESTIMULANTES MITÓGENOS
o PHA: Fitohemaglutinina (en cultivo de linfocitos)
 AMINOÁCIDOS:
o Todos los esenciales. Se añaden más según las necesidades de las células. Ej:
L-glutamina mejora el crecimiento celular
 COLORANTE INDICADOR DE PH:
o Rojo fenol
 SOLUCIÓN TAMPÓN:
o Las células son muy sensibles a los cambios de pH. El más usado es el tampón
de bicarbonato. Actualmente se usa el tampón HEPES con pH 7,2-7,6
 VITAMINAS:
o Influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia de las células
 pH:
o pH 7,4 (rango 7,2-7,6) → óptimo. Indicador rojo fenol

Depende de los requerimientos de las diferentes líneas celulares

 SUPLEMENTOS ORGÁNICOS DE BAJO PESO MOLECULAR:

o Ej: Ácidos grasos esenciales, lípidos, nucleósidos, piruvatos, …
 ANTIBIÓTICOS Y ANTIFÚNGICOS:
o Evitan contaminación. Pueden ser sólos o contaminados:
 Antibióticos: Gentamicina/Penicilina/Estreptomicina
 Antimicóticos: Antofericina-B
 HORMONAS Y FACTORES DE CRECIMIENTO:
o Esenciales para el crecimiento celular

Propiedades físico-químicas de los medios de cultivo

VISCOSIDAD:
o No es limitante. ↑[suero] → ↑viscosidad
TENSIÓN SUPERFICIAL:
o En cultivos en suspensión se añade CO2 al medio
o Sueros → ↑tensión → Espuma
PH:
o pH 7,4 (RANGO 7,2-7,6) → óptimo
OSMOLARIDAD:
o Rango 260-320 mOsm/kg, isotónicos o ligeramente hipotónicos.

ATMÓSFERA GASEOSA DE INCUBACIÓN

Es la mezcla de gases que mantienen los cultivos, siendo los dos componentes más
importantes el O2 y CO2.

El oxígeno es importante para que las células vivan, siendo normalmente un 21%

El CO2 es necesario para mantener el equilibrio carbonato-sódico (pH) del medio de cultivo.
Tiene que ser un 5% con pH neutro.
La Tª influye en la tasa del crecimiento celular. La óptima es la fisiológica (Ej: mamíferos
37º/insectos 28º)

La humedad debe de ser la suficiente para evitar la evapotranspiración del medio de cultivo
debido a la Tª. La evapotranspiración influye en la [componentes], la osmolaridad y el pH.

PROCEDIMIENTOS
DISGREGACIÓN CELULAR
Es la obtención de la suspensión celular heterogénea a partir de la separación de células (entre
sí o de la matriz extracelular). Se realiza para hacer cultivos primarios o subcultivos, y mantiene
la viabilidad de las células.

Las células epiteliales tienen disgregación difícil por tener las uniones cel-cel fuertes.

Las células madres tienen disgregación fácil por sólo tener uniones cel-matriz extracelular.

Los métodos de disgregación son: mecánicos, enzimáticos, químicos.

MÉTODO MECÁNICO
Se emplea en cualquier tipo celular, aunque puede causar daño mecánico haciendo que la
suspensión de las células obtenidas no sea de buena calidad. Los métodos son:

Raspado
Agitación manual (sacudir o pipetear)
Agitación automática
Tamizado (órganos blandos)
o Se acopla la malla (nailon o metálica) a un recipiente
o Se colocan trozos de órgano sobre la malla y se aplasta
suavemente
o Se realizan lavados seriados con tampón o medio de
cultivo, las células caen al recipiente.

MÉTODO ENZIMÁTICO
Se aplican enzimas proteolíticas en la matriz extracelular para liberar las células. Dependiendo
del tipo celular se usan distintas enzimas. Las proteasas más utilizadas son: Colagenasa,
Tripsina → Tripsinización, Elastasa, Proteinasa K.

MÉTODO QUÍMICO
Desestabiliza los receptores de membrana que unen la matriz extracelular y el citoesqueleto
(necesita iones de Ca y Mg). Los métodos son:

Lavar con PBS sin calcio y magnesio

Lavar con agentes quelantes (EDTA) = secuestran cationes.

SELECCIÓN DE CÉLULAS
Se parte de una mezcla heterogénea de células en suspensión, pudiendo iniciar un cultivo
primario (cultivo heterogéneo) o seleccionar un tipo celular (cultivo homogéneo). Los métodos
de selección son:

 SEGÚN PROPIEDADES ESPECÍFICAS:

o En base a su diferente adhesión a los sustratos.
 Se hace pasar las células por columnas de diferentes sustratos, las células
o
retenidas se liberan mediante un tampón que disminuye la adhesión.
 SELECCIÓN POR MÉTODOS INMUNOLÓGICOS:
o Técnicas basadas en ELISA → empleo de anticuerpos específicos (Ab) para
antígenos (Ag) celulares concretos
 Uso de pocillos con anticuerpos, las células retenidas se liberan con
cambios de pH.

VIABILIDAD CELULAR Y RECUENTO

Cuando se hace un cultivo es necesario conocer la densidad celular (cel/ml). Los métodos de
selección se realizan simultáneamente:

o Viabilidad celular → vivas vs muertas

o Recuento celular → concentración
o Manual → Cámara de Neubauer
o Automático → Cell-Counter

VIABILIDAD CELULAR
 Tinción con Tripan Blue: coloide que penetra en el interior de las
cel cuya membrana está rota pero no atraviesa la de las cel vivas
o Células azules → no viables
o Células blancas → viables
 Tinción con Yoduro de propidio: compuesto con fluorescencia
que es roja si atraviesa la membrana plasmática rota y se une
al ADN
o Células rojas → no viables
o Células verdes → viables

RECUENTO CON CÁMARA NEUBAUER

DIMENSIONES:
 El área de la cuadrícula es de 9 mm2 (3x3)
 La cuadrícula de recuente tiene 9 cuadrículas más grandes de 1
mm
 Los cuatro cuadrados laterales son para el recuento de
leucocitos (dividido en 16 cuadrados más pequeños)
 El cuadrado central es para el recuento de eritrocitos y plaquetas
(dividido en 25 cuadrados más pequeños)

PROTOCOLO DE CONTAJE CON CÁMARA NEUBAUER

 1. Hacer una visión general por toda la cuadrícula para ver si la muestra
está homogéneamente distribuida

2. Hacer zoom con 10X. Criterios de conteo

a. Se cuentan las células que se encuentran dentro del cuadrado formado por
líneas triples
b. Líneas superior e izquierda: SÍ se cuentan
c. Líneas inferior y derecha: NO se cuentan

Se obtienen 3 cálculos → B: blancas (cel viva) / A: azules (cel muerta)

𝐵+𝐴
 Densidad celular = × 2 × 104
4

𝐵
 Densidad celular viable = 4 × 2 × 104

𝐴
 Densidad celular no viable = 4 × 2 × 104

𝑛º 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ×10.000
Concentración (cel/ml) = 𝑛º 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑠

DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS
Se usa en la iniciación de cultivos secundarios a partir de líneas celulares mantenidas en
nitrógeno líquido. Al descongelar se conserva el 90% de la capacidad de proliferación celular y
se reduce el riesgo de contaminación cruzada y microbiana. Debe ser rápido, siguiente un
protocolo:

1. Incubar el vial de células congeladas a 37º durante 1-2 min

2. Transferir el contenido a un tubo y añadir medio de cultivo atemperado a 37º
3. Centrifugar el tubo a 800 rpm/5 min
4. Desechar el sobrenadante (DMSO)
5. Resuspender el pelet en medio de cultivo y añadir flask
6. Incubar

INICIO DEL CULTIVO (SIEMBRA)

Se parte de una suspensión celular obtenida mediante disgregación de un tejido, selección
celular o línea celular descongelada.

1. Elegir el recipiente a emplear y su volumen

2. En base al recipiente, ajustar la densidad de células a
sembrar
3. Recuento de células viables
4. Añadir al recipiente un volumen adecuado de la
suspensión celular
5. Añadir medio de cultivo nuevo atemperado a 37º hasta
alcanzar el volumen de cultivo adecuado al recipiente
6. Incubar a 37º, 95% de humedad y 5% de CO2

MANTENIMIENTO DEL CULTIVO

Su objetivo es el control de la viabilidad de las células:

 Control periódico microscópico

o Cada 1-3 días se examina al microscopio óptico invertido por su apariencia y
crecimiento
  Cambios de medio
o Se renuevan los nutrientes y se retiran los productos de desecho
o Cada 2-3 días:
 Se observa si hay cambio en el color del medio (pH)
 Cambio de medio parcial (2⁄3 partes del total)

PROTOCOLO EN MONOCAPA PROTOCOLO EN SUSPENSIÓN

Retirar 2⁄3 partes del medio antiguo con una Centrifugar a 800 rpm/5 min → depósito células
pipeta. en el fondo
Sustituirlo con un medio nuevo atemperado fresco Retirar 2⁄3 partes del medio antiguo
Sustituirlo con nuevo medio atemperado,
resuspendiendo células

PASE O SUBCULTIVO
Se realiza cada vez que levantamos las células y las subcultivamos. Antes de 6-7 días:

Monocapa → Llegan a confluencia máxima

Suspensión → Llegan a su densidad crítica

PASE DE MONOCAPA PASE DE SUSPENSIÓN

Es necesario despegar las células de la superficie. Se Se realiza el pase a partir de recuento de viables.
necesita un recuento de viabilidad. Protocolo: Calcular dilución necesaria a partir de la densidad
1. Lavar la monocapa con PBS (buffer fosfato celular.
salino) Escalar el cultivo → Aumentar el tamaño del recipiente
2. Incubar con tripsina + EDTA  Añadir medio de cultivo
3. Inhibir tripsina con 4-5 volúmenes de medio  Alcanzar la densidad celular que estimule el
de cultivo crecimiento.
4. Lavado de células y recuento de viables
5. Cálculo de factor de dilución
6. Preparar nuevo recipiente
7. Repartir las células del cultivo viejo

CONSERVACIÓN DE CÉLULAS
La crioconservación es una técnica que nos permite almacenar alícuotas celulares
indefinidamente, sin la necesidad de mantenerlas en cultivo perpetuo, N2 líquido o
ultracongeladores. Es necesario para congelar:

 Densidad celular máxima

o Cambiar el medio 24h antes
 Medio de cultivo
o Alta relación suero/proteína (>20%)
o Crioprotector (DMSO 10% o glicerol)

Las líneas celulares continuas se pueden conservar mediante su congelación

PROTOCOLO CONSERVACIÓN DE CÉLULAS

1. Obtener una suspensión celular del cultivo en monocapa. Los cultivos en suspensión no
precisan de este paso.
2. Centrifugar a 800 rpm/5 min y resuspender con FBS y DMSO. La concentración final debe ser
de 106 cel/ml
3. Se alicuotan en criotubos de 1ml, y se congela progresivamente. Las primeras 24h a -20º y en
las siguientes 24h a -80º. A continuación, pueden conservarse a -196º en nitrógeno líquido de
forma indefinida.
 CONTAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS
CELULARES
Alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados presentes en el
ambiente.

CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA
 En los cultivos a corto plaza, la contaminación más habitual es la de bacterias y hongos.
 En los cultivos a largo plazo, la contaminación más habitual es la de hongo filamentosos.

El uso de antibióticos y antifúngicos no siempre es suficiente para prevenir la contaminación.

MICROPLASMAS
Son microorganismos procariotas sin pared celular que infectan líneas celulares continuas. Sus
fuentes de contaminación son las propias líneas celulares continuas y los sueros animales.

Son difíciles de detectar ya que no causan síntomas (sin cambios de pH o turbidez), y aparecen
en gránulos oscuros en el citoplasma de las células. Se detecta mediante tinciones
fluorescentes, sondas ADN ribosomal de microplasmas y técnicas PCR.

VIRUS
Son poco frecuentes pero muy graves. Su fuente de contaminación son los sueros animales.
Son difíciles de detectar, usando la observación del efecto citopático (cambios morfológicos,
moleculares y de viabilidad). Se eliminan difícilmente, teniendo que eliminar el cultivo y
esterilizarlo mediante irradiación.

MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIÓN

 Trabajar en estrictas condiciones de asepsia (cabina de seguridad)
 Especial cuidado al manipular los recipientes
 Limpiar la superficie externa de los viales y recipientes que se introduzcan en la cabina
con etanol al 70%
 Si el incubador de cultivos tiene una bandeja para proporcionar humedad, hay que
cambiar el agua de forma regular y añadir antisépticos (clorhexidina)
 En caso de encontrar un cultivo contaminado, se ha de eliminar.
o Si el cultivo es reemplazable, es importante aislar y eliminar
o Si el cultivo es importante
 Tratar con antibióticos (Ej: kenamicina)
 Tratar con suero o antimicoplasma (muy costoso)
 APLICACIONES DE CULTIVOS
CELULARES
INVESTIGACIÓN
BÁSICA:
o Metabolismo, rutas, ciclo celular
o Interacciones celulares
o Diferenciación celular
APLICADA A LA BIOTECNOLOGÍA
o Inmunología: producción de anticuerpos
o Virología: producción de vacunas
o Farmacología: producción de fármacos
o Toxicología: estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis

CULTIVOS
CULTIVOS HISTOTÍPICOS → Producción de tejidos funcionales para trasplantes
CULTIVOS ORGANOTÍPICOS → Producción de órganos funcionales para trasplantes

SISTEMA CELULAR
TERAPIA CELULAR