PROYECTO DE AULA PRIMER SEMESTRE

BIOINSECTICIDA A PARTIR DE

RESUMEN: Entre las formulaciones biológicas para el control de los insectos se

destaca el Bacillus thuringiensis, por su alta especificidad para controlar insectos que
actúan negativamente en los cultivos. Es el bioinsecticida mas acogido en el mercado
de la agricultura. Su eficiente actividad es atribuida a las delta-endotoxinas que produce
y su presencia en muchos hábitats.

TABLA DE CONTENIDO: INTRODUCCION:

Introducción…………………………..1 El control de plagas ha estado desde
hace mucho basado en la utilización de
Descripción del producto……………2
agentes químicos, lo que ha traído como
Funcionalidad del B. thuringiensis....2 consecuencia problemas de
contaminación ambiental, de toxicidad a
Fuente, aislamiento y conservación del insectos no blancos y, de manera más
B.thuringiensis………………………..7 importante, a los agricultores que los
aplican . Por otra parte su aplicación ha
Características del B. thuringiensis...11 generado la aparición de poblaciones de
insectos resistentes. Así pues, el uso de
Requerimientos nutricionales para el biopesticidas se ha visto mundialmente
crecimiento y reproducción del como una de las mejores opciones para
B.thuringiensis………………………..13 cuidar de la salud de los cultivos que se
ve amenazada por plagas. Dentro de los
Crecimiento celular y fermentación...13 biopesticidas el Bacillus thuringiensis es
una de las alternativas más viables para
Observaciones finales……………….14 ser usada por su fácil manipulación, alta
especificidad hacia insectos blancos y
Referencias…………………………...14 por ser un microorganismo cuyo uso

1
como biopesticida no representa un cultivos de hortalizas y cereales. El
peligro hacia el medio ambiente. (1) tiempo de permanencia de sus
proteínas cry es muy corto, por lo que
se ha utilizado como alternativa
DESCRIPCION DEL PRODUCTO: compatible con el medio ambiente. Sin
embargo esta ventaja para el medio
El producto a obtener es un biopesticida ambiente representa una desventaja a
basado en la bacteria Bacillus nivel comercial debido a que su
thuringiensis. Una de sus características especificidad no le permite tener toxinas
principales es que es amigable con el que ataque a cada plaga que afecte
ambiente (biodegradable), inocuos para nuestros cultivos, por esta misma razón
los humanos y altamente específicos se requiere de un estudio cuidadoso de
contra sus insectos blanco. El producto la plaga que se desea exterminar, lo
es un bioinsecticida de primera cual además requiere de una selección
generación, cuya formulación incluye cuidadosa de los tiempos y formas de
como ingrediente activo una mezcla de aplicación.
cristales y esporas de B. thuringiensis.
Constituye la mayor proporción de los FUNCIONALIDAD DEL B.
productos comerciales que se utilizan en THURINGIENSIS:
el mundo. Estos productos se utilizan en
el sector agrícola, para el control de El Bacillus thuringiensis produce una
plagas en cultivos de maíz, trigo, sorgo, toxina conocida como Delta-endotoxina,
soja, algodón y frutales. Aunque su uso que es un polipéptido que forma
es limitado en comparación con los
inclusiones parasporales proteínicas, la
insecticidas convencionales, existe un
interés creciente en el manejo integrado cual presenta efectos tóxicos
de plagas. Dicho interés se debe al verificables experimentalmente sobre un
menor riesgo de desarrollo de organismo susceptible, o bien una
resistencia y a los costos altos del proteína que posee una obvia
desarrollo de insecticidas químicos similaridad de secuencia con alguna
nuevos. proteína Cry conocida. (2)
Ventajas y desventajas del producto: Existen diferentes tipos de delta
endotoxinas y cada una de ellas se
Se ha estimado que el 2% del mercado
asocia a un grupo determinado de
mundial de pesticidas es satisfecho con
biopesticidas en el que Bacillus insectos. Sus pesos moleculares varían
thuringiensis domina el 95% de las entre 72 y 135 Kdaltons y su
ventas. Varios han sido los factores que composición es proteínica, por lo cual se
han hecho posible su éxito en la desnaturalizan por el calor y son
agricultura, el más importante es su alta solubles en condiciones alcalinas. En
especificidad hacia insectos blancos y relación a la toxicidad, la delta
su inocuidad para mamíferos, otros
endotoxina se considera no tóxica; sin
invertebrados, plantas e inclusive otros
insectos benéficos. Las toxinas Bacillus embargo, algunas investigaciones
thuringiensis se han utilizado como señalan que las beta exotoxinas pueden
insecticidas en la agricultura durante los tener efectos citotóxicos a determinadas
últimos 40 años principalmente en concentraciones, por lo cual el empleo

2
de productos de B. thuringiensis a partir GRAFICO 1: dominios de las toxinas Cry.
de cepas que producen este tipo de
FUENTE: Biotecnología del Bacillus
toxina están sujetos a regulaciones thuringiensis. (2)
adicionales.
El cristal paraesporal puede presentar
Las delta endotoxinas se producen en varias morfologías: bipiramidal, ovoidal,
forma de cuerpos de inclusión o redondo, cuadrado, triangular, “plate
cristales paraesporales y forman una like”, y amorfo entre otros. Existe una
familia de proteínas cuyos miembros correlación bastante alta entre la forma
pueden ser tóxicos contra diversos del cristal y la actividad tóxica, por
grupos de invertebrados: seis ordenes ejemplo: los cristales bipiramidal están
de insectos, nematodos, ácaros, generalmente asociados a actividad
platelmintos y protozoos. contra lepidópteros y los cristales
redondos están asociados a actividad
Principales grupos de genes Cry en contra dípteros.
B. thuringiensis
Cry I Lepidópteros La técnica más utilizada para
caracterizar cepas de B. thuringiensis
Cry II Lepidópteros y Dípteros es la Reacción en cadena de
Polimerasa (PCR). Usando cebadores
Cry III Coleópteros específicos de DNA, se pueden
identificar los genes que codifican las
Cry IV Dípteros
distintas proteínas que forman los
Cry V Lepidópteros y coleópteros. (3) cristales, y así hacer una aproximación
de la toxicidad de cada aislamiento. En
Las toxinas Cry poseen 3 dominios. El la actualidad están catalogadas
dominio I consiste en un paquete de 7 α- genéticamente más de 350 proteínas
hélices antiparalelas, donde la hélice 5 cristalinas. (4)
está rodeada por las demás; el dominio
II consta de 3 láminas antiparalelas β A modo de ejemplo tenemos que
distribuidas en una típica topología de utilizando la técnica de PCR, fue
“llave griega”, acomodada en lo que se amplificado un fragmento de DNA de 2
ha llamado un β-prisma; el dominio III Kb, que codifica para delta-endotoxina
consiste de 2 laminas β antiparalelas de bacillus thuringiensis var.
dobladas formando un β sándwich.  Tenebrionis, a partir de DNA total. El
pesquisaje de los clones se realizó por
hibridación de colonias, utilizando como
sonda, un oligonucleótido cuya
secuencia corresponde a una región
interna del gen. Esta construcción
contiene el gen completo cuya
secuencia de aminoácidos predicha, a
partir de su secuencia nucleotídica,
corresponde a la proteína de 72 Kda. (5)

3
 información sobre la posible toxicidad de
los cristales de las cepas evaluadas.
Esta técnica puede ser complementada
combinándola con Western blot, en la
que los componentes separados
electroforéticamente son transferidos a
una membrana que se incuba con
anticuerpos específicos contra
secuencias de aminoácidos conocidas.
Así se pueden identificar las protoxinas.
(3)

Similaridades en estructura y
secuencia entre toxinas.

Hay 5 bloques de secuencias de

aminoácidos conservados entre las
proteínas Cry, y 3 grupos adicionales
para secuencias carboxy-terminal
(Figura 3). Las proteínas Cyt1, Cyt2,
Cry6, Cry15 y Cry22, no tienen
homología con los bloques conservados
que se pueda reconocer. El bloque 1
contiene 5 hélices del dominio I. y su
estructura altamente conservada hace
pensar que está implicado en la
formación del poro. La localización
GRAFICO 2: oligonucleótidos utilizados en el
PCR y clonación del gen de la delta-endotoxina
central de estas hélices dentro del
del Btt y comparación con la secuencia original dominio I sugiere un papel esencial en
del gen. Los oligonucleótidos A y B introducen el mantenimiento de la integridad
los sitios de restricción HindIII y BglIII estructural del haz.
respectivamente. El oligonucleótido C fue usado
como sonda en el pesquisaje de los clones. La
posición de las bases se asumió al inicio de la
El bloque 2 incluye 7 hélices de dominio
traducción. I y la primera lámina β del dominio II.
Estas 2 estructuras comprenden la
FUENTE: Expresión heteróloga del gen que región de contacto entre estos 2
codifica para la delta endotoxina activa de dominios. Hay 3 puentes salinos entre
Bacillus Thuringiensis var. Tenebrionis en E.
los dominios I y II en Cry1Aa y Cry3A.
Colli. (5)
Esto puede ser importante si el dominio
La composición proteica del cristal I cambia su orientación relativa para la
puede ser analizada mediante interacción con el receptor y para
electroforesis en geles mantener la forma globular de la
desnaturalizantes de poliacrilamida con proteína durante la solubilización y
dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE). activación.
De esta forma se separan las protoxinas
según su peso molecular y, comparando Los bloques 3, 4, y 5 están en cada una
con patrones de bandas de los cristales de las 3 cadenas dentro del dominio III.
de cepas conocidas, se puede obtener El bloque 3 contiene la ultima lamina β
4
del dominio II, una estructura
involucrada en las interacciones entre Interpretaciones de estructura y
los dominios I y III. Las 2 argininas función.
centrales del bloque 4 estarían
 Las hélices hidrofóbicas y
envueltas en los puentes salinos,
anfipáticas del dominio I,
afectando el cristal o la agregación sugieren que este dominio puede
oligomerica. La primera y última arginina ser responsable para la
son solventes expuestos y están formación de poros en el epitelio
implicados en la función del canal. intestinal del organismo
susceptible. Un modelo de
“sombrilla se ha propuesto en
que las proteínas Cry tienen una
horquilla helicoidal hidrofóbica
(α4- α5) que inicia la formación
del poro. En cuanto a la forma
final del poro, se ha visto que lo
más probable es una estructura
envolviendo las hélices
anfipáticas, con las caras
hidrofílicas formando el lumen del
poro. Un modelo alternativo de
“navaja” donde las hélices
hidrofóbicas α5 y α6 se juntan por
un loop en el extremo de la
estructura abriendo espacio a
manera de navaja e insertándose
en la superficie de la membrana.

 Los loops de superficie expuestos

en los ápices de las 3 β láminas
del dominio II, presentan
similaridades a los sitios de unión
antígeno-anticuerpo y son los
candidatos para la unión al
receptor.

GRAFICO 3: Bloques conservados de las  La estructura de β-sándwich del

proteínas Cry y estructura tridimensional de dominio III juega varios papeles
Cry1Aa. A) Bloques conservados en las en la bioquímica de la toxina.
secuencias aminoácidicas de las δ-endotoxinas.
Está involucrada en el
B) Estructura tridimensional de Cry1Aa; dominio
I en azul, dominio II en verde, dominio III en mantenimiento de la integridad
naranja. estructural de la toxina ante la
proteólisis en el intestino del
FUENTE: biotecnología del B. thuringiensis.(2) organismo susceptible, participa
en la unión al receptor,
penetración en la membrana
celular y en la formación de
5
 canales iónicos que generan 3.3. Unión del oligómero a la
desbalance osmótico. (2) aminopeptidasa N (APN) y/o
MECANISMO DE ACCION: fosfatasa alcalina (ALP) y
El siguiente mecanismo de accion esta migración a zonas específicas de
descrito principalmente en lepidopteros. la membrana
3.4. Formación del poro en el
intestino medio.
3.5. Desequilibrio osmótico y
consecuente lisis celular.
1. Los cristales de B. thuringiensis 3.6. El tejido intestinal resulta
son ingeridos y luego dañado gravemente, lo que
solubilizados en el intestino impide la asimilación y retención
medio del insecto. de compuestos vitales para la
2. se liberan las proteínas cristalinas larva y lleva a la muerte del
en forma de protoxinas. insecto.
3. las protoxinas son procesadas
La mortalidad inducida por B.
por proteasas intestinales para
thuringiensis dependerá en esencia de
generar las toxinas activas que
ciertas bacterias entéricas que son parte
llevarán a la muerte de la larva.
de la microbiota normal del intestino del
3.1. Las toxinas atraviesan la
insecto susceptible, ya que sólo B.
membrana peritrófica y se unen a
thuringiensis no será suficiente. Estas
la caderina en la cara apical de la
bacterias serán responsables de causar
membrana epitelial
la septicemia en el insecto luego de que
3.2. Se inicia una cascada de
B. thuringiensis les permite alcanzar el
señalización dependiente de Mg2+
hemocele tras dañar el epitelio
que sería responsable de la
intestinal. (6)
muerte celular, lo que estimula la
exocitosis de caderina desde
vesículas intracelulares hacia la
membrana apical de la célula y
aumenta el número de
receptores; por ende, recluta un
número mayor de toxinas libres
que amplificarían la señal inicial.
Aquí mismo la unión de los
monómeros a caderina facilita el
clivaje proteolítico sobre el
extremo N-terminal de la toxina. GRAFICO 4: mecanismo de acción de las
proteínas Cry de b. thuringiensis en
Este último clivaje induce el lepidópteros.
ensamble de los monómeros y se
establece una forma oligomérica FUENTE: Revista Argentina de Microbiología -
pre-poro. Bacillus thuringiensis generalidades Un
acercamiento a su empleo en el biocontrol de
6
insectos lepidópteros que son plagas  10 g tristona
agrícolas.mht (6)
 5 g extracto levadura
FUENTE AISLAMIENTO Y  10g NaCl, por litro)
CONSERVACION DEL B.
THURINGIENSIS: Y se dejaron crecer en una cámara a
28ºC.
El Bacillus thuringiensis es considerado
una bacteria ubicua, pues ha sido
Las cepas que crecieron en el medio
encontrada en distintas partes del
mundo y aislada de diferentes sistemas, Luria Bertani con características
se han aislado cepas de suelo, insectos morfológicas similares a Bacillus
muertos, polvo de productos thuringiensis se cultivaron aisladamente
almacenados, residuos, hojas coníferas, en un agar nutritivo hasta su autolisis a
también en ecosistemas terrestres como una temperatura de 28ºC. Con el cultivo
desiertos, estepas, bosque húmedo autolisado se preparó un frotis delgado
tropical, altas montañas, playas y
sobre un portaobjeto. El material fijado
cuevas, ambientes acuáticos, etc. Pero
es frecuente aislarla en productos se cubrió con una solución de azul de
almacenados, pues las condiciones en Coomasie R-250 al 0,25% en 50% de
la que allí se encuentran permiten la etanol y 7% de ácido acético durante 10
persistencia de las esporas. min. Se lavó el exceso de colorante con
Aunque su diversidad abarca muchos agua y se dejó secar el frotis a
ecosistemas, no se garantiza el temperatura ambiente. Los cuerpos
crecimiento en todos los lugares en paraesporales se observaron con
donde se encuentre. microscopio óptico (Nikon E-4000,
Tokio, Japón) con 1250X de aumento.
Aislamiento de las cepas de Bacillus
thuringiensis (ejemplo)
Como cepa control se utilizó la cepa B.
thuringiensis var. Kurstaki que se
Las cepas de Bt se aislaron desde regeneró a partir del producto comercial
muestras de suelo extraídas desde DipelÒ 2X (Laboratorios Abbott,
diferentes sistemas agroecológicos de la Chicago, EEUU). Este procedimiento
VII Región del país (Vásquez et al., consistió en tomar una cantidad
1995). El procesamiento de estas pequeña del producto para restablecer
muestras se realizó de la siguiente su crecimiento en una placa con medio
manera: 1g de suelo se mezcló con 10 LB.
mL de agua destilada estéril y se
pasteurizó a baño maría a 65ºC por 30 Para la conservación de los aislados se
min. Luego, se dejó en hielo por igual preparó una suspensión de células muy
tiempo y de éstos sólo 10 mL se densa de estos y se añadieron 100 μL a
aforaron con agua destilada estéril a un una placa de Petri estéril. El inóculo se
volumen final de 200 mL. Esta distribuyó en la superficie de la placa y
suspensión se depositó en placas con se le colocaron unos discos de papel de
agar Luria Bertani: filtro estériles. Se dejó secar en flujo
laminar. Los discos de papel de filtro
7
secos se guardaron en tubos eppendorf
estériles y se conservaron a 4°C hasta
su uso. (7) Tinción del cuerpo paraesporal
Se preparó un frotis delgado sobre un
Purificación de cristales (δ- vidrio portaobjeto, secándolo a
endotoxinas) temperatura ambiente y luego,
Las cepas se cultivaron en leche exponiéndolo suavemente a la llama del
peatonizada (PMB) (10 g leche mechero. El material fijado se cubrió con
peptonizada, 10 g dextrosa, 2 g extracto una solución de azul de Coomassie R-
levadura, 0,3 g MgSO4 x 7H2O, 0,02 250 al 0,25% en 50% de etanol y 7% de
mg mL-1 FeSO4 x 7H2O, 0,02 mg mL-1 ácido acético durante 10 min. Se lavó el
ZnSO4 x 7H2O, 0,020 mg mL-1 MnSO4 exceso de colorante con agua y se dejó
x 7H2O en un volumen final de un litro),  secar el frotis a temperatura ambiente.
con agitación constante de 300 rpm a Los cuerpos paraesporales se
28oC, hasta su completa autolisis. observaron al microscopio óptico (Nikon
Posteriormente, el sedimento se colectó E-4000) con 1250X de aumento.
por centrifugación a 10.000 rpm por 10
min, y se lavó tres veces con agua Microscopía electrónica de los
destilada estéril, eliminándose el cristales proteicos
sobrenadante en cada oportunidad. El Una identificación más fina del cuerpo
sedimento resultante se resuspendió en paraesporal se efectuó mediante
NaCl 0,5 M a 30ºC por 15 min. observación al microscopio electrónico
Enseguida, el sedimento se resuspendió de barrido (MEB) (Philips, Modelo XL-
en un volumen de PMSF 30-ESEM, Irapuato, México),
(fenilmetilsulfonil fluoruro) 1 mM y la gentilmente facilitado por el Centro de
suspensión se sometió a un gradiente Investigación de Estudios Avanzados
lineal de NaBr, preformado entre 30 y Querétaro, México.
60% (Vásquez et al., 1995). La
centrifugación se realizó a 10.000 rpm Se tomaron alícuotas de 10 mL a partir
por 2 h a 4ºC, utilizando una centrífuga de suspensiones de esporas y cristales.
refrigerada (Sorvall, modelo RC-5B, Éstas se distribuyeron en la superficie
Wilmington, Delaware, USA). Al término de portaobjetos cilíndricos de aluminio,
de la centrifugación, la banda de diseñados especialmente para observar
cristales se extrajo con una pipeta en el MEB.
Pasteur, se diluyó con agua destilada, y
se concentró por centrifugación. Luego Una vez que las muestras se secaron,
los cristales se lavaron dos veces con se llevaron a sombrear con oro por 4
agua destilada estéril y se recuperaron, min en un sombreador de oro (E.F.
en cada ocasión, por centrifugación. Fullam, Modelo EMS-76M, California,
Finalmente, los cristales se congelaron USA), utilizando una corriente de 10 A y
a -80ºC para luego ser liofilizados y una bomba de vacío de alto poder
almacenados a 4°C, hasta su utilización. conectada al sombreador, hasta

8
alcanzar un vacío de 200mTorr. trabajar. En 24 horas se empiezan a
notar cepas de microorganismos, se
Después de concluir el sombreado, se debe analizar características o comparar
tomaron los portaobjetos con unas con un cultivo puro del microorganismo
pinzas de plástico y se colocaron en una esperado, previamente obtenido para
caja de Petri que contenía cinta saber cuáles de esas cepas resultantes
adhesiva, para transportar así las son de dicha bacteria, y al reconocerlas,
muestras hasta el MEB. con un asa de siembra, esta se calienta
hasta que se vea incandescente y se
Electroforesis de proteínas enfría al aire, se esteriliza también las
paraesporales cajas donde se va a resembrar la cepa y
La electroforesis analítica de proteínas también donde se encuentra la muestra,
se realizó en geles de poliacrilamida en se extrae la verdadera cepa de Bacillus
condiciones desnaturantes, según el thuringiensis con el asa, se deposita en
procedimiento descrito por Laemmli la caja que se encuentra el medio estéril
(1970). con agar o caldo nutritivo, y el tubo de
donde fue sacada la muestra se vuelve
Técnicas de Cultivo Empleadas: a esterilizar con llama y se tapa. El asa
Como método podemos utilizar la toma se vuelve a flamear.
y resiembra por extensión, para obtener
un cultivo puro de Bacillus thuringiensis,
ya que en una muestra donde está la  Frotis
supuesta bacteria, pueden haber otros
microorganismos que no son de nuestro Se denomina frotis a la extensión que se
interés. Tendremos en cuenta la técnica realiza sobre un portaobjetos de una
aséptica que consiste en evitar la muestra o cultivo con objeto de separar
contaminación durante la manipulación lo más posible los microorganismos, ya
de los cultivos y medios de cultivo: que si aparecen agrupados en la
preparación es muy difícil obtener una
Ya obtenida la muestra donde imagen clara y nítida.
supuestamente se encuentra el
microorganismo, se procede a diluirla en
determinada cantidad de solución salina Pasos Frotis
(en mL), los tubos donde se encuentra
la solución se agitan y luego de esto se 1. Colocar una pequeña gota de
pasteuriza a baño maría para que haya agua en el centro de un
más posibilidad de obtener esporas de portaobjetos limpio. Es necesaria
muy poca cantidad de agua, por
Bacillus thuringiensis. Se dejó en hielo lo que se puede usar el asa de
por igual tiempo. El siguiente paso a siembra, ya que en el extremo
seguir es tomar determinada muestra curvo de su filamento queda
del pasteurizado e inocular en el caldo o retenida una mínima gota de
agar nutritivo con el que se vaya a agua, que resulta suficiente.

9
2. Flamear el asa de siembra, 6. Cubrir el frotis con abundante
tomar, en condiciones asépticas, colorante y dejarlos actuar
una pequeña cantidad del cultivo durante el tiempo que indique el
bacteriano en medio sólido y protocolo de cada tinción
transferirlo a la gota de agua. concreta. Suele oscilar entre 1 y
Remover la mezcla con el asa de 5 minutos. En ocasiones el
siembra hasta formar una colorante tiñe sólo en caliente,
suspensión homogénea que por lo que el tiempo que dure su
quede bastante extendida para actuación se deberá sostener el
facilitar su secado. portaobjetos con unas pinzas
Si la muestra se toma de un sobre la llama del mechero para
cultivo en medio líquido, no es que humee el colorante, pero
necesario realizar los dos teniendo mucho cuidado de que
primeros pasos ya que basta con no llegue a hervir ya que se
colocar y extender una gota de la produciría la destrucción de las
suspensión bacteriana, que se células.
toma con el asa de siembra,
directamente sobre el 7. Lavar la preparación con agua
portaobjetos. para eliminar el colorante. Esta
operación se realiza inclinando el
3. Esperar hasta que el líquido se portaobjetos y aplicando el chorro
evapore o acelerar su de agua en su parte superior de
evaporación acercando el porta a manera que resbale sobre el
la llama del mechero. En este frotis, pero sin que vaya dirigido
caso hay que tener mucha directamente sobre él, pues
precaución de no calentar podría arrastrar parte del frotis
demasiado el porta pues las consigo. Eliminar la máxima
células pueden deformarse o cantidad de agua de los
romperse. portaobjetos golpeándolos por su
canto con cuidado contra la
4. Por calor: Pasar tres veces el superficie de la mesa de trabajo.
portaobjetos por la llama durante
unos segundos. Dejar enfriar el 8. Secar el porta presionando entre
porta entre los pases. dos papeles de filtro, pero en
ningún caso se debe frotar el
5. Con metanol (para bacterias porta.
procedentes de medio líquido).
Añadir unas gotas de metanol 9. Observar la preparación al
sobre la extensión microscopio llegando hasta el
completamente seca. Golpear el máximo aumento. (2)
portaobjetos por su canto con
cuidado contra la mesa de trabajo
para retirar de inmediato el
exceso de metanol. Esperar a
que el metanol se evapore
completamente.
 Tinción  Microscopía electrónica

10
Técnica utilizada para mostrar imágenes invertebrados, especialmente larvas de
por medio de un microscopio electrónico insectos. Estas proteínas se llaman Cry
que utiliza electrones para formar (del inglés, Crystal) y constituyen la
imágenes microscópicas. Tienen una
base del insecticida biológico más
capacidad de aumento muy superior a
los microscopios convencionales. difundido a nivel mundial. (6).
Existen dos tecnicas de microscopia
Durante su ciclo de vida presenta dos
electrónica: Microscopía electrónica de
transmisión y Microscopía electrónica de fases principales, la fase de crecimiento
barrido vegetativo en donde las bacterias se
duplican por bipartición cada 30-90 min
 Microscopía Óptica dependiendo del medio de cultivo y la
fase de esporulación, la cual es un
Técnica utilizada para el análisis de programa de diferenciación de bacteria
objetos utilizando microscopios de
a espora.
lentes ópticas y en este caso no se
utilizan electrones para formar imágenes
sino que se hace a la luz visible. (8)

 Electroforésis

      La electroforesis es un método de

laboratorio en el que se utiliza una
corriente eléctrica controlada con la
finalidad de separar biomoleculas según GRAFICO 5: Imagen de microscopía
su tamaño y carga eléctrica a través de electrónica de transmisión de una cepa de B.
una matriz gelatinosa. (9) thuringiensis en estado de esporangio. C: cristal
parasporal; E: espora.
CARACTERISTICAS DEL B.
THURINGIENSIS: FUENTE: Revista Argentina de Microbiología -
Bacillus thuringiensis generalidades Un
Bacillus thuringiensis es un bacilo Gram acercamiento a su empleo en el biocontrol de
positivo, de flagelación perítrica, que insectos lepidópteros que son plagas
agrícolas.mht. (6)
mide de 3 a 5 µm de largo por 1 a 1,2
µm de ancho y que posee la
característica de desarrollar esporas de
resistencia elipsoidales que no provocan
el hinchamiento del perfil bacilar. Es un
microorganismo anaerobio facultativo,
quimioorganótrofo y con actividad de
catalasa. la característica principal de B.
thuringiensis es que durante el proceso
GRAFICO 6: Colonias de 3 a 8 mm de
de esporulación produce una inclusión diámetro beta hemolíticas con hemólisis
parasporal formada por uno o más completa, de color de gris a verde, con aspecto
cuerpos cristalinos de naturaleza de vidrio esmerilado y bordes regulares, que
forman agrupaciones en cadenas que se pueden
proteica que son tóxicos para distintos observar macroscópicamente.
11
 características morfológicas y
bioquímicas, por lo que la designación
FUENTE: Especies del género Bacillus: de B. thuringiensis como especie ha
morfología macroscópica y microscópica María
Elena Realpe 1, Carlos Arturo Hernández 2,
estado sometida a discusión. A pesar de
Clara Inés Agudelo 1 esto se reconoce la individualidad de
1 Grupo Microbiología, Instituto Nacional de estas especies basándose sobre todo
Salud, Bogotá, D.C., Colombia en dos características diferenciales: la
2 División de Biblioteca y Publicaciones, Instituto presencia de la inclusión o cristal
Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia (10) parasporal y sus propiedades
insecticidas. (6)

Cristales parasporales:

Al mismo tiempo que se forma la espora en

el bacillus thuringiensis, ocurre una síntesis
de uno a varios cristales parasporales, que
pueden representar hasta un 30% del peso
seco del esporangio. En la siguiente tabla
se muestra la clasificación de estos cristales
formados, sus proteínas Cry constituyentes,
GRAFICO 7: Gram 24 horas: bacilos Gram el peso molecular de éstas y su actividad
positivos, de 1,2 mm de diámetro por 3 a 5 mm insecticida.
de largo, con borde redondeados y que forman
cadenas cortas. Se observan esporas
elipsoidales y centrales que no deforman el
bacilo.
FUENTE: Especies del género Bacillus:
morfología macroscópica y microscópica María
Elena Realpe 1, Carlos Arturo Hernández 2,
Clara Inés Agudelo 1
1 Grupo Microbiología, Instituto Nacional de
Salud, Bogotá, D.C., Colombia
2 División de Biblioteca y Publicaciones, Instituto
Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia (10)
TABLA 1: Asociaciones entre los principales
Situación taxonómica y clasificación:
tipos de cristales de B. thuringiensis, proteínas
Cry y su espectro de actividad insecticida
B. thuringiensis pertenece a la familia
Bacillaceae y se ubica dentro del grupo FUENTE: Revista Argentina de Microbiología -
1 del género Bacillus; forma parte del Bacillus thuringiensis generalidades Un
grupo de Bacillus cereus, el que incluye acercamiento a su empleo en el biocontrol de
a B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, insectos lepidópteros que son plagas
así como también a los más agrícolas.mht
recientemente descritos B.
pseudomycoides y B. Los cristales de B. thuringiensis pueden ser
weihenstephanensis. Se encuentra degradados por la acción de los
estrechamente relacionado con los dos microorganismos del suelo y, al igual que
primeros, de los que no logra sus esporas, también pueden ser
distinguirse por completo debido a que inactivados por la acción de la luz
no existen suficientes diferencias en sus ultravioleta.
12
El cristal parasporal se ubica en el interior
del esporangio y, por lo general, fuera del
exosporio de la espora, y ambos son
finalmente liberados tras la lisis celular.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
PARA EL CRECIMIENTO Y LA
PRODUCCION DEL B.
THURINGIENSIS:
GRAFICO 8: línea punteada: concentración
Los requerimientos nutricionales de la Bt total de la célula. Línea entrecortada: célula
deben ser óptimos para un medio vegetativa. Línea: célula en forma de espora.
Círculos: concentración del sustrato.
adecuado de crecimiento, esporulación
y formación de la delta-endotoxina. FUENTE: sporulation kinetic model for batch
Como fuente de carbono: la principal es growth of B thuringiensis.” Sergio orduz,
glucosa pero se utilizan también la unalmed y CIB. (13)
sacarosa, el almidón, glicerol y melazas.
Para el crecimiento celular se necesita
(11)
la presencia de oxigeno para que
Como fuente de nitrógeno: el amonio es empiece el proceso.
importante durante la fase exponencial
La fermentación de B. thuringiensis se
de crecimiento. Sin embargo, en la fase
lleva a cabo normalmente a una
de esporulación el microorganismo
temperatura entre 27°C y 33°C siendo la
muestra una preferencia por los
temperatura óptima de 30°C; a 45°C o
aminoácidos. (12)
mas, se produce una disminución en la
Como elementos traza están los producción de cristales y por ende en
minerales como magnesio, cobre, una baja actividad insecticida. Por
manganeso, calcio y zinc que tienen debajo de 1os 20 C se observa una gran
efectos sobre la esporulación. disminución en la velocidad de
crecimiento de la bacteria. Se reporta un
pH optimo de 7.3y el PH inicial del
medio es de 6.8 a 7.2 (12)
CRECIMIENTO CELULAR Y
FERMENTACION: Medio de cultivo.

 El medio es continuo
 Componente gramos por litro.
 Glucosa 5.0
 Harina de soya 6.0
 Puré de tomate 40
13
  KH2P04 2.5 2009]
 CaC03 1 http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/r
 MgS04-7H20 0.0001 1 ev64/fitosanitarios.pdf
 MnS04-H20 0.04
 FeS04-7H20 0.028 (4)Estudio de la ecología de Bacillus
 CaC12-4H20 0.030 thuringiensis en la hoja. [Articulo en internet]
 Ajustar el pH a 7.0. Los medios se [Visitado en noviembre 6 de 2009]
esterilizan a 121°C durante 15 minutos. http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UAB/AV
AILABLE/TDX-1114108-121631//
OBSERVACIONES FINALES:
pms1de1.pdf
 Esta investigación logra
proporcionar información sobre la (5) De la Riva G. Xoconostle-Cázares B.
gran diversidad genética con la Gutiérrez C. Morán R. Álvarez A.
que cuenta la bacteria y gracias Herrera-Estrella L. y Pérez S. Expresión
a esto su gran campo de acción. heteróloga del gen que codifica para la
 Por las toxinas del B. delta endotoxina activa de Bacillus
thuringiensis observamos su gran Thuringiensis var. Tenebrionis en E.
eficacia contra los insectos Colli. Biotecnología aplicada 1992; 9(1):
blanco lo que confirma una vez
las grandes ventajas que posee 31 - 37
esta bacteria con respecto a otras
(6)Sauka D. Benitende G. Bacillus
fuentes de biopesticidas.
thuringiensis: generalidades. Un
 Otro aspecto relevante de la acercamiento a su empleo en el
información recopilada es que biocontrol de insectos lepidópteros que
B.thuringiensis tiene la capacidad son plagas agrícolas. Revista Argentina
de ocupar muchos ecosistemas de Microbiología Ciudad Autónoma de
por lo que es de fácil aislamiento. Buenos Aires abr./jun. 2008; 40(2)
Lo que permite entonces que en
el mundo pueda usarse sin límite (7) Evaluación de Cepas Nativas de
relativo de cantidad disponible y Bacillus thuringiensis Como una
contribuye a la conservación del Alternativa de Manejo Integrado de la
medio ambiente. Polilla del Tomate (Tuta absoluta
REFERENCIAS: Meyrick; Lepidoptera: Gelechiidae) en
Chile. http://www.scielo.cl/scielo.php?
(1)Posible control biológico de aethina pid=S036528072006000300002&script=
tumida M. con bacillus thuringiensis, sci_arttext
instituto de biotecnología UNAM.
(8) Preparación de un frotis bacteriano.
(2)Biotecnología del Bacillus http://www.joseacortes.com/practicas/fro
thuringiensis. [Articulo en internet] tisbact.htm
[Visitado en noviembre 6 de 2009]
http://silvioalejandro.tripod.com/biotecnol
ogiadeotro bacillusthuringiensis/id1.html (9) Electroforesis.
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/
(3)Tecnologías de producción de Ciencias/neurobioquimica/libros/
Bacillus thuringiensis. [Articulo en celular/electroforesis.html
internet] [Visitado en noviembre 6 de
14
(10) Especies del género Bacillus:
morfología macroscópica y microscópica
María Elena Realpe 1, Carlos Arturo
Hernández 2, Clara Inés Agudelo 1
1 Grupo Microbiología, Instituto Nacional
de Salud, Bogotá, D.C., Colombia
2 División de Biblioteca y Publicaciones,
Instituto Nacional de Salud, Bogotá,
D.C., Colombia

(11) Smith R.A. (1982). Effect of strain

and medium variation on mosquito toxin
production by Bacillus ~Thuringiensis
Var. israelensis. Can. J. Microbiol. 28.
1089-1092.

(12) Egorov N.S; Loriya 2h.K. y Yodina

T.G. (1984). Influence of arninoacids of
the synthesis of exoproteasa by
Bacillus thuringiensis. Appl.
Riochem. Microbiol. 19, 481.

(13) Sporulation kinetic model for

batch growth of B thuringiensis.”
Sergio orduz, unalmed y CIB.

15