DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:

NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010

HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 1 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

1. OBJETIVO
Determinar residuos de nicarbazina desde tejido animal mediante el sistema HPLC-DAD.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El alcance de este procedimiento es para muestras de tejido animal ingresadas al laboratorio
de residuos de medicamentos veterinarios.

3. FUNDAMENTO
La determinación de nicarbazina previa homogenización del tejido, se basa en la extracción con
acetonitrilo asistido con energía de ultrasonido. Luego la muestra es centrifugada, filtrada y
evaporada a una temperatura de 60 °C con corriente de nitrógeno. La detección se realiza por
cromatografía liquida acoplada a detección por arreglo de diodos.

4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
4.1. Decisión de la Comisión (2002/657/CE). “Funcionamiento de los métodos analíticos e
interpretación de los resultados”.
4.2. Efficient HPLC method for the determination of Nicarbazin, as dinitrocarbanilide in
broler liver. E, Capurro, M. Danaher, A. Anastasio, ML; Cortesi, M. O´keeffe. Journal of
Chromatography B 822 (2005) 154-159.

5. TERMINOLOGÍA
5.1. HPLC-DAD : Cromatografía líquida acoplada a detección por arreglo de diodos.
5.2. CH3OH : Metanol.
5.3. rpm : Revoluciones por minuto.
5.4. CH3CN : Acetonitrilo

6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1. REACTIVOS
6.1.1. Agua grado HPLC
6.1.2. Estándar analítico de Nicarbazina.
6.1.3. Acetonitrilo grado HPLC.
6.1.4. DMSO grado HPLC, 99.7% de pureza
DUEÑO DE PROCESO: APROBADO:
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE
Encargado de “DOCUMENTO CONTROLADO” SE Jefe
Laboratorio de CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA Subdepartamento
Residuos de Alimentos y
Medicamentos Nutrición
Veterinarios
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 2 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

6.1.5. Acetona grado HPLC..

6.1.6. Metanol grado HPLC.
6.1.7. Agua desionizada.

6.2. INSUMOS
6.2.1. Columna cromatográfica en fase reversa Eclipse XDB-C18 o similar de 2.1 mm x 150
mm (5 m).
6.2.2. Precolumna Phenomenex C18, 4*3 mm (5 m).
6.2.3. Columna HLB 60 mg, 3cc.
6.2.4. Micropipeta intervalo de 500-5000 l.
6.2.5. Micropipeta intervalo de 100-1000 l.
6.2.6. Micropipeta intervalo 20-200 l.
6.2.7. Filtros Millipore de 0.22 m de tamaño de poro o similar.
6.2.8. Filtros PTFE 0.45 m de tamaño de poro o similar.
6.2.9. Matraz de aforo de 10 ml, clase A.
6.2.10. Matraz de aforo de 25 ml, clase A.
6.2.11. Matraz de aforo de 1000 ml, clase A.
6.2.12. Probeta de 1000 ml, clase A.
6.2.13. Probeta de 100 ml, clase A.
6.2.14. Pipetas Pasteur de 3 ml.
6.2.15. Tubos de centrifuga Falcón con tapa de 50 ml.
6.2.16. Tubos de centrifuga Falcón con tapa de 15 ml
6.2.17. Tubos de vidrio 13*100 mm.
6.2.18. Viales de 2 ml para autosampler.
6.2.19. Insertos 100 μl.
6.2.20. Jeringas desechables de 1 o 3 ml.

6.3. EQUIPOS
6.3.1 Cromatógrafo Líquido acoplado a Detector de diodos (DAD).
6.3.2 Refrigerador para almacenar estándares intervalo entre 2 y 8°C.
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 3 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

6.3.3 Refrigerador para almacenar muestras intervalo entre 2 y 8°C.

6.3.4 Congelador para almacenar muestras a -20°C aproximadamente.
6.3.5 Congelador para almacenar estándares a -20°C aproximadamente.
6.3.6 Congelador para almacenar estándares a 70 °C bajo cero aproximadamente.
6.3.7 Campana con extractor de gases corrosivos.
6.3.8 Balanza macroanalítica de división 0.01mg.
6.3.9 Centrifuga de 10000 rpm o superior con temperatura regulable.
6.3.10 Homogeneizador blender o similar.
6.3.11 Agitador Orbital.
6.3.12 Agitador Vortex.
6.3.13 Baño de ultrasonido.
6.3.14 Evaporador con corriente de nitrógeno.
6.3.15 Bomba de vacío.
6.3.16 Desionizador Simplicity, Millipore o similar.

7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES

La realización de las actividades descritas en este punto implica la utilización de guantes para
la seguridad del analista y prevención de contaminación entre muestras.

7.1. Muestra
Previo a la aceptación de la muestra e ingreso al laboratorio verificar la temperatura de la
muestra y confirmar que sea una cantidad suficiente para realizar el análisis, todas las
condiciones y requisitos de las muestras se encuentran en el IT-711.00-151 de aceptación y
rechazo de muestras.
Inscribir las muestras que ingresan al laboratorio en la planilla digital RG-021-711.00
"Consolidado Muestras Residuos Uso Veterinario" y mantener en estado congelado. El
procesamiento de la muestra consiste en tomar la pieza semi congelada y eliminar la parte
visible de grasa con un cuchillo y homogenizar el resto en la picadora. Posteriormente, tomar
una porción representativa de la muestra homogeneizada y dividir en porciones suficientes
para la realización de los análisis asociados a la muestra, si los análisis no se realizan de
manera inmediata congelar las porciones para su pesaje posterior. Congelar el resto de cada
muestra debidamente identificada “contramuestra” por si es necesario repetir los análisis.
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 4 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

7.2. Preparación de Reactivos

7.2.1. Preparación de Estándares

Todas estas soluciones deben ser guardadas en envases ámbar.
a) Solución Stock (1000 µg/ml): Pesar aproximadamente 25 mg de Nicarbazina en una
balanza de exactitud de 0,0001 g, el analito fue disuelto en 25 ml de DMSO. Esta
solución se debe conservar a una temperatura inferior a 0°C y tiene una duración de 6
meses desde su elaboración.
b) Solución intermedia de 100 µg/ml: Tomar una alícuota de aproximadamente 1000 µl de la
solución stock (ajustar la alícuota) y depositarla en un matraz de 10 ml, aforar con
acetonitrilo. Esta solución se debe conservar a una temperatura inferior a 0°C y tiene una
duración de 3 meses desde su elaboración.
c) Solución de trabajo (10 µg/ml): Tomar una alícuota de 1000 µl de la solución intermedia
de 100 µg/ml y depositarla en un matraz de 10 ml, aforar con acetonitrilo. Esta solución
se debe conservar a una temperatura inferior a 0°C y tiene una duración de 1 mes desde
su elaboración.
d) Soluciones de Solución trabajo (0.2, 1, 2 y 3 µg/ml): Tomar una alícuotas de 1000 µl,
2000 µl y 3000 µl del estándar de 10 µg/ml de nicarbazina y agregar cada alícuota sobre
un matraz de aforo de 10 ml. Tomar una alícuota de 1000 µl de la solución de 2 µg/ml,
depositarlas sobre un matraz de aforo de 10 ml. Aforar todas las soluciones con
acetonitrilo. Estas soluciones se deben conservar a una temperatura inferior a 0°C y
tienen una duración de 15 días desde su elaboración.
NOTA: La preparación de cada una de estas soluciones está indicada en el registro: RG-
003-IT-700.00-009 “Registro preparación de soluciones de estándares puros” y RG-004-
IT-700.00-009 “Registro preparación de mezclas de soluciones de estándares”.

7.3. Preparación de curva de calibración

La curva de calibrado se realiza en matriz. Para obtener distintas concentraciones de
nicarbazina en la matriz, se procede a agregar la alícuota correspondiente del estándar de
analitos, luego se deja reposar por 15 minutos y se procede a la extracción, esto se resume en
el siguiente esquema:
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 5 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

Solución de Alícuota a Cantidad Concentración

trabajo de tomar de matriz en matriz
Nicarbazina l de (g) Nicarbazina
(µg/ml) Nicarbazina (µg/kg)
- - 2.0 Blanco
0.2 200 2.0 20
1 200 2.0 100
2 200 2.0 200
3 200 2.0 300

7.4. Preparación de controles

Los controles del análisis están descritos en el punto 7.3 debido a que la curva de calibrado se
realiza fortificando la matriz a distintos niveles de concentración, además se considera un
blanco en matriz.

7.5. Preparación de la Muestra

7.5.1 Extracción

a) Pesar 2.0 ± 0.05 g de la muestra previamente molida en tubo Falcon y registrar el valor
en la orden de trabajo RG-007-711.00 "Orden de Trabajo Muestras de Laboratorio". En
este punto se debe agregar la alícuota de los analitos en el caso de muestras fortificadas
según se indica en el punto 7.3, agitar en vortex al menos 1 minuto y esperar 15 minutos
previos a la extracción.
b) Agregar 12 ml de CH3CN.
c) Agitar 10 minutos en agitador orbital.
d) Aplicar energía de ultrasonido por 15 minutos.
e) Centrifugar la muestra por 8 minutos a 10000 rpm y a -5 ± 1 °C y registrar uso en RG-
011-711.00 “Registro de uso de centrífuga”.
f) Trasferir sobrenadante a otro tubo

7.5.2 Purificación

a) Filtrar el sobrenadante en membrana de 0,45 µm o papel filtro whatman 541 o similiar.

b) Colectar 6 mL del filtrado en un tubo de vidrio.

 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 6 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

c) Evaporar a sequedad bajo corriente de nitrógeno a una temperatura de 55 a 60 ° C.

d) Reconstituir la muestra con 500 µL CH3CN: H2O (1:1), agitar en un vortex por 1 minuto,
sonicar por 1 minutos y volver agitar 1 minuto en el vortex.

e) Filtrar la muestra en membrana de 0.22 micrones y colectar la muestra en un vial para

su análisis cromatográfico.

f) Comprobar que se encuentre completado el registro RG-007-711.00 "Orden de Trabajo

Muestras de Laboratorio” previo a la programación de las muestras en el sistema
LCMSMS.

NOTA: Todo el material en el proceso debe ser lavado con agua desionizada, etanol y
acetonitrilo grado HPLC para evitar contaminación de las muestras.

7.6. Análisis de la muestra o realización de la medición.

7.6.1. Condiciones Instrumentales

La determinación de los analitos se realiza a través de LCMSMS. Para comprobar el correcto

funcionamiento del sistema instrumental se debe preparar un estándar en paralelo con las
muestras, para eso seguir este esquema:

Aseguramiento Instrumental
Solución de trabajo Alícuota a tomar Volumen matraz Conc. en solvente
nicarbazina (µg/ml) l de nicarbazina (ml) nitrofuranos (ng/ml)
10 100 5 200
Acondicionar el sistema cromatográfico con la fase móvil durante al menos 15 minutos.

7.6.2. Cromatógrafo Líquido:

- Temperatura del horno de columna: 40 ºC.

- Flujo: 0,8 ml/min.
- Volumen de inyección: 25 µl.
- Tiempo de análisis: 15 min.
- Fase móvil: A: Agua grado HPLC.
B: Acetonitrilo grado HPLC.

- Gradiente
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 7 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

Tiempo A% B%
(min)
0 70 30
1.0 70 30
6.0 40 60
7.5 40 60
11 70 30
15 70 30

7.7. Cálculo de Resultados

7.7.1. Cuantificación
Se construye una curva de calibración en cada matriz analizada considerando como mínimo
cuatro puntos.
La ecuación de la curva corresponde a:

y=ax+b
Siendo:
X= Concentración (µg/kg) de nicarbazina.
Y= Área del pico de Nicarbazina.
b: Intercepto de la curva de calibración.
a: pendiente de la curva de calibración.

Se aceptará un coeficiente de correlación R2 igual o superior a 0.99

7.7.2. Confirmación
Siguiendo los criterios de confirmación definidos en la Decisión 2002/657/CE, la identidad del
compuesto se considera confirmada cuando:
a) Se observen picos correspondientes a las transiciones características de los analitos
monitoreados con una relación señal/ruido igual o superior a 3, esto se puede determinar
visualmente.
b) El tiempo de retención relativo (tiempo de retención del analito / tiempo de retención del
patrón interno) debe ser igual al que presenta el analito en la muestra adicionada con un
margen  2.5%.
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 8 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

7.8. Aseguramiento de la calidad del ensayo

7.8.1 Controles y criterios de aceptación de cumplimiento
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. Los controles de calidad
quedan agrupados en dos niveles de control:
a) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y
patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b) Nivel II: Este nivel se refiere a los controles a efectuar durante el desarrollo de toda serie
de trabajo, por ello será descrito con más detalle. Incluye:
- Control de blanco: No se deben evidenciar señales cromatográficas para ninguna de
las transiciones monitoreadas.
- Control muestras adicionadas (al nivel del límite de cuantificación, un control por set):
Se debe visualizar claramente la señal cromatográfica del analito monitoreado.
- Control de la curva en matriz con una muestra adicionada al nivel de 100 µg/Kg: Se
lleva una carta control para evaluar la eficiencia de la extracción de nicarbazina. Se
usa la desviación estándar de los primeros 20 datos como criterio de aceptacion de
esta manera se tiene una carta con valores fijos de control. Completar información en
RG-001-IT-700.00-008 “Registro cartas control”.

7.8.2 Cantidad de controles según el número de muestras

Set de Nº de Nº Fortificados/
muestras blancos QC 100 µg/Kg
1-10 1 1
11-20 1 1
21-30 1 1
31-40 2 2
41-50 2 2
51-60 2 2
61-70 3 3
71-80 3 3
81-100 3 3
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 9 de 10
ME-711.08-191
Alimentos

7.8.3 Secuencia en programación de muestras

a) Fase reconstituyente de extractos.

b) Estándar en solvente.
c) Fase reconstituyente de extractos.
d) Blanco matriz.
e) Puntos de curva de calibrado
f) Fase reconstituyente de extractos.
g) Estándar en matriz nivel LOQ.
h) Estándar en matriz nivel 100 µg/kg.
i) Fase reconstituyente de extractos.
j) Muestras.
k) Fase reconstituyente de extractos.
l) Curva de calibrado
m) Sobre 30 muestras incluir controles según tabla que señala la cantidad de controles

7.9. Expresión de los Resultados

Los resultados se expresarán de la siguiente forma en el Informe de Ensayo:
7.9.1 Cuando la concentración obtenida sea inferior al límite de cuantificación, el resultado
será indicado < LOQ. En el informe se indicará el valor del LOQ de cada analito
7.9.2 Cuando la concentración obtenida esté por sobre el límite de detección, pero debajo del
límite de cuantificación, no se informará el valor obtenido, en lugar de ello seseñalará la
presencia de trazas.
7.9.3 Cuando la concentración obtenida esté por sobre el límite de cuantificación, el resultado
será positivo y se indicará la concentración.

8. CONTROL DE REGISTROS

No Aplica
 DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE Emisión:
NICARBAZINA EN TEJIDO ANIMAL POR 12-04-2010
HPLC–DAD Versión: 2

MODIFICADO DEL MÉTODO JOURNAL OF Actualización:

CHROMATOGRAPHY B 822 (2005) 154-159. 03-06-2015
Sección Química de Página 10 de
ME-711.08-191
Alimentos 10

9. CONTROL DE CAMBIOS

PRINCIPALES
PUNTOS
VERSION FECHA MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES
0 03-06-2015 Todo Se pasa al nuevo formato de PRT a ME.
0 03-06-2015 7.1 Se reemplaza código antiguo registro ingreso de
muestras por nuevo código y registro digital para
consolidar muestras del laboratorio.
0 03-06-2015 7.2.1 NOTA Se alude a cambio en codificación de registro de
preparación de soluciones y calibración de medidor de
pH.
0 03-06-2015 7.2.2 Se indica la vigencia de soluciones preparadas.
0 03-06-2015 7.2.2 NOTA Se alude a cambio en codificación de registros de
preparación de soluciones de estándares puros y
mezclas.
0 03-06-2015 7.5.1 letra a) se menciona uso RG-007-711.00
letra e) se menciona uso RG-011-711.00
0 03-06-2015 7.5.2 se agrega letra f)
0 03-06-2015 7.8.1 Se escribe criterio de aceptación al lado de los
aseguramientos citados.
0 03-06-2015 7.8.2 Se agrega tabla con la cantidad de controles según
número de muestras.
0 03-06-2015 7.8.3 Se agrega secuencia para programación de muestras.
0 03-06-2015 7.9 Se modifica la redacción para la expresión de
resultados.

10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES

Responsabilidades con la ejecución del Método

Ejecuta el método Elabora el informe de Aprueba el informe

(Cargo) resultados de resultados
(Cargo) (Cargo)
Técnico de Laboratorio Encargado de Jefe de
Encargado de Laboratorio Laboratorio Subdepartamento

1. ANEXOS
“No Aplica”.