PRACTICA N° 11

PIGMENTOS BILIARES: HIPERBILIRRUBINEMIAS

RELACION DE EXPERIMENTOS

1.- Determinación de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo

2.- Identificación de pigmentos biliares en la orina (Reacción de Gmelin)

INTRODUCCION
Los pigmentos biliares son un grupo de compuestos derivados del grupo Hemo.
Generalmente son coloreados y se encuentran en la sangre, siendo eliminados en la bilis,
pasando al contenido intestinal de donde pueden ser parcialmente reabsorbidos
constituyendo ésta una circulación enterohepática. Se eliminan en las heces y en la orina.

El principal pigmento biliar es la bilirrubina, la cual deriva del grupo Hemo de la

hemoglobina (que contiene a la protoporfirina IX). En el hombre se forman diariamente
250ª 400 mg. de bilirrubina; de esto aproximadamente el 75 % provienen del grupo hemo
de la hemoglobina y el resto del grupo hemo de otras hemoproteinas (catalaza, peroxidasa,
citocromos, etc.) que tienen un recambio más lento en el organismo, comparado con el
recambio que sufre la hemoglobina; lo que hace que en la práctica, las alteraciones en los
niveles de bilirrubina se consideren relacionadas al grupo hemo de la bilirrubina.

La Hemoglobina de los eritrocitos es degradada en el sistema retículo endotelial (RES)

del bazo, hígado y médula ósea, principalmente. La fracción globina es separada del hemo
y este forma primero la biliverdina y luego es reducida a bilirrubina, la que luego pasa a la
sangre excretándose principalmente en la bilis y muy pocas cantidades en la orina. En el
intestino la bilirrubina se convierte en bilinógenos (d-urobilinógeno, mesobilirrubinógeno
y estercobilinógeno), los que también pueden ser oxidados a bilinas (d-urobilina, i-
urobilina y estercobilina), las que, por ser compuestos coloreados, contribuyen a dar color
a las heces.

Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan con aumento en la

concentración de bilirrubina en el suero sanguíneo. Este aumento puede ser a predominio
de la bilirrubina indirecta (no conjugada) o directa (conjugada); en cuyo caso se hablará de
hiperbilirrubinemias a predominio indirecto o a predominio directo respectivamente. Sin
embargo, resulta más apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atención al mecanismo
de su producción y desde este punto de vista, se describen cuatro categorías:

I.- Hiperbilirrubinemias por sobreproducción de bilirrubina

II.- Hiperbilirrubinemias por menor captación hepática de bilirrubina
III.- Hiperbilirrubinemias por alteración en la conjugación hepática de la bilirrubina
IV.- Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excreción de bilirrubina

Para la tipificación de las hiperbilirrubinemias se han descrito diversos análisis de

laboratorio. Entre estos podemos destacar :

a) Determinación de bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo

b) Identificación de pigmentos biliares (bilirrubina) en la orina
c) Excreción urinaria de urobilinógeno
d) Medida de la actividad transaminásica (TGP y TGO) en suero
e) Medida de la actividad glucoronil transferásica del hígado
f) Medida de la actividad fosfatásica alcalina del suero
g) Prueba de la bromosulfotaleina

De todas estas determinaciones sólo se practicarán las dos primeras en la presente

práctica y se usarán como muestra el suero sanguíneo y la orina de un paciente ictérico y
de una persona aparentemente normal.

EXPERIMENTO 1

DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL

SUERO (Método: Malloy Evelyn.)

Objetivos:
1.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia.
2.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal
3.- Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones

Procedimiento
1.- En 4 tubos de prueba rotularlos como I, II, III y IV, medir lo siguiente:
I II III IV
 Suero diluido (1/10) 2,0 2,0 2,0 2,0
Agua destilada 2,5 2,5 --- ---
Metanol --- --- 2,5 2,5
Reactivo de Erhlich 0,5 --- 0,5 ---
Reactivo blanco --- 0,5 --- 0,5

2.- Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos

3.- Leer en el fotocolorímetro utilizando filtro verde
4.- Con anterioridad a la práctica se preparó un sistema estándar, midiendo 2,5 ml de
una solución de bilirrubina (0.004 mg/ml), se añadió luego 2.5 ml de metanol y
0.5 ml del reactivo de Erhlich. Se midió la absorbancia en las condiciones
señaladas para el suero (2 y 3) y se obtuvo una lectura de 0.224.
5.- Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del paciente ictérico y el
suero normal

Fundamento del método.

M V M P P M M V

H N N CH N N O
C C H
O H 2
H H H

Acido Sulfanílico B I L I R R U B I N A
Diazotizado
HSO3 N = NCl

M V M P

HO N N CH2Cl
C P M M V
H

HSO3 N=N OH
N C N
H
COMPLEJO DE COLOR ROJO

Figura Nº 8.- Diazo reacción de Ehrlich

Expresión de los resultados
1.- Estimar el factor de calibración porcentual
Absorbancia del Estándar : .................
Concentración del Estándar : .................
Factor de calibración : .................
Factor de calibración porcentual : ................

2.- Completar la siguiente tabla:

ABSORBANCIAS CONC. BILIRRUBINAS

I II III IV BT BD BI
Suero Normal
Suero A 0.201 0.048 0.234 0.056
Suero B 0.052 0.034 0.430 0.046
Suero C 0.194 0.058 0.292 0.052

3.- Interpretación de resultados.

Teniendo en cuenta los valores normales para las bilirrubinas, que se señalan a
continuación, indique que pacientes tienen hiperbilirrubinemia y a qué tipo de
predominio pertenecen.

VALORES NORMALES:
Bilirrubina total: 0.4 – 1.0 mg %
Bilirrubina Directa 0.2 – 0.4 mg %
Bilirrubina Indirecta 0.2 – 0.6 mg %

3.- Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la concentración de

bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina indirecta (BI), están aumentados (A),
normales (N) o disminuidos (D).

Bilirrubina Bilirrubina Hiperbilirrubinemia

directa (BD) Indirecta (BI) (a predominio)
MUESTRA A
MUESTRA B
MUESTRA C
EXPERIMENTO 2
IDENTIFICACIÓN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA (Reac. de Gmelin)

La Reacción Gmelin de realiza en la orina e identifica la presencia de biliverdina y

bilirrubina. El reactivo de Gmelin, es una mezcla de ácido nítrico conteniendo trazas de
ácido nitroso. La positividad de la reacción se hace observando en la interfase formada
entre las dos fases que se constituyen al hacer la reacción una sucesión de colores que
empezando por el color amarillo, este luego pasa a color verde, azul, violeta, rojo, naranja
y luego nuevamente amarillo. Esta sucesión de colores, se explica porque si hay presencia
de bilirrubina en la orina esta se oxida a biliverdina, luego se rompen los enlaces metínicos
entre los pirroles dando otros derivados coloreados de oxidación.
Normalmente, la orina de una persona sana no dará positiva esta reacción ya que hay
muy poca cantidad de bilirrubina en la orina normal, por lo que la positividad a esta
reacción estará demostrando presencia anormal de bilirrubina en orina.
Objetivos
1.- Realizar la reacción de Gmelin en una orina colúrica
2.- Realizar la reacción de Gmelin en una orina normal y comparar el resultado
obtenido con el correspondiente a la orina colúrica

Método
Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la acción oxidante del
ácido conteniendo trazas de ácido nitroso (reacción de Gmelin).

Procedimiento
1.- En un tubo de prueba medir 2 ml de orina
2.- Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, 2 ml de ácido nítrico-nitroso,
tratando que se formen dos capas
3.- Observar los cambios de coloración que ocurren entre ambas capas
4.- Hacer la reacción utilizando la orina patológica y una orina normal

Expresión de los resultados

Anote sus resultados en el espacio en blanco
1.- Orina normal

2.- Orina patológica

INTERROGANTES
1.- Qué Contiene el reactivo de Erhlich

2.- Porqué no se prepara un tubo blanco para la determinación de bilirrubinas por el

método de Malloy Evelyn. Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no corresponden a
los blancos que Ud. está acostumbrado a preparar.

3.- Qué bilirrubina es la que se determina en el tubo Nº 3 y por qué?

4.- Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reacción de Gmelin. Fundamente su

respuesta.

5.- El urobilinógeno da positiva la reacción de Gmelin?

6.- Qué tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en cantidades trazas en una
persona normal?

7.- A qué se llama ictericia?

8.- Cumplen rol fisiológico los pigmentos biliares?

9.- Señale las causas más comunes de un aumento de bilirrubina tipo directa.
 10.- Defina los siguientes términos:
- Ictericia:
- Coluria:
- Acolia:
11.- Se encontrará pigmentos biliares en las heces de una persona que tenga una
obstrucción total del colédoco a causa de un cálculo. Por qué?

12.- Consultando la bibliografía correspondiente indique los hallazgos bioquímicos que

se encuentran en la ictericia obstructiva, ictericia hemolítica y en la ictericia
hepetocelular (hepatitis viral por ejemplo).

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Fecha: ______________________ Firma: _______________________

SEMINARIO – TALLER
 ALTERACIONES HEREDITARIAS EN EL METABOLISMO DE LA
BILIRRUBINA: SINDROME DE GILBERT
(Inherited Disorders of bilirrubin metabolism: Gilbert’s Syndrome)

CASO CLINICO 1
J.C.V. es un estudiante de medicina de 23 años de edad que decide donar sangre para
un paciente hospitalario. Al momento de tomarle una muestra para hacer algunos
exámenes previos, el laboratorista le informa que su suero está algo ictérico, por lo que
finalmente se decido no utilizar su sangre.

El estudiante preocupado por el hallazgo del suero consulta a un médico internista,

quien le hace e interrogatorio (anamnesis) y el examen clínico respectivo. Nació de parto
normal (eutócico) de padres no consanguíneos, su crecimiento y desarrollo fueron
normales, con excepción de un cuadro de apendicitis aguda del que fue operado cuando
tenía 11 años, no registra mayores antecedentes patológicos. Comentó que cuando
estudiaba el curso de semiología un compañero le observó sus conjuntivas oculares le dijo
que las notaba algo amarillas. También reportó que cuando tomaba paracetamol por
algunos días nauseas, vómitos y dolor en el hipocondrio derecho.

Al examen clínico se le encontró con un buen estado general, afebril, hidratado y con
un casi imperceptible tinte ictérico a nivel de las conjuntivas oculares. No se palpaban
hígado ni bazo. El resto del examen clínico completamente normal. Se le solicitó una
muestra de orina la misma que resulto de características normales.

Los exámenes de laboratorio que se le practicaron al día siguiente de la consulta dieron

los siguientes resultados: Hemoglobina 15.3 g %, glicemia 89 mg %, bilirrubina sérica
total 2.70 mg %, bilirrubina sérica directa 0.41 mg %, bilirrubina sérica indirecta 2.29 mg
%, colesterol sérico 167 mg %, actividad TGP sérico 23 U/L, actividad TGO 32 U/L, la
actividad fosfatásica alcalina fue informada como normal, recuento de leucocitos 7,800
cel/mm3, con una fórmula dentro de los límites normales. La radiografía y ecografía
abdominal no dio anormalidad alguna. No se encontró bilirrubinuria (coluria).

En los dos días posteriores se le practicó la determinación de las bilirrubinas séricas

luego de someterlo por un día a una dieta de 400 Kcal y se le obtuvieron los siguientes
resultados: Bilirrubina sérica total 3.45 mg %, bilirrubina directa 0.45 mg % y bilirrubina
indirecta 3.0 mg %.
 J.C.V. continuó llevando una vida normal, asistiendo a sus controles mensuales en
donde se le repitieron algunos análisis con los siguientes resultados:

Primera 30 días 60 días 90 días

consulta
Bilirrubina Total mg % 2.70 2.55 1.80 2.50
Bilirrubina Directa mg% 0.41 0.41 0.38 0.40
Bilirrubina Indirecta mg% 2.29 2.14 1.42 2.10
Actividad TGP U/L 23 ----- ----- 18
Actividad TGO U/L 32 ----- ----- 29

J.C.V. es actualmente médico endocrinólogo, goza de buena salud y está anictérico.

Las determinaciones de bilirrubinas séricas que regularmente se le practica, nunca superan
los 3 mg % en el caso de la bilirrubina total y siempre tubo predominio de la bilirrubina
indirecta.

CORRELATO CLINICO BIOQUIMICO

Se han descrito una serie de alteraciones hereditarias en el metabolismo hepático de la
bilirrubina en donde se afecta la conjugación al ácido glucurónico o el transporte. Una
única enzima la UDP-Glucuronil Transferasa I es la responsable de la conjugación
hepática de prácticamente toda la bilirrubina en humanos.

En el Síndrome de Crigler Najar I hay ausencia total de la enzima, mientras que el

síndrome de Crigler Najar II una mutación en el gen correspondiente determina una
deficiencia severa de la enzima. Ambos síndromes se heredan con un patrón autosómico
recesivo. En el síndrome de Crigler Najar tipo I los pacientes tienen una severa
hiperbilirrubinemia no conjugada, con niveles de bilirrubina sérica que varían entre 26 y 45
mg % , como consecuencia de ello desarrollan un fuerte compromiso neurológico
(kernicterus) y mueren frecuentemente en su primer año de vida. En el síndrome de Crigler
Najar tipo II los pacientes tienen una hiperbilirrubunemia no conjugada menos severa que
en el tipo I y usualmente su bilirrubina sérica es menor a 20 mg %, por lo que no
desarrollan cuadro neurológico. A diferencia del tipo I, la bilis de estos pacientes contiene
bilirrubina conjugada y el tratamiento con fenobarbital o con glutetimida incrementa el
metabolismo de la bilirrubina y determina una importante disminución de la
hiperbilirrubinemia.
 HEMOGLOBINA
3 O2 FP NADPH + H+
Globin
a P450
3 H2O FPH NADP+ Fe2+
GRUPO
HEMO HEMO OXIGENASA (microsomal)
CO

M V M P P M M V
BILIVERDINA
HO N CH N CH N CH N OH

BILIVERDINA NADPH + H+
REDUCTASA
NADP+
ALBUMINA M V M P P M M V

HO N CH N CH2 N CH N OH

ALBUMINA BILIRRUBINA

BILIRRUBINA
BILIRRUBINA
Orina
Bilirrubina UDP - GLUCURONATO
Glucuronil
Transferasa UDP
ALBUMINA
BILIRRUBINA
GLUCURONATO

Circulación
Vesícula
Biliar Enterohepática

Metabolismo
Bilirrubina Bacterial
Glucuronato

Bilirrubina
Estercobilinógeno
Bilirrubina Estercobilina
Urobilinógeno Urobilina

El síndrome de Gilbert se caracteriza por una moderada hiperbilirrubinemia no

conjugada en ausencia de enfermedad hepática y de hemólisis y que se observa con relativa
frecuencia en la población en general (7 %). El patrón hereditario es discutible ya que se
han descrito esquemas dominantes y recesivos. La disminución en la actividad de la UDP-
Glucuronil Transferasa I es aproximadamente un 30 % de lo normal, resultando en un
incremento en la concentración relativa de monoglucurónido de bilirrubina en la bilis. Las
técnicas de la ingeniería genética han determinado que la secuencia de nucleótidos en la
región codificante del gen respectivo no contiene mutación alguna, pero en la región
promotora (extremo 5’) contiene dos bases extras (TA) en las cajas TATA, determinando
que la secuencia sea A(TA7)TAA en lugar de la normal A(TA6)TAA, lo que determina la
menor expresión del gen en estos pacientes. El Diagnostico de la enfermedad de Gilbert se
hace por la moderada hiperbilirrubinemia (frecuentemente no supera los 3 mg %) no
conjugada, en pacientes clínicamente normales y cuyas pruebas de función hepática son
completamente normales. La biopsia hepática que no es estrictamente necesaria para su
diagnóstico, muestra una histología normal. El aumento en la concentración de la
bilirrubina sérica despues de varias horas de ayuno o luego de la administración de dietas
hipocalóricas (400 Kcal/día) o de ácido nicotínico ha sido señalada como criterio
diagnóstico de la enfermedad de Gilbert, aunque al momento no está plenamente aceptado.

El Síndrome de Dubin-Johnson corresponde a una alteración en el metabolismo

hepático de la bilirrubina que se transmite con carácter autosómico recesivo y que es de
rara observación. Se caracteriza por una hiperbilirrubinemia crónica a predominio
conjugado: Los pacientes tienen alteraciones en el transporte hepatobiliar de sales no
biliares de aniones orgánicos. Ultimamente se ha mostrado que es causada por una
mutación en el transportador canalicular no específico de aniones orgánicos o proteína 2
(MRP2) asociada a la resistencia a multidrogas. Esta proteína mediatiza el transporte de un
amplio rango de compuestos, incluyendo xenobióticos y su función es ATP dependiente.

El Síndrome de Rotor corresponde a una alteración rara, relativamente benigna y que

se hereda con un patrón autosómico recesivo. Es muy semejante en sus manifestaciones
clínicas y laboratoriales al Síndrome de Dubin-Johnson, con excepción que los hepatocitos
no tienen el pigmento oscuro itracitoplasmático descrito en esta alteración.

ALTERACIONES HEREDITARIAS DEL METABOLISMO HEPÄTICO DE LA BILIRRUBINA

Síndrome de Síndrome de Síndrome de Síndrome de Síndrome de

Gilbert Crigler Najar I Crigler Najar II Dubin Johnson Rotor

Incidencia Más del 70 % de Muy rara infrecuente infrecuente Muy rara

la población

Patrón Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica

hereditario dominante? recesiva recesiva recesiva recesiva
 Defecto en Disminución de la Ausencia de la Marcada Alteración de la Alteración de la
el actividad de la actividad de la disminución de la ezcresión de ezcresión de
metabolismo glucuronil Glucuronil actividad GT bilirrubina bilirrubina
de la transferasa.(70%) Transferasa (GT) conjugada (BD) conjugada (BD)
bilirrubina Menor captación

Concentraci BT: menor o igual BT: mayor de 20 BT: Hasta 20 mg BT: De 1 a 25 mg BT: De 1 a 20 mg
ón de a 3 mg %. mg %. Todo %. Todo como %. Generalmente %. Generalmente
bilirrubinas Predominio de como Bilirrubina Bilirrubina menos de 7 mg % menos de 7 mg %
séricas Bilirrubina Indirecta Indirecta El 60 % como BD El 60 % como BD
Indirecta

Coluria No No No Si Si

Evolución, Muerte en la Usualmente Usualmente

pronóstico Buena infancia con buena, rara vez Usualmente buena buena
Kernicterus Kernicterus

Prueba de la Discretamente Alterada Marcadamente

bromosulfo anormal (menos Usualmente Usualmente (Retención mayor alterada
leina del 15% de normal normal del 25% a los 45 (retención mayor
(BST) retención a los 45 min.) al 30% a los 45’)
min.)

Presencia
Histología Normal Normal Normal introcitoplasmática Normal
hepática de un pigmento
marrón negruzco

Respuesta al Si No Si Mínima Desconocida

fenobarbital

Clínica y Clinica y Clínica y Clínica y Clínica y

Diagnóstico laboratorio Loboratori Falta Laboratorio. laboratorio. Prueba laboratorio.
Espuesta al de respuesta al Respuesta al de la BST. Biopsia Prueba de la BST.
ayuno? fenobarbital fenobarbital hepática Biopsia hepática

Transplante de Fenobarbital No existe. Evitar Ninguno

Tratamiento No necesario hígado. Terapia cuando la estrógenos que disponible
génica bilirrubina está agravan la ictericia
muy alta

En el cuadro anterior se comparan las características más importantes del síndrome de

Gilbert, del síndrome de Crigler Najar tipo I, síndrome de Crigler Najar tipio II, del
síndrome de Dubin-Johnson y del síndrome de Rotor.

BIBLIOGRAFIA.
HARRISON T. (2008) Principios de Medicina Interna Ed.17. Capítulo 297-
Hiperbilirrubinemias. Interamericana. España S.A.
BOSMAP. And OOSTRA B. (1996) The genetic basis of Gilbert’sSyndrome. New Eng. J.
Med. 334: 802-803

GONZALES X. (2009) Sindrome de Gilbert: Una Hiperbilirrubinemia muy frecuente

(reporte de un caso) Rev. Medica de Costa Rica y Centro America. 285-287

BOSIA J.D., D ASCENZO M.V., BORZY Z Y Col (2008) Síndrome de Dubin Johnson:
Presentación de un caso y revisión de la literatura, Acta Gastroenterológica
Latinoamericana. Setiembre 38 (3)

INTERROGANTES
1.- Nombre las principales hiperbilirrubinemias hereditarias teniendo en cuenta bilirrubina
que predomina e indicando el tipo de defecto que la ocasiona.

2.- Que referencia tiene del Síndrome de Alagille?

3.- Que es el Kernicterus y que alteraciones hereditarias y no hereditarias del metabolismo

de la bilirrubina pueden causarlo?

4.- Cuál es el diagnótico del caso clínico 1? ¿Qué manifestaciones clínicas y de laboratorio
apoyan su diagnóstico?

5.- A que corresponde el termino coluria? ¿Qué alteraciones en el metabolismo hepático de

la bilirrubina cursan con coluria y por qué?
6.- Qué diferencias importantes se pueden establecer entre la ictericia fisiológica del recién
nacido y cada una de las alteraciones hereditarias del metabolismo de la bilirrubina?

7.- En que consiste la prueba de la bromosulfoleina?¿En qué alteraciones hereditarias del

metabolismo de la bilirrubina se encuentran resultados anormales con esta prueba? ¿Por
qué su uso es cada vez menos recomendado?

8.- Tiene alguna relación que JCV (caso clínico 1) de tener molestias luego de la ingesta de
paracetamol, con su enfermedad?

9.-En qué hiperbilirrubinemias se usa como tratamiento el fenobarbital? ¿Qué fundamento

tiene su empleo?

10.- Describa las diferencias más importantes entre el síndrome de Crigler Najar tipo I y el
de tipo II y que posibilitan hacer su diagnóstico.

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