CODIGO

VERSIÓN
FECHA DE
VIGENCIA
INSTRUCTIVO PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS
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1. OBJETIVO
Todos los medios de cultivos utilizados tendrán una forma de preparación y conservación para los análisis
microbiológicos y asegurar resultados confiables en las pruebas.

2. ALCANCE
Se aplica para la preparación de medios de cultivo sólidos o líquidos sean estos dispensados en placas
petri ,fiolas ,frascos o en tubos de ensayo.

3. DEFINICIONES
Medio de cultivo: Compuesto nutritivo en estado líquido, sólido o semisólido que promueve el
crecimiento de microorganismos.
Medios Sólidos: Medio de cultivo que se le añade un agente gelificante o solidificante.
Agar Agar: Es un alga utilizada en la fabricación de medios de cultivos deshidratados debido a que se
caracteriza por ser inerte frente a los microorganismos, es líquido a la temperatura de ebullición y
solidifica entre los 45-50ºC.
Agar: Medio de cultivo sólido con un contenido de agar –agar mayor al 1%
Medios Líquidos o Caldos: Medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento
de microorganismos y no contiene ningún agente gelificante para que mantengan el estado liquido.
Medios Enriquecidos: Son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden determinadas
sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un microorganismo exigente.
Medios Selectivos: Son aquellos medios que llevan incorporadas determinadas sustancias que inhiben
el crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que nos interesa.
Agua Estéril: Es el agua destilada o desmineralizada y esterilizada a 121°C por 15 min.
Selectividad: Inhibición de los microorganismos no deseados.
Solución desinfectante: son sustancias que actúan sobre los microorganismos inactivándolos y
ofreciendo la posibilidad de mejorar con más seguridad los equipos y materiales durante el lavado.
Cinta testigo de esterilización: es una cinta adhesiva con indicador químico que testifica el paso de
envases y paquetes por los procesos de esterilización a vapor.
Solución bufferada (diluyente): es la que se utiliza en procedimientos microbiológicos que requieren
diluyente isotónico o tamponado para la suspensión y dilución de microorganismos no exigentes.

4. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
 Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo que se encuentran en la
etiqueta del frasco.
 Durante el proceso de pesaje del medio de cultivo usar mascarilla, guantes y evitar derrames, si los
hubiera limpiar rápidamente con una solución desinfectante.
 Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo una vez que ha sido utilizado para evitar que
absorba humedad del medio ambiente.
 El polvo de los medios de cultivo deshidratados debe ser homogéneo, libre de grumos y deben tener
el color inicial indicado para cada medio. Si hay algún cambio de la apariencia física, descartar el
medio.
 Evitar que el medio de cultivo que está siendo preparado llegue a hervir para evitar quemaduras y
derrames.
 Durante el proceso de preparación de medios de cultivos tomar todas las precauciones para no tocar
material caliente.

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 Esterilizar de inmediato en autoclave todos los medios de cultivo que requieran ser sometidos a este
procedimiento.
 Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben
exceder las condiciones señaladas por el fabricante
 Verificar el enfriamiento de la autoclave antes de abrir
 No sellar herméticamente los envases que contienen los medios de cultivos preparados y que van a
ser sometidos al proceso de esterilización.
 Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
 Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de
cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan
pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La
absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo
cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar
contaminados.

5. ACTIVIDAD
5.1.- Ingreso de medios de cultivo:
Al Ingresar el medio de cultivo, se debe verificar en su certificado analítico lo siguiente:
 Nombre del medio de cultivo
 Lote
 Fecha de expiración
 Presentación

Datos que se registrarán en el Kardex correspondiente, además se registrará la fecha de ingreso,

proveedor y la cantidad ingresada.
El envase se debe colocar una etiqueta con: el código asignado y la fecha de ingreso del medio.
Se ubicarán los medios de cultivo en el lugar destinado para medios en stock, en donde
permanecerán hasta la fecha de apertura, la cual también quedará registrada en la etiqueta del
envase.
Guardar los medios de cultivo en un área cuya temperatura se encuentre entre los 15 a 30°C, donde la
humedad no exceda el 80% y no incida directamente la luz del sol.
Se deberá actualizar el listado de medios cada vez que ingresen nuevos medios de cultivos.

5.2.-Preparación de un medio de cultivo

 Procedimiento:

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1. Preparar todo el material que se va a utilizar en la preparación de medios de cultivos.

2. Se prepara según instructivo del fabricante y de acuerdo a la cantidad a utilizar. Si no existe
instrucciones en el medio seguir los pasos indicados en el ANEXO 1.

3. Pesar el medio de cultivo deshidratado en un beacker o en un papel, dependiendo la cantidad del

medio a utilizar. (ver ANEXO 2)

4. Medir la cantidad suficiente de agua purificada que previamente se ha tomado para la

preparación de medios de cultivos deshidratados.

5. Anotar los cálculos realizados en el Preparación de medios de cultivo y reactivos (ver ANEXO 3).
6. Una vez realizada la pesada de los medios de cultivo se registra el consumo realizado en el Kardex
correspondiente.
7. Colocar la cantidad de medio de cultivo deshidratado en un Recipiente limpio que tenga una
capacidad mayor (doble) al volumen que se va a preparar.
8. Añadir la cantidad de agua purificada haciendo uso de una probeta que indique el volumen
requerido.
9. Agitar y calentar hasta completa disolución del medio deshidratado:
-Para los agares será necesaria una agitación y calentamiento constante hasta que se inicie la
ebullición, debido a que en este momento el polvo estará completamente disuelto (observar el
medio que se está preparando).
-Para medios líquidos agitar y calentar ligeramente hasta completa disolución (no dejar hervir).

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10. Dejar de calentar una vez que se ha disuelto el medio de cultivo para evitar cualquier derrame
que pueda provocar quemaduras.
NOTA: Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, por este motivo no debe
calentarse más de lo estrictamente necesario.
11. Envasar los agares en fiolas y tapar con papel aluminio o con tapones de algodón- gasa y papel
de empaque y los caldos se envasan en tubos, fiolas o frascos adecuados para la esterilización de
acuerdo al tipo de análisis a realizar.

12. Rotular todos los medios preparados tanto en fiolas, frascos o tubos. La etiqueta debe contener
la siguiente información como mínimo:
-Nombre del medio preparado o iniciales (ver ANEXO 1).
-Lote (ver ANEXO 3).
-Fecha de preparación (ver ANEXO 3)
-Iniciales del analista responsable.
13. Colocar cinta testigo de esterilización con fecha en uno de los frascos, tubos o fiola y se procede a
esterilizar en Autoclave, registrar la esterilización en el REGISTRO DE ESTERILIZACIÓN EN
AUTOCLAVE.
14. Culminado el ciclo de esterilización esperar a que el equipo baje la temperatura y retirar de la
autoclave los medios de cultivos preparados.
15. Cada lote de preparación de medios de cultivos debe cumplir con los ensayos descritos en el INS
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16. Registrar el resultado obtenido en el REGISTRO DE PREPARACIÒN Y CONTROL DE CALIDAD DE
MEDIOS DE CULTIVOS.

5.3.-Preparación de medios de cultivo en placas petri para control de ambiente y superficie.

Las placas de petri se preparan vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ellas y en un ambiente
aséptico es conveniente homogenizar el medio en el transcurso de la operación para evitar que el agar
se sedimente en el fondo del recipiente.

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Antes de verter el agar en placas, se debe esperar a que el medio tenga una temperatura de 45 a 50°C.Si
la temperatura es más alta puede ocurrir una excesiva formación de agua condensada en las placas.
Se debe tener la precaución de evitar la formación de burbujas en la superficie del agar. Las placas se
deben dejar enfriar a temperatura ambiente, en una superficie horizontal. Una vez que las placas estén
solidificadas, mantener en posición invertida.
También es posible conservar el medio destinado a preparar placas petri solidificado y estéril en fiolas
que luego se fundirán al baño maría en el momento de la preparación de las mismas.

5.4.- Preparación de medios de cultivo que no requieren esterilización en autoclave

Existen medios de cultivo que por su composición termolábil no requieren de esterilización en
autoclave, los cuales se prepararan en un ambiente aséptico de la siguiente manera:
1. Que todo el material que se va a utilizar en la preparación de medios de cultivos sea estéril.
2. Se prepara según instructivo del fabricante y de acuerdo a la cantidad a utilizar. Si no existe
instrucciones en el medio seguir los pasos indicados en el ANEXO 1.
3. Anotar los cálculos realizados en el Preparación de medios de cultivo y reactivos (ver ANEXO 3).
4. Ingresar al área estéril con mandil, guantes, mascarilla y gorro para realizar la pesada del medio y
la preparación.
5. Medir la cantidad suficiente de agua purificada estéril para la preparación de medios de cultivos
deshidratados.
6. Pesar el medio de cultivo deshidratado en un beacker o en un papel estéril, dependiendo la
cantidad del medio a utilizar y de acuerdo a los cálculos realizados (ver ANEXO 2)
7. Colocar la cantidad de medio de cultivo deshidratado pesado en un recipiente limpio y estéril
(fiola) que tenga una capacidad mayor (doble) al volumen que se va a preparar.
8. Añadir la cantidad de agua purificada estéril haciendo uso de una probeta estéril que indique el
volumen requerido.
9. Agitar y se procede a calentar hasta completa disolución del medio deshidratado:
- Para los agares será necesaria una agitación y calentamiento constante hasta que se inicie la
ebullición, debido a que en este momento el polvo estará completamente disuelto (observar el
medio que se está preparando).
- Para medios líquidos agitar y calentar ligeramente hasta completa disolución (no dejar hervir).
10. Dejar de calentar una vez que se ha disuelto el medio de cultivo para evitar cualquier derrame
que pueda provocar quemaduras.
11. Dentro de la cabina de bioseguridad verter los agares en cajas Petri estériles, dejarlas que se
solidifiquen y los caldos se envasan en tubos tapa roscas estériles.

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12. Rotular todos los medios preparados tanto en placas, tubo y fiolas. La etiqueta debe contener la
siguiente información como mínimo:
-Nombre del medio preparado o iniciales (Ver ANEXO 1).
-Lote (Ver ANEXO 3)
-Fecha de preparación
-Iniciales del analista responsable.
13. Una vez terminada la preparación de los medios de cultivo se registra el consumo realizado en el
el Kardex correspondiente.
14. Cada lote de preparación de medios de cultivos debe cumplir con los ensayos descritos en el INS
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15. Registrar el resultado obtenido en el REGISTRO DE PREPARACIÒN Y CONTROL DE CALIDAD DE
MEDIOS DE CULTIVOS.

5.5.- Almacenaje:
Colocar en la refrigeradora los medios preparados colocando los de más reciente preparación al fondo y
los más viejos adelante. Los medios de cultivos preparados y estériles se deben almacenar en la
refrigeradora a una temperatura de 2°C a 8°C por no más de un mes a partir de su esterilización.
Las placas preparadas para cultivos por siembra en superficie y las placas de agares selectivos pueden
permanecer a temperatura ambiente colocadas en fundas plásticas impermeables a la humedad por
máximo 2 días o en refrigeración por no más de una semana.
La refrigeración favorece la deshidratación del medio, por lo que antes de la utilización del medio se
debe observar si existe evidencia de deshidratación. Se debe evitar la condensación ya que el depósito
de gotas de agua puede causar la alteración del medio.

ANEXO 1
PREPARACIÓN DE REACTIVOS

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN STOCK O SOLUCIÓN MADRE BUFFERADA

Para la preparación de la solución bufferada o diluyente se procederá a preparar la solución Stock o

solución madre

KH2PO4 34 gr.
Agua destilada 1000 ml.
NaOH 1M para ajustar el pH.

Se procede a pesar el KH2PO4 en un beacker, se disuelve con 500ml de agua destilada.

Se ajusta a pH 7,2 con NaOH 1M y se trasvasa en un matraz aforado y se enrasa a un 1litro con el restante
de agua destilada. Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
Se rotula el envase que contiene la solución madre con una etiqueta en la que constara: el lote interno,
fecha de preparación y las iniciales del responsable.
Se almacena en la refrigeradora hasta su utilización en la preparación de solución de trabajo.

SOLUCIÓN BUFFERADA (DILUYENTE) DE TRABAJO

Diluir 1.25 ml de la solución Stock en un litro de agua destilada. Se dispensara en frascos o tubos tapas rosca
y se deberá colocar por encima una envoltura de papel (Craft).
Se rotula con la fecha de preparación, lote interno y las iniciales del analista responsable.
Se esteriliza y se almacena en refrigeración hasta su utilización.

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 SOLUCIÒN DE YODO
Pesar 6g de cristales de yodo y 5 g de yoduro de potasio y mezclar con 20 ml de agua destilada estéril. Se
rotula con la fecha de preparación, lote interno y las iniciales del analista responsable.
Almacenar la solución de Yodo en un lugar oscuro protegido de la luz, no refrigera.

 SOLUCIÓN VERDE BRILLANTE AL 0.1 %

Para inhibir otras bacterias Gram. (-) que no sean Salmonella .
Pesar verde brillante 0.1g y disolver en 100ml de agua destilada estéril .
Se rotula con la fecha de preparación, lote interno y las iniciales del analista responsable.
Conservar en frasco ámbar a 4°C.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS

 AGAR SOYA TRIPTICA

Pesar 40g de polvo y disolver en 1 litro de agua purificada, mezcle bien, calentando con agitación
frecuente por 1minuto hasta total disolución del polvo. Autoclavar a 121º C por 15 minutos.

 AGAR SABOURAUD DEXTROSA

Pesar 65g de polvo en 1litro de agua purificada, mezcle bien, calentando con agitación frecuente por
1minuto hasta total disolución del polvo, autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

 AGAR PLATE COUNT

Pesar 23.5g de polvo en 1litro de agua purificada, mezcle bien, calentando con agitación frecuente por
1minuto hasta total disolución del polvo, autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

 CALDO EC
Pesar 37g de polvo 1litro de agua purificada mezcle bien, calentando ligeramente con agitación
frecuente por 1minuto hasta total disolución del polvo, dispense 7ml de caldo en tubos que contengan
tubos de fermentación invertidos Durham, autoclavar a 121ºC por 15 minutos.

 CALDO DE SOYA TRIPTICA con glicerol al 20%:

Pesar 30g de polvo y disolver en 1litro de agua purificada, mezcle bien calentando ligeramente hasta
total disolución del polvo, dispensar 80ml de caldo más 20 ml de glicerol en frascos tapa-rosca,
esterilizar a 121º C por 15 minutos. Para la conservación de las cepas en crioviales.

 CALDO LACTOSA
Para el análisis de salmonella se prepara siguiendo las instrucciones del fabricante:
Disolver 13g de polvo en un 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo,
dispensar en frascos tapa rosca 225ml, tapar y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.
Para la determinación de coliformes en agua según el Standard Methods se utiliza caldo lactosa en
concentración simple y concentración doble.
Para la concentración simple se prepara de la siguiente manera:
Disolver 13g de polvo en un 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo,
dispensar 7ml de caldo en tubos que contengan tubos de fermentación invertidos, esterilizar a 121ºC
por 15 minutos.
Para la concentración doble se prepara de la siguiente manera:

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Pesar 26g de polvo en 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo, dispensar
11ml de caldo en tubos que contengan tubos de fermentación invertidos, esterilizar a 121°C por 15
minutos.

 AGAR MACCONKEY
Pesar 50g de polvo en 1litro de agua purificada, mezcle bien calentando con agitación frecuente hasta
total disolución del polvo, esterilice a 121°C por 15 minutos.

 AGAR BISMUTO SULFITO

Suspender 52g de polvo en 1litro de agua purificada estéril. Caliente con agitación frecuente por
1minuto, hasta obtener una suspensión uniforme y en las paredes de la fiola no quede residuo de agar
crudo, una vez listo se procede a colocar en cajas petri estériles aproximadamente unos 20ml de agar,
dejamos solidificar, una vez solidificados se procede a guardar en la refrigeradora hasta su utilización,
Observación: este medio preparado tiene un tiempo de vida útil de 48H por lo que hay que preparar
solo la cantidad que se requiere para el análisis.
NO AUTOCLAVAR.

 AGAR HEKTOEN
Suspender 76g de polvo en 1litro de agua purificada estéril, mezcle bien. Caliente con agitación
frecuente por 1 minuto hasta obtener una suspensión uniforme y en las paredes de la fiola no quede
residuo de agar crudo, una vez listo se procede a colocar en cajas petri estériles aproximadamente unos
20ml de agar, dejamos solidificar, una vez solidificados se procede a guardar en la refrigeradora hasta su
utilización.
NO AUTOCLAVAR.

 AGAR XLD
Suspender 55g de polvo en 1litro de agua purificada estéril, mezcle bien. Caliente con agitación
frecuente por 1minuto hasta obtener una suspensión uniforme y en las paredes de la fiola no quede
residuo de agar crudo, una vez listo se procede a colocar en cajas petri estériles aproximadamente unos
20ml de agar, dejamos solidificar, una vez solidificados se procede a guardar en la refrigeradora hasta su
utilización.
NO AUTOCLAVAR.

 AGAR NUTRIENTE
Pesar 23g de polvo en 1litro de agua purificada, mezcle bien calentando con agitación frecuente hasta
total disolución del polvo, esterilice a 121ºC por 15 minutos..

 CALDO LAURIL SULFATO

Para la determinación de coliformes en agua según el Standard Methods se utiliza caldo lauril en
concentración simple y concentración doble.
Para concentración simple se prepara de la siguiente manera:
Disolver 35.6 g de polvo en 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo,
dispensar 7 mL de caldo en tubos que contengan tubos de fermentación invertidos, esterilizar a 121 °C
por 15 minutos.
Para la concentración doble se prepara de la siguiente manera:
Disolver 71.2 g de polvo en 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo,
dispensar 11 mL de caldo en tubos que contengan tubos de fermentación invertidos, esterilizar a 121 °C
por 15 minutos.

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 CALDO BILIS VERDE BRILLANTE 2%

Disolver 40 g de polvo en 1 litro de agua purificada, mezcle bien hasta total disolución del polvo,
dispensar 7 mL de caldo en tubos tapa rosca que contengan tubos de fermentación invertidos, esterilizar
a 121 °C por 15 minutos.

 CALDO TETRATIONATO BASE

Suspenda 4.6g del polvo en 100ml de agua purificada estéril y caliente la mezcla hasta llevarla a
ebullición, enfrié la mezcla por debajo de 60°C. Añada 2ml de solución de yodo.
No vuelva a calentar el medio después de añadir yodo, NO AUTOCLAVE.

 AGAR SS
Suspenda 60g del polvo en 1L de agua purificada estéril. Mezcle bien. Caliente agitando frecuentemente
y hierva durante no más de 2 a 3 minutos hasta disolver completamente el polvo.
Evite calentar demasiado. NO LO AUTOCLAVE.

 AGAR MANITOL SALADO

Suspenda 111g del polvo en 1L de agua purificada. Mezcle bien. Mezcle bien calentando con agitación
frecuente hasta total disolución del polvo, esterilice a 121ºC por 15 minutos.

 AGAR VRBG
Suspenda 38.53g del polvo en 1L de agua purificada estéril. Mezcle bien. Caliente agitando
frecuentemente y hierva durante no más de 2 a 3 minutos hasta disolver completamente el polvo.
Evite calentar demasiado. NO LO AUTOCLAVE.

ANEXO 2
CÁLCULOS
Para el cálculo correcto de la cantidad de medio de cultivo deshidratado que se requiera preparar, se
deberá seguir las instrucciones del fabricante que se encuentran en la etiqueta de mismo.

ANEXO 3
Se anotara en el registro de preparación de medios de cultivo lo siguiente:
-NOMBRE DEL MEDIO DE CULTIVO/REACTIVO A PREPARAR
-FECHA DE PREPARACIÓN
-LOTE DEL MEDIO PREPARADO
-NOMBRE DEL MEDIO DE CULTIVO/REACTIVO UTILIZADO
-LOTE
- FECHA DE VENCIMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVO
-CANTIDAD A PREPARAR
-CÁLCULOS
-CANTIDAD PESADA
-VOLUMEN FINAL PREPARADO
-FIRMA O INICIALES DE LA PERSONA RESPONSABLE

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