Facultad de Ciencias de la Salud

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PROFESORA: La Torre Aponte, María Luz

INFORME DE PRÁCTICAS

PRÁCTICA N°: 4

TÍTULO: Factores que influyen en la actividad enzimática

INTEGRANTES: Mesa 1

- Gamonal Espinoza Flor Yasminne

- Ibarra Palacios, Angeles Natalia

- Monteza Olaya, Mariafernanda

- Vadillo Pinedo, Katherine Verónica

HORARIO DE PRÁCTICA

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 22 de septiembre del 2022

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 02 de octubre del 2022

LIMA- PERÚ

2022
 ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 3
1. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 5
2. MATERIALES Y MÉTODOS: ................................................................................................... 5
Materiales............................................................................................................................................ 5
Métodos .............................................................................................................................................. 9
3. RESULTADOS: .......................................................................................................................... 11
1. Para la determinación de la catalaza en el hígado de pollo ....................................................... 11
2. Para la determinación de la actividad enzimática ..................................................................... 11
4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS .............................................................................................. 15
1. Para determinar la catalaza en el hígado de pollo ..................................................................... 15
2. Para determinar la actividad enzimática ................................................................................... 15
5. CONCLUSIONES....................................................................................................................... 17
6. RECOMENDACIONES............................................................................................................. 17
7. REFERENCIAS .......................................................................................................................... 18

2
 Factores que influyen en la actividad enzimática

INTRODUCCIÓN

En cualquier reacción catalizada, el sustrato primero debe unirse a la enzima para formar un

complejo enzima-sustrato. Para una concentración de sustrato dada, el aumento de la

concentración de enzima aumenta la velocidad de la reacción catalizada. A mayores

concentraciones de enzima, hay más moléculas que se unen al sustrato y catalizan la reacción.

Siempre que la concentración de sustrato sea mayor que la concentración de enzima, existe una

relación directa entre la concentración de enzima y la actividad de la enzima. En muchas

reacciones catalizadas, la concentración de sustrato es mucho mayor que la concentración de

enzima. Si la concentración de la enzima se mantiene constante, la adición del sustrato

aumentará la velocidad de la reacción. Si la concentración de sustrato es alta, puede saturar

todas las moléculas de enzima. La velocidad de reacción alcanza entonces un máximo y la

adición de sustrato ya no aumenta la velocidad de reacción.

Las enzimas son muy sensibles a la temperatura. A bajas temperaturas, la mayoría de las

enzimas muestran poca actividad porque no hay suficiente energía para la reacción catalítica.

A temperaturas más altas, la actividad de la enzima aumenta porque las moléculas de los

reactivos se mueven más rápido para hacer más colisiones con la enzima. La mayoría de las

enzimas humanas son más activas a una temperatura óptima de 37°C o temperatura corporal.

A temperaturas superiores a 50 °C, se destruye la estructura terciaria y, por tanto, la forma de

la mayoría de las proteínas, lo que provoca la pérdida de la actividad enzimática. Por lo tanto,

los equipos de hospitales y laboratorios se esterilizan en autoclaves, donde las altas

temperaturas desnaturalizan las enzimas presentes en las bacterias dañinas. La temperatura

corporal alta puede ayudar a desnaturalizar las enzimas presentes en las bacterias que causan

3
infecciones. Algunos microorganismos, llamados termófilos, viven en ambientes con

temperaturas entre 50 °C y 120 °C. Para sobrevivir en estas condiciones extremas, las enzimas

termófilas necesitan estructuras terciarias que no se dañen con temperaturas tan altas. Algunos

estudios muestran que sus enzimas son muy similares a las enzimas ordinarias, excepto que

contienen más arginina y tirosina. Estos cambios sutiles permiten que las enzimas de los

termófilos formen más enlaces de hidrógeno y puentes salinos que estabilizan sus estructuras

terciarias a altas temperaturas y resisten la degradación y la pérdida de actividad enzimática.

Las enzimas son más activas en su pH óptimo, el pH que mantiene la estructura terciaria

adecuada de la proteína. Cuando el pH está por encima o por debajo del pH óptimo, las

interacciones entre los grupos R se interrumpen, destruyendo la estructura terciaria y el sitio

activo. Como resultado, la enzima ya no puede unirse correctamente al sustrato y las reacciones

no tienen lugar. Cuando se invierte un pequeño cambio en el pH, la enzima puede restaurar su

estructura y actividad. Sin embargo, grandes desviaciones del pH óptimo alteran

permanentemente la estructura de la enzima. Las enzimas en la mayoría de las células humanas

tienen un nivel de pH óptimo a un pH fisiológico de alrededor de 7.4. Sin embargo, las enzimas

en el estómago tienen un pH óptimo más bajo porque hidrolizan las proteínas en el pH ácido

del estómago. Por ejemplo, la pepsina, una enzima digestiva que se encuentra en el estómago,

tiene un pH óptimo de 1,5 a 2,0. Entre comidas, el pH del estómago es de 4 o 5, y la pepsina

muestra poca o ninguna actividad digestiva. Cuando la comida ingresa al estómago, la

secreción de HCl reduce el pH a aproximadamente 2, lo que activa la pepsina.

4
 1. OBJETIVOS

- Determinar la concentración del sustrato.

- Determinar el efecto de la concentración de la enzima.

- Determinar el efecto del pH sobre la actividad enzimática.

2. MATERIALES Y MÉTODOS:

Materiales

Se utilizaron los materiales de la Tabla 1.

Tabla 1

Materiales para la parte experimental.

-El espectrofotómetro: Es un

instrumento usado en química para

medir la concentración de sustancias o

microorganismos en función de la

absorción y transmisión de luz de una

determinada longitud de onda que

atraviesa un sistema químico.

-Gradilla y tubos de ensayo Fuente:

https://www.museohistoricodeenfermeria.org/lista_c
olecciones.php?cat=3&instrumento=2&scat1=5&scat
2=120

5
-Piseta con agua destilada:

Fuente: https://www.tplaboratorioquimico.com/wp-
content/uploads/2015/01/piseta1.jpg
-Micropipeta

Fuente: https://www.interempresas.net/Quimica/Fer
iaVirtual/Producto-Pipetas-automaticas-105985.html
-Pipeta graduada

Fuente:https://website.cimatec.pe/wp-
content/uploads/2019/09/20110405_000_p_vg_10_10
00860_measuringpipettewideopeningserology_co_o.jp
g

6
-Cubetas para espectrofotometría

Fuente:
http://www.ictsl.net/productos/plastico/cubetaparaespe
ctrofotometriapmmaplastibrand.html
- Propipeta

Fuente:https://tecfresh.com/producto/bombilla-
propipeta-standar-de-3-salidas-x-10ml-011-02-001/
-Agua fría

Fuente: https://articulo.mercadolibre.com.ar/MLA-
924308962-reactivo-de-biuret-en-frasco-x-250-ml-
salttech-_JM

7
-Pepsina

Fuente: https://grupomexlab.com/producto/8001007-
albumina/
-Albúmina

Fuente:
https://cefra.com.pe/web/image/product.template/665/i
mage_1024?unique=46802f3
-Hígado de pollo

Fuente:
https://images.app.goo.gl/yhRQVSGGE8fwy9bq7

8
 -Peróxido de hidrógeno

Fuente: https://bcdn.products.pcc.eu/wp-
content/uploads/2021/10/fot-1-wwoda-utleniona.jpg

Métodos

Procedimiento experimental:

1. Para la determinación de la catalaza en el hígado de pollo

- Cortamos una cantidad pequeña de hígado de pollo y la colocamos en un tubo de ensayo.

- Agregamos peróxido de hidrógeno al tubo de ensayo.

- Observamos la reacción de la desnaturalización de enzimas (catalasa).

2. Para la determinación de la actividad enzimática:

- Para empezar, enumeráramos los 8 tubos de ensayos de 13x100 mm.

- Después colocamos los reactivos de acuerdo a la Tabla 2 en cada tubo de ensayo

- Mezclamos el contenido de cada tubo.

9
- En cuarto lugar, colocamos los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro, para leer

los resultados (considerar las absorbancias como lectura Inicial).

- Luego, colocamos los nueve tubos a 37ºC por 5 min.

- Añadimos 0.5 mL de pepsina a cada tubo y pasamos a incubar nuevamente a 37ºC por 5 min

o hasta que el tubo 1 este claro.

- Colocamos los tubos a baño de agua con hielo para detener la reacción enzimática.

- Ubicamos los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro para leer los resultados.

- Considerar las absorbancias como lectura final.

Tabla 2

Medidas para la determinación de la actividad enzimática.

1 2 3 4 5 6 7 8

Agua

destilada 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5

(ml)

HCl (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Albúmina
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
(Mml)

10
 3. RESULTADOS:

Después de llevar a cabo los procedimientos antes descritos, se llegaron a los siguientes

resultados.

1. Para la determinación de la catalaza en el hígado de pollo

Después de que se le añadiera peróxido de hidrógeno al tubo de ensayo, comenzaron a salir

burbujas y el trozo de hígado comenzó a perder su color, esto de debe a que el peróxido de
hidrógeno actúa inmediatamente con la enzima catalaza presente en el hígado de pollo. La
explicación detallada se describirá en la sección de discusión de resultados.

2. Para la determinación de la actividad enzimática

Después de seguir el procedimiento descrito en la anterior sección, se procede a realizar los

cálculos de concentración de la albúmina con la siguiente fórmula.
c1 × v1 = c2 × v2
Donde:
c1 = 5%
v2 = 4.7
v1 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑎𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎
Según los datos presentados en la tabla 3, los resultados de la concentración para cada tubo
son los siguientes:

Tabla 3
Concentración de albúmina en cada tubo de ensayo.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8
c1 5 5 5 5 5 5 5 5
v1 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
v2 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7
c2 0.53 1.06 1.59 2.12 2.66 3.19 3.72 4.25

Luego determinaremos la actividad enzimática restando la lectura final de los tubos de ensayo
menos la lectura inicial a 450 nm en el espectrofotómetro. Los resultados de cada lectura se
muestran en la Figura 1 y 2.

11
Figura 1
Lectura inicial a 450nm.

Figura 2
Lectura final a 450nm.

12
Para la lectura se agregó un noveno tubo de ensayo con 0.5ml de pepsina que sirvió como
blanco. Luego de las lecturas los resultados para la actividad enzimática se muestran en la Tabla
3.
Tabla 3
Determinación de la actividad enzimática.
1 2 3 4 5 6 7 8
Lectura -1.192 -0.937 -0.818 -0.707 -0.573 -0.103 -0.017 0.110
inicial
Lectura -1.118 -1.031 -1.001 -0.890 -0.810 -0.501 -0.411 -0.279
final
Actividad 0.074 -0.094 -0.183 -0.183 -0.237 -0.398 -0.394 -0.389
enzimática

Relacionaremos la actividad enzimática con la concentración de albúmina (substrato) con el

gráfico de Michalis- Menten, según los datos que muestra la Tabla 4.
Tabla 4
Actividad enzimática y concentración de albúmina.
1 2 3 4 5 6 7 8
Actividad 0.074 -0.094 -0.183 -0.183 -0.237 -0.398 -0.394 -0.389
enzimática
Concentración 0.53 1.06 1.59 2.12 2.66 3.19 3.72 4.25
de albúmina

Gráfico 1
Gráfico de Michelis-Menten.

Gráfico de Michaelis- Menten

0.1

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

-0.1

-0.2
V

-0.3

-0.4

-0.5
[S]

13
Realizaremos el gráfico de Lineweaver-Burk que relaciona la inversa de [S] y Vo, el Gráfico
2, con los datos de la Tabla 5.
Tabla 5
Parámetros cinéticos en la experimentación.
Actividad de la
Concentración
Tubo de ensayo enzima Vo 1/[S] 1/Vo
de albúmina [S]
(Absorbancia)
1 0.53 0.074 1.887 13.51
2 1.06 -0.094 0.943 -10.638
3 1.59 -0.183 0.629 -5.464
4 2.12 -0.183 0.472 -5.464
5 2.66 -0.237 0.376 -4.219
6 3.19 -0.398 0.313 -2.513
7 3.72 -0.394 0.269 -2.538
8 4.25 -0.389 0.235 -2.571

Gráfico 2
Gráfico de Lineweaver- Burk.

Gráfico de Lineweaver- Burk

15

10
y = 8.6048x - 7.9985
R² = 0.4648

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

-5

-10

-15

14
 4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En base a los resultados obtenidos podemos decir que:

1. Para determinar la catalaza en el hígado de pollo

Los resultados en los que vemos que comenzaron a salir burbujas y con el tiempo el hígado se

volvió de un color pálido se debe a que el peróxido de hidrógeno fue catalizado en agua y

oxígeno gracias a la enzima catalaza presente en el hígado que es una enzima que pertenece al

grupo de las oxidorreductasas, es por eso que las burbujas que observamos son el resultado de

la catálisis mostrada en la siguiente ecuación química.

2𝐻2 𝑂2 ↔ 2𝐻2 𝑂 + 𝑂2

2. Para determinar la actividad enzimática

Gracias a los gráficos de Michaelis- Menten y de Lineweaver-Burk se podrá determinar Km y

la Vmáx en la reacción enzimática con la siguiente fórmula.

1
𝑏=
𝑉𝑚á𝑥

Como ya tenemos la ecuación de la recta podemos reemplazar, donde “b” es el término

independiente de la ecuación lineal. Además, recordamos que y=mx+b

y = 8.6048x - 7.9985

1
−7.9985 =
𝑉𝑚á𝑥

Vmáx= -0.125

Además, podemos hallar Km con la siguiente fórmula:

15
 𝐾𝑚
𝑚=
𝑉𝑚á𝑥

𝐾𝑚
8.6048 =
−0.125

Km= -1.0756

Sabiendo Vmáx se puede hallar Vo que de manera gráfica será el valor en el eje Y que se une

con Km en el eje X, como se muestra en el Gráfico 3, para hallar Vo solo se multiplica ½ por

Vmáx.

Vo= ½ -0.125= -0.0625

Gráfico 3

Representación de Vo.

Gráfico de Michaelis- Menten

0.1

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

-0.1

-0.2
V

-0.3

-0.4

-0.5
[S]

Determinar el Km nos permite saber el nivel de afinidad de un substrato a la enzima, pues

tienen una relación indirectamente proporcional, lo que quiere decir que mientras menos Km

haya, existe una mayor afinidad como en el caso de la experimentación, en donde Km toma un

valor negativo, indicando que existe mayor afinidad entre el substrato y la enzima conforme
16
aumenta la concentración de substrato, en este caso, la albúmina que actúa como substrato y la

pepsina que actúa como enzima.

Con el gráfico de Lineweaver-Burk y su ecuación lineal, nos ayudó a determinar si conforme

aumentaba la concentración de albúmina aumentaba la afinidad, pues disminuye Km. En este

trabajo se comprobó que conforme aumenta la concentración, disminuye Km, por ende

aumenta la afinidad de la enzima hacia el substrato.

5. CONCLUSIONES

Después de todo lo analizado en el presente trabajo, se puede concluir que:

1. La Se logró determinar el Km y V.máx experimental de la pepsina a partir de la gráfica

de Vo contra [S].

2. Se logró determinar el Km y la V.Máx experimental de la pepsina a partir de la gráfica

de dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S]

3. En síntesis, para determinar la actividad enzimática es necesario determinar Km y

Vmáx que se pueden hallar utilizando los gráficos de Michaelis- Menten y Lineweaver-

Burk, para saber si cierto substrato es afín a la enzima con la que se está

experimentando, además es necesario ir aumentan la concentración del substrato para

ver la incidencia y relación entre la concentración de substrato y Km, para luego ver la

afinidad.

6. RECOMENDACIONES

- Antes En caso de dudas, consultar al profesor antes de realizar alguna preparación o

medición.

- Al momento de realizar las mediciones se debe colocar la pipeta a la altura de los ojos

para determinar la medida exacta.

17
 - Se deben identificar los reactivos que se van a utilizar para no cometer errores l

memento de preparar una solución.

- Cuando se toman las cubetas que van a ser introducida en el espectrofotómetro se debe

agarrar por la parte opaca para poder evitar ensuciar la parte translucida y así permitir

el paso de la luz.

- La micropipeta debe ser agarrada por todo el mango de la misma, evitar utilizarla como

si fuera una inyectadora.

- Uso de guantes y bata a lo largo de la practica para estar protegidos ante cualquier

sustancia que se vaya a utilizar.

7. REFERENCIAS

González, J. (s/f-a). Enzimas. Cinética enzimática. Ehu.eus. Recuperado el 3 de octubre de

2022, de https://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm

González, J. (s/f-b). Enzimas. Regulación de la actividad anzimática. Ehu.eus. Recuperado el

3 de octubre de 2022, de https://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm

Lúa, I., Gurrola, C., Chávez, P., & Sánchez, S. (2014). Práctica 5: Regulación no específica

de la actividad enzimática. En Manual de prácticas de laboratorio de

bioquímica (Vol. 3). McGraw Hill.

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1496&sectionid=10011

0047

Soto, I., Meléndez, L., & Jiménez, A. (2015). El tema de la catalasa en los diferentes niveles

de enseñanza aprendizaje. Revista Iberoamericana de Producción Académica y

Gestión Educativa , 3, 1–15.

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